CN104007268A - 一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及应用，首先在96孔板上修饰胶体金，利用金-硫键的结合把一端含巯基另外一端含生物素的肽连接到胶体金-96孔板上。再制备出链霉亲和素-蔗糖转化酶-胶体金探针(streptavidin-转化酶-AuNPs)。通过生物素和亲和素的特异性结合，从而得到streptavidin-转化酶-AuNPs-肽修饰的96孔板(基质金属蛋白酶-2生物传感器)。MMP-2可以把含特异性序列PLGVR的肽切割成两部分，streptavidin-转化酶-AuNPs在上清液中，吸出上清液加入果糖溶液，根据血糖仪读数，从而实现MMP-2浓度的测定。本发明的传感器具有很高的选择性和检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于分析化学与生物传感器领域，具体为一种检测基质金属蛋白酶-2生物传感器的制备方法及其应用。另外，本发明还涉及所述的生物传感器检测基质金属蛋白酶-2的方法。
背景技术
肿瘤浸润转移的过程是肿瘤细胞与宿主相互作用的多环节过程。肿瘤细胞分泌产生多种蛋白水解酶参与降解细胞外基质。基质金属蛋白酶是其中的主要酶类，基质金属蛋白酶是一个大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-7(MMP-7)除可以降解Ⅳ型胶原外，还能降解Ⅴ、Ⅶ型胶原及明胶，与肿瘤侵袭转移的关系最为密切。近年来，MMP-2的结构和功能得到了广泛、深入的研究。很多研究结果表明，MMP-2在多种疾病的病理进程中发挥着关键的作用。一些研究者根据实验结果指出，通过检测MMP-2可以估计这些疾病的病理进程，也就是MMP-2可以作为这些疾病的预后指标。据此，研制准确、灵敏、快速测定MMP-2、MMP-7活性的方法具有极高的医学应用价值。
基质金属蛋白酶常用测定方法有酶联免疫吸附法(Patel,S.；Sumitra,G.；Koner,B.C.；Saxena,A.Clin.Biochem.2011,44,869-872)；表面等离子共振法(Pieper-Fürst,U.；Kleuser,U.； W.F.M.；Warsinke,A.；Scheller,F.W.Anal.Biochem.2004,332,160-167)；凝胶电泳法(Barbosa,F Jr.；Gerlach,R.F.；Tanus-Santos,J.E.Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.2006,98,559-564.Yamane,T.；Mitsumata,M.；Yamaguchi,N.；Nakazawa,T.；Mochizuki,K.；Kondo,T.；Kawasaki,T.；Murata,S.；Yoshida,Y.；Katoh,R.Cell Tissue Res.2010,340,471-479)；荧光法(Lefkowitz,R.B.；Schmid-G.W.；Heller,M.J.Anal.Chem.2010,82,8251-8258)；酶切割超磁性法(Zhao,M.；Josephson,L.；Tang,Y.；Weissleder,R.Angew.Chem.,Int.Ed.2003,42,1375-1378)；磁共振成像法(Harris,T.J.；von Maltzahn,G.；Derfus,A.M.；Ruoslahti,E.；Bhatia,S.N.Angew.Chem.,Int.Ed.2006,45,3161-3165)和荧光共振能量转移法(Wang,Y.H.；Shen,P.；Li,C.Y.；Wang,Y.Y.；Liu,Z.H.Anal.Chem.2012,84,1466-1473)等。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对基质金属蛋白酶-2的检测要求，但方法复杂，需要贵重的仪器，检测成本高。所以必须发展一种方法简单、成本低廉的新型检测方法。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及应用，以及提供一种采用所述的生物传感器检测基质金属蛋白酶-2的方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)将100μL0.1～10μM肽溶液加到胶体金修饰的96孔板中，37℃反应12～60h，用Tris-HCl溶液冲洗各孔，得肽修饰胶体金-96孔板；
(2)加10μL0.1～2mg/mL链霉亲和素溶液于转化酶-AuNPs(转化酶修饰胶体金)溶液中，置于恒温振荡器上震荡4～32h。然后以8000～14000转速下离心，将沉淀加1mL Tris-HCl溶液分散，得链霉亲和素修饰转化酶胶体金(streptavidin-转化酶-AuNPs)；
(3)取streptavidin-转化酶-AuNPs溶液加到肽修饰胶体金-96孔板中反应，之后用Tris-HCl溶液冲洗各孔，从而得基质金属蛋白酶-2生物传感器；
其中：所述的胶体金修饰的96孔板按如下的方法制备而成：96孔板用无水乙醇和水依次超声处理3次，然后在37℃下干燥。将100μL胶体金溶液滴涂在处理好的96孔板中，在室温条件下使溶剂自然挥发，即得胶体金修饰96孔板(胶体金-96孔板)；
所述的转化酶修饰胶体金按如下的方法制备而成：用NaOH溶液将胶体金溶液pH调至 7.0，取0.2～2mL胶体金溶液于离心管中，然后加入500μL0.1～2mg/mL转化酶溶液，4℃反应2～12h，8000～14000转速下离心，并用PBS洗涤后分散于磷酸缓冲溶液中，即得；
所述的肽的部分序列为CGHHYYGPLGVRGC-biotin。
优选的，上述的生物传感器的制备方法，其中所述的金纳米粒子按如下方法制备而成：在圆底烧瓶中加入100mL、0.01％的HAuCl4，搅拌加热至沸腾，然后快速加入1.8mL、1％的Na3C6H5O7，再加热、搅拌10分钟，冷却至室温，即得。
一种利用上述方法制备的生物传感器检测基质金属蛋白酶-2含量的方法，使用不同浓度的基质金属蛋白酶-2加入基质金属蛋白酶-2生物传感器中，然后取出上清液于0.5mL小离心管中，准确加入100μL、0.5mM蔗糖溶液，37℃下反应30～180分钟，用血糖仪检测生成葡萄糖含量，以血糖仪读数(Glucose meters signal(mg/dL))为分析信号，进行基质金属蛋白酶-2的测定。
由于上述方法制备的生物传感器可以检测基质金属蛋白酶-2，因此，本发明提供了上述的生物传感器在检测基质金属蛋白酶-2含量中的应用。
与现有技术相比，本发明涉及的生物传感器具有如下优点和显著地进步：金纳米粒子提供相对大的比表面积用于负载转化酶，使得本发明设计的生物传感器具有高灵敏度。另外，根据实验血糖仪读数(图6)可以看出，当本发明的生物传感器用于检测MMP-1，MMP-2，BSA和IgG时，其血糖仪读数远远低于检测基质金属蛋白酶-2的血糖仪读数，这说明该生物传感器具有很高的选择性来检测基质金属蛋白酶-2。以胶体金修饰的96孔板为基质，通过肽链上的巯基和胶体金易于固定肽链，操作简单。其次，以血糖仪为检测仪器，操作简单、能够及时快速的提供定量的结果，检测仪器体积小、价格便宜，可便携。再者，以市场上价格便宜的96孔板为载体可以节约测定成本。因此，本发明涉及的生物传感器在构建检测蛋白质的研究方法中体现出良好的发展前景。
附图说明
图1检测基质金属蛋白酶-2的原理图。
图2为肽切割溶液酸度对血糖仪读数的影响。
图3为切割时间对血糖仪读数的影响。
图4为探针的用量对血糖仪读数的影响。
图5为MMP-2标准曲线。横坐标为MMP-2浓度(Cmmp-2(pg/mL))。
图6方法选择性图。本发明的生物传感器检测不同物质(Sample)MMP-7，MMP-1，BSA，IgG和MMP-2的血糖仪读数。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
本发明涉及的一种检测基质金属蛋白酶-2生物传感器，先在96孔板上修饰胶体金，利用金-硫键的结合把一端含巯基一端含生物素的肽连接到胶体金-96孔板上。再制备出链霉亲和素-蔗糖转化酶-胶体金探针(streptavidin-转化酶-AuNPs)。通过生物素和亲和素的特异性结合，从而得到streptavidin-转化酶-AuNPs-肽修饰的96孔板(基质金属蛋白酶-2生物传感器)。MMP-2可以把含特异性序列PLGVR的肽切割成两部分，streptavidin-转化酶-AuNPs在上清液中，吸出上清液加入蔗糖溶液，根据血糖仪读数，从而实现MMP-2浓度的测定。
本发明是通过以下措施来实现的：一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用胶体金溶液滴涂在处理好的96孔板中，得胶体金修饰96孔板；
(2)将肽溶液加到胶体金修饰96孔板中，得肽修饰胶体金-96孔板；
(3)利用NaOH溶液调节胶体金溶液pH，与转化酶溶液反应，得转化酶修饰胶体金；
(4)利用链霉亲和素溶液和转化酶-AuNPs溶液，制备链霉亲和素修饰转化酶胶体金(streptavidin-转化酶-AuNPs)；
(5)构建基质金属蛋白酶-2生物传感器：
所述基质金属蛋白酶-2生物传感器的制备包括如下步骤：
(1)96孔板用无水乙醇和水依次超声处理3次，每次超声时间约15分钟，然后在37℃下干燥。将100μL直径为20±3nm胶体金溶液滴涂在处理好的96孔板中，在室温条件下使溶剂自然挥发，得胶体金修饰96孔板(胶体金-96孔板)。
(2)将100μL10μM肽溶液加到胶体金修饰的96孔板中，37℃反应48h，用pH8.0Tris-HCl溶液洗涤各孔三次，得肽修饰胶体金-96孔板。
(3)为了制备转化酶修饰胶体金，用NaOH溶液将胶体金溶液pH调至7.0。取1mL胶体金溶液于离心管中，然后加入500μL1mg/mL转化酶溶液，4℃反应6h，得转化酶修饰胶体金(转化酶-AuNPs)，4℃储存备用。
(4)加10μL1mg/mL链霉亲和素溶液于转化酶-AuNPs溶液中，置于恒温振荡器上震荡16h。然后以12000r/min的转速离心30min，将沉淀加1mL pH8.0Tris-HCl溶液分散，得探针，即链霉亲和素修饰转化酶胶体金(streptavidin-转化酶-AuNPs)，4℃储存备用。
(5)将100μL streptavidin-转化酶-AuNPs溶液加到肽修饰胶体金-96孔板中反应2h。用50μL pH8.0Tris-HCl溶液洗涤各孔三次，得基质金属蛋白酶-2生物传感器。
一种利用上述方法制备的生物传感器检测基质金属蛋白酶-2含量的方法，使用100μL不同浓度的基质金属蛋白酶-2加入基质金属蛋白酶-2生物传感器中，然后取出上清液于1.5mL小离心管中，准确加入100μL、0.5mM蔗糖溶液，37℃下反应30～180分钟，用血糖仪检测生成葡萄糖含量，以血糖仪读数为分析信号，进行基质金属蛋白酶-2的测定。
本发明检测条件，具体特征如下：
(1)酸度的影响由于MMP-2是一种蛋白酶，因此肽切割反应溶液酸度的控制对于分析检测的灵敏度起着重要的作用。考察了pH在6.3～8.5范围内溶液酸度对检测MMP-2的影响。随着pH的增加，血糖仪读数有所增大，随后又有所下降，当pH为7.4时达到最佳(图2)。故选择pH7.4为最佳条件。
(2)切割时间对信号强度的影响实验表明，MMP-2加入传感器中进行肽切割时间(Cleavage time(min))对血糖仪读数有很大的影响。如图3所示，在5～15min范围内，血糖仪读数很小，20min后血糖仪读数迅速增加，直到35min时达到最大值，大于35min之后变化不大(图3)。因此实验确定切割时间最佳时间为35min。
(3)探针的用量对血糖仪读数的影响为了获得高灵敏度，我们考察了探针用量(Dose of NDA2-invertase-AuNPs(μL))对血糖仪读数的影响。固定MMP-2浓度为7.0pg/mL，当探针用量从50到200μL变化时，血糖仪读数逐渐变大，随后再增大探针用量，血糖仪读数基本不变(图4)，故分析测定过程中，探针用量选择为200μL。
3.4分析参数及工作曲线
当基质金属蛋白酶-2存在，发生水解作用将肽链切断，随着MMP-2浓度的增加，血糖仪读数增大。依本实验方法，根据MMP-2浓度和血糖仪读数，绘制标准工作曲线，如图5所示。MMP-2在0.8～540pg/mL范围内与血糖仪读数呈线性关系，线性回归方程为y＝-0.003x2+2.542x+2.968(y，血糖仪读数；x，MMP-2浓度，单位为pg/mL)。检出限为0.2pg/mL。
实施例：
1.实验部分
1.1仪器与试剂
Z-82A气浴恒温振荡器(全坛市医疗仪器厂)；Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机(上海市安亭科学仪器厂)；透明96孔聚苯乙烯微孔板(96孔板)(Corning公司)、怡成血糖仪(北京 怡成生物电子技术有限公司)。
三(2-羧乙基)膦(TCEP)购于天津市广成化学试剂有限公司；氯金酸(HAuCl4)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)购于国药集团化学试剂有限公司；蔗糖、柠檬酸钠购于天津市红岩化学试剂厂；基质金属蛋白酶-2(MMP-2)购自吉泰生物科技有限公司；蔗糖转化酶(简称转化酶)购于Sigma；肽：CGHHYYGPLGVRGC-bition由上海楚肽生物科技有限公司合成。
Tris-HCl溶液pH为8.0的配置方法：称量121.1g Tris置于2L烧杯中，加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加入浓盐酸调节所需要的pH为8.0，即得。
1.2实验步骤
1.2.1胶体金修饰96孔板制备
96孔板用无水乙醇和水依次超声处理3次，每次超声时间约15分钟，然后在37℃下干燥。将100μL直径为20±3nm胶体金溶液滴涂在处理好的96孔板中，在室温条件下使溶剂自然挥发，得胶体金修饰96孔板(胶体金-96孔板)。
1.2.2肽修饰胶体金-96孔板制备
将100μL10μM肽溶液加到胶体金修饰的96孔板中，37℃反应48h，用pH8.0Tris-HCl溶液洗涤各孔三次，得肽修饰胶体金-96孔板。
1.2.3转化酶修饰胶体金制备
为了制备转化酶修饰胶体金，用NaOH溶液将胶体金溶液pH调至7.0。取1mL胶体金溶液于离心管中，然后加入500μL1mg/mL转化酶溶液，4℃反应6h，得转化酶修饰胶体金(转化酶-AuNPs)，4℃储存备用。
1.2.4链霉亲和素修饰转化酶胶体金制备
加10μL1mg/mL链霉亲和素溶液于转化酶-AuNPs溶液中，置于恒温振荡器上震荡16h。然后以12000r/min的转速离心30min，将沉淀加1mL pH8.0Tris-HCl溶液分散，得探针，即链霉亲和素修饰转化酶胶体金(streptavidin-转化酶-AuNPs)，4℃储存备用。
1.2.5基质金属蛋白酶-2生物传感器的制备
将100μL streptavidin-转化酶-AuNPs溶液加到肽修饰胶体金-96孔板中反应2h。用50μL pH8.0Tris-HCl溶液洗涤各孔三次，得基质金属蛋白酶-2生物传感器。
1.2.6基质金属蛋白酶-2预处理
将胶原酶潜酶激活剂加入待测的MMP-2溶液中，使得APMA终浓度为1mM，37℃孵育1h。
1.2.7标准曲线绘制
将100μL预处理后的MMP-2一系列一定浓度的溶液加入上述基质金属蛋白酶-2生物传感器中，37℃下反应0.5h。取出上清液于0.5mL小离心管中，并加入100μL0.5mM蔗糖溶液，37℃下反应2h，用血糖仪检测生成葡萄糖含量，根据血糖仪读数和基质金属蛋白酶-2浓度关系得标准曲线。
1.2.8样品中基质金属蛋白酶-2含量测定
为了测定血清样品中基质金属蛋白酶-2含量，在200μL新鲜血清样品加入胶原酶潜酶激活剂(APMA)37℃孵育1h，然后取100μL加入基质金属蛋白酶-2生物传感器中，37℃下反应0.5h。取出上清液于0.5mL小离心管中，并加入100μL0.5mM蔗糖溶液，37℃下反应2h，用血糖仪检测生成葡萄糖含量，根据血糖仪读数和标准曲线计算样品中基质金属蛋白酶-2含量。
1.3结果与讨论
根据发明的方法对血液样品中MMP-2含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，测定结果见表1，样品测定回收率为98.9–102.2％，本发明的方法在MMP-2检测中具有精密度高的特点。
我们通过MMP-2特异性切割PLGVR肽序列，用便携式血糖仪实现MMP-2的测定。用血糖仪检测MMP-2，发现MMP-2浓度在0.8～540pg/mL范围内与血糖仪读数呈线性关系， 检出限为0.2pg/mL，快速简便，易于检测和推广。
本发明是基于基质金属蛋白酶-2切割肽，生物素-链霉亲和素特异性识别和转化酶标记纳米金技术机制研制了一种高灵敏检测基质金属蛋白酶-2的新型生物传感器。研制的传感器具有如下优势：金纳米提供相对大的比表面积用于负载酶水解试剂-转化酶；设计的生物传感器具有高灵敏度；用血糖仪作为检测仪器检测MMP-2，快速简便，易于检测和推广。因此，所设计的生物传感器在构建检测蛋白质、酶以及生物分子的研究方法中体现出良好的发展前景。
表1.样品分析测定结果
| 编号 | 含量a,b | 标准样品加入量 | 测得量 | 回收率(％) |
| 1 | 209.5 | 200.0 | 413.9 | 102.2 |
| 2 | 187.2 | 150.0 | 337.8 | 100.4 |
| 3 | 137.0 | 100.0 | 235.9 | 98.9 |
a9次测量结果
b单位：pg/mL
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>青岛科技大学
<120>一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及其应用
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Cys-Gly-His-His-Tyr-Tyr-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Cys 14
1 5 10
Claims (6)
1.一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及其应用，包括以下步骤：
(1)将100μL的0.1～10μM肽溶液加到胶体金修饰的96孔板中，37℃反应12～60h，用Tris-HCl溶液冲洗各孔，得肽修饰胶体金-96孔板；
(2)加10μL的0.1～2mg/mL链霉亲和素溶液于转化酶-AuNPs(转化酶修饰胶体金)溶液中，置于恒温振荡器上震荡4～32h；然后以8000～14000转速下离心，将沉淀加1mL Tris-HCl溶液分散，得链霉亲和素修饰转化酶胶体金(streptavidin-转化酶-AuNPs)；
(3)取streptavidin-转化酶-AuNPs溶液加到肽修饰胶体金-96孔板中反应，之后用Tris-HCl溶液冲洗各孔，从而得基质金属蛋白酶-2生物传感器；
其中：所述的胶体金修饰的96孔板按如下的方法制备而成：96孔板用无水乙醇和水依次超声处理3次，然后在37℃下干燥；将100μL胶体金溶液滴涂在处理好的96孔板中，在室温条件下使溶剂自然挥发，即得胶体金修饰96孔板(胶体金-96孔板)；
所述的转化酶修饰胶体金按如下的方法制备而成：用NaOH溶液将胶体金溶液pH调至7.0，取0.2～2mL胶体金溶液于离心管中，然后加入500μL0.1～2mg/mL转化酶溶液，4℃反应2～12h，8000～14000转速下离心，并用PBS洗涤后分散于磷酸缓冲溶液中，即得。
2.根据权利要求1的一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于所述的肽的部分如下：
所述的肽的部分序列为CGHHYYGPLGVRGC-biotin。
3.根据权利要求1的一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及其应用，其中所述的金纳米粒子按如下方法制备而成：在圆底烧瓶中加入100mL、0.01％的HAuCl4，搅拌加热至沸腾，然后快速加入1.8mL、1％的Na3C6H5O7，再加热、搅拌10分钟，冷却至室温，即得。
4.根据权利要求1的一种利用上述方法制备的生物传感器检测基质金属蛋白酶-2含量的方法，使用不同浓度的基质金属蛋白酶-2加入基质金属蛋白酶-2生物传感器中，然后取出上清液于0.5mL小离心管中，准确加入100μL的0.5mM蔗糖溶液，37℃下反应30～180分钟，用血糖仪检测生成葡萄糖含量，以血糖仪读数为分析信号，进行基质金属蛋白酶-2的测定。
5.根据权利要求1所述的生物传感器在检测基质金属蛋白酶-2含量中的应用。
6.根据权利要求1所述的Tris-HCl溶液的配制方法为：称量121.1g Tris置于2L烧杯中，加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加入浓盐酸调节所需要的pH为8.0，即得。
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