CN1697975A

CN1697975A - 包含纳米结构的分析或分离用装置、制备方法及其应用

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Publication number: CN1697975A
Application number: CNA2004800006534A
Authority: CN
Inventors: 邹方霖; 陈春生; 陈宁; 王建霞
Original assignee: Chengdu Kuachang Medical Industrial Ltd; Chengdu Kuachang Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2003-04-30
Filing date: 2004-04-30
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2024-04-30
Also published as: CN1514243A; CN100410664C; US7842515B2; US20060057631A1; JP2007502998A

Abstract

本发明涉及用于分离或/和分析的纳米结构载体，特别是芯片片基、酶标板片基、平面层析条、层析凝胶。本发明还涉及用于分离或/和分析的高灵敏度纳米结构活性载体、特别是芯片、酶标板、平面层析试剂条、层析凝胶。本发明还涉及用于分析的含纳米结构的标记系统。本发明还涉及试剂盒，特别是芯片试剂盒、酶标试剂盒、平面层析试剂盒。本发明还涉及上述涉及物的制备方法及其应用，特别是在芯片分析、酶标板分析、平面层析条分析、层析分离方面的应用。

Description

包含纳米结构的分析或分离用装置、制备方法及其应用技术领域

本发明涉及用于分离或 /和分析的纳米结构载体，特别是芯片片基、酶标板片基、平面层析条、层析凝胶。本发明还涉及用于分离或 /和分析的高灵敏度纳米结构活性载体、特别是芯片、酶标板、平面层析试剂条、层析凝胶。本发明还涉及用于分析的含纳米结构的标记系统。本发明还涉及试剂盒，特别是芯片试剂盒、酶标试剂盒、平面层析试剂盒。本发明还涉及上述涉及物的制备方法及其应用，特别是在芯片分析、酶标板分析、平面层析条分析、层析分离方面的应用。背景技术

载体、特别是具有选择性反应活性的活性载体，在很多方面、尤其是在对样品中的目标物进行定性和 /或定量分析或 /和分离方面获得了广泛的应用。分离方面应用的活性载体，例如有亲和层析凝胶。分析方面应用的活性载体，例如有抗原或 /和抗体芯片。

目前的活性载体，主要是将活性试剂（例如配基）直接固定在固相载体表面上形成的。所用固相载体主要是由无机材料、有机材料或复合材料及其衍生物制作的面状载体（例如生物芯片、酶标板等的片基）、粒状载体（例如层析凝胶、特别是微米粒子层析凝胶）和膜状载体（例如平面层析条）。其中，玻片衍生物（例如胺基玻片、醛基玻片、环氧基玻片和聚氨基酸包被玻片等）是生物芯片目前使用的主要片基。活性试剂在片基上的固定形成的固定化活性试剂，是影响生物芯片检测灵敏度或 /和特异性的关健之一。固定化方法主要有：共价键固定法、物理化学吸附法、包埋法和交联法。物理化学吸附法包括特异性吸附法和非特异性吸附法。非特异性吸附的例子有离子吸附。特异性吸附的例子有亲和吸附。抗原一抗体反应、核苷酸配对反应、亲油反应等，都属于亲和吸附。目前的活性载体，其活性试剂反应动力学条件尚待优化，表现为灵敏度或 /和特异性尚待提高、或 /和反应时间尚待缩短。

通过对载体的表面进行改造来改造固定化活性试剂，一直是分析或 /和分离研究开发的一项重要内容，吸引了数以千计的实验室。仅对载体的表面进行纳米粒子或胶体改造，就有很多研究者在工作。然而，这些工作要么没有把主要目标确定为灵敏度（例如 WO 0183825)、要么没有把主要目标确定为固定化活性试剂（例如美国专利申请号 20030207296)、要么所获载体的成本太高（例如美国 3M公司制作定向排列的、不连续的亚微米须晶结构，中国专利申请号 96193700.9) 。在文件 WO 0183825中，将胶体、特别是尺寸为 100 nm_500 nm 的有机粒子用作配基载体，其目的以及所要达到的效果仅为减小芯片的加工劳动量例如加工步骤以加工出探针点均匀的芯片。在第 20030207296号美国专利申请中，其重点在于将纳米粒子本身用作核酸检测配基载体，而对纳米粒子改性的片基的研究不够。

决定灵敏度和检测时间的另一关键因素是标记系统。目前的标记系统，主要是分子分散标记系统，其灵敏度尚待提高。数以百计的实验室在进行这方面的工作。尽管目前标记系统中已引入某些纳米粒子来提高检测灵敏度（如 WO 00/72018 A1 , 第 20030211488号美国专利申请，第 02133538.9、 02137418.X、 01133527.0号中国专利申请，它们使用胶体金作为标记物，加上银增强系统），但它们或是标记物质本身（例如第 02141718.0、 01109551.2号中国专利申请，其使用荧光稀土络合物纳米颗粒标记物）、或是标记物质增强剂（例如第 20030232388、 20030166297、 20020142480、 20030211488号美国专利申请，使用具有拉曼增强效应的金属）。还有一些专利在微米粒子中引入某些纳米晶体粒子来作为连接不同活性分子的微米粒子载体的识别编码，如 6544732号美国专利。

此外，在分离装置例如层析装置中也大量使用活性载体，例如亲和层析固定相。尽管用作层析固定相基质的粒子比之基片有更大的比表面积，然而在层析时间和层析收率等方面，仍有待改进。发明内容

本发明的主要目的是以较低的成本提高分析、分离中活性载体或 /和标记物的反应效率，从而提高检测灵敏度或 /和特异性、或 /和降低检测时间、或 /和提供更多种类的具有足够高灵敏度的固相载体。本发明的目标通过对载体、活性载体和标记系统的开发来实现。由于对载体和活性载体的研究，本发明的另一个目的是提高分离介质的分离效率。

根据本发明的第一个方面，其提供一种用于分离或 /和分析的纳米结构载体，其包含纳米结构区，所述纳米结构区包含常规固相载体及其上固定的纳米结构，所述纳米结构包含非定向排列的纳米结构单元，所述纳米结构单元包括凸出高度大于 3 nm、且凸出半高处至少一维尺寸在 1一 500 mn、优选 1一 lOOnm 之间的纳米凸体，且所述纳米凸体在所述纳米结构区中的分布密度大于 1个 / μ m 优选大于 10个 / μ ιη²。在本发明中，术语"纳米凸体"是指至少一维具有尺寸 1一 lOOOnm的仅有一个顶部的凸体，例如一个固定于固相载体、或其它结构上的纳米粒子；术语 "纳米结构单元"是指至少一维具有尺寸 1一 lOOOnm的结构单元，例如一个纳米粒子；术语 "纳米结构"是指由纳米结构单元为结构单元构成的高度小于 lOOOnm的结构，例如由纳米结构单元或纳米凸体形成的树枝状、深丘状、网状、或其它几何形貌，及其间纳米结构单元或纳米凸体的相互关系（例如所述树枝状可以有向上的或平行于表面的走向等；在附图 1中，可以看到这些纳米凸体或含纳米凸体的树状体）；术语 "纳米结构区"是指纳米结构载体上具有本发明的确定特征（例如纳米结构单元分布及分布密度等）的区域，其包括所述纳米结构及任选存在的未固定有所述纳米结构的常规固相载体表面；术语 "非纳米结构区"是指纳米结构载体上纳米结构区以外的区域，非纳米结构区可以含有纳米结构但其不具有纳米结构区特征。本发明纳米结构载体包括纳米结构区和任选存在的非纳米结构区。所述分离或 /和分析的目标物包括下述一组或多组物质：多肽、与多肽相互作用的药物、核酸、与核酸相互作用的药物。

在根据本发明第一方面的纳米结构载体中，所述纳米结构区的纳米结构覆盖率大于 20%、优选大于 30%。在本发明中，术语 "纳米结构覆盖率"是指覆盖有所述纳米结构的常规固相载体的表面积在纳米结构区包含的常规固相载体的总表面积中的比率：纳米结构覆盖率=纳米结构覆盖的常规固相载体表面积 / 常规固相载体总表面积。

在根据本发明第一方面的纳米结构载体中，所述纳米结构区的表面积提高率大于 200%、优选大于 300%、更优选大于 400%。在本发明中，术语"纳米结构区表面积提高率"是指纳米结构区与其所含的所述常规固相载体的比表面积之比：表面积提高率 = (纳米结构区比表面积 /其所含常规固相载体的比表面积） X 100 %。表面积提高率可以直接测定也可以间接测定。

在根据本发明第一方面的纳米结构载体中，所述纳米结构区的吸附能力提高率大于 115 %、优选大于 130%、更优选大于 150%。在本发明中，术语"纳米结构区的吸附能力提高率"是指纳米结构区与其所含的所述常规固相载体的吸附能力之比：吸附能力提高率= (纳米结构区吸附能力 /其所含常规固相载体的吸附能力） X 100 %。吸附能力中被吸附物的选择，按公知方法进行。

在根据本发明第一方面的纳米结构载体中，所述纳米结构区的吸附量衰减速率比小于 90%、优选小于 80%。在本发明中，术语 "纳米结构区的吸附量衰减速率比"是指纳米结构区与其所含的所述常规固相载体之间对吸附量随目标物低浓度下降而衰减的速度比较：吸附量衰减速率比 = (纳米结构区吸附量随目标物低浓度下降而衰减的速度 /常规固相载体对吸附量随目标物低浓度下降而衰减的速度） X 100%。

本发明的纳米结构载体具有确定的纳米结构特征（例如，纳米结构区及其中纳米结构单元分布及分布密度，纳米结构覆盖率等）及纳米性质特征（表面积提高率、吸附能力提高率、吸附量衰减速率比等) 。本发明的纳米结构载体的纳米性质特征可能与述及的纳米结构有关，也可能与未述及的纳米结构有关。本发明的具有确定的纳米结构特征及纳米性质特征的纳米结构载体，不同于 "纳米粒子包被载体"。实际上，即使是常规载体，其上也容易有纳米粒子，例如加工缺陷、非专门的微尘吸附等。但它们不是本发明的纳米结构载体。即使是专门用纳米粒子包被载体，所得纳米粒子包被载体很多情况下也不具有本发明的纳米结构载体特征、特别是纳米结构区的特征，其同常规载体没有质的区别 (例如：表面积提高率、吸附能力提高率、吸附量衰减速率比等），也不是本发明的纳米结构载体。本发明的纳米结构载体可以通过多种方法获得，但本发明纳米结构载体的制备为本发明的纳米结构载体优选的制备方法。特别要强调的是，本发明的制备方法中，一个优选的纳米粒子浓度是获得本发明的纳米结构载体的关健之一。本发明的一个实施例中，在优选浓度之外的条件下制备的纳米粒子包被载体不具有本发明的纳米结构载体的特征，不是本发明的纳米结构载体。

在根据本发明第一方面的纳米结构载体中，所述纳米结构单元由纳米粒子形成，所述纳米粒子其粒径尺寸 1一 500nm、优选 1一 100nm、更优选 1一 50nm。所述纳米粒子与固相载体之间、或 /和所述纳米粒子之间可通过一种或多种方式结合，例如：共价键结合、非特异性物理化学吸附、抗原一抗体吸附、亲和吸附、核苷酸配对结合、及低于软化温度的热结合、等等。优选的是，所述结合包括通过固相载体或 /和纳米粒子表面的连接剂来进行，所述连接剂包括表面基团或 /和包被有机物。

在根据本发明第一方面的纳米结构载体中，所述纳米粒子包括无机纳米粒子或 /和有机纳米粒子及它们的衍生物，所述无机纳米粒子包括非磁性无机纳米粒子和磁性无机纳米粒子，所述非磁性无机纳米粒子包括非磁性金属纳米粒子和非磁性非金属纳米粒子，所述衍生物包括结合有表面基团或 /和包被有机物的衍生物。所述非金属纳米粒子包括塑料、多糖、乳胶、树脂粒子的有机纳米粒子。所述无机非磁性非金属纳米粒子包括氧化硅粒子、氧化钛粒子、氧化铝粒子在内的氧化物纳米粒子。所述非磁性金属纳米粒子包括金粒子、钒粒子、铅粒子。虽然纳米粒子金等金属粒子已被用于快检试剂条，但它是作为粒子分子标记物质，而不是本发明方法的固相载体使用的。

在根据本发明第一方面的纳米结构载体中，所述常规固相载体包括由以下之一组或多组材料或其衍生物制成的尺寸大于 lOOOmn的固相载体：玻璃、硅片、硅胶、陶瓷、金属氧化物、金属、聚合物材料及它们的复合物，所述衍生物包括结合有表面基团或 /和包被有机物的衍生物。所述固相载体包括面状载体（例如生物芯片、酶标板等的片基）、粒状载体（例如层析凝胶、特别是微米粒子层析凝胶）和膜状载体（例如平面层析条）。

在根据本发明第一方面的纳米结构载体中，所述表面基团包括下述一种或多种基团：氨基、醛基、环氧基、氨基肼、二乙氨基乙基、二乙基一（2—羟丙基）氨乙基、羧甲基、磺酸丙基、巯乙基吡啶基、硅氧烷基、硫醇基、垸基；所述包被有机物包括下述一种或多种有机物：包括聚乙烯吡咯垸酮、吐温类表面活性剂在内的表面活性剂，包括聚氨基酸在内的聚电解质，包括聚硅氧垸在内的亲油有机物，包括葡聚糖衍生物、琼脂糖衍生物、纤维素衍生物、聚丙烯酰胺在内的离子交换聚合物，和包括肝素钠、抗原、抗体在内的亲和物质。所述表面基团还可以是长臂衍生基团 R— (CH₂)_X—，其中 R是衍生基团， X等于或大于 2、优选大于 4、更优选大于 6。在本发明中，特别是由于包被衍生物的制备，使得纳米粒子表面可以引入的活性有机基团的范围很大。例如在本发明实施例中，纳米粒子衍生物如超疏水氧化硅（CDS7)上有烷基，包被衍生物表面有包被有机物的基团，例如聚氨基酸具有氨基、氨基肼一聚氨基酸具有氨基和氨基肼基、 DEAE— Dextmn具有二乙氨乙基、等等。另一方面，表面活性剂如聚乙烯吡咯烷酮、聚电解质如聚氨基酸、离子交换聚合物如 DEAE— DextraiK 亲和物质如蛋白质 A等均用在本发明方法中制备配基 /纳米粒子 /片基复合物和配基 / 纳米粒子 /分子标记物质复合物。实际上，粒子衍生物的重要方面是包被衍生物。本发明方法中的包被衍生物可以是一重或多重包被衍生物。例如，包被有分散剂或 /和分散稳定剂的氧化硅粒子上（一重包被），还可以包被 PVP (二重包被），继续还可以包被蛋白质 A (三重包被) 等等。因此，可以选择的包被有机物的范围是非常的大。所述表面基团或 /和包被有机物可以固定在纳米粒子上或 /和常规固相载体上。在根据本发明第一方面的纳米结构载体中，所述纳米结构载体包括：纳米粒子 /片基复合物、纳米粒子 /微米粒子复合物或纳米粒子 /微米粒子 /片基复合物。要强调的是，本发明的纳米粒子 /片基复合物、纳米粒子 /微米粒子复合物或纳米粒子 /微米粒子 /片基复合物，是作为本发明纳米结构载体的纳米粒子 /片基复合物、纳米粒子 /微米粒子复合物或纳米粒子 /微米粒子 /片基复合物。

根据本发明第一方面的纳米结构载体可以作为分析芯片纳米结构片基、酶标板纳米结构微孔板、平面层析纳米结构片基、纳米结构分离固定相、及包括纳米结构层析凝胶在内的纳米结构分离固定相。

根据本发明的第二方面，其提供一种制备根据本发明第一方面的纳米结构载体的方法，其包括将所述纳米粒子的悬浮液与所述常规固相载体接触并进行固定化反应，且固定化反应时所述悬浮液中的纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml) 为五百分之一至十五万分之一，或纳米粒子摩尔浓度为 0.12— 37.4 nM。本发明的纳米结构载体制备方法中，确定的纳米粒子浓度是关键所在之一。根据本发明方法制备的纳米结构载体可以作为分析芯片片基、分析芯片流路、酶标板片基、平面层析试剂条片基、及层析凝胶的载体等。

在根据本发明第二方面的方法中，所述纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml) 为五千分之一至十五万分之一，或纳米粒子摩尔浓度为 0.12— 3.74 nM。优选地，所述纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml) 为二万分之一至六万分之一，或纳米粒子摩尔浓度为 0.31— 0.93 nM。

根据本发明第二方面的方法还可包括下述一种或多种功能化 ( functionalization) 处理以有利于与其它相关物质的结合：

(a) 先将所述纳米粒子或 /和所述常规固相载体功能化，再进行所述接触和固化；

(b) 先进行所述接触和固化，再进行所述纳米粒子或 /和所述常规固相载体的功能化；

(c) 将所述纳米粒子或 /和所述常规固相载体功能化，再进行所述接触和固化，然后再进行所述纳米粒子或 /和所述常规固相载体的功能化；

其中所述功能化处理包括引入所述表面基团或 /和包被有机物。

根据本发明第二方面的方法还可包括对所述固定化反应后的产物进行化学交联处理。可以在本发明中使用的交联剂包括偶合剂，例如环氧氯丙垸、乌洛托品等。

根据本发明第二方面的方法还可包括对所述固定化反应后的产物进行热处理，所述热处理包括在 30°C以上、优选 37°C以上、更优选 40°C以上但固相载体的软化温度以下加温然后冷却。现有技术中，提高纳米粒子包被片基稳定性的方法之一是在固相载体的软化温度的热处理。然而，软化温度的热处理易造成固相载体变形，产生应用困难。令人吃 '惊的是，本发明的热处理方法，即使是在软化温度以下、甚至以下数十度、上百度，仍能使固相载体与纳米粒子之间产生足够强的结合。本发明不拟进入理论讨论，只是假设纳米粒子可能具有异于常规材料的热性质。本发明的热处理方法不造成固相载体变形。

根据本发明的第三方面，其提供一种用于分离或 /和分析反应器的纳米结构活性载体，其包含纳米结构活性区，所述纳米结构活性区包含常规固相载体及其上固定的活性纳米结构，所述活性纳米结构包含非定向排列的纳米结构单元及其上固定的活性试剂，所述纳米结构单元包括凸出高度大于 3 nm、且凸出半高处至少一维尺寸在 1一 500 nm、优选 1一 lOOnm之间的纳米凸体，且所述纳米凸体在所述纳米结构区中的分布密度大于 1个 / μ πι²、优选大于 10个 / μ ιη²。本发明中，术语 "活性区"是指固定有所述活性试剂的区域，活性区可以包含整个固相载体也可以只包含固相载体的一个或互相独立的多个区域（例如微阵列芯片）；术语 "非活性区"是指活性区以外的区域；术语 "纳米结构活性区"是指活性区中除含有所述活性试剂、还含有具有本发明的确定特征（例如纳米结构单元分布及分布密度等）的纳米结构的区域，其包括所述纳米结构、固定在纳米结构上的活性试剂及任选存在的未固定有所述纳米结构的常规固相载体表面（在附图 2中，可以看到这些纳米凸体或含纳米凸体的树状体。），纳米结构活性区可以包含整个固相载体也可以只包含固相载体的一个或互相独立的多个区域（例如纳米结构芯片）；本发明中，术语 "纳米结构芯片"为至少含有一个本发明所述纳米结构活性区（例如探针微阵列中的一个样点）的芯片，一个芯片可以有多个反应器，一个反应器可以有多个含活性试剂的样点（探针点），只要其中有一个样点为本发明的纳米结构活性区，则芯片为本发明的纳米结构活性载体或纳米结构芯片；术语 "非纳米结构活性区"是指活性区中纳米结构活性区以外的区域，非纳米结构区可以含有纳米结构但其不具有纳米结构活性区的特征。术语 "纳米凸体"、 "纳米结构单元"、 "纳米结构"、 "纳米结构区"、 "非纳米结构区" 以在上述段落中定义。纳米结构活性载体包括活性区及任选存在的非活性区，所述活性区包括纳米结构活性区和任选存在的非纳米结构活性区。在本发明中，所述活性试剂为赋于所述纳米结构活性载体以反应活性（例如与目标物反应的活性）的试剂，例如离子交换剂、药物、多肽、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、抗原、以及病毒、细胞或它们的组成。本发明纳米结构活性载体未含标记物质（例如未含荧光素的生物芯片）、仅用于反应器，因而本发明的纳米结构活性载体不包括标记物。

特别要强调的是，确定的纳米结构特征及纳米性质特征使本发明中的纳米结构活性载体不同于一般意义上含有纳米粒子的活性载体。尽管某些文件（例如第 20030207296号美国专利申请）中的活性载体是包括固相载体和固相载体上的纳米粒子的活性载体，而我们在大量的试验中惊奇地发现：不同特征（例如不同表面形貌特征) 的活性载体，其活性 (例如检测灵敏度)可以是非常不同的。本发明的纳米结构活性载体具有确定特征，才具有确定的高活性（例如检测灵敏度）。此外，美国专利 US6025202的自构胶体金属层（ Self-assemble metal colloid monolayers) 也与本发明纳米结构活性载体的技术方案根本不同，前者不具有本发明纳米结构活性载体的这些特征。实际上，载体表面附着的活性纳米粒子不一定形成本发明所述纳米结构活性区。

在根据本发明第三方面的纳米结构活性载体中，所述纳米结构活性区的纳米结构覆盖率大于 30%、优选大于 75 %。在本发明中，术语 "纳米结构活性区的纳米结构覆盖率"是指覆盖有所述纳米结构的常规固相载体的表面积在纳米结构活性区包含的常规固相载体的总表面积中的比率：纳米结构覆盖率=纳米结构覆盖的常规固相载体表面积 /常规固相载体总表面积。

在根据本发明第三方面的纳米结构活性载体中，所述纳米结构活性区的表面积提高率大于 200%、优选大于 400%、更优选大于 600%。在本发明中，术语 "纳米结构活性区表面积提高率"是指纳米结构活性区与其所含的所述常规固相载体的比表面积之比：表面积提高率 = (纳米结构活性区比表面积 /其所含常规固相载体的比表面积） X 100 %。表面积提高率可以直接测定也可以间接测定。本发明的一个实施例中，分析芯片的表面积提高率是通过对整个片基分别包被活性纳米粒子及活性试剂来间接测定的。本发明的芯片，其表面积提高率可达 8.0甚至更高。

在根据本发明第三方面的纳米结构活性载体中，所述纳米结构活性区的灵敏度提高率大于 120%、优选大于 150%、更优选大于 200%，或 /和吸附能力提高率大于 115%、优选大于 130%、更优选大于 150%。本发明中，术语"纳米结构活性区的灵敏度提高率"是指纳米结构活性区与含相同常规固相载体和活性试剂的非纳米结构活性载体的分析灵敏度之比：灵敏度提高率 = (纳米结构活性区灵敏度 /非纳米结构活性载体灵敏度） X 100% ; 术语 "纳米结构活性区的吸附能力提高率"是指纳米结构活性区与含相同常规固相载体和活性试剂的非纳米结构活性载体的吸附能力之比：吸附能力提高率- (纳米结构活性区吸附熊力 /非纳米结构活性载体吸附能力 ) X 100% _; 术语 "非纳米结构活性载体" 是指不含本发明的纳米结构活性区的活性载体，例如 HCV抗原点样至还氧基玻片形成的芯片 (纳米结构活性载体的例子有本发明的 HCV抗原包被氧化硅纳米粒子悬浮液点样至还氧基玻片形成的芯片 ) 。吸附能力中被吸附物的选择，取决于所固定的所述活性试剂。本发明中的芯片的灵敏度提高率可达 300 %甚至更高。

在根据本发明第三方面的纳米结构活性载体中，所述纳米结构活性区的识别信号衰减速率比小于 90%、优选小于 70%，或 /和吸附量衰减速率比小于 90%、优选小于 80%。在本发明中，术语"纳米结构活性区的识别信号衰减速率比" 是指纳米结构活性区与含相同常规固相载体和活性试剂的非纳米结构活性载体在分析时的识别信号随目标物低浓度下降而衰减的速度比较：识别信号衰减速率比= (纳米结构区识别信号随目标物低浓度下降而衰减的速度 /非纳米结构活性载体识别信号随目标物低浓度下降而衰减的速度） X 100% ; 术语"纳米结构活性区的吸附量衰减速率比"是指纳米结构区与含相同常规固相载体和活性试剂的非纳米结构活性载体吸附量随目标物低浓度下降而衰减的速度比较：吸附量衰减速率比 = (纳米结构活性区吸附量随目标物低浓度下降而衰减的速度 /非纳米结构活性载体吸附量随目标物低浓度下降而衰减的速度） X 100%。

本发明的纳米结构活性载体在技术方案上不同于 PCT国际专利申请 PCT/US96/04485 (及 CN96193700.9)中描述的生物活性载体，后者的活性纳米结构是由定向排别的纳米须晶形成的，其优选的制作方法也完全不同于本发明优选的制作方法，结果是其成本高而且不能像本发明的一种芯片那样在仅在固相载体上需要处定点地固定活性纳米粒子阵列。本发明的纳米结构活性载体也不同于己公开的其它含纳米结构的活性载体。本发明的纳米结构活性载体具有确定的纳米结构特征（例如，纳米结构活性区及其中纳米结构单元分布及分布密度，纳米结构覆盖率等）及纳米性质特征（表面积提高率、吸附能力提高率、吸附量衰减速率比、灵敏度提高率、识别信号衰减速率比等）。本发明的纳米结构活性载体的纳米性质特征可能与述及的纳米结构有关，也可能与未述及的纳米结构有关。本发明的具有确定的纳米结构特征及纳米性质特征的纳米结活性构载体，就像本发明的具有确定的纳米结构特征及纳米性质特征的纳米结构载体不同于普通意义的 "纳米粒子包被载体"一样，不同于普通意义的 "含活性试剂的纳米粒子包被载体"。本发明的纳米结构活性载体可以通过多种方法获得，但本发明纳米结构活性载体的制备方法为本发明的纳米结构活性载体优选的制备方法。特别要强调的是，本发明的制备方法中，一个优选的活性纳米粒子浓度是获得本发明的纳米结构活性载体的关健之一。本发明的一个实施例中，在优选浓度之外的条件下制备的纳米粒子包被活性载体不具有本发明的纳米结构活性载体的特征，不是本发明的纳米结构活性载体。在本发明的一个实施例中，我们将讨论研究它们的差别，例如形貌差别。在电子探针显微镜（DFM) 和电子扫描显微镜帮助下，可以观察到表面一些凸起但凸出尺寸远大于纳米尺寸的凸体，很可能是纳米粒子的聚集体。而且，大尺寸的纳米粒子聚集体可能失去了、至少部分失去了部分纳米结构特性。例如，在实施例中活性氧化硅浓度大于 1 %时形成的活性载体，其中这类凸体（非纳米结构活性区）在活性区中的比例就比较大，因而其检测灵敏度就较低。总之，在没有严格的结构设计的条件下形成的含活性纳米粒子的活性载体是与本发明的纳米结构活性载体不相同的。只有拥有上述特征的活性载体，才是本发明的纳米结构活性载体。此外，本发明的纳米结构活性载体包括纳米结构单活性载体和纳米结构多活性载体，其中所述纳米结构单活性载体在同一个固相载体上只固定有包含一种活性试剂的活性纳米粒子，而所述纳米结构多活性载体在同一个固相载体上固定有包含二种以上活性试剂的活性纳米粒子。在第 20030207296号美国专利申请中，只有纳米结构单活性载体。包含纳米结构多活性载体的装置例如是芯片和平面层析试剂条，而包含纳米结构单活性载体的装置例如是酶标板。

在根据本发明第三方面的纳米结构活性载体中，所述分离或 /和分析的目标物包括多肽或 /和与多肽相互作用的药物。公知的可与目标多肽作用的活性试剂很多，例如离子交换剂、药物、多肽、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、抗原、以及病毒、细胞或它们的组成。在此类纳米结构活性载体中，所述活性纳米结构与所述固相载体之间可以不通过核苷酸配对结合，例如下述一种或多种方式结合：共价键结合、非特异性物理化学吸附、抗原一抗体吸附、及亲和吸附，而且所述结合是通过固相载体或 /和纳米粒子表面的连接剂实现的，所述连接剂包括表面基团或 /和包被有机物或 /和所述活性试剂。在第 20030207296号美国专利申请中，纳米粒子与片基之间的结合必须通过核酸的配对作用来进行，不适合处理核酸以外的物质例如多肽的检测和分离。

在根据本发明第三方面的纳米结构活性载体中，所述分离或 /和分析的目标物包括核酸或 /和与核酸相互作用的药物。即使是本发明的核酸纳米粒子包被片基，由于其具有具有确定的纳米结构特征及纳米性质特征，与第 20030207296 号美国专利申请中的核酸纳米粒子包被片基不相同。

根据本发明第三方面的纳米结构活性载体可以为活性纳米粒子与固相载体的复合物，其中所述活性纳米粒子包含纳米粒子和固定于其上的一种或多种所述活性试剂或任选存在的连接剂，所述纳米粒子粒径为 1一 500nm、优选 1一 100讓、更优选 l—50nm，所述固相载体为常规固相载体或权利要求 1一 14之一所述纳米结构载体。本发明活性纳米粒子 /片基复合物可以通过多种方法获得，但本发明活性纳米粒子 /片基复合物的制备方法为本发明的优选制备方法。

在根据本发明第三方面的纳米结构活性载体中，所述纳米粒子包括根据本发明第一方面的纳米粒子，优选方案为所述无机非磁性非金属纳米粒子及其所述衍生物。而在美国专利 6025202和 PCT国际专利申请 PCT/US96/04485 (及 CN96193700.9) 中，除了其结构特征与本发明纳米结构活性载体结构特征不同外，本发明纳米结构活性载体的优选方案包括不含金属表面和金属纳米粒子的纳米结构活性载体。而美国专利 US6025202中纳米结构表面涂布金属， PCT国际专利申请 PCT/US96/04485 (及 CN96193700.9)中使用胶体金（胶体金固定在有机膜上、有机膜固定在片基上）。本发明纳米结构活性载体制作更简便、成本更低廉。

根据本发明第三方面的纳米结构活性载体包括选自于以下组中的复合物之一：活性纳米粒子 /片基复合物、活性纳米粒子 /微米粒子复合物、活性纳米粒子 /纳米结构片基复合物、活性纳米粒子 /纳米结构微米粒子复合物、及它们的组合物。

根据本发明第三方面的纳米结构活性载体可以为活性试剂与根据本发明第一方面的纳米结构载体的复合物。

根据本发明第三方面的纳米结构活性载体包括选自于以下组中的复合物之一：活性试剂 /纳米结构片基复合物、活性试剂 /纳米结构微米粒子复合物、及它们的组合物。所述活性纳米粒子 /片基复合物可以通过多种方法获得，但本发明纳米粒子 /片基复合物的制备为本发明的优选制备方法。

在根据本发明第三方面的纳米结构活性载体中，一种或多种纳米粒子与固相载体之间有一重或多重配基、或 /和一种或多种配基与固相载体之间有一重或多重纳米粒子、或 /和所述至少一重纳米粒子与另一重纳米粒子之间有一重或多重配基。一种或多种纳米粒子与载体之间有多重配基的纳米结构活性载体例如是如下制备的：分别将载体包被一重配基 1形成配基 1包被载体，并将纳米粒子包被一重另一种配基 2 (配基 1和 2之间可发生配对反应）形成配基 2/纳米粒子复合物，再将配基 2/纳米粒子复合物包被或点样至配基 1包被载体上，形成配基 2 一纳米粒子一配基 2—配基 1一载体形式的复合物。当配基层数大于 2时以此类推。一重纳米粒子与另一层纳米粒子之间有多重配基的纳米结构活性载体有很多种类，例如配基 3—纳米粒子一配基 3—配基 2—纳米粒子一配基 2—配基 1一载体或配基 2—纳米粒子—配基 2—配基 1一纳米粒子一配基 1一载体等。一种或多种配基与载体之间有多重纳米粒子的纳米结构活性载体可如下制备：先将一种或一种以上所述纳米粒子与多种所述配基结合在一起形成多种活性纳米粒子 (例如配基 2—纳米粒子一配基 2、配基 3—纳米粒子一配基 2、配基 1一纳米粒子一配基 1等），再将这些活性纳米粒子先后或同时结合在所述载体上，形成诸如配基 2—纳米粒子一配基 2—配基 1一纳米粒子一配基 1一载体、配基 3—纳米粒子一配基 2—配基 1一纳考粒子一配基 1一载体等形式的纳米结构活性载体。

根据本发明第三方面的纳米结构活性载体可以作为纳米结构分析芯片。另外，其还可作为纳米结构酶标板、纳米结构平面层析试剂条、及包括纳米结构层析活性凝胶在内的纳米结构活性分离固定相。

根据本发明的第四方面，其提供一种制备根据本发明第二方面的纳米结构活性载体的方法，其包括将所述活性纳米粒子的悬浮液与所述常规固相载体接触并进行固定化反应，而且：固定化反应时所¾悬浮液中的纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml)为五百分之一至十五万分之一，或纳米粒子摩尔浓度为 0.12— 37.4 nM;所述接触为表面直径小于 0.5mm的点接触或表面直径大于 0.5mm的面接触。本发明活性纳米粒子与固相载体的复合物的一个形成例子是：纳米粒子悬浮液与配基溶液混合反应后形成活性纳米粒子、通过点样将混合液点至芯片基片片基上进行结合反应等。

本发明所述的载体也可以是以与其它结构共存的方式被准备，例如多片基池基片中的片基等。所述活性纳米粒子可以是纳米粒子和配基以与其它物质的混合物的方式被准备，例如含有着色剂或 /和粘结剂的纳米粒子悬浮液、含有稳定剂的配基溶液等。所述活性纳米粒子悬浮液包括混合物（例如纳米粒子与配基混合反应后的未纯化物）和纯化物（例如纳米粒子与配基混合反应后结离心分离去除自由配基的纯化物），而且其纯化物中一种纳米粒子上固定一种或多种配基。需要特别强调的是，当纳米粒子不够稀释或过分稀释时，利用某些纳米粒子制备的所述复合物观察不到灵敏度的提高。

在根据本发明第四方面的方法中，所述纳米粒子的重量 /体积浓度（g/ml) 为五千分之一至十五万分之一，或纳米粒子摩尔浓度为 0.12— 3.74 nM。优选地所述纳米粒子的重量 /体积浓度（g/ml) 为二万分之一至六万分之一，或纳米粒子摩尔浓度为 0.31— 0.93 nM。

根据本发明第四方面的方法还包括对所述固定化反应后的产物进行化学交联处理。另外，该方法还可包括对所述固定化反应后的产物进行热处理，所述热处理包括在任选存在的活性试剂保护剂保护下在 30°C以上、优选 37。C以上但固相载体的软化温度以下加温然后冷却。所述活性试剂保护剂包括下述之一种或多种保护剂：氨基酸、蛋白质及糖类。

根据本发明的第五方面，其提供一种分析或 /和分离装置，其含有根据本发明第一方面的纳米结构载体或 /和根据本发明第三方面的纳米结构活性载体。其包括用于多肽分析、核酸分析、或 /和药物分析的装置。根据本发明的纳米结构活性载体可以作为分析芯片、酶标板、平面层析试剂条、及层析凝胶，或它们的组成装置。

根据第五方面的装置包括以下分析芯片之一：微阵列芯片、微阵列一流路芯片及流路芯片，其中所述流路包括含所述纳米结构载体的纳米结构流路、或 /和含所述纳米结构活性载体的纳米结构活性流路。本发明的分析芯片是本发明的重点。

本发明的分析芯片之一是含流路的芯片。目前，最广泛研究的反应器流路结构和反应器分离结构为微流路，或微流路。微流路尺寸通常为：宽度小于 0.10 mm，深度小于 0.025■。因而现有微流路实际上是一种凹流路。含有微流路的芯片被称作微流路芯片，即以微流路为网络连接微泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件等集采样、前处理、液体输送等分析功能集成于一体的微全分析系统。微流体芯片每一个反应器中通常只固定一种配基，一次检测样品中的一个目标物。微流路芯片的一个例子是 Caliper Technologies Inc.公司（www.caliper.com)的检测用芯片。微流路芯片的优点是灵敏度高、速度快。其缺点是： 1 )生产过程中需先刻蚀出微流路，点上探针，然后再进行微流路密封制作，其构造复杂，工业化生产难度非常大； 2)检测时液体流速需用专门精密设备控制，例如电渗透装置，等; 3)反应完成后，由于固定的探针分子在其内表面，对于某些检测例如荧光标记物检测，不能直接使用普通芯片扫描仪读取结果。尽管目前有非常多的微流路方案 (如第 98805243.1、 98813487.X和 98813488.8中国专利申请;第 878437、 801390 和 090840号美国专利)，易制作、低成本的流路结构仍是芯片开发的热门课题之一。本发明的流路是通过在固相载体上固定纳米结构或 /和活性纳米结构而形成的，例如将纳米粒子或 /和活性纳米粒子在芯片片基流路位置上形成涂层。其尺寸是容易控别变化的，例如可形成微流路，也可形成较宽的流路。其输运流动相的能力，也容易根据需要通过对纳米粒子改性来实现。此外，其制作成本是很低的。

根据第五方面的装置包括以下装置之一：酶标板、平面层析试剂条、及包括层析柱在内的含分离固定相的装置。

根据本发明的第六方面，其提供一种定量或 /和定性分析标记系统，该系统含标记物，且至少一种标记物为标记标记活性试剂 /纳米结构 /分子标记物质复合物，所述纳米结构包括纳米粒子或 /和由纳米粒子组成的结构，且所述纳米粒子为粒径 1一 100 nm且本身不是标记物质增强剂的非磁性无机非金属粒子。本发明配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物为混合物或纯化物，纯化物含有一种或多种分子标记物质、一种或多种纳米粒子、一种或多种标记活性试剂以及任选的封闭剂。本发明标记物可标记的目标物较广泛，例如：肽及与多肽相互作用的药物、等等。本发明标记物也可标记核酸及与核酸相互作用的药物。本发明中的标记活性试剂为用于与目标物结合从而实现对目标物标记的试剂，例如抗原、抗体、单链或多链 DNA、 RNA、核苷酸、以及病毒、细胞或它们的组成等。在此方面中，本发明的配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物不同于配基一纳米粒子复合物，例如不含纳米载体的配基一粒子配基（第 02137418.X、 02115771.5 和 01133527.0号中国专利申请）、配基一纳米磁性粒子（第 02103867.8号中国专利申请）等。因为，本发明复合物中，标记物质是分子标记物质（例如罗丹明）而不是纳米粒子，而纳米粒子不是标记物质而是载体。载体可以用作保持标记活性试剂的某些活性位点的手段之一。本发明的配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物，也不同于配基一微球一荧光粒子复合物（第 02121391.7号中国专利申请）、分子标记物质一微粒配基（第 0211411903号中国专利申请）。因为，本发明复合物中的载体是纳米粒子（例如 40 nm的纳米氧化硅）而不是尺寸较大的微球或微粒，纳米粒子通常具有高得多的可分散性、甚至结合活性。

在上述标记系统中，活性试剂 /纳米结构 /分子标记物质复合物的制备方法较多，例如：将所述一种或多种配基、一种或多种纳米粒子、以及一种或多种所述分子标记物质按下列之一种方式结合：将所述配基与所述纳米粒子结合再与所述分子标记物质结合、将所述纳米粒子与所述分子标记物质结合再与所述配基结合、将所述配基与所述分子标记物质结合再与所述纳米粒子结合、将所述配基与所述分子标记物质和所述纳米粒子同时结合、及基于这些方式的组合。本发明的复合物的制备方法简单、制备物水溶性好且灵敏度高。

在根据本发明第六方面的标记系统中，所述非磁性无机非金属粒子包括在根据本发明第一方面的纳米结构载体中所述的非磁性无机非金属粒子。根据本发明的标记系统中，所述复合物中包含的非磁性无机非金属纳米粒子包括尺寸 1 - 100 亂优选 1一 50nm的氧化物粒子及其衍生物，所述氧化物粒子包括氧化硅、氧化钛、氧化铝，所述衍生物包括表面含衍生基团或 /和包被功能有机物的衍生物。所述衍生基团包括下述一种或多种基团：氨基、醛基、环氧基、氨基肼、二乙氨基乙基、二乙基一 (2—羟丙基)氨乙基、羧甲基、磺酸丙基、巯乙基吡啶基、硅氧烷基、硫醇基、烷基；所述功能有机物包括下述一种或多种有机物：包括聚乙烯吡咯烷酮、吐温类表面活性剂在内的表面活性剂，包括聚氨基酸在内的聚电解质，包括聚硅氧垸在内的亲油有机物，包括葡聚糖衍生物、琼脂糖衍生物、纤维素衍生物、聚丙烯酰胺在内的离子交换聚合物，和包括肝素钠在内的活性物质；其中所述微载体包被衍生物中的微载体包括所述纳米粒子。

在根据本发明第六方面的标记系统中，所述分子标记物质包括下述一种或多种物质：荧光物质、化学发光物质、化学发光催化剂、有色金属盐、染料和颜料，例如，下述物质之一种或多种：荧光素、罗丹明、海藻蛋白、银盐、酶、碱性黑、碱性紫、胺基黑、考马斯亮蓝、结晶紫、等等。

根据本发明的第七方面，其提供一种定量或 /和定性分析方法，其中包括使用根据本发明第五方面的分析或 /和分离装置来捕捉或 /和输运或 /和分离样品目标物，及使用根据本发明第六方面的定量或 /和定性分析标记系统进行标记。此一方法至少包括：利用所述纳米结构载体活固定目标物和利用所述配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物标记目标物；或 /和，利用所述纳米结构流路、或 /和活性纳米结构流路对反应介质进行输运、或 /和分离。固定和标记目标物可通过至少 2种方式来进行：将样品中的可能存在的所述目标物固定在所述装置中，然后将所述标记物用于标记结合到所述纳米结构活性载体上的目标物；或，将样品中的可能存在的所述目标物与所述标记物结合，然后将结合产物固定在所述装置中。此外，本发明的分析方法的一些实施例中，与上述制备纳米结构活性载体方法中观察的纳米粒子的影响完全不同的是，检测灵敏度可以是随所述标记活性试剂 /纳米结构 /分子标记物质复合物是随纳米粒子浓度升高而升高的，因而所用标记活性试剂 /纳米结构 /分子标记物质复合物中纳米粒子的重量 /体积浓度 ( g/ml)大于三万分之一、优选大于千分之一、更优选大于百分之一，或者：纳米粒子的摩尔浓度大于 0.25nM、优选大于 7.48 nM、更优选大于 74.8 nM。

根据本发明的第八方面，其提供一种定量或 /和定性检测试剂盒，其包含根据本发明第五方面的分析或 /和分离装置或装置和根据本发明第六方面的定量或 /和定性分析标记系统。这些物质的详细描述都可参考以上段落。

根据第八方面的试剂盒可为用于多肽或 /和与多肽相关的药物分析的试剂盒，包括多肽分析芯片试剂盒、多肽分析酶标试剂盒、或多肽分析平面层析试剂盒，并优选为用于核酸或 /和与核酸相关的药物分析的试剂盒。

根据本发明的第九方面，其提供一种定量或 /和定性分析方法，其中包括使用根据本发明第五方面的分析或 /和分离装置来捕捉或 /和输运或 /和分离样品目标物。此一方法至少包括：利用所述纳米结构载体活固定目标物；或 /和，利用所述纳米结构流路、或 /和活性纳米结构流路对反应介质进行输运、或 /和分离。固定目标物可通过至少 2种方式来进行:将样品中的可能存在的所述目标物固定在所述装置中；或，将样品中的可能存在的所述目标物与标记物结合，然后将结合产物固定在所述装置中。

根据本发明的第十方面，其提供一种定量或 /和定性检测试剂盒，其包含根据本发明第五方面的分析或 /和分离装置。这些装置的详细描述都可参^"以上段落。

根据本发明第十方面的试剂盒可以是用于多肽或 /和与多肽相关的药物分析的试剂盒，包括多肽分析芯片试剂盒、多肽分析酶标试剂盒、或多肽分析平面层析试剂盒，优选为用于核酸或 /和与核酸相关的药物分析的试剂盒。

根据本发明的第十一方面，其提供一种定量或 /和定性分析方法，其中包括使用根据本发明的第六方面的定量或 /和定性分析标记系统进行标记。该方法至少包括将所述标记物用于标记被活性载体捕获的所述目标物，或将所述标记物加于样品中标记可能存在的所述目标物。此外，在本发明的分析方法的一些实施例中，与上述制备纳米结构活性载体方法中观察的纳米粒子的影响完全不同的是，检测灵敏度可以是随所述标记活性试剂 /纳米结构 /分子标记物质复合物是随纳米粒子浓度升高而升高的，因而所用标记活性试剂 /纳米结构 /分子标记物质复合物中纳米粒子的重量 /体积浓度（g/ml) 大于三万分之一、优选大于千分之一、更优选大于百分之一，或者：纳米粒子的摩尔浓度大于 0.25nM、优选大于 7.48 nM、更优选大于 74.8 nM。

根据本发明的第十二方面，其提供一种定量或 /和定性检测试剂盒，其包含根据本发明第六方面的定量或 /和定性分析标记系统。这些标记系统的详细描述都可参考以上段落。

根据本发明第十二方面的试剂盒可以是用于多肽或 /和与多肽相关的药物分析的试剂盒，包括多肽分析芯片试剂盒、多肽分析酶标试剂盒、或多肽分析平面层析试剂盒，优选为用于核酸或 /和与核酸相关的药物分析的试剂盒。

根据本发明的第十三方面，其提供一种芯片检测方法，该方法至少包括以下步骤-

(a)准备样品、芯片及芯片标记系统，所述样品可能含有目标物，所述芯片包含固定化活性试剂阵列 , 所述芯片标记系统包含标记物、着色剂、和任选存在的着色控制剂及着色定型剂，且所述标记物包含标记活性试剂 /纳米结构 / 催化剂复合物，其中所述纳米结构包括纳米粒子或 /和由纳米粒子组成的结构，所述纳米粒子为粒径 1― 100 nm的无机纳米粒子或 /和有机纳米粒子或 /和它们的衍生物，所述无机纳米粒子包括非磁性无机纳米粒子和磁性无机纳米粒子，所述非磁性无机纳米粒子包括非磁性金属纳米粒子和非磁性非金属纳米粒子，所述衍生物包括结合有表面基团或 /和包被有机物的衍生物；

(b)用所述固定化活性试剂固定所述目标物，然后通过所述目标物与所述标记物中的标记活性试剂反应，固定所述标记物中的纳米结构及其上的催化剂；或

(c)使所述目标物结合在所述全部或部分标记物上，然后通过所述目标物与所述固定化活性试剂反应，固定所述标记物中的纳米结构及其上的催化剂；

(d)加入所述着色剂并在所述催化剂作用下、在所述纳米结构上而不是在所述固定化活性试剂与所述目标物的结合处进行着色反应，所述可见光着色反应中还包括任选地使用着色控制剂及定型剂；

(e)对步骤（d) 中着色反应的结果、及步骤（b) 或（c) 中着色剂的着色结果进行检测、分析。

本发明方法的技术方案不同于 CN1351712T。后者在标记活性试剂一被捕获目标物结合处进行催化反应，很难控制反应速度。本发明的方法，在与被捕获目标物结合的纳米结构上进行催化反应，容易通过控制纳米结构参数（标记活性试剂量、催化剂量、纳米粒子尺寸等）及其特异性（更易分离等）来控制反应速度。其结果是，本发明的方法具有更快的目标物一标记物反应时间和更高的捡测特异性。

在根据第十三方面的方法中，所述标记物中还含有染色剂，在所述着色反应前、反应中、或 /和反应后还进行染色反应，其中所述染色剂存在于下述之一种或多种标记物中：标记活性试剂 /纳米结构 /催化剂 /染色剂复合物、标记活性试剂 /纳米结构 /染色剂复合物、及标记活性试剂 /染色剂复合物，其中所述纳米结构可为根据本发明以上方面所述的纳米结构。本发明的方法的一个优选方案是，既着色又染色，以获得高的灵敏度和更高的特异性。

在根据第十三方面的方法中，所述标记系统中的所述纳米粒子包括在根据本发明第一方面的纳米结构载体中所述的纳米粒子。

在根据第十三方面的方法中，所述催化剂包括金属化合物还原反应的金催化剂或 /和酶催化剂，所述染色剂包括染料，所述着色剂包括金属化合物。

根据本发明的第十四方面，其提供一种芯片检测方法，该方法至少包括以下步骤：

(a)准备样品、芯片及芯片标记系统，所述样品可能含有目标物，所述芯片包含固定化活性试剂阵列，所述芯片标记系统包含标记物、着色剂、和任选存在的着色控制剂及着色定型剂，且所述标记物包含活性试剂、催化剂、染色剂及任选存在的纳米结构，其中所述纳米结构、染色剂、催化剂、着色剂分别为本发明以上方面所述的芯片标记系统中所述纳米结构、染色剂、催化剂、着色剂；

(b )在所述芯片中加入所述样品，在所述固定化活性试剂与可能存在的所述目标物反应后加入所述标记物和着色剂，并对所述反应处进行染色和着色；或

( c)将所述样品与所述全部或部分标记物混合，在所述标记活性试剂与可能存在的所述目标物反应后加入所述芯片中，在所述固定化活性试剂与可能存在的所述目标物反应后加入所述着色剂，并对芯片中所述反应处进行染色和着色；

( d)对在步骤（b) 或（c) 中染色和着色的结果进行检测、分析。

根据本发明的第十五方面，其提供一种芯片试剂盒，其包含标记系统，其中至少一个所述标记系统为根据本发明以上方面所述的标记系统。这些物质的详细描述都可参考以上段落。

根据本发明第十五方面的试剂盒可以是用于多肽或 /和多肽相关药物分析的试剂盒，优选为用于核酸或 /和核酸相关药物分析的试剂盒。

根据本发明的第十六方面，其提供一种多肽分析的分析芯片检测方法，该方法至少包括下述之一个步骤：

(a)将样品与磁纳米粒子混合；

(b )将样品与活性试剂 /磁纳米粒子复合物混合；

( c )将样品与芯片接触并反应，反应时可任选存在外加磁场，所述芯片为纳米结构芯片，且其中所述纳米结构包含磁纳米粒子；

( d) 将标记活性试剂 /磁纳米粒子 /分子标记物质复合物用于标记反应，在标记时可任选存在外加磁场，所述活性试剂 /磁纳米粒子 /分子标记物质复合物含有一种或多种分子标记物质、一种或多种磁纳米粒子、 .一种或多种活性试剂以及任选存在的封闭剂的混合物或纯化物；

其中:所述磁纳米粒子在三维空间中至少有一维为 1一 200皿 1、优选 1— 100 讓、更优选 1一 50讓，且其本身不是分子标记物质增强剂的磁粒子及其衍生物; 所述活性试剂选自以下组中能与多肽作用的物质：多肽、多糖、维生素、抗生素、病毒、细胞、及功能有机物，所述活性试剂 /磁纳米粒子 /分子标记物质复合物在标记时的磁纳米粒子浓度为：纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml)大于三万分之一、或纳米粒子摩尔浓度大于 0.25nM，优选为纳米粒子重量 /体积浓度 (g/ml)大于三千分之一、或纳米粒子摩尔浓度大于 2.4nM，更优选为纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml) 大于五百分之一、或纳米粒子摩尔浓度大于 15.0nM。

在根据第十六方面的方法中，所述磁粒子选自于包括四氧化三铁、三氧化二铁在内的铁氧体及其衍生物，所述衍生物包括表面含衍生基团的表面修饰或 / 和功能有机物包被衍生物。

在根据第十六方面的方法中，所述外加磁场是脉冲式的。

根据本发明的第十七方面，其提供一种多肽分析芯片试剂盒，其包含根据本发明以上方面所述的磁纳米粒子。这些物质的详细描述都可参考以上段落。在该试剂盒，所述磁纳米粒子单独使用用以产生反应介质混合，所述配基 /磁纳米粒子用以浓缩样品目标物，所述配基 /磁纳米粒子 /分子标记物质复合物用以标记反应。该其包括使用根据本发明第五方面的分离装置。

本发明的用于分离或 /和分析的纳米结构载体的优点是：制作简便成本低、吸附性好。

本发明制备纳米结构载体的制备方法的优点是：简便有效成本低、不需加热至固相载体软化点（固相载体变化更小）即可获得稳定的具有确定的纳米结构特征的纳米结构载体。

本发明的用于分离或 /和分析的纳米结构活性载体的优点是：灵敏度高、制作简便成本低、反应效率高、反应速度高。

本发明的制备纳米结构活性载体的方法的优点是：适应性强、简便有效成本低、不需加热至固相载体软化点（固相载体变化更小）即可获得稳定的具有确定的纳米结构特征的纳米结构活性载体。本发明的分析或 /和分离装置的优点是：灵敏度高、制作简便成本低、反应效率高、反应速度高。

本发明的定量或 /和定性分析标记系统的优点是：反应效率高、制作简便。本发明的检测方法 (其中使用纳米结构活性载体和配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物）的优点是：既利用纳米结构活性载体捕捉样品中的目标多肽，又利用配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物进行标记，大大提高了检测灵敏度或 / 和大大提高了检测速度。

本发明的检测试剂盒 (其中含纳米结构活性载体和配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物）的优点是：集中了纳米结构活性载体和配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物的优点、灵敏度很高、检测速度很高、制作简便。

本发明的检测方法（其中使用纳米结构活性载体）的优点是：灵敏度高、检测速度高、制作简便。

本发明的检测试剂盒（其中含纳米结构活性载体）的优点是：灵敏度高、检测速度高、制作简便。

本发明的检测方法（其中使用配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物）的优点是：提高了检测灵敏度或 /和提高了检测速度。

本发明的检测试剂盒（其中含配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物）的优点是：提高了检测灵敏度或 /和提高了检测速度。

本发明的芯片检测方法（其中含配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物）的优点是：提高了检测灵敏度或 /和提高了检测速度。

本发明的芯片检测方法（其中使用标记活性试剂 /纳米结构 /催化剂复合物）的优点是：提高了检测灵敏度、检测速度和检测特异性。

本发明的芯片试剂盒（其中含标记活性试剂 /纳米结构 /催化剂复合物）的优点是：提高了检测灵敏度、检测速度和检测特异性。

本发明的芯片检测方法（其中使用包含活性试剂、催化剂、染色剂的标记物）的优点是：提高了检测灵敏度和检测特异性。

本发明的芯片试剂盒（其中含包含活性试剂、催化剂、染色剂的标记物）的优点是：提高了检测灵敏度和检测特异性。

本发明的芯片试剂盒（其中含纳米结构活性载体和 /或配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物）的优点是：提高了检测灵敏度或 /和提高了检测速度。

本发明的多肽分析的分析芯片检测方法（其 ·中使用磁纳米结构）的优点是：提高了检测灵敏度或 /和提高了检测速度。本发明的多肽分析芯片试剂盒（其中含磁纳米结构）的优点是：提高了检测灵敏度或 /和提高了检测速度。

本发明的分离方法的优点是：高吸附率、高分辨率。附图说明

图 1是一种纳米结构载体的 DFM平面图。

图 2A和 2B分别是一种纳米结构活性载体的 DFM平面图和立体图。

需要说明的是，这些图只给出本发明的纳米结构载体和纳米结构活性载体的多种 DFM图中的一种 , 不可视为代表本发明的其它纳米结构载体和纳米结构活性载体。具体实施方式

术语定义

本发明术语 "检测装置"是指定量或 /和定性检测过程中所用的包含有用以同样品目标物作用的配基的用品，例如含有捕获配基的仪器、耗材和含有捕获配基和标记配基的标记试剂盒。例子有分析芯片、酶标板、亲和电泳条、亲和层析柱、平面层析试剂条、分析芯片试剂盒、酶标板试剂盒、亲和电泳试剂盒、等等。定量或 /和定性检测过程可以在体外进行、也可以在体内进行。

本发明术语"分离装置"是指分离过程中所用的包含有具有分离功能的物质的分离用品。分离过程是通过分离方法获得样品的全部或部分组分的过程，分离装置的例子可举层析装置，具有分离功能的物质的例子有层析载体等。

本发明术语 "配基 /磁纳米粒子 /固相载体"是指一种至少包含有配基、磁纳米粒子、和载体的复合物，其中配基、磁纳米粒子、载体间的结合可以有不同的形式，包括直接结合和间接结合。

本发明术语"活性试剂"是指用以通过相互作用（包括亲和作用、离子交换、亲油作用、等等）捕获目标物的物质，包括配基（相当于英语中的 Ligand) 和离子交换剂，例如：二乙氨乙基（DEAE)、二乙基一（2—羟丙基）氨乙基（QAE)、羧甲基（CM)、磺酸丙基（SP)、巯乙基吡啶基（MEP)、 -NR³\ — RCOOH、硅氧烷基、硫醇基、烷基、抗原、抗体、配体、配体指数增强系统进化技术筛选的适配分子、配基、多肽、多糖、共酶、辅因子、抗生素、类固醇、病毒、细胞等。

本发明术语 "标记活性试剂"是指包含于标记物中、通过其与目标物相互作用（包括亲和作用、离子交换、亲油作用、等等）实现对目标物标记的物质，包括配基（相当于英语中的 Ligand) ，例如：抗原、抗体、配体、配体指数增强系统进化技术筛选的适配分子、配基、多肽、多糖、共酶、辅因子、抗生素、类固醇、病毒、细胞等。

本发明术语 "多肽''相当于英语中的 "polypeptide"，包括天然或合成蛋白质、蛋白质片断、合成肽、等等，免疫检测中通常的目标物和检测中通用的配基、例如抗原、抗体、等等都属于多肽。

本发明术语 "纳米粒子"是指在三维空间中至少有一维小于 500 nm、优选小于 100 nm、更优选小于 50 nm的固相载体粒子。

本发明术语"固相载体"，本发明的固相载体包括常规载体和纳米结构载体，其中所述常规载体为表面未固定有所述纳米结构的固相载体，所述纳米结构载体为固定有所述纳米结构的固相载体。所述固相载体包括面状载体（例如生物芯片、酶标板等的片基）、粒状载体（例如层析凝胶、特别是微米粒子层析凝胶）和膜状载体（例如平面层析条）。

本发明术语 "片基"是指其具有固定功能的一面具有宏观平面的固相载体，例如：分析芯片片基、酶标板片基、电泳胶片、平面层析载体等。

本发明术语 "配基 /纳米粒子 /片基复合物"是指包含有配基、纳米粒子、片基的一种复合组成，其中配基、纳米粒子、片基间的结合可以有不同的形式，例如：配基一纳米粒子一片基、配基一纳米粒子一配基一片基、配基一纳米粒子一配基一纳米粒子一片基、配基一纳米粒子一配基一纳米粒子一配基一片基等。

本发明术语 "活性纳米粒子"，是指活性试剂与纳米粒子通过共价或 /和非共价结合形成的复合物。

本发明术语 "反应器"是指其中固定有活性载体与目标分子发生特异性反应的场所及与其连通的其它相关结构，例如开放式多反应器生物芯片中的反应池和相关的隔离结构和进出液结构等、 96孔酶标板中的孔、快速检测试剂盒的试剂条等。

本发明术语 "基片 "是指以片基为基础的、结合有无其它结构（例如隔离结构）的用以在固定配基后形成芯片的产品。基片上可以有一个或多个片基池。单片基池基片上通常没有隔离结构，此时基片既是片基 (例如市售的氨基玻片）。多片基池基片上有隔离结构，此时基片包括片基和隔离结构。片基池在固定上配基后形成反应器，多片基池片基形成多反应器芯片。片基是用以固定配基及其它助剂（假如有的话）的片基，其表面化学性质和光学性质是影响芯片性能及成本的重要因素。

本发明术语 "片基池"是指片基与其隔离结构形成的结构。

本发明术语 "分析芯片"简称为 "芯片"，包括但不限于英语中的 Bio_Chip、 Microarray、 Bioarray，是指定性和 /或定量分析中的一种检测装置，其反应器中微量配基同样品中的目标分子发生特异反应的结果可以以可寻址的方式进行识别。芯片的核心是其中的反应器，反应器的核心是其中的芯片片基和固定在芯片片基上的配基。芯片包括微流路芯片（相当于英语中的 MicroChannel Biochip) 和微阵列芯片（相当于英语中的 Biochip、 Microarray, Bioarray) ，但众所周知不包括现有的快检试剂条。本发明的芯片含有单反应器或多反应器且有无标记系统，反应器中配基在片基上的分布密度大于 10点 /cm²、优选方案大于 20点 /cm²,且每个配基点的面积不大于 1 mm²。生物芯片由于其高通量和微型化特点，有着广泛的应用范围，包括基因表达检测、基因筛选、药物筛选、疾病诊断治疗、环境监测和治理、司法鉴定等领域。灵敏度和特异性是生物芯片检测的二个主要质量指标，而载体、特别是活性载体是决定灵敏度和特异性的关键之一。

本发明中，术语 "纳米结构芯片"为至少含有一个本发明所述纳米结构活性区（例如探针微阵列中的一个样点）。一个芯片可以有多个反应器，一个反应器可以有多个含活性试剂的样点（探针点），只要其中有一个样点为本发明的纳米结构活性区，则芯片为本发明的纳米结构活性载体或纳米结构芯片。

本发明术语 "层析 "相当于英语 "Chromatography", 包括亲和层析、反相层析、疏水层析、离子交换层析、等等，其分为平面层析（例如快检试剂条和快检试剂盒）和柱层析等。

本发明术语 "分子标记物质"是指用以形成或参与形成检出信号、并在标记时具有分子形态的物质，例如芯片检测常用标记物中的罗丹明、 CY3、 CY5等。

本发明术语 "纳米结构"是指具有纳米尺寸且反应出部分或全部纳米效应 (例如表面效应、尺寸效应等）的结构。

本发明术语 "凸出距离"是指上述凸体沿其顶部至其底部的距离。

本发明术语 "凸出半距处横断面"是指上述凸体在其凸出距离一半处垂直于这一距离的面。

本发明术语 "单活性载体"是指只固定有一种上述活性试剂的活性载体。本发明术语 "多活性载体"是指固定有一种以上的多种上述活性试剂的活性载体。本发明术语 "纳米粒子摩尔浓度" 是指将纳米粒子作为分子的摩尔浓度，反映的是单位体积液体中纳米粒子的数目。本发明中的纳米粒子摩尔浓度是以本发明实施例中所用纳米粒子的重量 /体积浓度（g/ml) (w/v) (即单位体积中纳米粒子的总重量），是目前供货商通用的浓度，根据其平均半径及比重，再按公知的摩尔浓度一重量 /体积浓度（g/ml)的实算关系计算出来的。所用 nM 的含义为纳摩尔。

以下将通过实施例更为详细地说明本发明。实施例

在以下实施例使用的纳米粒子及其衍生物如以下表 1所示。表 1

在以下实施例中使用的活性试剂如下表 2所示。表 1

活性试剂种类来源

EBV— VCA—P18抗原合成肽自制 *

丙肝病毒抗原（HCV AG) 蛋白质北京大学人民医院肝病研究所爱滋病毒抗原（HIV AG) 蛋白质北京大学人民医院肝病研究所梅毒抗原蛋白质北京大学人民医院肝病研究所抗乙肝病毒表面抗体（HBS Ab ) 蛋白质北京大学人民医院肝病研究所 * 制作方法参考： Tranchand— Bunel, D.， Auriault, C, Diesis, E.， Gras— Masse, H. (1998) Detection of human antibodies using "convergent" combinatorial peptide libraries or "mixotopes"designed form a nonvariable antigen: Application to the EBV viral capsid antigen pi 8， J. Peptide Res. 52, 1998, 495— 508。在以下实施例中所用的片基和微米颗粒如下表 3所示。表 3

*：制作方法参考 Melnyk 0等， Peptide arrays for highly sensitive and special antibody― binding fluorescence arrays, Bioconjug Chem. 13： 713一 20.2002。

**：制作方法参考第 03135618.4号中国专利申请实施例 1 : 纳米粒子衍生物的制备方法

本实施例所制备的纳米粒子衍生物为用功能高分子包被的衍生物，所用纳米粒子包括在表 1 中的纳米粒子 (所述纳米粒子均为非晶纳米粒子) ，所用的功能高分子列于下表 2中，包括聚离子型有机物（聚赖氨酸）、离子型衍生高聚物（DEAE—葡聚糖、 QAE—纤维素、氨基肼一聚赖氨酸）、高分子表面活性剂 (聚乙烯吡咯垸酮) 。

有机物包被纳米粒子的制备方法要点为：将纳米粒子在超声振荡下分散配制成不同浓度 (w/v) 的纳米粒子液，再与等体积的浓度为 1/12500 (w/v) 的有机物溶液混合，在超声振荡下在 37°C反应 1小时。反应产物滴入装有凝胶的旋转管，在 4000 ipm/min条件下离心，取收集管液体备用（在所有条件优化后，也可以略去离心分离步骤）。

本实施例制备的纳米粒子包被衍生物的部分例子列于下表 4中。

实施例 2: 活性纳米粒子的制备方法

本实施例所制备的活性纳米粒子，所用纳米粒子包括选自于表 1中的纳米粒子及实施例 1制备的纳米粒子衍生物，所用活性试剂选自于表 2中的配基。本实施例活性纳米粒子制备方法包括以下步骤：将纳米粒子或纳米粒子多聚物在超声振荡下分散配制成浓度 1/6250— 1/25000 (w/v) 的纳米粒子液，再将浓度为 1一 2 mg/ml的配基溶液分别与其作 1 : 1混合，在室温下反应 1小时。如需纯化，纯化方法为：将产物滴入装有凝胶的旋转管，在 4000 rpm/min条件下离心，取收集管中的液体。利用其它纳米粒子和 /或其它活性试剂制备活性纳米粒子，也可以使用相同方法。本实施例所获部分活性纳米粒子的部分例子见表 5。表 5

活性纳米粒子纳米粒子活性试剂（配基）

EBV抗原 -STN-3 氧化硅纳米粒子（STN-3) EBV-VCA-P18抗原丙肝病毒抗原 (HCV AG)-STN-3 氧化硅纳米粒子（STO-3) 丙肝病毒抗原 (HCV AG) 爱滋病毒抗原 (HIV AG)-STO-3 氧化硅纳米粒子 ( ST -3) 爱滋病毒抗原 (HIV AG)

HBs抗原 -STN-3 氧化硅纳米粒子（STN-3 ) HBs抗原

EBV抗原 -LuDOX 氧化硅（LuDOX As-40) EBV-VCA-P18抗原丙肝病毒抗原 (HCV AG)-LuDOX 氧化硅（LuDOX As-40) 丙肝病毒抗原 (HCV AG) 爱滋病毒抗原 (HIV AG)-LuDOX 氧化硅（LuDOX As-40) 爱滋病毒抗原 (HIV AG)

HBs抗原 -LuDOX 氧化硅（LuDOX As-40) HBs抗原

HBs抗体 -LuDOX 氧化硅（LuDOX As-40) HBs抗体

丙肝病毒抗原 (HCV AG 氧化钛氧化钛纳米粒子丙肝病毒抗原 (HCV AG) 爱滋病毒抗原 OilV AG)-氧化钛氧化钛纳米粒子爱滋病毒抗原 (HIV AG) 丙肝病毒抗原 (HCV AG)-CDS7 疏水硅纳米粒子 (CDS7) 丙肝病毒抗原 (HCV AG) 爱滋病毒抗原 (HIV AG)-CDS7 疏水納米粒子（CDS7) 爱滋病毒抗原 (HIV AG)

EBV抗原-胶体金胶体金 EBV VCA-P18抗原

EBV原 -胺基胶体金胺基胶体金 EBV VCA-P18抗原丙肝病毒抗原 (HCV AG)-DEAE粒子 DEAE-葡聚糖包被纳米粒子丙肝病毒抗原 (HCV AG) 爱滋病毒抗原 (HIV AG)-DEAE粒子 DEAE-葡聚糖包被纳米粒子爱滋病毒抗原 (HIV AG) 丙肝病毒抗原 (HCV AG)-Q粒子 Q-葡聚糖包被纳米粒子丙肝病毒抗原 (HCV AG) 爱滋病毒抗原 (HIV AG)-Q粒子 Q-葡聚糖包被纳米粒子爱滋病毒抗原 (HIV AG) 丙肝病毒抗原 (HCV AG)-聚乙烯聚乙烯吡咯烷酮丙肝病毒抗原 (HCV AG) 吡咯烷酮粒子包被纳米粒子

爱滋病毒抗原 (HIV AG)-聚乙烯聚乙烯吡咯烷酮爱滋病毒抗原 (HIV AG) 吡咯垸酮粒子包被纳米粒子丙肝病毒抗原 (HCV AG 聚赖氨酸粒子聚赖氨酸包被纳米粒子丙肝病毒抗原 (HCV AG) 爱滋病毒抗原 (HIV AG)-聚赖氨酸粒子聚赖氨酸包被纳米粒子爱滋病毒抗原 (HIV AG) 丙肝病毒抗原 (HCV AG)-氨基肼赖氨酸氨基肼聚赖氨酸包被纳米粒丙肝病毒抗原 (HCV AG) 粒子子

爱滋病毒抗原 (HIV AG 氨基肼赖氨酸氨基肼聚赖氨酸包被纳米粒爱滋病毒抗原 (HIV AG) 粒子子实施例 3: 纳米结构载体的制备方法

本实施例制备的纳米结构载体包括纳米粒子 /片基复合物及纳米粒子 /微米粒子复合物，按照己公开的微米粒子 /片基复合物制备方法还可制备纳米粒子 / 微米粒子 /片基复合物。本实施例制备的纳米结构载体可以分别用作分析芯片片基、酶标板片基、平面层析试剂条片基、及层析凝胶。

本实施例所用固相载体为常规固相载体，包括表 1中的玻片、 96孔聚苯乙烯板及硝基纤维膜条。本实施例的制备方法同样适于由以下材料或其衍生物制成的常规固相载体：硅片、硅胶、陶瓷、金属氧化物、金属、其它聚合物材料及它们的复合物。本实施例所用纳米粒子包括无机纳米粒子（例如：表 1中的氧化硅纳米粒子（STN—3) 、氧化硅（LUDOX AS—40) 、氧化钛纳米粒子、胶体金）及它们的衍生物 (例如实施例的制备物) 。本实施的方法也适于有机纳米粒子及其它无机纳米粒子，例如：包括氧化铝粒子在内的无机非磁性氧化物纳米粒子，包括钒粒子、铅粒子在内的非磁性金属纳米粒子金粒子，包括塑料、多糖、乳胶、树脂粒子在内的有机纳米粒子。本实施例所用纳米粒子衍生物包括结合有表面基团或 /和包被有机物的衍生物，且所述表面基团包括氨基，所述包被有机物包括聚乙烯吡咯烷酮及葡聚糖衍生物。本实施例所用玻片衍生物中，表面基团包括氨基、醛基、环氧基、氨基肼，包被有机物包括聚乙烯吡咯垸酮及葡聚糖衍生物。本实施的方法也适于纳米粒子或 /和固相载体的其它衍生物，例如包括下述表面基团或 /和包被有机物的衍生物：所述表面基团包括下述一种或多种基团- 二乙氨基乙基、二乙基一 (2—羟丙基)氨乙基、羧甲基、磺酸丙基、巯乙基吡啶基、硅氧烷基、硫醇基、烷基；包被有机物包括下述一种或多种有机物：包括吐温类表面活性剂在内的表面活性剂，包括聚氨基酸在内的聚电解质，包括聚硅氧烷在内的亲油有机物，包括葡聚糖衍生物、琼脂糖衍生物、纤维素衍生物、聚丙烯酰胺在内的离子交换聚合物，和包括肝素钠、抗原、抗体在内的亲和物质。

1)纳米粒子 /片基复合物的制备

( 1 ) 纳米粒子悬浮液固定化法制备芯片片基，

(a)直接固定

将表 1中的载玻片或其它芯片片基放入选自于表 3或表 4的不同浓度纳米粒子悬浮液中浸泡 2小时以上，然后洗涤烘干。此方法可获得众多不同的纳米结构芯片片基。

(b )先活化再固定

其包括先活化纳米粒子或 /和片基，再进行纳米粒子的固定，例如：将所述纳米粒子进行有利于结合所述活性试剂或 /和所述固相载体的活化处理，再将其悬浮液与所述固相载体接触并进行固定化反应；或将所述固相载体进行有利于结合所述纳米粒子或 /和所述活性试剂的活化处理，再将其与所述纳米粒子悬浮液接触并进行固定化反应。

例如，将表 1中的载玻片或其它芯片片基放入选自于实施例 1制备的纳米粒子衍生物（表 4) 不同浓度悬浮液中浸泡 2小时以上，然后洗涤烘干。又例如，先将表 1中的载玻片用浓度为 10 %的 NaOH及 HN0₃处理并洗净干燥制成活化载玻片，然后将上述活化载玻片放入选自于表 3或表 4的纳米粒子不同浓度悬浮液中浸泡 2小时以上，然后洗涤烘干。此方法可获得众多不同的纳米结构芯片片基。

(c) 先固定再活化- 即将所述纳米粒子的悬浮液与所述固相载体接触并进行固定化反应，然后进行有利于固定所述活性试剂的活化处理。例如，将表 1中的载玻片放入选自于表 3或表 4的纳米粒子不同浓度悬浮液中浸泡 2小时以上，洗涤烘干，然后用载玻片活化方法进行活化处理。此方法可获得众多不同的纳米结构芯片片基。

(2)化学交联处理法制备芯片片基

固定在固相载体上的含包被高分子的纳米粒子，总可以通过化学交联增加其固定稳定性。例如，先将表 1中的载玻片用 Deae—葡聚糖包被，再将其放入实施例 1制备的 Cm—葡聚糖包被氧化硅纳米粒子的不同浓度悬浮液中浸泡 2小时以上，洗涤烘干，再用交联剂环氧氯丙垸进行葡聚糖交联。此方法可获得众多稳定性高的纳米结构芯片片基。

(3 )热处理法制备芯片片基

固定在固相载体上的纳米粒子，还可以通过热处理增加其固定稳定性。例如，将上述纳米粒子悬浮液固定化法制备的芯片片基在 30度以上、固相载体的软化温度以下加温然后冷却，可增加其固定稳定性。表现为，经热处理法制备 (例如 37度 15小时以上、 60度 10小时以上，或 150度 1小时以上）的芯片片基与仅用纳米粒子悬浮液固定化法制备的芯片片基相比，两者在超声清洗 1小时后固定的罗丹明标记二抗的强度，前者比后者为高。此方法可获得众多稳定性高的纳米结构芯片片基。

(4)制备纳米结构流路芯片片基

本发明的纳米结构载体中的纳米结构区，也可用作流动相的输运流路。本实施例中制备纳米结构流路芯片片基的方法，同上述制备芯片片基的方法相同。只是根椐流路尺寸及其在片基上的位置，不是将片基放入纳米粒子悬浮液中浸泡，而是将不同浓度纳米粒子悬浮液以定量定位的方式（例如划宽度为 0.3— 1.0 mm, 长度 3mm的线条）涂到片基表面再进行 0.5小时以上的反应，然后洗尽、干燥。在玻片片基上固定的亲水性纳米粒子（例如表 1中的 LUDOX AS-40和表 4中的 DEAE—葡聚糖包被纳米粒子、 QAE—纤维素包被纳米粒子和聚乙烯吡咯烷酮包被纳米粒子）形成的纳米结构区，经测定其表面水接触度均比玻片片基的为小，具有输水性能。尽管不拟进入理论讨论，但有可能本发明的微流路中，由于其上的纳米结构的作用（例如更高的表面积，更多微小凹体），是形成此一类 "毛细现象"的原因或部分原因。尽管本发明的微流路很简单，但专业人士都知道，结合本发明的微流路，利用公知的微流路芯片制备的其它技术，是容易制成各种不同类型的微流路芯片的。

(5 ) 纳米粒子包被微孔板的制备

本实施例所用片基为 96孔聚苯乙烯板（深圳金灿华实业有限公司 )，所用纳米粒子分别为胶体金、氧化硅纳米粒子 (STN-3 )和氧化硅 (LUDOX AS-40) (表 1 ) 。本实施例纳米粒子包被微孔板的制备方法为：将不同浓度的纳米粒子液与聚苯乙烯板微孔底部接触，在室温下反应 15小时，再用蒸馏水反复清洗。上述制备芯片片基的化学交联法和热处理法也可用于制备纳米粒子包被微孔板。本实施例制备的部分纳米粒子包被微孔板列于表 6中。

(6) 纳米粒子包被平面层析条的制备

制备方法要点与上述纳米粒子包被微孔板的制备相同。本实施例制备的部分纳米粒子包被平面层析条列于表 6中。

2)纳米粒子 /微米粒子复合物的制备

本实施例制备的纳米粒子 /微米粒子复合物包括用于制备分析芯片、酶标板、平面层析试剂条、及层析凝胶的纳米粒子 /微米粒子复合物。本实施例所用微米粒子为表 1中的微米粒子，包括常规层析凝胶：硅胶（粒径 40— 60um，中国科学院化学研究所）、 Sephadex (Pharmacia) 。本实施例的制备方法同样适于由以下材料或其衍生物制成的微米粒子：陶瓷、金属氧化物、金属、其它聚合物材料及它们的复合物，及表面分布纳米粒子的微米粒子。

本实施例所用纳米粒子包括无机纳米粒子（例如：表 1中的氧化娃纳米粒子 (STN— 3)、氧化硅（LUDOXAS—40)、氧化钛纳米粒子、胶体金）及它们的衍生物（例如实施例 1的制备物）。本实施的方法也适于有机纳米粒子及其它无机纳米粒子，例如：包括氧化铝粒子在内的无机非磁性氧化物纳米粒子，包括钒粒子、铅粒子在内的非磁性金属纳米粒子金粒子，包括塑料、多糖、乳胶、树脂粒子在内的有机纳米粒子。本实施例所用纳米粒子衍生物包括结合有表面基团或 /和包被有机物的衍生物，且所述表面基团包括氨基，所述包被有机物包括聚乙烯吡咯烷酮及葡聚糖衍生物。本实施例所用玻片衍生物中，表面基团包括氨基、醛基、环氧基、氨基肼，包被有机物包括聚乙烯吡咯烷酮及葡聚糖衍生物。本实施的方法也适于纳米粒子或 /和固相载体的其它衍生物，例如包括下述表面基团或 / 和包被有机物的衍生物：所述表面基团包括下述一种或多种基团：二乙氨基乙基、二乙基一（2—羟丙基）氨乙基、羧甲基、磺酸丙基、巯乙基吡啶基、硅氧烷基、硫醇基、烷基；包被有机物包括下述一种或多种有机物：包括吐温类表面活性剂在内的表面活性剂，包括聚氨基酸在内的聚电解质，包括聚硅氧烷在内的亲油有机物，包括葡聚糖衍生物、琼脂糖衍生物、纤维素衍生物、聚丙烯酰胺在内的离子交换聚合物，和包括肝素钠、抗原、抗体在内的亲和物质。

本实施例纳米粒子 /微米粒子复合物的制备方法的要点，与上述纳米粒子 / 片基复合物的制备方法的要点。只是在使用片基的地方，这里是使用微米粒子。本实施例制备的部分纳米粒子 /微米粒子复合物列于表 6中。

3 ) 纳米结构载体的鉴定

本实施中，纳米结构单元及其分布的确定，利用 SPA— 300HV型扫描探针显微镜（DFM)和电子扫描显微镜进行（例如图 1 )。本实施例制备的纳米结构载体中，纳米结构单元均为非定向排列（例如图 1 )。

本实施中，纳米凸体及其高度、半高处的最小尺寸及其分布密度的测定，利用 SPA— 300HV型扫描探针显微镜（DFM)及分析软件进行（例如图 1 )。本实施例制备的纳米结构载体中，当制备中使用浓度（w/v) 为 1/250或 1/175000 的纳米粒子悬浮液包被固相载体时，高度大于 3 nm、且凸出半高处至少一维尺寸在 1—500 nm的纳米凸体的分布密度小于 10个 / μ ιη²、甚至小于 10个 /μ ιη²。而当制备中使用浓度（w/v) 为 1/25000至 1/50000的纳米粒子悬浮液包被固相载体时，高度大于 3 nm、且凸出半高处至少一维尺寸在 1一 500 nm的纳米凸体的分布密度大于 10个 / μ ηι²、甚至大于 20个 /μ πι²。

本实施中，纳米结构区中纳米结构覆盖率的测定，利用 SPA— 300HV型扫描探针显微镜（DFM)及分析软件进行（例如图 1 ) ( 纳米结构覆盖率=纳米结构覆盖的常规固相载体表面积 /常规固相载体总表面积）。本实施例制备的纳米结构载体中，当制备中使用浓度（w/v) (w/v) 为 1/250) 或 1/175000的纳米粒子悬浮液包被固相载体时，纳米结构区中纳米结构覆盖率均小于 30%、甚至小于 20%。而当制备中使用浓度（w/v)为 1/25000至 1/50000的纳米粒子悬浮液包被固相载体时，纳米结构区中纳米结构覆盖率均大于 30%、甚至大于 40%。

本实施中，纳米结构区的表面积提高率的测定，通过分别检测固相载体和纳米结构载体的比表面积并计算它们的比表面积之比来进行 [表面积提高率= (纳米结构区比表面积 /其所含常规固相载体的比表面积） X 100%]，其中纳米结构载体是将上述纳米微粒用上述方法包被整个固相载体而得。本实施例制备的纳米结构载体中，当制备中使用浓度（w/v) 为 1/250或 1/175000的纳米粒子悬浮液包被固相载体时，表面积提高率均小于 300%、甚至小于 200%。而当制备中使用浓度（w/v) 1/25000至 1/50000的纳米粒子悬浮液包被固相载体时，表面积提高率均大于 200%、甚至大于 300%、个别大于 500%。

本实施中，纳米结构区的吸咐能力提高率的测定，通过分别检测固相载体和纳米结构载体的吸附能力来进行 [吸附能力提高率 = (纳米结构区吸附能力 /其所含常规固相载体的吸附能力) X 100%], 其中纳米结构载体是将上述纳米微粒用上述方法包被整个固相载体而得。吸附能力的测定按公知方法进行，静态吸咐时在室温下吸附 30分钟。鉴定芯片片基时测定对罗丹明标记抗抗体（用 Molecular Probes F- 6163 标记的 IgG) 的吸附能力，鉴定微孔板片基时测定对酶标抗抗体（天坛生物制品股分有限公司）的吸附能力，而鉴定纳米粒子 /微米粒子复合物测定其用作柱层析固定相时对白蛋白（天坛生物制品股分有限公司）的吸附能力。本实施例制备的纳米结构载体中，当制备中使用浓度（w/v) 1/250 或 1/175000的纳米粒子悬浮液包被固相载体时，吸附能力提高率小于 130%、甚至小于 115 %。而当制备中使用浓度（w/v) 1/25000至 1/50000 的纳米粒子悬浮液包被固相载体时，吸附能力提高率均大于 115 %、甚至大于 130%、个别大于 180%。

本实施中，吸附量衰减速率比的测定，通过分别检测固相载体和纳米结构载体的吸附量随被吸附物浓度下降（每一次下降为 10倍稀释）来进行 [吸咐量衰减速率比= (纳米结构区吸附量随目标物下限浓度下降而衰减的速度 /常规固相载体对吸附量随目标物下限浓度下降而衰减的速度） X 100%]，其中：纳米结构载体是将上述纳米微粒用上述方法包被整个固相载体而得，吸附量随目标物下限浓度下降而衰减的速度 = (吸附量 2—吸附量 1 ) / (目标物浓度 2—目标物浓度 1 )。吸附量的测定方法与上述吸咐能力的测定方法相同。本实施例制备的纳米结构载体中，当制备中使用浓度（w/v) 为 1/250或 1/175000的纳米粒子悬浮液包被固相载体时，吸附量衰减速率比大于 90%、甚至接近 100%。而当制备中使用浓度（w/v) 1/25000至 1/50000 的纳米粒子悬浮液包被固相载体时，吸附量衰减速率比小于 90%、甚至小于 80%、个别小于 65 %。 ·

本实施中， DFM检测在成都电子科技大学分析测试中心进行，扫描电子显微镜捡测在四川大学分析测试中心进行，比表面积的检测在中国科学院有机化学研究所分析试验室进行，芯片片基吸附量利用公知的芯片检测方法（参考以下实施例）通过建立标准曲线进行，微孔板片基吸附量利用公知的酶标检测方法 (参考以下实施例)通过建立标准曲线进行，纳米粒子 /微米粒子吸附量利用公知的层折检测方法（参考以下实施例）通过建立标准曲线进行。尽管利用不同的检测仪器和计算方法可能会有数据差别，但原则上一些数据明显大于另一些数据的时候，这些数据的比值还是有意义的。实施例 4_S 纳米结构活性载体的制备（1)

本实施例制备的纳米结构活性载体为用于多肽分析的纳米结构活性载体，特别是纳米结构芯片。本发明中，术语 "纳米结构芯片"为至少含有一个本发明所述纳米结构活性区 (例如探针微阵列中的一个样点）。一个芯片可以有多个反应器，一个反应器可以有多个含活性试剂的样点（探针点），只要其中有一个样点为本发明的纳米结构活性区，则芯片为本发明的纳米结构活性载体或纳米结构芯片。本实施例纳米结构芯片包括活性纳米粒子 /片基复合物和活性纳米粒子 /微米粒子 /片基复合物。本实施例的纳米结构芯片也可应用于其它目标物，例如与多肽相互作用的药物。

本实施例所用活性试剂包括多肽（例如合成肽 EBV VCA— P18)、抗原（例如 HCV、 HIV和 Syphilis抗原）、及抗体（例如 HBs抗体）。本实施例的方法也适于其它活性试剂，例如：药物、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、单链或多链 DNA、 RNA、以及病毒、细胞或它们的组成。

本实施例所用固相载体包括常现固相载体和纳米结构载体。本实施例所用常规固相载体包括表 1中的芯片片基（载玻片及载玻片衍生物）。本实施例的制备方法同样适于由以下材料或其衍生物制成的芯片片基：硅片、硅胶、陶瓷、金属氧化物、金属、其它聚合物材料及它们的复合物。本实施例所用纳米结构载体为未含上述活性试剂的纳米结构载体，包括实施例 3中制备的纳米结构芯片片基。

本实施例所用纳米粒子与实施例 3所用纳米粒子相同（表 1中的纳米粒子及实施例 1制备的纳米粒子衍生物。本实施例的方法也适于其它纳米粒子。本实施例所用活性纳米粒子为实施例 2中制备的活性纳米粒子。本实施例的方法也适于其它活性纳米粒子。本实施例所用微米粒子与实施例 3所用微米粒子相同（表 1 中的微米粒子）。

本实施例制备的芯片为多反应池芯片，制备方法为：用高疏水有机硅涂料 (成都晨光化工研究院）涂在芯片上隔离结构处，然后干燥成膜（膜厚小于 0.05 mm) ，由此形成反应池隔离结构（参考中国专利申请号 03117397.7) 。每 1个芯片上有 8个反应池，每个反应池尺寸为 4.5 mmX4.5 mm，反应池间隔离结构宽度为 4.5 mm。本实施例的方法当然也适于单反应池芯片。

1)活性纳米粒子 /片基复合物的制备（1)

本实施例所制备的活性纳米粒子 /片基复合物为单活性试剂纳米结构载体，即一个纳米结构活性区内只含一种活性试剂的纳米结构活性载体，包括配基一纳米粒子包被片基、配基一纳米结构一配基一片基和配基一纳米结构一配基一纳米粒子包被片基。本实施例中所述配基既作为试剂又作为连接剂使用。

( 1 )基本方法

(a) 固定活性试剂法

将上述活性试剂直接用点样仪（DY— 2003生物芯片点样仪）以微阵列形式点到上述未含上述活性试剂的纳米结构载体上可制得活性纳米粒子 /片基复合物。本实施例所用点样方法与条件与公知的点样方法与条件相同。此方法可获得众多不同的纳米结构芯片（配基一纳米粒子包被片基）。

(b) 固定活性纳米粒子法

将实施例 2制备的亲和纳米粒子（表 5)制成不同浓度悬浮液，用点样仪（DY 一 2003生物芯片点样仪）以微阵列形式点到上述常规固相载体（配基一纳米结构一配基一片基）或纳米结构载体（配基一纳米结构一配基一纳米粒子包被片基）上可制得活性纳米粒子 /片基复合物。在本实施中，在片基上有时还固定用以固定活性纳米粒子的试剂，例如配对活性试剂。本实施例所用点样方法与条件与公知的点样方法与条件相同。此方法可获得众多不同的纳米结构芯片。

(2) 热处理法制备芯片

固定在固相载体上的纳米粒子，还可以通过热处理增加其固定稳定性。例如，将上述制备的芯片用小牛血清白蛋白封闭后不清洗掉蛋白质，干燥后在 50 度加温 10小时然后冷却，至少可增加部分芯片上纳米结构的稳定性。公知的活性试剂的加热保护剂很多，例如除白蛋白外还有糖类（葡聚糖、麦芽糖、等等）。加热条件除考虑到加强纳米结构的稳定性，还考虑到在保护剂存在下活性试剂的稳定性。纳米结构稳定性的提高表现为，经热处理法处理（例如 37度 15小时以上、 60度 10小时以上，或 150度 1小时以上）的部分芯片（例如表 7中的芯片 19 和 20)与未经热处理法处理的相应芯片相比，两者在超声清洗 2小时后的灵敏度，前者比后者为高。此方法可获得众多稳定性高的纳米结构芯片。

( 3)制备纳米结构活性流路芯片或芯片片基

本发明的纳米结构活性载体中的纳米结构活性区，也可用作流动相的输运、分离流路。本实施例中制备纳米结构活性流路的方法，同实施例 3中制备纳米结构流路的方法相同，只是在其使用纳米粒子的地方使用活性纳米粒子（例如实施例 2中制备的活性纳米粒子）。尽管本发明的活性流路很简单，但专业人士都知道，结合本发明的活性流路，利用公知技术，是容易制成各种不同类型的流路芯片的。

2)活性纳米粒子 /片基复合物的制备（2)

本实施例所制备的活性纳米粒子 /片基复合物为多活性试剂纳米结构载体，即一个纳米结构活性区内含二种或二种活性试剂的纳米结构活性载体，包括：配基 2—纳米粒子一配基 2—配基 1一纳米粒子一配基 1一片基，和配基 2—纳米粒子一配基 2—配基 1一片基。其中配基 1可以与配基 2进行配对反应且配基 1 比配基 2更易与片基结合。本实施例中一种配基（配基 2，例如 HBsAb) 既作为试剂使用又作为连接剂使用，另一种配基仅作为连接剂使用（配基 1，例如 HBsAg)。

本实施例中，配基 2—纳米粒子一配基 2—配基 1一纳米粒子一配基 1一片基的制备方法为：将纳米粒子浓度为 1/25000 (W/V) 的配基 2—纳米粒子一配基 2和配基 1一纳米粒子一配基 1悬浮液作 1 : 1混合后，按通常的点样方法点样至片基上。每种活性纳米粒子点 2个点，形成 3 X 2阵列，然后用牛血清白蛋白溶液封闭后备用。所得芯片记作芯片 223。点样时 HBsAb浓度为 3 mg/ml。

本实施例中，配基 2—纳米粒子一配基 2—配基 1一片基复合物的制备方法为：将纳米粒子浓度为 1/12500 (W/V) 的配基 2—纳米粒子一配基 2和配基 1作 1 : 1 混合后，按通常的点样方法点样至片基上。每种活性纳米粒子点 2个点，形成 3 X 2阵列，然后用牛血清白蛋白溶液封闭后备用。所得芯片记作芯片 224。点样时 HBsAb浓度为 3 mg/mlo

3)纳米结构活性载体的鉴定

本实施中，纳米结构单元及其分布，纳米凸体及其高度、半高处的最小尺寸及其分布密度的测定，均利用 SPA— 300HV型扫描探针显微镜（DFM) 和电子扫描显微竟进行（例如图 2)，测定方法如实施例 3中的测定方法。本实施例制备的纳米结构活性载体中，纳米结构单元均为非定向排列（例如图 2)。当制备中使用浓度（w/v) 为 1/250或 1/175000的活性纳米粒子悬浮液点样至固相载体时，高度大于 3 nm、且凸出半高处至少一维尺寸在 1一 500 nm的纳米凸体的分布密度小于 10个 / μ ηι²、甚至小于 10个 /μ ηι²，且活性区中纳米结构覆盖率均小于 30%、甚至小于 20%。而当制备中使用浓度（w/v) 为 1/25000至 1/50000的活性纳米粒子悬浮液点样至固相载体时，高度大于 3 nm、且凸出半高处至少一维尺寸在 1一 500 nm的纳米凸体的分布密度大于 10个 / μ ιη²、甚至大于 20个 / μ ηι²，且纳米结构活性区中纳米结构覆盖率均大于 30%、甚至大于 50%乃至 80%。其中：纳米结构覆盖率=纳米结构覆盖的常规固相载体表面积 /常规固相载体总表面积。

本实施例中，纳米结构活性区的表面积提高率 [表面积提高率= (纳米结构活性区比表面积 /其所含常规固相载体的比表面积） X 100%]的测定方法如实施例 3 中的测定方法。由于芯片样点数少，纳米结构活性区是将活性纳米微粒（例如表 5中的（HCV—Ag) -LuDOX) 用上述方法包被整个片基（例如表 3中的环氧基玻片）而得的模型，而所述常规固相载体也就是整个片基（例如环氧基玻片）。本实施例制备的纳米结构活性载体中，当制备中使用浓度（w/v) 为 1/250 或 1/175000 的活性纳米粒子悬浮液包被片基时，表面积提高率均小于 300%、甚至小于 200%。而当制备中使用浓度（w/v) 1/25000至 1/50000 的相同活性纳米粒子悬浮液包被相同片基时，表面积提高率均大于 200%、甚至大于 400%、个别大于 650%。

本实施中，纳米结构活性区的吸附能力提高率 [吸附能力提高率 = (纳米结构活性区吸附能力 /非纳米结构活性载体吸附能力） X 100%]的测定方法如实施例 3 中的测定方法，也是将活性纳米微粒用上述方法包被整个固相载体而得的模型作为纳米结构活性区。本实施例制备的纳米结构活性载体中，当制备中使用浓度（w/v) 1/250或 1/175000的活性纳米粒子悬浮液（例如表 5中的（HCV - Ag) -LuDOX) 包被片基（例如表 3 中的环氧基玻片）时，吸咐能力提高率小于 130%、甚至小于 115%。而当制备中使用浓度 (w/v) 1/25000至 1/50000的相同活性纳米粒子悬浮液包被相同片基时，吸附能力提高率均大于 115 %、甚至大于 130%、个别大于 180%。

本实施中，灵敏度提高率的测定是通过比较纳米结构活性区与含相同常规固相载体和活性试剂的非纳米结构活性载体的分析灵敏度之比来进行：灵敏度提高率 = (纳米结构活性区灵敏度 /非纳米结构活性载体灵敏度） χ ιοο%。本实施中，纳米结构芯片以用浓度（w/v) 1/25000至 1/50000的活性纳米粒子悬浮液点样到片基（例如表 3中的环氧基玻片）制备的、且样点具有上述纳米结构活性区形貌特征的芯片为模型，非纳米结构活性载体以相同活性试剂在相同条件下点样至相同片基获得的芯片为模型。本实施例制备的纳米结构芯片中，当制备中使用浓度（w/v)为 1/250或 1/175000的活性纳米粒子悬浮液包被片基时，灵敏度提高率提高率小于 150%、甚至小于 120%。而当制备中使用浓度 (w/v) 1/25000至 1/50000的相同活性纳米粒子悬浮液包被相同片基时，灵敏度提高率均大于 120%、甚至大于 150 %、个别大于 600%。

本实施中，识别信号衰减速率比的测定，通过分别检测纳米结构芯片与含相同片基和活性试剂的非纳米结构芯片在分析时的识别信号随目标物下限浓度下降而衰减的速度来进行：识别信号衰减速率比 = (纳米结构活性区识别信号随目标物下限浓度下降而衰减的速度 /非纳米结构活性载体识别信号随目标物下限浓度下降而衰减的速度） X 100%，其中：识别信号随目标物下限浓度下降而衰减的速度= (识别信号 2—识别信号 1 ) I (目标物浓度 2—目标物浓度 1 ) 。识别信号（例如荧光标记活性纳米结构捕获目标物在共聚焦荧光扫描仪上的读数）的测定方法按公知芯片检测方法进行。本实施例制备的纳米结构芯片中，当制备中使用浓度（w/v) 为 1/250或 1/175000的活性纳米粒子悬浮液包被片基时，识别信号衰减速率比大于 70%、甚至大于 90%。而当制备中使用浓度 (w/v) 1/25000至 1/50000的相同活性纳米粒子悬浮液包被相同片基时，识别信号衰减速率比均小于 90%、甚至小于 70%、个别小于 50%。

本实施中，吸附量衰减速率比 [吸附量衰减速率比 = (纳米结构活性区吸附量随目标物下限浓度下降而衰减的速度 /非纳米结构活性载体吸附量随目标物下限浓度下降而衰减的速度） X 100%]的测定方法如实施例 3中的测定方法，也是将活性纳米微粒用上述方法包被整个固相载体而得的模型作为纳米结构活性区。本实施例制备的纳米结构活性载体中，当制备中使用浓度（w/v) (w/v) 为 1/1/250或 1/175000的活性纳米粒子悬浮液（例如表 5中的 (HCV —Ag)— LuDOX) 包被片基（例如表 3中的环氧基玻片）时，吸附量衰减速率比大于 80 %、甚至大于 90%。而当制备中使用浓度（w/v) 1/25000至 1/50000 的相同活性纳米粒子悬浮液包被相同片基时，吸附量衰减速率比均小于 90%、甚至小于 80 %、个别小于 70 %。尽管利用不同的检测仪器和计算方法可能会有数据差别，但原则上一些数据明显大于另一些数据的时候，这些数据的比值还是有意义的。实施例 5s 纳米结构活性载体的制备（2)

本实施例制备的纳米结构载体为用于核酸分析的纳米结构活性载体，特别是核酸分析纳米结构芯片。本实施例的纳米结构活性载体也可应用于其它目标物，例如与核酸相互作用的药物。

本实施例所用活性试剂包括单链或多链 DNA、 RNA、以及病毒。本实施例所用固相载体、纳米粒子与实施例 4相同。本实施例制备方法也与实施例 4相同。

本实施例鉴定方法与实施例 4中的方法相同。本实施例所制得的活性纳米载体与实施例 4中相同方法制得的活性纳米载体的结果一至。当制备中使用浓度 (w/v) 1/25000至 1/50000 的活性纳米粒子悬浮液包被片基时，它们的结果如下：通过形貌分析，纳米结构单元均为非定向排列，高度大于 3 nm、且凸出半高处至少一维尺寸在 1一 500 nm的纳米凸体的分布密度大于 18个 / μ ηι²，纳米结构覆盖率均大于 70% ; 表面积提高率大于 450% ; 吸附能力提高率大于 160% ; 吸附量衰减速率比均小于 70%。实施例 6: 纳米结构活性载体的制备（3)

本实施例制备的纳米结构活性载体为活性纳米粒子 /微米粒子复合物。本实施例的活性纳米粒子 /微米粒子复合物可应用于制备分析芯片或层析凝胶。

本实施例所用活性试剂包括多肽（例如合成肽 EBV VCA— P18)、抗原（例如 HCV、 HIV和 Syphilis) 、及抗体（例如 HBs抗体）。本实施例的方法也适于其它活性试剂，例如：药物、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、单链或多链 DNA、 RNA、以及病毒、细胞或它们的组成。

本实施例所用微米粒子为表 1中的微米粒子，包括常规层析凝胶:硅胶 (粒径 40— 60 m，中国科学院化学研究所）、 Sephadex (Pharmacia) 。本实施例的制备方法同样适于由以下材料或其衍生物制成的微米粒子：陶瓷、金属氧化物、金属、其它聚合物材料及它们的复合物，及表面分布纳米粒子的微米粒子。

本实施例所用纳米粒子与实施例 3所用纳米粒子相同 (表 1中的纳米粒子及实施例 1制备的纳米粒子衍生物。本实施例的方法也适于其它纳米粒子。本实施例所用活性纳米粒子为实施例 2中制备的活性纳米粒子。本实施例的方法也适于其它活性纳米粒子。本实施例所用微米粒子与实施例 3所用微米粒子相同（表 1 中的微米粒子）。

1 ) 制备方法

本实施例活性纳米粒子 /微米粒子复合物的制备，包括三种方法：在实施例 3中制备的纳米粒子 /微米粒子复合物上包被活性试剂；将实施例 2制备的活性纳米粒子按实施例 3制备纳米粒子 /微米粒子复合物的方法与粒子一起制备活性纳米粒子 /微米粒子复合物; 在实施例 3中制备的纳米粒子 /微米粒子复合物上按实施例 3制备纳米粒子 /微米粒子复合物的方法包被实施例 2制备的活性纳米粒子。本实施例中，在纳米粒子 /微米粒子复合物上包被活性试剂的方法是按公知方法进行的，例如亲和层析凝胶的制备中在微米粒子上包被活性试剂的方法。本实施例制备的部分活性纳米粒子 /微米粒子复合物列于表 7中。

2) 鉴定方法

本实施例鉴定方法与实施例 4中的方法相同。本实施例所制得的活性纳米载体与实施例 4中相同方法制得的活性纳米载体的结果一至。例如，本实施例中 (HCV AG) —LuDOX分别包被硅胶和 Sephadex A50制得的 (HCV AG) 一 LuDOX/硅胶复合物和（HCV AG) - LuDOX/Sephadex复合物，当制备中使用浓度（w/v) 1/25000至 1/50000 的相同活性纳米粒子悬浮液时，它们的结果如下：通过局部形貌分析，纳米结构单元均为非定向排列，高度大于 3 nm、且凸出半高处至少一维尺寸在 1一 500 nm的纳米凸体的分布密度大于 15个 /μ πι²，纳米结构覆盖率均大于 50% ; 表面积提高率大于 350% ; 吸附能力提高率大于 130% ; 吸附量衰减速率比均小于 80%。实施例 7: 纳米粒子标记物的制备

本实施例所制备的标记活性试剂 /纳米粒子 /分子标记物质复合物为用于芯片的纳米粒子标记物。

本实施例所用标记活性试剂包括多肽，例如 HCV抗原及羊抗人二抗（北京天坛生物制品股份有限公司）。本实施例的方法也适于其它标记活性试剂，例如：药物、多糖、维生素、抗生素、功能有机物、单链或多链 DNA、 RNA、以及病毒、细胞或它们的组成。

本实施例所用纳米粒子为粒径 1一 100 nm且本身不是标记物质增强剂的非磁性无机非金属粒子，包括表 1中的无机非金属纳米粒子及实施例 1制备的这些无机非金属纳米粒子的衍生物。本实施例的方法也适于其它非磁性无机非金属纳米粒子。本实施例所用活性纳米粒子为实施例 2中制备的基于非磁性无机非金属纳米粒子的活性纳米粒子。本实施例所用微米粒子与实施例 3所用微米粒子相同 (表 1中的微米粒子）。本实施例所用分子标记物质为罗丹明 (Molecular probes公司）。本实施例的方法也适于其它标记物质，例如荧光物质、化学发光物质、化学发光催化剂、有色金属盐、染料和颜料。

本实施例对照标记物为未用含纳米粒子液体处理的常规标记物（罗丹明标记羊抗人二抗，美国 Jackson ImmunoRresearch Laboratories公司) 。

1 )准备

本实施例配基一分子标记物质复合物制备方法为公知的罗丹明标记抗抗体的制备方法。

本实施例中所用的活性纳米粒子制备方法为：将纳米粒子在超声振荡下分散配制成浓度为 1/50 ( 1/125) - 1/10000 ( 1/25000) (w/v) 的纳米粒子液，再将浓度为 2 mg/ml的标记活性试剂溶液分别与其作 1 : 1混合，在室温下避光反应 2小时。混合物的纯化方法为，混合产物滴入装有凝胶的旋转管，在 4000 r/min 条件下离心，取收集管液体。

本实施例纳米粒子一分子标记物质复合物制备方法为：将纳米粒子在超声振荡下分散配制成浓度为 1/1000(

的纳米粒子液，再将浓度为2 1 ¾/1111 的分子标记物质溶液分别与其作 1 : 1混合，在室温下反应 1小时。如有必要纯化，混合物的纯化方法为：混合产物滴入装有凝胶的旋转管，在 4000 r/min条件下离心，取收集管液体。

2) 配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物的制备

本实施例制备方法，其中所述配基、分子标记物质和纳米粒子的结合，包括下列一种或多种方式：将上述活性纳米粒子与分子标记物质结合（A)、将上述纳米粒子一分子标记物质与配基结合（B)、将按公知方法制备的分子标记物质标记配基与纳米粒子结合 (C)、将配基与分子标记物质和纳米粒子同时结合 (D)，其中所述结合其产物为混合物和纯化物均可。本实施例制备的部分配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物列于表 6中。 3 ) 比较

本实施例所用芯片为按公知芯片制备方法制备的（片基为环氧基玻片，配基分别为丙肝病毒抗原（HCV AG)和爱滋病毒抗原（HIV AG) ) 。

比较方法与实施例 10中芯片的应用方法相同，本实施例制备的部分标记物的比较结果列于表 9中，可见至少其灵敏度比对照标记物有明显提高。表 6

实施例 8: 芯片标记系统的制备及应用 (1 )

本实施例所制备芯片标记系统包括含标记物、着色剂、和任选存在的着色控制剂及着色定型剂。

1 )制备

本实施例所制备芯片标记物分别为：标记活性试剂 /纳米结构 /催化剂复合物，标记活性试剂 /纳米结构 /催化剂和着色剂复合物，标记活性试剂 /纳米结构 / 催化剂复合物和及标记活性试剂 /纳米结构 /着色剂复合物或标记活性试剂 /着色剂复合物的混合物。

本实施例所用标记活性试剂、纳米粒子及活性纳米粒子与实施例 7中所用标记活性试剂、纳米粒子及活性纳米粒子相同。本实施例所用催化剂为粒径 1.4nm 的胺基胶体金（2020) (Nanoprobes公司）。本实施例的方法也适于其它催化剂，例如酶催化剂。本实施例所用着色剂包括银化合物（AgN0₃)和结晶紫。本实施例的方法也适于其它金属化合物和其它染料。本实施例标记活性试剂 /纳米结构 /催化剂复合物、标记活性试剂 /纳米结构 / 催化剂和着色剂复合物、标记活性试剂 /纳米结构 /着色剂复合物的制备方法与实施例 Ί中标记活性试剂 /纳米结构 /分子标记物质复合物的制备方法相同。

本实施例标记活性试剂 /着色剂复合物的的制备方法参考文件 (颜料标记专利申请）。

上述复合物的混合物根据需要按一定的体积比混合而成。 2)应用

利用公知方法将 HIV抗原和 HCV抗原点样至环氧基玻片上制成 HIV抗原 /HCV抗原芯片。将阳性对照血清（HIV抗体阳性血清和 HCV抗体阳性血清的混合物）和阴性对照血清（HIV抗体阴性血清和 HCV抗体阴性血清的混合物）分别以各种稀释度加入（PBS缓冲液为稀释液），室温反应 1小时后洗净。然后分别加入上述制备的各种标记物（例如，胺基胶体金 /氧化硅纳米粒子 /抗人二抗复合物，胺基胶体金 /氧化硅纳米粒子 /结晶紫 /抗人二抗复合物）及参考标记物（金标羊抗人二抗），反应 10分钟后洗净加 2.5 %戊二醛，再按银增强剂（Sigma公司）说明书操作，加入 A液和 B液的混合物，反应后用硫代硫酸钠中止反应。芯片洗净后肉眼观察，结果是：使用所有标记物， 5000倍稀释的阳性对照血清均可观察到阳性反应（黑点）；使用本发明的标记物， 10倍稀释的阴性对照血清均可观察到阴性反应（无黑点），而相同条件下使用参考标记物可观察到阳性反应（黑点）。这说明使用本发明的标记物的方法具有更高的特异性。实施例 9: 芯片标记系统的制备（2)

1 ) 制备

本实施例所制备芯片标记物分别为：活性试剂 /催化剂复合物与活性试剂 / 着色剂的混合物，活性试剂 /催化剂复合物与活性试剂 /纳米结构 /着色剂的混合物，标记活性试剂 /纳米结构 /催化剂复合物及标记活性试剂 /纳米结构 /着色剂复合物的混合物。

本实施例所用标记活性试剂、纳米粒子、活性纳米粒子、催化剂、及着色剂与实施例 8中所用标记活性试剂、纳米粒子及活性纳米粒子相同。本实施例标记活性试剂 /纳米结构 /催化剂复合物、标记活性试剂 /纳米结构 / 催化剂和着色剂复合物、标记活性试剂 /纳米结构 /着色剂复合物的制备方法与实施例 7中标记活性试剂 /纳米结构 /分子标记物质复合物的制备方法相同。

本实施例标记活性试剂 /着色剂复合物的的制备方法参考文件 (颜料标记专利申请）。本实施例所用活性试剂 /催化剂复合物为 1.4nm的纳米金标记的羊抗人抗抗体 (Nanoprobes公司）。

上述复合物的混合物根据需要按一定的体积比混合而成。

2) 应用

利用公知方法将 HIV抗原和 HCV抗原点样至环氧基玻片上制成 HIV抗原 /HCV抗原芯片。将阳性对照血清（HIV抗体阳性血清和 HCV抗体阳性血清的混合物）和阴性对照血清（HIV抗体阴性血清和 HCV抗体阴性血清的混合物）分别以各种稀释度加入（PBS缓冲液为稀释液），室温反应 1小时后洗净。然后分别加入上述制备的各种标记物（例如，胺基胶体金 /氧化硅纳米粒子 /结晶紫 /抗人二抗复合物，胺基胶体金 /抗人二抗复合物和结晶紫 /抗人二抗复合物混合物）及参考标记物（金标羊抗人二抗），反应 10分钟后洗净加 2.5%戊二醛，再按银增强剂（Sigma公司）说明书操作，加入 A液和 B液的混合物，反应后用硫代硫酸钠中止反应。芯片洗净后肉眼观察，结果是：使用所有标记物， 5000倍稀释的阳性对照血清均可观察到阳性反应（黑点）；使用本发明的标记物， 15 倍稀释的阴性对照血清均可观察到阴性反应（无黑点），而相同条件下使用参考标记物可观察到阳性反应（黑点）。这说明使用本发明的标记物的方法具有更高的特异性。实施例 10: 芯片试剂盒的制备及应用（1)

1 )试剂盒的制备

本实施例试剂盒含实施例 4中制备的本发明纳米结构芯片。

2)试剂盒的应用

在本实施例中， 1号样为 HCV抗体阳性血清， 2号样为 HIV₁₊₂抗体阳性人血清， 3号样为阴性对照物（HCV抗体和 HIV₁₊₂抗体都为阴性的血清对照物）。所有的样品均经使用经典的 ELISA方法在血清 20倍稀释反应条件下预先检测。本实施例的标记物为罗丹明标记羊抗人二抗（美国 Jackson ImmunoRresearch Laboratories公司)。

实验时前述 3种样品分别加入表 10中所述芯片的反应池中。其中对照片为以表 1 中的环氧基玻片按常规的点样方法固定有相同配基制备的芯片。加样量为 15μ1,反应 30分钟后洗涤 5次，洗涤液每次加入量为 25μ1。标记物加入量为 15μ1，反应后洗涤 5次，洗涤液每次加入量为 25μ 1，干燥后在 35/50下进行扫描。扫描仪为共聚焦激光扫描仪（Afymetrix公司 GMS 418芯片扫描仪），扫描激发光波长 532 nm，发射光波长 570 nm, 读取的信号经处理软件（JAGUARII ) 处理，然后取平均值后根据 Cut— off值判定阴（一）阳（+)性得到结果的例子如表 7。本发明纳米结构芯片表现出灵敏度提高的结果。

表 7

芯片号配基 /纳米粒子 /片基复合物检测结果

配基或活性纳米粒子样品 1 样品 2 样品 3 样品稀释对照片醛基玻片配基 + + ― 100倍对照片醛基玻片配基 ― 一 ― 500倍配基—鈉米粒子一配基一片基复合物

201 醛基玻片配基胶体金 + + ― 500倍

202 酸基玻片配基胺基胶体金（2020) + + ― 500倍

203 醛基玻片配基 DEAE—葡聚糖 + + ― 500倍包被纳米粒子

204 醛基玻片配基聚乙烯吡咯綜酮 + + ― 500倍包被纳米粒子

205 醛基玻片配基氨基肼一聚赖氨酸包被 + + 一 500倍纳米粒子

206 醛基玻片配基疏水氧化硅 + + 500倍纳米粒子（CDS7)

207 环氧基配基氧化硅纳米粒子 + + ― 500倍玻片 (STN-3 )

208 环氧基配基氧化硅 + + ― 500倍玻片 (LUDOX AS-40)

209 环氧基配基多孔氧化硅（AEROSIL + + ― 500倍玻片 200)

210 环氧基配基氧化钛纳米粒子 + + 500倍玻片

211 环氧基配基 DEAE—葡聚糖 + + ― 500倍玻片包被纳米粒子

212 环氧基配基聚乙烯吡咯垸酮 + + 500倍玻片包被纳米粒子

213 环氧基配基氨基肼一聚赖氨酸包被 + + ― 500倍玻片纳米粒子

214 环氧基配基疏水氧化硅 + + ― 500倍玻片纳米粒子 (CDS7)

215 氨基肼配基疏水氧化硅 + + ― 500倍玻片纳米粒子 (CDS7)

216 氨基肼配基氧化硅纳米粒子 + + 500倍玻片 (STN-3 ) 217 氨基肼配基氧化硅 + + 一 500倍玻片 (LUDOX AS -40)

218 氨基肼配基氨基肼一聚赖氨酸包被 + + 一 500倍玻片纳米粒子

219 PVP包被玻配基疏水氧化硅 + + 一 500倍片纳米粒子 (CDS7)

220 PVP包被玻配基氧化硅纳米粒子 + + — 500倍片 (STN-3 )

221 PVP包被玻配基氧化硅 + + 一 500倍片 (LUDOX AS-40)

222 PVP包被玻配基氨基肼一聚赖氨酸包被 + + 一 500倍片纳米粒子

配基一纳米粒子一配基一纳米粒子一片基复合物

223 片基 2 配基氧化硅 + + 一 500倍

(LUDOX AS-40)

224 片基 2 配基氨基肼一聚赖氨酸包被 + + 一 500倍纳米粒子

其中：配基分别为 HIV抗原和 HCV抗原。实施例 11: 芯片试剂盒的制备及应用（2)

1 )试剂盒的制备

本实施例试剂盒为含配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物的分析芯片试剂盒。本实施例中使用的为实施例 7制备的本发明的配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物。本实施例试剂盒中所含芯片为实施例 10中所述的对照片。因此，本实施例可以形成数量众多的不同试剂盒。

2)试剂盒的应用

本实施例中，所用样品及检测方法同实施例 10中的样品和检测方法相同。使用本发明的标记物， 500倍稀释的阳性血清均可观察到阳性反应，而相同条件下使用参考标记物可观察到阴性反应。这说明使用本发明的标记物的方法具有更高的灵敏度。实施例 12; 芯片试剂盒的制备及应用 (3)

1 )试剂盒的制备

本实施例试剂盒包括实施例 4制备的本发明的纳米结构芯片和实施例 7制备的本发明的含配基 /纳米粒子 /分子标记物质复合物的标记系统。因此，本实施例可以形成数量众多的不同试剂盒。

本实施例中，所用样品及检测方法同实施例 10中的样品和检测方法相同，所得结果的例子如表 8所示。表 8

实施例 13: 芯片试剂盒的制备及应用（4)

1 )试剂盒的制备

本实施例试剂盒包括磁芯片。

本实施例中所用磁纳米粒子为表 1中的水基磁液（NG— 21A)，所用片基为表 3环氧基玻片，所用的配基为实施例 2中所用配基丙肝病毒抗原（HCVAG) 和 HIV₁₊₂抗原。

1 )磁纳米粒子芯片的制备

本实施例中的磁纳米粒子芯片为一种配基 /磁纳米粒子 /片基复合物。

本实施例中的磁纳米芯片为多反应器芯片，其中多片基池基片的制备与实施例题中多片基池基片的制备相同。本实施例的亲和磁纳米粒子的制备与实施例如中活性纳米粒子的制备。

将制备好的分别含丙肝病毒抗原（HCVAG) ( l mg/ml)和含 HIV₁₊₂抗原（1 mg/ml)的亲和磁纳米粒子点样至多片基池基片的片基池中，每种亲和磁纳米粒子点 2个点，形成 2X2阵列。然后在外磁场作用下于 37°C反应一小时。外磁场的作用在于有利亲和磁纳米粒子向片基的移动及固定。包被完成后，用牛血清白蛋白溶液封闭后备用。

本实施例中的对照芯片为以醛基为片基，按公知的点样方法点有不含磁纳米粒子的丙肝病毒抗原（HCV AG) ( l mg/ml)和含 HIV₁₊₂抗原 ( 1 mg/ml)制备的芯片。

2)磁纳米标记物的制备

本实施例中的磁纳米标记物为一种配基 /磁纳米粒子 /分子标记物质复合物。其中酉己基为羊抗人二抗 (Jackson ImmnoResearch Laboratories公司 )。

3 )磁芯片试剂盒的制备

本实施例中的磁芯片试剂盒，其中可含一种、二种、三种或四种含磁粒子的组分。所述含磁粒子组分分别为：上述制备的磁纳米粒子芯片，上述制备的磁纳米粒子标记物，上述制备的亲和磁纳米粒子（已用小牛血清白蛋白封闭）和磁纳米粒子（已用小牛血清白蛋白封闭）。因其不同组合而形成的不同试剂盒见表 11。

4)磁芯片试剂盒的应用

本实施例中磁芯片试剂盒用于检测样品血清中的 HIV₁₊₂抗体和 HCV抗体的阴（一）、阳（+) 性。所用血清样品与实施例 2中的血清样品同。捡测方法与公知的芯片捡测方法不同之处在于，当试剂盒中除磁芯片外尚含有含磁粒子组分（例如磁纳米粒子）时，检测反应是在芯片底部有外界磁场的条件下进行的。特别是定脉冲磁场。在外磁场作用下，有利于磁纳米粒子标记物及亲和磁纳米粒子捕捉的目标物向反应器底部的运动。而加入样品中的磁纳米粒子在脉动磁场的作用下有利于加入芯片反应器中的液相样品内部产生流动以有利于样品的混合。由于试剂盒种类多，下面取一个试剂盒为例来说明其使用方法，其它试剂盒的使用方法可根据此例类推。

本例中使用试剂盒的组成为：对照芯片，磁纳米粒子，亲和磁纳米粒子与四种血清样品分别混合 [混合后的磁纳米粒子浓度为 1/2000 (W/V), 亲和磁纳米粒子浓度为 1/4000 (W/V) ]；将 15μ1血清样品加入芯片反应池中并在脉动磁场作用下于 37°C反应 10分钟；洗涤；加入 15μ1磁纳米标记物并在脉动磁场作用下于 37°C反应 10分钟；洗涤并干燥；然后按与实施例 10中相同的扫描及分析方法进行扫描及分析。所得结果的例子见表 9。表 9

I一对照芯片， II一磁纳米粒子芯片， ΙΠ—磁纳米粒子， IV—亲和磁纳米粒子， V—磁纳米粒子标记物， VI—对照标记物实施例 14: 多肽定量或 /和定性检测试剂盒的制备及应用

1 )试剂盒的制备

本实施例试剂盒为含纳米结构活性载体的酶标试剂盒

本实施例所用配基为合成肽，其为根据以下文献中公开的方法方法制得的

EBV VCA— P18抗原： Tranchand—Bunel， D.， Auriault, C.， Diesis, E.， Gras — Masse , H. ( 1998 ) Detection of human antibodies using "convergent" combinatorial peptide libraries or "mixotopes"designed form a nonvariable antigen: Application to the EBV viral capsid antigen pi 8， J. Peptide Res. 52, 1998， 495— 508。本实施例中所用的纳米结构酶标板是通过在上述纳米结构微孔板的微孔底部固定配基而成。

( 1 ) 从纳米粒子包被载体制备纳米结构活性载体：

纳米结构微孔板的制备及鉴定见实施例 3。将浓度为 0.3 g/ml的合成肽按照通常的酶标板制作方法分别包被到上述纳米粒子包被微孔板（胶体金包被微孔板、氧化硅包被微孔板和氧化硅包被微孔板）和对照微孔板上（96孔聚苯乙烯板），每一种微孔板上包被 8个孔。包被后用牛血清白蛋白溶液封闭后备用。本实施例中的对照酶标板为以 96孔板为片基按照上述包被方法包被有 EBV VCA 一 P18抗原的酶标板。

(2) 从活性纳米粒子制备纳米结构活性载体:

含有 EBV VCA-P18抗原和氧化硅纳米粒子 (STN-3 )的活性纳米粒子的制备方法同例 2中活性纳米粒子的制备方法。

将 EBV VCA— P18抗原浓度为 O. igml的活性纳米粒子中的纳米粒子浓度 (w/v) 为 25000, 按公知的酶标板包被方法包被到表 3中的 96孔板微孔内，包被 8个孔，包被后用牛血清白蛋白溶液封闭后备用。

2) 应用

在本实施例中，所用样品为 EBV IgA阳性血清、 EBV IgA阴性血清。所有的样品均经使用经典的 ELISA方法在血清 20倍稀释反应条件下预先检测。

实验时 2种样品分别加入上述对照酶标板及 3个纳米结构酶标板中，每种样品加 4个反应池。加样时样品作适当稀释，加样量为 ΙΟΟμ Ι, 反应温度 37°C。洗涤液每次加入量为 300μ 1，洗涤 3次。标记物为酶标记的羊抗人 IgA (北京天坛生物制品股分有限公司），加入量为 100μ1，反应温度 37度，反应时间 30分钟。加入底物的反应条件和与经典的 ELISA法相同。利用酶标仪（Thermo Labsystems, 上海雷勃分析仪器有限公司）进行比色分析， 8 孔平均结果根据 Cut— off值判定阴（一）阳 (+) 性，结果见表 10。

表 10

由表 10中的结果可见，纳米结构酶标板比对照酶标板至少具有较高的灵敏度，还有更快的反应速度。实施例 15: 多肽定量或 /和定性检测试剂盒的制备及应用（2)

本实施例试剂盒为含纳米结构活性载体的快捡试剂盒。

1 ) 试剂盒的制备

( 1 ) 纳米粒子包被平面层析试纸条的制备

本实施例所用的片基为硝酸纤维膜条（福建泉州长立生化有限公司）和尼龙纤维膜条（福建泉州长立生化有限公司），所用的纳米粒子分别为氧化硅纳米粒子（STN— 3 ) (浙江舟山明日纳米材料有限公司）和氧化硅（LUDOX AS— 40) ( Sigma— Aldrich公司）。

本实施例中所用的纳米粒子包被平面层析试纸条的制备方法为：将浓度为 1/12500至 1/25000 (w/v)的纳米粒子液与片基接触，在室温下反应 5小时，再用蒸馏水反复清洗。

对照片基为未用含纳米粒子缓冲液处理的硝酸纤维膜条和尼龙纤维膜条。 (2) 纳米结构活性载体的快捡试剂条的制备

本实施例所用配基为丙肝病毒抗原（HCVAG) (中国北京人民医院肝病研究所）。将浓度 0.5 mg/ml的丙肝病毒抗原（HCV AG)分别在上述制备的 4种纳米结构平面层析带和 2种对照片基上进行点样（检测线），再按常规方法分别点上兔抗羊 IgG质控线后用牛血清白蛋白溶液封闭，再组装上加样区、胶体金标记羊抗人标记物区、吸水区组合而成。

对照快检试剂条为其中以对照片基制备的快检试剂条。

2)应用

在本实施例中，样品 1和 2分别为 HCV抗体阳性血清和 HCV抗体阴性血清，所有的样品均预先用经典的 ELISA方法检测确定其阴、阳性。

实验时， 2种样品分别加入上述制备的 6种快检试纸条。加样时样品作适当稀释，加样量为 50 l，加样后接着加入洗涤液试纸条缓慢吸至质控线出现。结果见表 11。表 11

由以上表 11的结果可以看出，纳米粒子包被快检试剂条比对照试剂条仅需要短一倍的时间。实施例 16：纳米结构活性载体分离介质的制备及应用

本实施例制备的分离介质为层析固定相。

1 )制备

本实施例中所用配基为 DEAE—葡聚糖（Phamiacia公司）、所用纳米粒子为表 1中的氧化硅纳米粒子 (STN— 3)、所用载体为平均粒径 60 u m的用于层析的硅胶粒子（中国科学院化学研究所）。

将浓度为 1/百万（w/v) 的 DEAE—葡聚糖溶液与浓度 1/6250 (w/v) 的氧化硅纳米粒子 ( STN-3 ) 混合并在室温下搅拌 4小时，然后将预干燥的硅胶粒子浸泡于其中，再按照本发明之一发明人发表的方法（参考本发明发明人之一的文章（COATED SILICA SUPPORTS FOR HIGH-PERFORMANCE AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF PROTEIN, Journal of Chromatography, 476, ( 1989) 195-203)进行葡聚糖交联并得 DEAE—葡聚糖 /纳米粒子 /硅胶粒子复合物。实际上，由于在纳米葡聚糖的引入，其还可以应用经典的葡聚糖衍生方法衍生出多种层析固定相出来。

作为对比的 DEAE—葡聚糖 /硅胶粒子复合物的制备方法参考本发明之一发明人发表的方法（同上）。

2) 配基 /纳米粒子 /载体复合物分离介质的应用

本实施例检测了上述硅胶粒子、 DEAE—葡聚糖 /硅胶粒子复合物和 DEAE 一葡聚糖 /纳米粒子 /硅胶粒子复合物的动力学吸附容量。动力学吸附容量检测中，用于填充上述介质的柱子内径 0.5 cm和长度 2 cm, 缓冲液为 0.01M Tris— HCl/pH 7.40, 流速为 l ml/min, 所用层析仪为 HP 1090，所用样品为人白蛋白。按照公知的人白蛋白动力学吸附容量分别为 1.2 mg/mK 7.8 mg/ml和 13.5 mg/ml, 其中 DEAE—葡聚糖 /纳米粒子 /硅胶粒子复合物具有最高的动力学吸附容量。实施例 17: HIV检测核酸芯片检测

1、 HIV芯片制作

本例使用的芯片为本发明的纳米结构芯片，其中片基为环氧基玻片（表 3)，活性试剂为公开的 HIV病毒保守区 8种靶基因（其中 SK区 6个、 P区 1个、 C 区 1 )，活性纳米粒子为活性试剂包被的氧化硅 (LUDOX AS - 40)。活性纳米粒子制备方法如实施例 2，纳米结构芯片制备方法及鉴定方法如实施例 4。 2、样品准备

将已经过煮沸 10分钟灭活的血液样品，按常规方法从中提取 DNA。提取的 DNA加热至 98°C，速冷至 4°C以下，用变性缓冲液处理。变性处理的 DNA 经去除变性缓冲液，换为标记缓冲液后，用罗丹明进行标记，标记反应完成后，用离心层析法去除游离的罗丹明备用。

3、检测

将上述 2个血液样品制得的标记 DNA样品加入杂交液混合，加入比例分别为 9； 1： 99； 1： 199；再将 6个不同稀释度的样品加入到 6块芯片，各加 4 个反应池，放入湿盒于 42 °C反应 60分钟，芯片取出后用缓冲液冲洗 3遍，乙醇冲洗后干燥。用激光共聚焦扫描仪检测，图像处理软件处理后得到结果。表 15为一块芯片上 4个反应池的多个样点的综合评判结果。

表 15

检测心斤样品稀释倍数检测结果

1 对照片 10 +

2 对照片 100 _

3 对照片 400 ―

4 纳米片 10 +

5 纳米片 100 +

6 纳米片 400 ―

Claims

权利要求

1、一种用于分离或 /和分析的纳米结构载体，其包含纳米结构区，所述纳米结构区包含常规固相载体及其上固定的纳米结构，所述纳米结构包含非定向排列的纳米结构单元，所述纳米结构单元包括凸出高度大于 3 nm、且凸出半高处至少一维尺寸在 1一 500 纖、优选 1― 1 OOnm之间的纳米凸体，且所述纳米凸体在所述纳米结构区中的分布密度大于 1个 / μ m²、优选大于 10个 / μ m²。
2、根据权利要求 1所述的纳米结构载体，其中所述纳米结构区中纳米结构覆盖率大于 20%、优选大于 30%。
3、根据权利要求 1或 2所述的纳米结构载体，其中所述纳米结构区的表面积提高率大于 200%、优选大于 300%、更优选大于 400%。
4、根据权利要求 1一 3之一所述的纳米结构载体，其中所述纳米结构区的吸附能力提高率大于 115 %、优选大于 130%、更优选大于 150%。
5、根据权利要求 1一 4之一所述的纳米结构载体，其中所述纳米结构区的吸附量衰减速率比小于 90%、优选小于 80%。
6、根据权利要求 1一 5之一所述的纳米结构载体，其中所述纳米结构单元由纳米粒子形成，所述纳米粒子其粒径尺寸 1一 500nm、优选 1一 100nm、更优选 1 — 50nm。
7、根据权利要求 6所述的纳米结构载体，其中所述纳米粒子包括无机纳米粒子或 /和有机纳米粒子及它们的衍生物，所述无机纳米粒子包括非磁性无机纳米粒子和磁性无机纳米粒子，所述非磁性无机纳米粒子包括非磁性金属纳米粒子和非磁性非金属纳米粒子，所述衍生物包括结合有表面基团或 /和包被有机物的衍生物。
8、根据权利要求 7所述的纳米结构载体，其中所述无机非磁性非金属纳米粒子包括氧化硅粒子、氧化钛粒子、氧化铝粒子在内的氧化物纳米粒子。
9、根据权利要求 7所述的纳米结构载体，其中所述非磁性金属纳米粒子包括金粒子、钒粒子、铅粒子。
10、根据权利要求 1一 9之一所述的纳米结构载体，其中所述常规固相载体包括由以下之一组或多组材料或其衍生物制成的尺寸大于 lOOOnm的固相载体：玻璃、硅片、硅胶、陶瓷、金属氧化物、金属、聚合物材料及它们的复合物，所述衍生物包括结合有表面基团或 /和包被有机物的衍生物。
11、根据权利要求 8— 10之一所述的纳米结构载体，其中所述表面基团包括下述一种或多种基团：氨基、醛基、环氧基、氨基肼、二乙氨基乙基、二乙基一（2—羟丙基）氨乙基、羧甲基、磺酸丙基、巯乙基吡啶基、硅氧垸基、硫醇基、垸基；所述包被有机物包括下述一种或多种有机物：包括聚乙烯吡咯垸酮、吐温类表面活性剂在内的表面活性剂，包括聚氨基酸在内的聚电解质，包括聚硅氧烷在内的亲油有机物，包括葡聚糖衍生物、琼脂糖衍生物、纤维素衍生物、聚丙烯酰胺在内的离子交换聚合物，和包括肝素钠、抗原、抗体在内的亲和物质。
12、根据权利要求 1一 11之一所述的纳米结构载体，其中所述纳米结构载体包括：纳米粒子 /片基复合物、纳米粒子 /微米粒子复合物或纳米粒子 /微米粒子 / 片基复合物。
13、根据权利要求 1一 12之一所述的纳米结构载体，其为下述组之一：分析芯片纳米结构片基、用以制作酶标板的纳米结构微孔板、平面层析纳米结构片基、纳米结构分离固定相、及包括纳米结构层析凝胶在内的纳米结构分离固定相。

14、一种制备如权利要求 1一 13之一所述的纳米结构载体的方法，其包括将所述纳米粒子的悬浮液与所述常规固相载体接触并进行固定化反应，且固定化反应时所述悬浮液中的纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml)为五百分之一至十五万分之一，或纳米粒子摩尔浓度为 0.12— 37.4 nM。

15、根据权利要求 14所述的方法，其中所述纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml) 为五千分之一至十五万分之一，或纳米粒子摩尔浓度为 0.12— 3.74 nM。

16、根据权利要求 14所述的方法，其中所述纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml) 为二万分之一至六万分之一，或纳米粒子摩尔浓度为 0.31— 0.93 nM。
17、根据权利要求 14一 16之一所述的方法，其还包括下述一种或多种功能化处理：

(a) 先将所述纳米粒子或 /和所述常规固相载体功能化，再进行所述接触和固化；

(b) 先进行所述接触和固化，再进行所述纳米粒子或 /和所述常规固相载体的功能化；

(c) 将所述纳米粒子或 /和所述常规固相载体功能化，再进行所述接触和固化，然后再进行所述纳米粒子或 /和所述常规固相载体的功能化;

其中：所述功能化处理包括引入所述表面基团或 /和包被有机物。
18、根据权利要求 14一 17之一所述的方法，其还包括对所述固定化反应后的产物进行化学交联处理。
19、根据权利要求 14一 18之一所述的方法，其还包括对所述固定化反应后的产物进行热处理，所述热处理包括在 30°C以上、优选 37°C以上、更优选 40°C 以上但固相载体的软化温度以下加温然后冷却。
20、一种用于分离或 /和分析反应器的纳米结构活性载体，其包含纳米结构活性区，所述纳米结构活性区包含常规固相载体及其上固定的活性纳米结构，所述活性纳米结构包含非定向排列的纳米结构单元及其上固定的活性试剂，所述纳米结构单元包括凸出高度大于 3 nm、且凸出半高处至少一维尺寸在 1一 500 nm、优选 1一 lOOrnn之间的纳米凸体，且所述纳米凸体在所述纳米结构区中的分布密度大于 1个 / μ πι<sup>2</sup>、优选大于 10个 / μ ιη<sup>2</sup>。
21、根据权利要求 20所述的纳米结构活性载体，其中所述纳米结构活性区中纳米结构覆盖率大于 30%、优选大于 75 %。
22、根据权利要求 20或 21所述的纳米结构活性载体，其中所述纳米结构活性区的表面积提高率大于 200%、优选大于 400%、更优选大于 600%，或 /和吸附能力提高率大于 115 %、优选大于 130%、更优选大于 150%。
23、根据权利要求 20— 22之一所述的纳米结构活性载体，其中所述纳米结构活性区的灵敏度提高率大于 120%、优选大于 150%、更优选大于 200%。
24、根据权利要求 20— 23之一所述的纳米结构活性载体，其中所述纳米结构活性区的识别信号衰减速率比小于 90%、优选小于 70%，或 /和吸附量衰减速率比小于 90%、优选小于 80%。
25、根据权利要求 20— 24之一所述的纳米结构活性载体，其中所述分离或 / 和分析的目标物包括多肽或 /和与多肽相互作用的药物。
26、根据权利要求 20— 25之一所述的纳米结构活性载体，其中所述分离或 / 和分析的目标物包括核酸或 /和与核酸相互作用的药物。
27、根据权利要求 20— 26之一所述的纳米结构活性载体，其为活性纳米粒子与固相载体的复合物，其中：所述活性纳米粒子包含纳米粒子和固定于其上的一种或多种所述活性试剂或任选存在的连接剂，所述纳米粒子粒径为 1一 500nm、优选 1一 100nm、更优选 1一 50nm，所述固相载体为常规固相载体或权利要求 1一 14之一所述纳米结构载体。
28、根据权利要求 27所述的纳米结构活性载体，所述纳米粒子包括权利要求 6— 11之一所述纳米粒子，优选为所述无机非磁性非金属纳米粒子及其所述衍生物。 29、根据权利要求 27或 28之一所述的纳米结构活性载体，其包括下述组之 -: 活性纳米粒子 /片基复合物、活性纳米粒子 /微米粒子复合物、活性纳米粒子 /纳米结构片基复合物、活性纳米粒子 /纳米结构微米粒子复合物、及它们的组合物。
30、根据权利要求 20— 26之一所述的纳米结构活性载体，其为活性试剂与权利要求 1一 13之一所述纳米结构载体的复合物。
31、根据权利要求 30所述的纳米结构活性载体，其包括下述组之一：活性试剂 /纳米结构片基复合物、活性试剂 /纳米结构微米粒子复合物、及它们的组合物。
32、根据权利要求 20— 31之一所述的纳米结构活性载体，其包括纳米结构分析芯片。
33、根据权利要求 20— 31之一所述的纳米结构活性载体，其包括下述组之一：纳米结构酶标板、纳米结构平面层析试剂条、及包括纳米结构层析活性凝胶在内的纳米结构活性分离固定相。

34、一种制备如权利要求 21— 33之一所述的纳米结构活性载体的方法，其包括将所述活性纳米粒子的悬浮液与所述常规固相载体接触并进行固定化反应，而且：固定化反应时所述悬浮液中的纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml) 为五百分之一至十五万分之一，或纳米粒子摩尔浓度为 0.12— 37.4 nM_; 所述接触为表面直径小于 0.5mm的点接触或表面直径大于 0.'5mm的面接触。

35、根据权利要求 34所述的方法，其中所述纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml) 为五千分之一至十五万分之一，或纳米粒子摩尔浓度为 0.12— 3.74 nM。

36、根据权利要求 34所述的方法，其中所述纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml) 为二万分之一至六万分之一，或纳米粒子摩尔浓度为 0.31— 0.93 nM。
37、根据权利要求 34— 36之一所述的方法，其还包括对所述固定化反应后的产物进行化学交联处理。
38、根据权利要求 34— 37之一所述的方法，其还包括对所述固定化反应后的产物进行热处理，所述热处理包括在任选存在的活性试剂保护剂保护下在 30 度以上、优选 37度以上但固相载体的软化温度以下加温然后冷却。
39、一种分析或 /和分离装置，其含有权利要求 21— 33之一所述的纳米结构载体或 /和权利要求 1一 14之一所述的纳米结构载体。
40、根据权利要求 39所述的装置，其包括下述组之一的分析芯片：微阵列芯片、微阵列一流路芯片及流路芯片，其中所述流路包括含所述纳米结构载体的纳米结构流路、或 /和含所述纳米结构活性载体的纳米结构活性流路。
41、根据权利要求 39所述的装置，其包括下述组之一：酶标板、平面层析试剂条、及包括层析柱在内的含分离固定相的装置。
42、一种定量或 /和定性分析标记系统，其含标记物，且至少一种标记物为标记标记活性试剂 /纳米结构 /分子标记物质复合物，所述纳米结构包括纳米粒子或 /和由纳米粒子组成的结构，且所述纳米粒子为粒径 1— 100 urn且本身不是标记物质增强剂的非磁性无机非金属粒子。
43、根据权利要求 42所述的标记系统，其中所述非磁性无机非金属粒子包括权利要求 8或 9或 11所述非磁性无机非金属粒子。
44、根据权利要求 42或 43所述的标记系统，其中所述分子标记物质包括下述一种或多种物质：荧光物质、化学发光物质、化学发光催化剂、有色金属盐、染料和颜料。
45、一种定量或 /和定性分析方法，其中包括使用权利要求 39— 41之一所述分析或 /和分离装置来捕捉或 /和输运或 /和分离样品目标物，及使用权利要求 42 一 44之一所述定量或 /和定性分析标记系统进行标记。
46、一种定量或 /和定性检测试剂盒，其包含权利要求 39— 41之一所述分析或 /和分离装置或装置和权利要求 42— 44之一所述定量或 /和定性分析标记系统。
47、根据权利要求 46所述的试剂盒，其为用于多肽或 /和与多肽相关的药物分析的试剂盒，包括多肽分析芯片试剂盒、多肽分析酶标试剂盒、或多肽分析平面层析试剂盒。
48、根据权利要求 46所述的试剂盒，其为用于核酸或 /和与核酸相关的药物分析的试剂盒。
49、一种定量或 /和定性分析方法，其包括使用权利要求 39— 41之一所述分析或 /和分离装置来捕捉或 /和输运或 /和分离样品目标物。
50、一种定量或 /和定性检测试剂盒，其包含权利要求 39— 41之一所述分析或 /和分离装置或装置。

51、根据权利要求 50所述的试剂盒，其为用于多肽或 /和与多肽相关的药物分析的.试剂盒，包括多肽分析芯片试剂盒、多肽分析酶标试剂盒、或多肽分析平面层析试剂盒。
52、根据权利要求 50所述的试剂盒，其为用于核酸或 /和与核酸相关的药物分析的试剂盒。 53、一种定量或 /和定性分析方法，其包括使用权利要求 42— 44之一所述定量或 /和定性分析标记系统进行标记。
54、一种定量或 /和定性检测试剂盒，其包含权利要求 42— 44之一所述定量或 /和定性分析标记系统。
55、根据权利要求 54所述的试剂盒，其为用于多肽或 /和与多肽相关的药物分析的试剂盒，包括多肽分析芯片试剂盒、多肽分析酶标试剂盒、或多肽分析平面层析试剂盒。
56、根据权利要求 54所述的试剂盒，其为用于核酸或 /和与核酸相关的药物分析的试剂盒。
57、一种芯片检测方法，其至少包括以下步骤：

(a)准备样品、芯片及芯片标记系统，所述样品可能含有目标物，所述芯片包含固定化活性试剂阵列，所述芯片标记系统包含标记物、着色剂、和任选存在的着色控制剂及着色定型剂，且所述标记物包含标记活性试剂 /纳米结构 / 催化剂复合物，其中所述纳米结构包括纳米粒子或 /和由纳米粒子组成的结构，所述纳米粒子为粒径 1一 100 nm的无机纳米粒子或 /和有机纳米粒子或 /和它们的衍生物，所述无机纳米粒子包括非磁性无机纳米粒子和磁性无机纳米粒子，所述非磁性无机纳米粒子包括非磁性金属纳米粒子和非磁性非金属纳米粒子，所述衍生物包括结合有表面基团或 /和包被有机物的衍生物；

(b)用所述固定化活性试剂固定所述目标物，然后通过所述目标物与所述标记物中的标记活性试剂反应，固定所述标记物中的纳米结构及其上的催化剂；或

(c)使所述目标物结合在所述全部或部分标记物上，然后通过所述目标物与所述固定化活性试剂反应，固定所述标记物中的纳米结构及其上的催化剂；

(d)加入所述着色剂并在所述催化剂作用下、在所述纳米结构上而不是在所述固定化活性试剂与所述目标物的结合处进行着色反应，所述可见光着色反应中还包括任选地使用着色控制剂及定型剂；

(e) 对步骤（d) 中着色反应的结果、及步骤（b)或（c) 中着色剂的着色结果进行检测、分析。
58、根据权利要求 57所述的方法，所述标记物中还含有染色剂，在所述着色反应前、反应中、或 /和反应后还进行染色反应，其中所述染色剂存在于下述之一种或多种标记物中：标记活性试剂 /纳米结构 /催化剂 /染色剂复合物、标记活性试剂 /纳米结构 /染色剂复合物、及标记活性试剂 /染色剂复合物，其中所述纳米结构为权利要求 57所述纳米结构。
59、根据权利要求 57或 58所述的方法，其中所述标记系统中的所述纳米粒子包括权利要求 6— 11之一所述纳米粒子。
60、根据权利要求 57或 58所述的方法，其中所述催化剂包括金属化合物还原反应的金催化剂或 /和酶催化剂，所述染色剂包括染料，所述着色剂包括金属化合物。
61、一种芯片检测方法，其至少包括以下步骤：

(a)准备样品、芯片及芯片标记系统，所述样品可能含有目标物，所述芯片包含固定化活性试剂阵列，所述芯片标记系统包含标记物、着色剂、和任选存在的着色控制剂及着色定型剂，且所述标记物包含活性试剂、催化剂、染色剂及任选存在的纳米结构，其中所述纳米结构、染色剂、催化剂、着色剂分别为权利要求 57— 60之一所述的芯片标记系统中所述纳米结构、染色剂、催化剂、着色剂；

(b)在所述芯片中加入所述样品，在所述固定化活性试剂与可能存在的所述目标物反应后加入所述标记物和着色剂，并对所述反应处进行染色和着色；或

(c )将所述样品与所述全部或部分标记物混合，在所述标记活性试剂与可能存在的所述目标物反应后加入所述芯片中，在所述固定化活性试剂与可能存在的所述目标物反应后加入所述着色剂，并对芯片中所述反应处进行染色和着色；

( d) 对步骤（b ) 或（c) 中染色和着色的结果进行检测、分析。
62、一种芯片试剂盒，其包含标记系统，其中至少一个所述标记系统为权利要求 57— 60之一或权利要求 61所述芯片标记系统。
63、根据权利要求 62所述的试剂盒，其为用于多肽或 /和多肽相关药物分析的试剂盒。
64、根据权利要求 62所述的试剂盒，其为用于核酸或 /和核酸相关药物分析的试剂盒。
65、一种多肽分析的分析芯片检测方法，其至少包括下述之一个步骤：

( a)将样品与磁纳米粒子混合；

(b )将样品与活性试剂 /磁纳米粒子复合物混合；

( c)将样品与芯片接触并反应，反应时可任选存在外加磁场，所述芯片为纳米结构芯片，且其中所述纳米结构包含磁纳米粒子；

( d) 将标记活性试剂 /磁纳米粒子 /分子标记物质复合物用于标记反应，在标记时可任选存在外加磁场，所述活性试剂 /磁纳米粒子 /分子标记物质复合物含有一种或多种分子标记物质、一种或多种磁纳米粒子、一种或多种活性试剂以及任选存在的封闭剂的混合物或纯化物；

其中：所述磁纳米粒子在三维空间中至少有一维为 1一 200 nm、优选 1一 100 讓、更优选 1一 50 nm，且其本身不是分子标记物质增强剂的磁粒子及其衍生物; 所述活性试剂选自以下组中能与多肽作用的物质：多肽、多糖、维生素、抗生素、病毒、细胞、及功能有机物，所述活性试剂 /磁纳米粒子 /分子标记物质复合物在标记时的磁纳米粒子浓度为：纳米粒子重量 /体积浓度 (g/ml)大于三万分之一、或纳米粒子摩尔浓度大于 0.25nM，优选为纳米粒子重量 /体积浓度 (g/ml)大于三千分之一、或纳米粒子摩尔浓度大于 2.4nM，更优选为纳米粒子重量 /体积浓度（g/ml)大于五百分之一、或纳米粒子摩尔浓度大于 15.0nM。
66、根据权利要求 65所述的方法，其中所述磁粒子选自于包括四氧化三铁、三氧化二铁在内的铁氧体及其衍生物，而所述衍生物包括表面含衍生基团的表面修饰或 /和功能有机物包被衍生物。
67、根据权利要求 65或 66所述的方法，其中所述外加磁场是脉冲式的。
68、一种多肽分析芯片试剂盒，其包含如权利要求 65或 66所述磁纳米粒子。
69、一种分离方法，其包括使用如权利要求 39— 41之一所述分离装置。