CN112362706A - 一种检测基质金属蛋白酶的电化学传感器及检测方法 - Google Patents

一种检测基质金属蛋白酶的电化学传感器及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112362706A
CN112362706A CN202011207150.1A CN202011207150A CN112362706A CN 112362706 A CN112362706 A CN 112362706A CN 202011207150 A CN202011207150 A CN 202011207150A CN 112362706 A CN112362706 A CN 112362706A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
electrode
polypeptide
mmp
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011207150.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112362706B (zh
Inventor
李金龙
程文婷
张永臣
许传军
张兆利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Hospital of Nanjing
Original Assignee
Second Hospital of Nanjing
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Hospital of Nanjing filed Critical Second Hospital of Nanjing
Priority to CN202011207150.1A priority Critical patent/CN112362706B/zh
Publication of CN112362706A publication Critical patent/CN112362706A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112362706B publication Critical patent/CN112362706B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

因MMP‑2在肿瘤的发生、转移和预后中起着重要作用，本发明公开了一种简便、灵敏的检测MMP‑2的电化学方法。首先在电极表面修饰一个含有MMP‑2限制性酶切位点的肽1，它可以通过CB[8]识别来富集肽模板的银纳米颗粒，从而产生显著的电化学信号，但在MMP‑2存在的情况下，多肽1在G和V之间的位置被特异性切割，随后将肽模板银纳米颗粒从电极表面分离出来，可以大大降低电流信号，从而实现对MMP‑2活性的灵敏电化学检测。在本发明中，电化学信号放大是通过在电极表面沉积AgNPs来实现的，从而得到在0.5pg·mL‑1‑50ng·mL‑1范围内显著增强MMP‑2的电化学信号，检测限值可以达到0.12pg·mL‑1。此外，本发明公开的检测方法在实际样本中显示了令人信服的结果。与传统方法相比，该检测方法的突出优点是设计简单，灵敏度高。

Description

一种检测基质金属蛋白酶的电化学传感器及检测方法
技术领域
本发明涉及基质金属蛋白酶电化学检测领域，特别是涉及一种检测基质金属蛋白酶的电化学传感器及检测方法。
背景技术
基质金属蛋白酶(MMPs)通过降解基底膜、胶原和纤维连接蛋白等多种细胞外蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织屏障。它们被认为是与肿瘤侵袭和转移相关的主要蛋白水解酶。MMP-2作为分泌和激活的MMPs之一，主要作用于基底膜细胞外基质(ECM)蛋白的降解，因此其表达与癌症的发生、转移和预后密切相关。因此，建立一种灵敏度高、特异性强的检测复杂生物样品中MMP-2的方法，对肿瘤的早期诊断具有重要意义。
传统的基于抗原抗体反应的检测方法已被广泛应用于MMP-2的定量。瓶颈在于上述方法需要昂贵的抗体、复杂的仪器和较长的孵育时间。因此，为了克服传统方法的缺陷，人们对测定MMPs活性的方法进行了大量的尝试，如比色法、化学发光法、荧光法和电化学检测法。其中，电化学方法具有灵敏度高、操作简便等优点。
在此，本发明提出了一种简单而灵敏的检测MMP-2的电化学方法，它依赖于主客体识别机制和银纳米粒子(AgNPs)的沉积。CB[8]被定义为一种大环受体，能够通过高亲和力的主客体识别作用将两个芳香氨基酸残基连接在一起，正是这种大环受体可以将肽-AgNPs复合物与修饰在电极上的其他多肽结合，从而产生电流信号。其次，MMP-2的加入使多肽在G和V之间的位置得到精确的识别和切割，减弱了电流信号，从而实现MMP-2的检测。
传统的检测MMP-2的方法相比，本发明中的检测方法具有以下优点：第一，利用通过主客体相互作用沉积的AgNP的信号放大策略，即使癌细胞计数很低，也可以检测出细胞裂解液中的MMP-2活性；第二，该方法不需要使用昂贵的抗体或者蛋白酶，因此成本低廉；第三，该方法非常简单，MMP-2的活性可以通过一步过程实现，为MMP-2的检测提供了一种可靠的设计。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种用于检测基质金属蛋白酶的电化学传感器，其制备方法如下：
(1)金电极预处理：
1)金电极用氧化铝粉末抛光至光滑；
2)将抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液[V(H2SO4)：(30％H2O2)＝3：1]中消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗；
3)将步骤2)清洗后的电极用50％硝酸浸泡10-50min，然后，电极分别用乙醇和去离子水处理1-10min；
4)用氮气将步骤3)制得的电极吹干后，将电极浸入0.1-1M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号，制得预处理电极；
(2)将步骤(1)制得的预处理电极浸入50-150μL，pH 6-8的肽溶液中孵育10-20h，多肽通过Au-S化学键修饰在电极表面；
(3)在室温下将电极浸泡在MN溶液中1-5h；
(4)用蒸馏水对步骤(1)-3)制得的电极进行冲洗并保存；
(5)合成多肽模板-AgNPs：
1)将含肽2和AgNO3的水溶液混合，用磁力搅拌装置搅拌10-30分钟；
2)通过缓慢添加1-3mM新制备的NaBH4溶液，对混合物进行化学还原反应,然后轻轻搅拌5-20分钟，溶液颜色变为稳定的黄色，显示多肽-AgNPs的形成；
3)将多肽1修饰电极浸入含有多肽2-AgNPs和CB的溶液中0.5-5小时，最终在电极表面形成多肽2-AgNPs·CB[8]·多肽1复合物；
4)将电极用洗涤液进行清洗，制得电化学传感器；
其中，所述的多肽1(P1)具体为FGPLGVRGKGGC-11-mercaptoundecanoic acid(MUA)；
其中，所述的多肽2(P2)具体为FGGGASLWWSEKL；
优选地，步骤(1)-2)中所述的浸泡在水虎鱼溶液中的时间为10min；
优选地，步骤(1)-2)中所述的肽溶液制备方法为：将5mM TCEP和0.5μM肽1溶于10mM PBS中；
优选地，步骤(1)-3)中所述的浸泡在50％硝酸的时间为30min；
优选地，步骤(1)-3)中所述的电极分别用乙醇和去离子水处理5min；
优选地，步骤(1)-4)中将电极浸入0.5M硫酸中；
优选地，步骤(2)中所述的肽溶液的用量为100μL，pH 7.4；
优选地，步骤(2)中所述的孵育时间为16小时；
优选地，步骤(3)中所述的MN溶液为1mM，ph7.4；
优选地，步骤(3)中所述的浸泡在MN溶液的时间为2.5h；
优选地，步骤(5)-1)中所述肽2浓度为100ng/μL，AgNO3浓度为0.2mM；
优选地，步骤(5)-1中所述磁力搅拌时间为20分钟；
优选地，步骤(5)-2中所述的NaBH4溶液浓度为2mM；
优选地，步骤(5)-2中所述的搅拌时间为10分钟；
优选地，步骤(5)-3中所述溶液中CB的浓度为10μM；
优选地，步骤(5)-3中所述浸入时间为1小时。
本发明的第二个目的在于提供一种用上述电化学传感器检测基质金属蛋白酶的检测方法，具体步骤如下：
(1)将MMP-2标准样品或人血清样品用PBS稀释成不同浓度；
(2)将制备好的peptide 2-AgNPAs·CB[8]·peptide1修饰电极浸泡在步骤(1)制得的溶液中，保持10min-3h；
(3)电极用蒸馏水中冲洗后，进行进一步的测量；
其中，为了获得方波伏安图(SWV)，使用Tris-HNO3和KCl的混合物作为缓冲液；
其中，为了获得电化学阻抗谱(EIS)，将[Fe(CN)6]3-/4-溶液作为缓冲液，频率在10～105Hz之间，循环伏安(CV)测量在100mV/s扫描速率下进行；
优选地，步骤(1)中所述的PBS具体为10mM PBS，pH7.4；
优选地，步骤(2)中所述的保持时间为30min,保持温度为37℃；
优选地，步骤(3)中参数设置为：扫描范围，-0.2至0.3V；阶跃电位，5mV；频率，15Hz；振幅，25mV；
优选地，步骤(3)中所述的Tris-HNO3和KCl溶液中Tris-HNO3浓度为10mM、pH7.4，KCl浓度为100mM，溶液用量为6ml；
优选地，步骤(3)中所述的[Fe(CN)6]3-/4-溶液浓度为5.0mM。
本发明最后一个目的在于，将上述电化学传感器和检测方法在检测基质金属蛋白酶活性方面的应用。
本发明的有益效果
(1)利用通过主客体相互作用沉积的AgNP的信号放大策略，即使癌细胞计数很低，也可以检测出细胞裂解液中的MMP-2活性。
(2)该方法不需要使用昂贵的抗体，因此成本低廉。
(3)该方法操作简单，MMP-2的活性可以通过一步过程实现。
附图说明
图1为本发明的检测原理图。
图2为实验例1中不同修饰电极的EIS图(A)和CV图(B)。
图3为实验例2中肽模板AgNPs的表征图。
图4为实验例3中检测方案可行性图。
图5为实施例4中优化分析条件图。
图6为实施例5中MMP-2活性的电化学测定图。
图7为实施例6中检测方法的特异性图。
图8为实施例7中实际血清样本分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1生物传感器的构建
金电极预处理：首先，金电极
Figure BDA0002757411580000041
用各种粒子大小的(1.0、0.3和0.05μm)氧化铝粉末抛光，直到像镜面一样光滑。然后，将电极浸泡在水虎鱼溶液[V(H2SO4)：(30％H2O2)＝3：1]中10min消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗37-38。其次将电极用50％硝酸浸泡30min，然后，电极分别用乙醇和去离子水处理5min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号。
经过氮气干燥后，将预处理电极浸入100μL pH 7.4的肽溶液(5mM TCEP和0.5μM肽1溶于10mM PBS中)中孵育16h，多肽通过Au-S化学键修饰在电极表面，其中TCEP可以避免多肽1二硫键的形成。然后，为防止多肽的非共价吸附，在室温下将电极浸泡在1mM，ph7.4的MN溶液中2.5h，最后，用蒸馏水对上述电极进行严格冲洗并保存。
多肽模板-AgNPs的合成是根据现有技术，稍加修改。首先，将5ml含肽2(100ng/μL)和AgNO3(0.2mM)的水溶液混合，用磁力搅拌装置搅拌20分钟。随后，通过缓慢添加2mM新制备的NaBH4溶液，对混合物进行化学还原反应。在轻轻搅拌10分钟后，上述溶液颜色变为稳定的黄色，显示多肽-AgNPs的形成。
最后，将多肽1修饰电极浸入含有多肽2-AgNPs和10μM CB的溶液中1小时，最终在电极表面形成多肽2-AgNPs·CB多肽1复合物。然后将电极用洗涤液进行清洗，获得电化学传感器，并用于进一步的电化学分析。
实施例2 MMP-2活性的电化学检测
检测MMP-2活性的主要步骤如下：首先，将MMP-2标准样品或人血清样品用10mMPBS(ph7.4)稀释成不同浓度。随后，将制备好的peptide 2-AgNPAs·CB·peptide1修饰电极浸泡在上述溶液(100μL)中，在37℃下保持30min。电极用蒸馏水中严格冲洗后，进行进一步的测量。
为了获得方波伏安图(SWV)，使用6ml 10mM Tris-HNO3(pH7.4)和100mM KCl的混合物作为缓冲液。参数设置为：扫描范围，-0.2至0.3V；阶跃电位，5mV；频率，15Hz；振幅，25mV。为了获得电化学阻抗谱(EIS)，5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液作为缓冲液，频率在10～105Hz之间。循环伏安(CV)测量在100mV/s扫描速率下进行。
实验例1电极改性的表征
MMP-2活性电化学分析的基本原理在附图1中进行了说明。多肽1包含一个N-端苯丙氨酸(F)残基与CB[8]结合，一个MUA基团修饰在C-端以实现电极表面的固定，以及一个蛋白水解基序P-L-G-V-R序列，以允许MMP-2的特异性切割。由于主客体相互作用，含F残基的多肽模板化的AgNPs可以牢固地捕捉到电极表面，因为CB[8]只能同时接受两个π-堆积几何结构的苯丙氨酸残基。在没有MMP-2的情况下，被捕获的AgNPs产生显著的高电流信号。然而，加入MMP-2后，肽1被完全裂解，多肽2-AgNPs被从电极表面被冲走，显著地降低了电流信号，实现对MMP-2活性检测。
本实验例首先采用EIS来验证电极的修饰过程。如图2A所示，裸金电极的EIS在外观上呈现一条直线(曲线a)，表示电子转移电阻极低。在电极上修饰多肽1后，可以观察到一个小半圆(曲线b)，表明电子转移电阻增加。在电极表面修饰的多肽1实现了CB介导的识别后，半环直径明显变大(曲线c)，说明CB[8]和多肽的导电性较差。此外，当电极与MMP-2孵育时，发现半环直径变小(曲线d)，表明MMP-2催化的多肽断裂。此外，图2B的CV说明裸电极显示最大氧化还原峰值电流(曲线a)。随后在裸电极表面有序地修饰多肽1和CB[8]，导致峰值电流逐渐下降(曲线b和c)。与MMP-2孵育后，氧化还原峰电流略有增加(曲线d)，与EIS结果一致。这些EIS和CV结果初步证明了电极表面修饰过程是成功的。
实验例2肽模板AgNPs的表征
此外，本实验例利用透射电镜(TEM)、紫外可见分光光度法和X射线光电子能谱(XPS)对肽模板AgNPs进行了表征和合成的验证。图3A和3B中的TEM结果说明合成的AgNPs的直径约为10nm。紫外-可见光谱分析结果如图3C所示，在405nm区域观察到一个强吸收峰，这是AgNPs的特征。XPS结果如图3D所示。AgNPs XPS光谱是通过间接电还原获得的。已经确定在367.5和373.5eV的Ag 3d5/2和Ag 3d3/2的结合能，结合能峰值正好对应于零价银。上述光谱数据与现有技术提出的元素银数据一致，说明溶液中只有银存在，而银离子完全还原。
实验例3 MMP-2检测策略的可行性检验
为了验证所提出的方法检测MMP-2活性的可行性，采用SWV对不同电极的电化学行为进行了研究。如图4所示，当不存在MMP-2时，示出高度可见的电流信号(曲线a)。然而，在10ng·mL-1的MMP-2存在下，只有一个小的电流信号响应(曲线b)。所获得的SWV反应之间的显著差异反映了所提出的方法可以有效地检测MMP-2的活性。因此，根据以上结果，可以很好地验证本文提出的检测MMP-2活性的方法的可行性。
实验例4优化分析条件
为了达到期望的性能，在试验过程中预先确定了几个重要因素。实验结果表明，随着CB[8]浓度增加到10μM，组装时间延长到60min，SWV峰值电流达到一个平台(图5a和图5b)。因此CB[8]的最佳浓度和组装时间分别为10μM和60min。此外，还观察了MMP-2催化多肽水解的动态过程。实验结果清楚地显示，在30分钟达到峰值后，随反应时间的延长，SWV响应降低(图5c)。为后续实验选择了30min的最佳降解时间。
实验例5 MMP-2活性的电化学测定
在最佳实验条件下，根据所提出的检测方法，对不同浓度的MMP2进行了检测。如图6所示，添加MMP-2后，SWV响应逐渐降低。因为更多的MMP-2会促进更多肽1的水解，导致电极上AgNPs的数量减少。如图6的插图所示，在0.5pg·mL-1到50ng·mL-1范围内，MMP-2不同浓度对数值与相应的SWV峰值电流呈现良好的线性相关性。回归方程的值为y＝-0.689x+4.284(R2＝0.969)，y为峰值电流(μA)，x为MMP-2浓度的对数值(pg·mL-1)。检测限估计为0.12pg·mL-1(S/N＝3)，显示良好的灵敏度和可靠性。以上结果验证了该方法可以对MMP-2活性进行有效、敏感的检测。
实验例6检测方法的特异性
生物传感器的特异性是其实际应用中对抗各种潜在干扰的一个极其重要的因素。为了评价MMP-2生物传感器的特异性，本实验例对MMP-7、MMP-9、PSA、BSA等潜在干扰因子进行了研究。图7显示在加入10ng·mL-1的MMP-2后呈现最低的电流信号，这是因为MMP-2可以对多肽进行特异性切割，而其他干扰因子获得了几乎与空白对照相同的电流信号，因为它们不能被MMP-2识别和切割。以上结果表明，所研制的生物传感器对MMP-2具有良好的特异性。
实验例7实际血清样本分析
本实验例利用所开发的生物传感器对人血清样品(来自南京市第二医院)中的MMP-2进行检测，以验证该方法的实际应用能力。如图8所示，本发明提出的方法可以检测到MMP-2的浓度远低于0.1ng·mL-1，但ELISA方法无法达到这样的检测限。这两种方法在高浓度MMP-2样品中的检测结果无明显差异，表明该传感器在实际生物样品中，特别是在低浓度MMP-2中检测MMP-2具有很好的实用性。
综上所述，本发明基于CB[8]介导的主客体识别和AgNPs辅助信号放大，建立了一种简便、灵敏的MMP-2检测方法。本发明实验例结果表明，该方法设计简单，具有良好的选择性和重复性。更重要的是，通过利用CB[8]辅助多肽组装富集的AgNPs沉积，可以获得0.12pg·mL-1的检测限。此外，本发明的方法在线性范围和分析时间方面优于现有技术。因此，该方法对于从生物样本中检测MMP-2活性具有很大的潜力，可以应用于癌症的早期诊断。

Claims (6)

1.一种检测基质金属蛋白酶的电化学传感器的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)金电极预处理：
1)金电极用氧化铝粉末抛光至光滑；
2)将抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液[V(H2SO4)：(30％H2O2)＝3：1]中消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗；
3)将步骤2)清洗后的电极用50％硝酸浸泡10-50min，然后，电极分别用乙醇和去离子水处理1-10min；
4)用氮气将步骤3)制得的电极吹干后，将电极浸入0.1-1M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号，制得预处理电极；
(2)将步骤(1)制得的预处理电极浸入50-150μL，pH 6-8的肽溶液中孵育10-20h，多肽通过Au-S化学键修饰在电极表面；
(3)在室温下将步骤(2)制得的电极浸泡在MN溶液中1-5h；
(4)用蒸馏水对步骤(3)制得的电极进行冲洗并保存；
(5)合成多肽模板-AgNPs：
1)将含肽2和AgNO3的水溶液混合，用磁力搅拌装置搅拌10-30分钟；
2)通过缓慢添加1-3mM新制备的NaBH4溶液，对混合物进行化学还原反应,然后轻轻搅拌5-20分钟，溶液颜色变为稳定的黄色，显示多肽-AgNPs的形成；
(6)多肽2-AgNPs·CB[8]多肽1复合物的构建：
1)将多肽1修饰电极浸入含有多肽2-AgNPs和CB[8]的溶液中0.5-5小时，最终在电极表面形成多肽2-AgNPs·CB[8]多肽1复合物；
2)将电极用洗涤液进行清洗，制得电化学传感器；
所述的多肽1(P1)具体为FGPLGVRGKGGC-11-mercaptoundecanoic acid(MUA)；
所述的多肽2(P2)具体为FGGGASLWWSEKL。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
其中，步骤(1)-2)中所述的浸泡在水虎鱼溶液中的时间为10min；
其中，步骤(1)-3)中所述的浸泡在50％硝酸的时间为30min；
其中，步骤(1)-3)中所述的电极分别用乙醇和去离子水处理5min；
其中，步骤(1)-4)中将电极浸入0.5M硫酸中；
其中，步骤(2)中所述的肽溶液制备方法为：将5mM TCEP和0.5μM肽1溶于10mM PBS中；
其中，步骤(2)中所述的肽溶液的用量为100μL，pH 7.4；
其中，步骤(2)中所述的孵育时间为16小时；
其中，步骤(3)中所述的MN溶液为1mM，ph7.4；
其中，步骤(3)中所述的浸泡在MN溶液的时间为2.5h；
其中，步骤(5)-1)中所述肽2浓度为100ng/μL，AgNO3浓度为0.2mM；
其中，步骤(5)-1)中所述磁力搅拌时间为20分钟；
其中，步骤(5)-2)中所述的NaBH4溶液浓度为2mM；
其中，步骤(5)-2)中所述的搅拌时间为10分钟；
其中，步骤(5)-3)中所述溶液中CB[8]的浓度为10μM；
其中，步骤(5)-3)中所述浸入时间为1小时。
3.一种用权利要求1所述的制备方法制得的电化学传感器检测基质金属蛋白酶的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将MMP-2标准样品用PBS稀释成不同浓度；
(2)将制备好的peptide 2-AgNPAs·CB[8]·peptide1修饰电极浸泡在步骤(1)制得的溶液中，保持10min-3h；
(3)电极用蒸馏水中冲洗后，进行测量；
其中，为了获得方波伏安图(SWV)，使用Tris-HNO3和KCl的混合物作为缓冲液；
其中，为了获得电化学阻抗谱(EIS)，将[Fe(CN)6]3-/4-溶液作为缓冲液，频率在10～105Hz之间，循环伏安(CV)测量在100mV/s扫描速率下进行。
4.一种用权利要求1所述的制备方法制得的电化学传感器检测基质金属蛋白酶的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将人血清样品用PBS稀释成不同浓度；
(2)将制备好的peptide 2-AgNPAs·CB[8]·peptide1修饰电极浸泡在步骤(1)制得的溶液中，保持10min-3h；
(3)电极用蒸馏水中冲洗后，进行测量；
其中，为了获得方波伏安图(SWV)，使用Tris-HNO3和KCl的混合物作为缓冲液；
其中，为了获得电化学阻抗谱(EIS)，将[Fe(CN)6]3-/4-溶液作为缓冲液，频率在10～105Hz之间，循环伏安(CV)测量在100mV/s扫描速率下进行。
5.如权利要求3或4中任意一项所述的检测方法，其特征在于，
其中，步骤(1)中所述的PBS具体为10mM PBS，pH7.4；
其中，步骤(2)中所述的保持时间为30min,保持温度为37℃；
其中，步骤(3)中参数设置为：扫描范围，-0.2至0.3V；阶跃电位，5mV；频率，15Hz；振幅，25mV；
其中，步骤(3)中所述的Tris-HNO3和KCl溶液中Tris-HNO3浓度为10mM、pH7.4，KCl浓度为100mM，溶液用量为6ml；
其中，步骤(3)中所述的[Fe(CN)6]3-/4-溶液浓度为5.0mM。
6.如权利要求1所述的制备方法和权利要求3或4中任意一项所述的检测方法在检测基质金属蛋白酶活性方面的应用。
CN202011207150.1A 2020-11-03 2020-11-03 一种检测基质金属蛋白酶的电化学传感器及检测方法 Active CN112362706B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011207150.1A CN112362706B (zh) 2020-11-03 2020-11-03 一种检测基质金属蛋白酶的电化学传感器及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011207150.1A CN112362706B (zh) 2020-11-03 2020-11-03 一种检测基质金属蛋白酶的电化学传感器及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112362706A true CN112362706A (zh) 2021-02-12
CN112362706B CN112362706B (zh) 2023-07-14

Family

ID=74512706

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011207150.1A Active CN112362706B (zh) 2020-11-03 2020-11-03 一种检测基质金属蛋白酶的电化学传感器及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112362706B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113514518A (zh) * 2021-03-30 2021-10-19 江苏大学 一种基于多肽-酶复合材料的过氧化氢传感器的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104007268A (zh) * 2014-06-05 2014-08-27 青岛科技大学 一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及其应用
CN109187708A (zh) * 2018-09-18 2019-01-11 苏州健雄职业技术学院 一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法
CN110426440A (zh) * 2019-07-16 2019-11-08 曲阜师范大学 一种光电化学生物传感器及其对blm的检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104007268A (zh) * 2014-06-05 2014-08-27 青岛科技大学 一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及其应用
CN109187708A (zh) * 2018-09-18 2019-01-11 苏州健雄职业技术学院 一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法
CN110426440A (zh) * 2019-07-16 2019-11-08 曲阜师范大学 一种光电化学生物传感器及其对blm的检测方法

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DING WANG等: "An electrochemical peptide cleavage-based biosensor for matrix metalloproteinase-2 detection with exonuclease III-assisted cycling signal amplification", CHEM. COMMUN., vol. 54, pages 5943 *
SUNFENGDA SONG等: "Guests involved CB[8] capped silver nanoparticles as a means of electrochemical signal enhancement for sensitive detection of Caspase-3", SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL, vol. 274, pages 54 - 59, XP085469365, DOI: 10.1016/j.snb.2018.07.143 *
SUNFENGDA SONG等: "Guests involved CB[8] capped silver nanoparticles as a", 《SENSORS AND ACTUATORS B》 *
SUNFENGDA SONG等: "Guests involved CB[8] capped silver nanoparticles as a", 《SENSORS AND ACTUATORS B》, vol. 274, 28 July 2018 (2018-07-28), pages 1 - 30 *
TRONG BINH TRAN等: "Electrical dual-sensingmethodforreal-timequantitativemonitoring", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
TRONG BINH TRAN等: "Electrical dual-sensingmethodforreal-timequantitativemonitoring", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》, vol. 77, 9 October 2015 (2015-10-09), pages 631 *
WENJU XU等: "Bimetallic Pt/Pd encapsulated mesoporous-hollow CeO2nanospheresfor signal amplification toward electrochemical peptide-basedbiosensing for matrix metalloproteinase", 《SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL》 *
WENJU XU等: "Bimetallic Pt/Pd encapsulated mesoporous-hollow CeO2nanospheresfor signal amplification toward electrochemical peptide-basedbiosensing for matrix metalloproteinase", 《SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL》, vol. 230, 21 February 2016 (2016-02-21), pages 345 - 352, XP029506778, DOI: 10.1016/j.snb.2016.02.064 *
WENTING CHENG等: "One step electrochemical detection for matrix metalloproteinase 2 based on anodic stripping of silver nanoparticles mediated by host-guest interactions", SENSORS AND ACTUATORS: B. CHEMICAL, vol. 330, pages 1 - 7 *
XIANGYANG MIAO: "Cucurbit[8]uril-assisted peptide assembly for feasible electrochemical", 《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》 *
XIANGYANG MIAO: "Cucurbit[8]uril-assisted peptide assembly for feasible electrochemical", 《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》, vol. 411, 31 October 2018 (2018-10-31), pages 387, XP036675969, DOI: 10.1007/s00216-018-1445-4 *
ZHEN LEI等: "Biosensors and bioassays for determination", 《JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY B》 *
ZHEN LEI等: "Biosensors and bioassays for determination", 《JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY B》, vol. 8, 13 November 2019 (2019-11-13), pages 1 - 31 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113514518A (zh) * 2021-03-30 2021-10-19 江苏大学 一种基于多肽-酶复合材料的过氧化氢传感器的制备方法
CN113514518B (zh) * 2021-03-30 2023-05-09 江苏大学 一种基于多肽-酶复合材料的过氧化氢传感器的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112362706B (zh) 2023-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102209124B1 (ko) Ti₃C₂2차원 금속 탄화물 촉매를 이용한 루미놀 전기화학발광 프로브 기반의 바이오 센서 및 그 제조 방법
Holt et al. Surface-enhanced resonance Raman and electrochemical investigation of glucose oxidase catalysis at a silver electrode
Abbasi et al. Graphene based electrochemical immunosensor for the ultra-sensitive label free detection of Alzheimer's beta amyloid peptides Aβ (1–42)
NZ585851A (en) Electrochemical detection of a metal - labelled analyte
JP2007525653A (ja) センサチップの改良
Wang et al. Graphene-Prussian blue/gold nanoparticles based electrochemical immunoassay of carcinoembryonic antigen
CN107543850A (zh) 检测胰蛋白酶的生物传感器及其制备方法和应用
CN112362706B (zh) 一种检测基质金属蛋白酶的电化学传感器及检测方法
CN108827946B (zh) 一种共用共反应试剂类型的呕吐毒素比率型电致化学发光免疫传感器及其检测方法
Shaban et al. An Fe 3 O 4/PEDOT: PSS nanocomposite as an advanced electroconductive material for the biosensing of the prostate-specific antigen in unprocessed human plasma samples
Wang et al. Immunosensors Based on Layer‐by‐Layer Self‐Assembled Au Colloidal Electrode for the Electrochemical Detection of Antigen
KR20020007083A (ko) 덴드리머를 이용한 단분자막의 제조방법
Zhu et al. A novel amperometric immunosensor constructed with gold–platinum nanoparticles and horseradish peroxidase nanoparticles as well as nickel hexacyanoferrates nanoparticles
Proença et al. Use of data processing for rapid detection of the prostate-specific antigen biomarker using immunomagnetic sandwich-type sensors
CN111004836A (zh) 双向放大的比率型电化学适体传感器及其应用
Xiao et al. Electrochemiluminescence immunosensor using poly (l-histidine)-protected glucose dehydrogenase on Pt/Au bimetallic nanoparticles to generate an in situ co-reactant
JP5473382B2 (ja) 免疫測定方法
Dong et al. Amperometric immunosensor based on carbon nanotubes/chitosan film modified electrodes for detection of human leptin
CN116297756A (zh) 一种检测黑色素瘤标志物s100b蛋白的电化学传感器及其制备方法
Li et al. Ultrasensitive simultaneous electrochemical immunoassay of acute myocardial infarction biomarkers using metal ion chelated polydopamine nanospheres
Tang et al. Direct and rapid detection of diphtherotoxin via potentiometric immunosensor based on nanoparticles mixture and polyvinyl butyral as matrixes
CN114295703B (zh) 一种基于靶诱导银纳米簇探针的高灵敏细胞因子电化学适配体传感器
CN113325060B (zh) 石墨烯磁性纳米电极、电化学免疫传感器及制备方法及应用
Zhou et al. An amperometric immunosensor based on a conducting immunocomposite electrode for the determination of schistosoma japonicum antigen
Lai et al. Mesoporous nanogold–MnO 2–poly (o-phenylenediamine) hollow microspheres as nanotags and peroxidase mimics for sensing biomolecules

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant