KR20020007083A - 덴드리머를 이용한 단분자막의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 덴드리머 고분자를 이용한 단분자막의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 덴드리머의 단분자막은 금속 또는 유리 표면에 한쪽 말단이 아민기, 또는 숙신이미드(succinimide)로 수식된 알칸티올(alkanethiol) 분자를 이용하여 자기조립박막(self-assembled monolayer)을 수득하는 단계; 및, 전기 자기조립박막에 아민기를 포함하는 덴드리머 또는 N-하이드로숙신이미드로 수식된 카르복실기를 포함하는 덴드리머를 반응시킴으로써 덴드리머의 단분자막을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조된다. 본 발명에 의하면, 전기 제조된 단분자막에 단백질, 항원, 항체, 효소, 리셉터(receptor), 및 리간드(ligand)를 반응시켜 생체분자의 단분자막을 제조할 수 있으며, 이는 진단용 킷트, 바이오센서(biosensor)의 개발 및 유용물질의 생산을 위한 효소의 고정화, 단백질 칩 등 생명공학 및 생물공학 분야에서 광범위하게 활용될 수 있다.

Description

덴드리머를 이용한 단분자막의 제조방법{A Process for Preparing Monolayer by Using Dendrimer}
본 발명은 덴드리머 고분자를 이용한 단분자막의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 고체 표면상에서 결합된 덴드리머를 단백질, 항원, 항체, 효소, 리간드, 리셉터 등의 생체분자와 반응시킴으로써 단분자막을 제조하는 방법에 관한 것이다.
단백질, 효소, 항원, 항체, 리간드, 리셉터 등의 생체분자를 고체표면이나고분자 물질상에 고정화시키는 기술은 전기 물질을 지표물질로 삼아 질병을 진단하는 킷트에 사용되거나, 바이오센서(biosensor)의 개발 및 유용물질의 생산을 위한 효소의 고정화 등 생명공학 및 생물공학 분야에서 광범위하게 활용되며, 최근에는 단백질 칩(protein chip)의 제조에 널리 이용되고 있다.
현재까지 상술한 목적으로 생체분자를 고체표면에 고정화시키는 방법으로는 물리적 흡착, 전기 전도성 고분자를 이용한 전기중합식 방법 및 아미드결합에 의한 공유결합 방법 등을 주로 이용하였다. 그러나, 이들 방법 중 생체분자를 고체표면에 물리적으로 흡착시키는 경우 고정량 자체가 적고 고정된 생체 분자의 탈리 및 불활성화가 일어나며, 전기중합식 방법은 전도성 고분자의 망쇄 구조에 생체분자를 포획하므로 고정량을 조절할 수 없고 다른 분자와의 상호작용을 확인할 수 없다는 단점이 있었다.
이와 같이. 기존의 고정 방법으로는 단백질의 배향성(orientation)을 조절하기 어려울 뿐만 아니라, 균일하고 안정한 생체분자의 단분자막을 제조할 수 없다는 단점을 안고 있었다. 더욱이, 충분한 민감도와 분해능을 갖는 단백질 칩의 개발을 위해서는, 고체 표면에 생체분자의 마이크로어레이(microarray)를 고밀도로 제조할 수 있는 방법의 개발이 시급히 요구되었다.
이에, 본 발명자들은 생체분자를 균일하고 안정하게 고체표면에 고정화시키고자 예의 연구 노력한 결과, 덴드리머를 이용하여 고체 표면상에 생체분자를 결합시킴으로써 고밀도의 안정하고 균일한 생체분자의 단분자막을 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 덴드리머를 이용한 단분자막을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 단분자막 상에서 단백질, 항원, 항체, 효소, 리셉터(receptor), 및 리간드(ligand) 등의 생체분자를 반응시킴으로써 생체분자의 단분자막을 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 아민기를 가진 덴드리머의 구조를 나타낸 그림이다.
도 2은 본 발명의 덴드리머를 이용한 당단백질의 단분자막을 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 덴드리머를 이용한 항원·항체의 단분자막을 제조하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
본 발명의 덴드리머를 사용하여 단분자막을 제조하는 방법 및 생체분자의 단분자막을 제조하는 방법을 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명의 덴드리머를 사용하여 단분자막을 제조하는 방법은 금속 또는 유리 표면에 한쪽 말단이 아민기, 또는 숙신이미드(succinimide)로 수식된 알칸티올(alkanethiol) 분자를 이용하여 자기조립박막(self-assembled monolayer, SAM)을 수득하는 단계; 및, 전기 자기조립박막에 아민기를 포함하는 덴드리머 또는 N-하이드로숙신이미드로 수식된 카르복실기를 포함하는 덴드리머를 반응시킴으로써 덴드리머의 단분자막(monolayer)을 수득하는 단계를 포함한다. 아울러, 전기 제조된 덴드리머의 단분자 상에서 단백질, 항원, 항체, 효소, 리셉터 및 리간드 등의 생체분자를 반응시킴으로써, 생체분자의 단분자막을 효율적으로 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 덴드리머 단분자막을 사용하여 생체분자의 단분자막을 제조하는 방법을 단계별로 나누어 구체적으로 설명하고자 한다.
제 1단계: 자기조립박막의 수득
금속 또는 유리 표면을 한쪽 말단이 아민기, 또는 숙신이미드로 수식된 알칸티올 용액에 담구고, 1시간 내지 2시간 동안 반응시켜 자기조립박막을 수득한다: 이때, 금속은 금(gold), 은(silver), 구리(copper) 또는 백금(platinum)을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 금이 증착된 실리콘 기판을 사용된다.
아민기를 포함하는 덴드리머의 단분자막의 수득에 있어서, 알칸티올의 말단이 숙신이미드로 수식된 디티오프로피온산 비스-N-하이드록시숙신이미드에스테르(dithiopropionic acid bis-N-hydroxysuccinimide ester)를 DMSO(dimethylsulfoxide)에 용해된 상태로 반응시킨다. 한편, N-하이드로숙신이미드로 수식된 카르복실기를 포함하는 덴드리머의 자기조립박막의 수득에 있어서는, 알칸티올 분자의 말단이 아민기로 수식된 시스타민 다이하이드로클로라이드(cystamine dihydrochloride)를 사용하여 반응시킨다.
제 2단계: 덴드리머 단분자막의 수득
전기 자기조립박막에 아민기를 포함하는 덴드리머 또는 N-하이드로숙신이미드로 수식된 카르복실기를 포함하는 덴드리머 용액에 30분 내지 1시간 동안 담그고 반응시켜 덴드리머의 단분자막을 수득한다: 이때, 아민기를 포함하는 덴드리머는 G1, G2, G3, G4 또는 G5에 해당하는 덴드리머를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 G4에 해당하는 덴드리머로서 64개의 아민반응기를 가진 구형의 고분자물질을 사용하며, 전기 아민기로 수식된 덴드리머를 도 1에 개시하였다. 전기 아민기를 포함하는 덴드리머를 사용하여 형성된 단일분자막은 표면의 아민반응기로 인하여 알데히드기에 대해 높은 반응성을 지니게 된다.
아울러, N-하이드로숙신이미드로 수식된 카르복실기를 포함하는 덴드리머는 G1.5, G2.5, G3.5, G4.5 또는 G5.5에 해당하는 덴드리머의 카르복실기를 N-하이드로숙신이미드로 수식하여 사용하게 되며, 바람직하게는 G3.5(세대수 4)에 해당하는 덴드리머의 카르복실기를 N-하이드로숙신이미드로 수식하여 사용하게 된다. 이때, N-하이드로숙신이미드로 수식된 카르복실기를 포함하는 덴드리머는 아민에 대한 반응성이 높아 상기 제 1단계에서 형성된 자기조립박막과의 반응성이 높아진다. 이때, 덴드리머는 0.01mM 내지 0.1mM의 농도로, 가장 바람직하게는 0.022mM 내지 0.04mM의 농도로 에탄올, 메탄올 등의 알코올 용액, 바람직하게는 메탄올 용액에 용해시켜 사용하며, N-하이드로숙신이미드로 수식된 카르복실기를 포함하는 덴드리머는 완충용액에 용해시켜 사용한다.
제 3단계: 생체분자의 단분자막의 제조
전기 제조된 덴드리머의 단분자 상에서 단백질, 당단백질, 항원, 항체, 효소, 리셉터, 및 리간드 등의 생체분자를 반응시킴으로써 생체분자의 단분자막을 수득한다: 이때, 생체분자가 당쇄구조를 갖는 항원, 항체, 또는 당단백질의 경우는 당쇄구조를 과요오드산염(periodate)로 산화시켜서 알데히드기를 갖도록 한 후, 아민기를 포함한 덴드리머와 반응시킨다. 그외의 아민기를 포함하는 단백질은 그대로 N-하이드로숙신이미드로 수식된 덴드리머와 반응시킨다.
한편, 말단이 아민으로 수식된 덴드리머를 이용하여 포도당 산화효소와 같은 전형적인 당단백질의 단분자막을 제조하는 경우에는, 이민 결합의 안정화를 위하여 보로하이드라이드(borohydride) 화합물을 이용하여 환원반응을 수행하고, 고정화된 효소의 표면에 잔존하는 알데히드 반응기에 의한 부반응을 억제하기 위하여 에탄올아민을 처리할 수 있다. 이렇게 고정화된 포도당 산화효소의 양은 시편의 단위면적cm2당 1.2×10-12내지 1.7×10-12mol 정도가 되며, 바람직하게는 최대 고정량인 1.7×10-12mol 정도이다. 상술한 본 발명의 덴드리머를 이용한 당단백질의 단분자막의 제조방법은 도 2에 개략적으로 나타내었다.
아울러, 본 발명은 바이오틴(biotin)과 아비딘(avidin)의 강한 결합력을 이용하여 생체분자의 단분자막을 제조하는 방법을 제공한다. 우선 알칸티올 자기조립박막에 바이오틴으로 말단이 수식된 덴드리머 분자를 이용하여 단분자막을 제조하고, 여기에 아비딘을 반응시켜 아비딘의 단분자막을 제조한다. 단분자막을 형성한 아비딘은 여분의 바이오틴 결합부위가 반대방향으로 존재하기 때문에, 바이오틴으로 수식된 생체분자를 반응시켜서 목적하는 생체분자의 단분자막을 제조한다. 단분자막을 형성한 아비딘의 바이오틴 결합 부위가 반대방향으로 존재하기 때문에, 바이오틴으로 수식된 생체분자를 추가로 반응시켜서 목적하는 생체분자의 단분자막을 제조할 수 있다. 도 3에 본 발명의 덴드리머를 이용한 항원·항체의 단분자막의 제조방법을 개략적으로 나타내었다. 전기 형성된 단분자막의 특성은 엘립소메트리(ellipsometry), 전기화학적 방법이나 형광 현미경 등을 이용하여 분석될 수 있다. 아비딘의 단분자막 형성을 전기화학적 방법으로 확인하는 경우, 고밀도의 아비딘 단분자막이 형성된 시편을 포도당, 포도당 산화효소 및 페로센(ferrocene)을 포함한 완충용액에 담그고, 일정한 전압을 가하였을 때, 아비딘 분자막에 의하여 전도성 금속표면으로 잔자전달이 완전히 차단되어 측정전류값의 변화가 없게 된다.
상술한 방법에 의하여 제조된 생체분자의 단분자막을 엘립소케트리를 이용하여 분석한 결과, 고체 표면에 고정된 생체분자 박막의 두께가 단분자의 크기 만큼 증가하였으며, 전기화학적 방법에 의하여 단백질의 활성을 측정한 결과, 단백질이 고밀도의 단분자막을 형성하였음을 확인하였다. 아울러, 항원·항체의 단분자막의 제조에서 형광현미경으로 분석한 결과, 고체 표면에 형광물질이 표식된 항체의 단분자막이 형성되었음을 확인하였다. 전기의 덴드리머 및 생체분자의 단분자막의제조방법은 종래의 기술에 비하여 균일하고, 고밀도인 단분자막을 제조할 수 있으며, 단백질의 공유결합이나 배향성 등을 고려하지 않아도 되는 장점을 가진다. 따라서, 본 발명의 생체분자의 단분자막은 진단 키트, 바이오센서 또는 단백질 칩 등의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 덴드리머를 이용한 단분자막의 제조
우선, 금이 증착된 실리콘 기판을 에탄올로 세척하고, 세척된 기질시편을 디티오프로피온산 비스-N-하이드록시숙신이미드에스테르(dithiopropionic acid bis-N-hydroxysuccinimide ester)가 DMSO에 5mM의 농도로 용해되어있는 용액에 담그고, 2시간 동안 반응시켜 자기조립박막을 수득하였다.
전기 수득된 자기조립박막을 메탄올로 세척하고, 아민기를 포함하는 덴드리머(Denditeh Inc., Midland)가 0.022mM의 농도로 용해된 메탄올 용액에 1시간 담금으로써 덴드리머의 단일분자막을 수득하였다.
실시예 2: 포도당 산화효소의 단분자막의 제조
포도당 산화효소의 단분자막을 형성하기 위하여 과요오드산염(periodate)으로 처리된 포도당 산화효소용액을 준비하고, 이를 전기 제조된 덴드리머의 단분자막표면에 점적하고 30분 내지 1시간 동안 반응시켰다. 이때 형성되는 이민 결합의 안정화를 위하여 보로하이드라이드(borohydride) 화합물을 이용하여 환원반응을 30분간 수행하고, 고정화된 효소의 표면에 잔존하는 알데히드 반응기에 의한 부반응을 억제하기 위하여 에탄올아민 10mM으로 30분간 처리하였다. 전기 시편위에 제조된 포도당 산화효소 단분자막의 특성은 다음과 같은 전기화학적 방법으로 분석하였다: 즉, 포도당 산화효소가 고정된 시편을 효소의 기질에 해당하는 포도당과 전도성 금속표면으로의 전자수송에 관여하는 페로센(ferrocene)을 포함한 완충용액에 담그고 250mV의 전압을 가하여 흐르는 고정화된 포도당 산화효소의 양을 측정한 결과, 시편의 단위면적 cm2당 약 1.7×10-12mol 정도이고, 저장한지 20일 후에도 고정화된 효소의 80% 정도가 활성을 유지하는 놀라운 효과를 나타내었다.
실시예 3: 덴드리머를 이용한 항체 단분자막의 제조
전기 실시예 1에서 상술한 바와 같이 덴드리머의 단분자막을 형성하고, 덴드리머의 단분자막이 형성된 기질시편을 증류수로 세척한 후, 단분자막 표면의 아민반응기를 바이오틴으로 수식하기 위하여 하기의 반응을 수행하였다: 즉, 덴드리머의 단분자막을 2 mg/㎖의 바이오틴-N-하이드록시설포숙신이미드에스테르(biotin-N-hydroxysulfosuccinimide ester)가 용해된 인산염 완충용액에 담가 1시간동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후 시편을 완충용액으로 세척한 후, 다음과 같이 아비딘과 반응시켜 아비딘의 단분자막을 제조하였다: 즉, 바이오틴으로 수식된 덴드리머 단분자막을 0.01 mg/㎖의 아비딘이 용해된 인산염 완충용액에 담가 30분간 반응시켰다. 그런 다음, 전기 아비딘과 반응한 단분자막을 포도당, 포도당 산화효소 및 페로센을 포함한 완충용액에 담그고, 일정한 전압을 가하였을 때, 아비딘 분자막에 의하여 전도성 금속표면으로 잔자전달이 완전히 차단되어 측정전류값의 변화가 없는 것으로 전기 아비딘 단분자막의 형성을 확인하였다.
전기 아비딘 단분자막에 바이오틴으로 수식된 항체 (0.01 mg/㎖) 용액에 담가 20분간 반응시켜서 안정적인 항원의 단분자막을 형성시킨 후, IgG(Sigma Chemical Co., U.S.A.)를 반응시켜 항체의 단분자막을 제조하였다. 이어, 형광물질인 FITC로 표식된 IgG에 대한 단분자막을 별도로 제조하여 형광현미경으로 관찰한 결과, 항체의 단분자막이 형성되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 단백질 단분자막의 제조
카르복실기 말단의 덴드리머를 사용하여 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)로 수식된 덴드리머를 합성하고 이를 단백질의 아민기와 반응시켜서 다음과 같이 단백질의 단분자막을 제조하였다: 먼저, N-하이드록시숙신이미드로 수식된 덴드리머는 염이 결합된 카르복실기를 산성조건 하에서 나트륨염을 대부분 제거한 후, 유기용매 조건하에서 카르복실기를 N-하이드록시숙신이미드로 수식하였다.
이와는 별도로, 금이 증착된 실리콘 기판을 세척하고, 10mM 시스타민 다이하이드로클로라이드(cystamine dihydrochloride) 용액에 2시간 담가서 말단이 아민기인 자기조립박막을 형성시켰다. 반응이 종결된 후 시편을 증류수로 깨끗이 세척하고, 앞서 제조한 N-하이드록시숙신이미드로 수식된 덴드리머를 100μM 농도로 반응시켜 덴드리머의 단분자막을 제조하였다. 덴드리머와 반응하지 않은 잔여 N-하이드록시숙신이미드는 단백질의 아민기에 대해 높은 반응성을 나타내므로 깨끗이 세척하여 제거하였다. 다음으로, N-하이드록시숙신이미드로 수식된 덴드리머의 단분자막에 45μM 농도의 단백질용액을 첨가하여 최종적으로 단백질의 단분자막을 제조하였다. 본 발명에서는 전형적인 단백질로 포도당 산화효소, 싸이토크롬 C, 안티바이오틴 항체를 이용하여 단백질의 단분자막을 제조하였다.
전기 제조된 단백질의 단분자막을 형광현미경으로 관찰한 결과, 단백질의 단분자막이 고밀도로 형성되었으며, 형광현미경으로 관찰한 결과, 생체분자가 균일하게 분포되는 단분자막을 형성하였음을 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 덴드리머의 단분자막은 금속또는 유리 표면에 한쪽 말단이 아민기 또는 숙신이미드(succinimide)로 수식된 알칸티올(alkanethiol) 분자를 이용하여 자기조립박막(self-assembled monolayer)을 수득하는 단계; 및, 전기 자기조립박막에 아민기를 포함하는 덴드리머 또는 N-하이드로숙신이미드로 수식된 카르복실기를 포함하는 덴드리머를 반응시킴으로써 덴드리머의 단분자막을 수득하는 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조된다. 아울러, 전기 제조된 단분자막에 단백질, 항원, 항체, 효소, 리셉터(receptor), 및 리간드(ligand)를 반응시켜 생체분자의 단분자막을 제조할 수 있으며, 이는 진단용 킷트, 바이오센서(biosensor)의 개발 및 유용물질의 생산을 위한 효소의 고정화, 단백질 칩 등 생명공학 및 생물공학 분야에서 광범위하게 활용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 금속 또는 유리 표면에 한쪽 말단이 아민기 또는 숙신이미드(succinimide)로 수식된 알칸티올(alkanethiol) 분자를 이용하여 자기조립박막(self-assembled monolayer)을 수득하는 단계; 및, 전기 자기조립박막에 아민기를 포함하는 덴드리머 또는 n-하이드로숙신이미드로 수식된 카르복실기를 포함하는 덴드리머를 반응시킴으로써 덴드리머의 단분자막을 수득하는 단계를 포함하는 단분자막을 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    알칸티올 분자는
    디티오프로피온산 비스-N-하이드록시숙신이미드에스테르 또는
    시스타민 다이하이드로클로라이드인 것을 특징으로 하는
    단분자막을 제조하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    덴드리머는
    (ⅰ) G1, G2, G3, G4 및 G5로 구성되는 아민기로 수식된 덴드리머; 및,
    (ⅱ) G1.5, G2.5, G3.5, G4.5 및 G5.5.로 구성되는 덴드리머의 말단에
    위치하는 카르복실기가 N-하이드록시숙신아미드로 수식된
    덴드리머로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    단분자막을 제조하는 방법.
  4. 제 1항의 방법에 의하여 제조된 단분자막에 단백질, 항원, 항체, 효소, 리셉터(receptor) 또는 리간드(ligand)인 생체분자를 반응시키는 단계를 포함하는 생체분자의 단분자막을 제조하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    생체분자가 아민기를 가질 경우 아민기를 가진 덴드리머와 그대로
    반응시키며, 생체분자가 당쇄구조를 가질 경우 당쇄구조를
    과요오드산염으로 산화시켜 알데히드기를 갖도록 한 후, 반응시키는
    것을 특징으로 하는
    생체분자의 단분자막을 제조하는 방법.
  6. 금속 또는 유리 표면에 한쪽 말단이 아민기 또는 숙신이미드(succinimide)로수식된 알칸티올(alkanethiol) 분자를 이용하여 자기조립박막을 수득하는 단계; 전기 자기조립박막에 바이오틴(biotin)으로 수식된 덴드리머(dendrimer)를 반응시켜 덴드리머의 단분자막을 수득하는 단계; 전기 덴드리머의 단분자막에 아비딘(avidin)을 반응시켜 아비딘의 단분자막을 수득하는 단계; 및, 전기 아비딘의 단분자막에 바이오틴으로 수식된 생체분자를 반응시키는 단계를 포함하는 생체분자의 단분자막을 제조하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    생체분자는 단백질, 항원, 항체, 효소, 리셉터 또는 리간드를
    포함하는 것을 특징으로 하는
    생체분자의 단분자막을 제조하는 방법.
  8. 제 1항의 방법에 의하여 제조된 단분자막에 포도당 산화효소 용액을 점적하여 반응시키고, 보로하이드라이드 화합물을 사용하여 환원반응을 수행한 후, 에탄올아민으로 처리하여 부반응을 억제함으로써 제조되는 포도당 산화효소 단분자막.
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