KR100480339B1 - 재생이 가능한 전기 화학적 바이오센서 및 이의 재생 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표면 재생이 가능한 전기 화학적 바이오센서에 관하여 개시한다. 본 발명에 따른 바이오센서는 기판 상의 전극 위에 형성되고, 목표 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 바인더가 부동화되어 있는 바이오물질 감지막을 포함하며, 상기 목표 물질에 표지된 촉매 물질의 촉매 작용에 의하여 형성된 침전물 박막에 의한 상기 전극의 유효 면적의 감소에 의해 생성되는 전기화학적 신호로 상기 목표 물질의 유무 및/또는 그 양을 감지하며, 에탄올, 메탄올, 디메틸술폭사이드로 이루어진 그룹에서 선택된 유기 용매 2 내지 5 중량%와 잔량의 완충 용액으로 이루어져서 상기 침전물 박막을 제거할 수 있는 제1 시약을 처리함으로써 표면 재생이 가능한 바이오센서이다.

Description

재생이 가능한 전기 화학적 바이오센서 및 이의 재생 방법{Regenerable electrochemical biosensor and regeneration method thereof}

본 발명은 표면 재생이 가능한 전기 화학적 바이오센서 및 이의 재생 방법에 관한 것이다.

최근 들어 바이오센서의 미소화에 따라 바이오물질(bio-molecule)의 감지에 참여할 바이오물질의 절대량이 극도로 제한되므로 신호 추출의 고감도화, 신호의 정확성 및 정량화 관점에서 전자 공학 분야와 기술적으로 융합된 전기 화학적 바이오센서에 대한 연구가 활발히 수행되고 있다.

바이오센서는 바이오 물질들간의 특이적이고 안정한 결합력을 신호검출의 원리로 사용한다. 그러나, 이와 같은 특이적이고 안정한 결합에 기인하여 현재까지 개발된 바이오센서들은 일회용이라는 사용 한계를 갖는다. 즉, 한번의 특이적 결합반응이 유도되고 나면 그 바이오센서의 표면은 비가역적으로 측정 대상물에 의하여 변형된다.

종래에는 비등, 계면활성제, 산 또는 염기를 처리하여 바이오센서를 재생하였으나, 이 경우는 바이오물질 감지막 전체를 없앤다. 따라서, 바이오물질 감지막을 새로 형성하기 위해서는 시간 및 비용이 많이 들기 때문에 엄밀한 의미의 바이오센서의 재생이라 할 수 없다.

따라서, 바이오물질 감지막에 부동화된 목표 물질막을 유지한 상태의 표면 재생과 더불어 부동화된 목표 물질막을 유리시키되 바이오물질 감지막을 재사용시 감도가 떨어지지 않도록 재생 가능한 바이오센서에 대한 개발이 요구되고 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 고감도 감지가 그대로 유지되도록 표면 재생 및 재사용이 가능한 바이오센서를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 고감도 감지력을 그대로 유지할 수 있도록 바이오센서의 표면을 재생하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 표면 재생이 가능한 바이오센서는 기판 상의 전극 위에 형성되고, 목표 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 바인더가 부동화되어 있는 바이오물질 감지막을 포함하며, 상기 목표 물질에 표지된 촉매 물질의 촉매 작용에 의하여 형성된 침전물 박막에 의한 상기 전극의 유효 면적의 감소에 의해 생성되는 전기화학적 신호로 상기 목표 물질의 유무 및/또는 그 양을 감지하며, 에탄올, 메탄올, 디메틸술폭사이드로 이루어진 그룹에서 선택된 유기 용매 2 내지 5 중량%와 잔량의 완충 용액으로 이루어져서 상기 침전물 박막을 제거할 수 있는 제1 시약을 처리함으로써 표면 재생이 가능하다.

바람직하기로는 상기 제1 시약은 상기 바인더와 경쟁적으로 상기 목표 물질에 결합하여 상기 목표 물질을 환치할 수 있는 바인더를 더 포함한다. 바람직하기로는, 상기 바인더와 경쟁적으로 상기 목표 물질에 결합하여 상기 목표 물질을 환치할 수 있는 바인더와 완충 용액을 포함하는 제2 시약을 상기 제1 시약과 순차적으로 처리함으로써 표면 재생이 가능하다.

상기 바이오물질 감지막은 상기 전극 상에 형성되고, 상기 바인더가 부동화되어 있는 덴드라이머 자기 조립 단일막이거나, 상기 전극 상에 형성되고 2 이상의 리간드 결합 부위를 가지는 리셉터와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드가 부동화되어 있는 덴드라이머 자기 조립 단일막을 포함하는 제1 바이오물질 감지막 및 상기 제1 바이오물질 감지막 상부에 형성되고 상기 리간드와 결합된 상기 리셉터, 상기 리셉터에 상기 리간드를 매개로 하여 부동화되어 있는 상기 바인더를 포함하는 제2 바이오물질 감지막을 포함한다.

제1 및 제2 바이오물질 감지막을 포함하는 경우에는 상기 제1 시약은 상기 제1 바이오물질 감지막에 부동화되어 있는 상기 리간드와 경쟁적으로 상기 리셉터에 결합하여 상기 리셉터를 환치할 수 있는 리간드를 더 포함한다. 또, 상기 리간드와 경쟁적으로 상기 리셉터에 결합하여 상기 리셉터를 환치할 수 있는 리간드와 완충 용액을 포함하는 제2 시약을 상기 제1 시약과 순차적으로 처리함으로써 표면 재생이 가능하다.

바람직하기로는 상기 리간드는 바이오틴이고, 상기 리셉터는 아비딘 또는 스트렙트아비딘이다. 상기 바인더와 상기 목표 물질 쌍은 항원-항체, 호르몬-호르몬 리셉터, 폴리뉴클레오타이드-상보적인 폴리뉴클레오타이드, 렉틴-당쇄(poly- saccharide), 지질-지질 결합 단백질 또는 멤브레인-멤브레인 결합 단백질, 폴리뉴클레오타이드-폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 리셉터-리간드, 약-타켓, 단백질-단백질, 단백질-폴리뉴클레오타이드 이다.

상기 침전물 박막은 수용액에는 불용성이다. 상기 제1 시약 및/또는 제2 시약은 상기 바이오물질 감지막 및/또는 상기 목표 물질의 활성에 영향을 주지 않는 시약이다.

상기 다른 기술적 과제를 달성하기 위한 바이오센서의 표면 재생 방법에 따르면 먼저, 기판 상의 전극 위에 형성되고, 목표 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 바인더가 부동화되어 있는 바이오물질 감지막을 포함하는 바이오 센서로, 상기 목표 물질에 표지된 촉매 물질의 촉매 작용에 의하여 형성된 침전물 박막에 의한 상기 전극의 유효 면적의 감소에 의해 생성되는 전기화학적 신호로 상기 목표 물질의 유무 및/또는 그 양을 감지한 바이오 센서를 제공한다. 이어서, 에탄올, 메탄올, 디메틸술폭사이드로 이루어진 그룹에서 선택된 유기 용매 2 내지 5 중량%와 잔량의 완충 용액으로 이루어진 제1 시약을 처리한다.

기타 나머지 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다, 그러나 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 이하 첨부된 도면들을 참조하면서, 본 발명에 따른 바이오센서 및 이의 재생 방법에 대한 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 층 및 물질들의 모양 및 두께는 설명의 편의를 위하여 과장 또는 개략화된 것이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 부재를 지칭한다.

본 발명에 따른 바이오센서의 일부는 본 발명자에 의해 출원되고 공개된 공개 특허 제2002-007083호 및 본 발명자에 의해 출원된 특허출원 제 2001-076229호에 상세히 개시되어 있으며, 이것은 본 명세서에 속하는 것으로 한다.

도 1은 본 발명의 제1 실시예에 따른 전기 화학적 바이오센서(100)의 모식도이다. 도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 전기 화학적 바이오센서(100)는 기판(101)과, 상기 기판(101) 위에 형성된 전극(102)과, 바이오물질 감지막(110)을 포함한다.

상기 기판(101)은 실리콘 또는 유리로 이루어질 수 있다. 상기 전극(102)은 금, 은, 구리 또는 백금을 증발 또는 스퍼터링 방법으로 증착하여 형성한다. 바람직하기로는 금이 증착된 실리콘 기판이 사용된다.

바이오물질 감지막(110)은 특정 목표 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 바인더(104)가 부동화되어 있는 고분자 자기조립 단분자막(103)을 포함한다. 고분자 자기조립 단분자막(103)은 덴드라이머(dendrimer) 자기 조립 단분자막(103)인 것이 바람직하다. 바이오물질 감지막(110)은 기판(101)의 표면으로부터 수 나노미터 이내의 범위에 형성된다.

고분자 자기조립 단분자막(103)은 다음 두 가지 방법으로 형성할 수 있다. 전극(102) 상에 한쪽 말단이 아민, 숙신이미드, 카르복시아미드 또는 알데히드 등의 작용기로 수식된 알칸티올을 사용하여 자기조립막을 형성한 후, 상기 작용기와 이민 또는 아미드 결합을 형성할 수 있는 작용기인 알데히드, 숙신이미드, 카르복시아미드, 아민 등으로 수식된 덴드라이머 용액을 처리하여 덴드라이머 자기조립 단분자막(103)을 형성한다.

덴드라이머 자기조립 단분자막(103) 표면에 노출되어 있는 작용기인 알데히드, 숙신이미드, 카르복시아미드, 아민 등과 반응하여 이민 또는 아미드 결합을 형성할 수 있는 작용기로 수식된 바인더(104)를 덴드라이머 자기조립 단분자막(103)과 반응시켜 이민 또는 아미드 결합에 의해 바인더(104)를 부동화(immobilization)시켜서 바이오물질 감지막(110)을 완성한다.

바인더(104)는 검출하고자 하는 목표 물질의 종류에 따라 선택된다. 바인더와 목표 물질의 쌍으로는 항원-항체, 호르몬-호르몬 리셉터, 폴리뉴클레오타이드-상보적인 폴리뉴클레오타이드, 렉틴-당쇄(poly- saccharide), 지질-지질 결합 단백질 또는 멤브레인-멤브레인 결합 단백질, 폴리뉴클레오타이드-폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 리셉터-리간드, 약-타켓, 단백질-단백질, 단백질-폴리뉴클레오타이드 등의 조합들이 모두 가능하다. 상기 바인더와 목표 물질들은 생체내에서 추출한 물질, 생체외에서 합성된 물질 모두를 지칭한다.

도 2는 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오센서의 감지 및 재생 과정을 나타내는 흐름도이다. 도 3 내지 도 6은 도 2의 각 흐름도에 대응하는 바이오센서의 모식도들이다.

도 1에 도시되어 있는 바이오센서를 사용하여 테스트 샘플내의 목표 물질 존재 유무를 감지한다. 먼저 바이오센서(100)에 테스트 샘플을 공급하여 바인더(104)와 목표 물질(105)간의 특이적 결합을 유도한다(S10). 테스트 샘플은 테스트하고자 하는 시료를 완충 수용액에 희석하여 준비한다. 테스트 샘플 내에 바이오센서(100)의 바인더(104)와 특이적으로 결합할 수 있는 타켓 물질(105)이 존재한다면 도 3과 같은 특이적 결합이 일어난다. 도3 에서는 바인더(104)와 목표 물질(105)이 각각 항원과 항체인 경우를 예시하고 있다.

목표 물질(105)의 결합 유무를 전기 화학적인 방법으로 검출하기 위한 침전 반응 유도를 위하여 바이오센서(100)와 반응시키기 전에 목표 물질(105)은 침전 반응을 유도할 수 있는 촉매 물질(106)로 표지한다. 촉매 물질(106)로는 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 포도당산화효소 등의 촉매 효소를 사용하는 것이 바람직하다.

이어서, 침전 반응을 유도한다(도2의 S20). 테스트 샘플을 처리한 후, 바인더(104)와 목표 물질(105)의 반응이 완료되기에 적정한 시간이 소요된 후, 바이오센서(100)에 침전 기질과 표지된 촉매 물질(106)의 촉매 작용을 활성화시킬 수 있는 기질의 혼합 완충 수용액인 침전 반응 유도 용액을 공급한다. 만약 촉매 물질(106)이 표지되어 있는 목표 물질(105)이 테스트 샘플 내에 존재한다면, 촉매 물질(106)의 작용에 의해 도 4에 도시되어 있는 바와 같이 침전물 박막(107)이 형성되어 전극(102) 표면을 덮게 된다.

촉매 물질(106)이 퍼옥시다아제인 경우 침전 기질로는 4-클로로-1-나프톨을 사용한다. 침전 반응 유도 용액내의 퍼옥시다아제의 기질에 의해 퍼옥시다아제(106)가 활성화되면, 활성화된 퍼옥시다아제의 작용에 의해 침전 기질인 4-클로로-1-나프톨이 수용액에 대해 수용성에서 불용성으로 변성된다. 그 결과 침전물 박막(107)이 형성되게 된다.

따라서, 침전 기질은 촉매 물질(106), 즉 촉매 효소의 종류에 따라 다양하게 선택할 수 있다. 예를 들어 촉매 물질(106)이 알칼라인포스파타아제인 경우에는 침전 기질로는 니트로 블루 테트라졸리움(nitro blue tetrazolium), 인도니트로테트라졸리움(indonitrotetrazolium) 등이 적합하며, 포도당 산화효소인 경우에는 테트라니트로 블루 테트라졸리움(tetranitro blue tetrazolium), 디메틸티아졸 디페닐테트라졸리움(dimethylthiazol diphenyltetrazolium) 등이 침전 기질로 적합하다.

계속해서, 전기화학적 방법으로 목표 물질의 유무 및 그 양을 감지한다(도 2의 S30). 전기화학적 방법으로는 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry)을 사용하는 것이 바람직하다. 순환 전압 전류법은 도 4에 도시되어 있는 바이오센서(100)의 전극(101)을 작업 전극으로 하고, 은/염화은 기준 전극, 그리고 백금선 전극을 보조 전극으로 하는 삼 전극계를 구성하여 신호 검출을 한다. 순환 전압 전류법은 전기 화학적 활성 종을 전해질 용액 내에 공급하여 전극 상에서 전기 화학적 활성종이 산화되면서 발생시키는 산화 전류를 측정함으로써 수행한다. 전기 화학적 활성 종으로는 일반적으로 페로센 유도체 등이 주로 사용되며, 전해질 용액 내에 수 밀리몰 이하의 농도가 되도록 조제하여 사용한다.

도 4에 도시되어 있는바와 같이 형성된 침전물 박막(107)에 의하여 전극(101)의 유효 면적이 감소하면 순환 전압 전류법에 의해 측정되는 전압 전류의 파형 및 최대 전류값이 변화하게 된다. 따라서 전압 전류의 파형의 변화 또는 최대 전류 값의 변화를 측정하여 센서 신호를 정량 수치화함으로써 목표 물질(105)의 양을 정량적으로 분석할 수 있다.

이와 같이 바이오센서(100)를 이용한 신호 검출을 수행하고 나면, 도 4와 같이, 사용된 바이오센서(100)의 바이오물질 감지막(110)은 특이적 결합반응이 일어난 목표 물질(105)층과 단백질의 분자층과 침전물 박막(107)에 의하여 비가역적으로 덮이게 되고 따라서 재사용이 불가능해 진다.

따라서, 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오센서(100)를 재사용하기 위해서는 표면 재생 단계를 실시한다.

먼저, 침전물 제거용 시약을 처리하여 침전물 박막을 제거한다(도 2의 S40). 그 결과 도 5에 도시되어 있는 바와 같이 침전물 박막이 제거된 표면을 구비하는 바이오센서(100)가 재생된다.

침전물 박막(도 4의 107)의 제거는 바이오물질 감지막(110)의 표면에 결합되어 있는 물질들, 즉, 목표 물질(105) 및 표지된 촉매 물질(106)의 생체 활성에 영향을 주지 않는 시약을 사용하여 진행하는 것이 바람직하다. 그리고 수용액에는 불용성인 상기 침전물 박막(107)을 효율적으로 제거할 수 있는 시약을 사용하여 진행하는 것이 바람직하다.

따라서, 침전물 박막(107) 제거 시약으로는 에탄올, 메탄올, 디메틸술폭사이드(DMSO)로 이루어진 그룹에서 선택된 유기 용매 2 내지 5 중량%와 잔량의 완충 용액으로 이루어진 시약이 적합하다. 완충 용액으로는 인산염 완충용액(PBS), 카보네이트 완충용액, 보레이트 완충용액 등이 적합하다.

퍼옥시다아제에 의해 형성된 침전물 박막(107) 제거의 경우에는 중량비로 5%인 에탄올과 95%인 인산염 완충용액의 혼합액을 사용한다. 그러나, 침전 반응을 일으키는 표지 촉매 효소 및 침전 기질에 따라 형성되는 침전물 박막의 물성이 다르므로 제거 시약 또한 침전물 박막에 따라 그 조성 성분 및 함량이 달라질 수 있음은 물론이다.

이어서, 바이오 물질 감지막(110)에 결합되어 있는 촉매 물질(106)이 표지되어 있는 목표 물질(105)을 분리시킨다(도 2의 S50). 도 6과 같이, 목표 물질(105)의 분리는 바이오 물질 감지막(110)의 바인더(104)와 경쟁적으로 상기 목표 물질(105)에 결합하여 상기 목표 물질(105)을 환치(displace)할 수 있는 바인더(108)가 완충 용액에 희석되어 있는 시약을 사용하여 상기 목표 물질(105)을 분리시켜서 바이오 물질 감지막(110)의 표면을 완전히 재생한다. 환치 반응에 사용되는 시약내의 바인더(108)는 바이오 물질 감지막(110)에 부동화되어 있는 바인더(104)와 동일물질일 수도 있고, 이와 경쟁적으로 목표 물질(105)에 결합할 수 있는 다른 물질일 수도 있다.

재생이 완료된 바이오센서(100)는 필요에 따라 상술한 S10 내지 S50 단계를 거치면서 반복적으로 재사용될 수 있다.

도 2에서는 침전물 박막 제거와 목표 물질 분리 단계가 순차적으로 진행되는 경우에 대해서만 도시하였으나, 침전물 박막 제거 시약이 바인더(104)와 경쟁적으로 상기 목표 물질에 결합하여 상기 목표 물질을 환치할 수 있는 바인더(108)를 더 포함하여 침전물 박막 제거와 목표 물질 분리가 동시에 진행되도록 할 수도 있다.

도 7은 본 발명의 제2 실시예에 따른 전기 화학적 바이오센서(200)의 모식도이다. 제2 실시예에 따른 바이오센서(200)는 제1 바이오물질 감지막(110) 및 제2 바이오물질 감지막(120)으로 구성된다는 점에 있어서 제1 실시예와 차이가 있다. 제1 바이오물질 감지막(110)의 구조는 제1 실시예와 거의 동일하다. 다만, 고분자 자기 조립 단분자막(103)에 부동화된 제1 바인더(104)가 2 이상의 리간드 결합 부위를 가지는 리셉터(113)와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드라는 점에 있어서 제1 실시예와 차이가 있다.

제2 바이오물질 감지막(120)은 제1 바이오물질 감지막(110)에 부동화된 리간드(104)에 결합된 리셉터(113)을 매개로 하여 구성된다. 즉, 상기 리간드(104)와 결합된 상기 리셉터(113)의 나머지 결합부위에 목표 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제2 바인더(114)가 결합된 리간드(104)가 부동화되어 제2 바이오물질 감지막(120)을 형성한다.

상기 리간드로는 바이오틴이 상기 리셉터로는 아비딘 또는 스트렙트아비딘(이하 (스트렙트)아비딘))이 적합하다.

제2 실시예에 따른 바이오센서(200)의 경우에는 리간드(104)인 바이오틴에 결합시킬 수 있는 제2 바인더(114)의 선택 폭이 다양하므로 다양한 형태의 목표 물질에 대한 바이오센서를 구현할 수 있다는 장점이 있다.

제 2실시예에 따른 바이오센서(200)의 감지 및 재생 과정을 도 8 내지 도 11을 참고하여 설명한다. 제1 실시예와 동일한 단계는 상세한 설명을 생략하도록 한다.

먼저, 바이오센서(200)에 테스트 샘플을 공급한다. 테스트 샘플내에 제2 바인더(114)와 특이적으로 결합할 수 있는 목표 물질(125)이 존재한다면 도 8과 같은 특이적 결합이 일어난다. 목표 물질(125)의 결합 유무를 전기 화학적인 방법으로 검출하기 위한 침전 반응 유도를 위하여 바이오센서(200)와 반응시키기 전에 목표 물질(125)은 침전 반응을 유도할 수 있는 촉매 물질(126)로 표지한다.

이어서, 제1 실시예와 마찬가지로 침전 반응을 유도한다. 만약 촉매 물질(126)이 표지되어 있는 목표 물질(125)이 테스트 샘플내에 존재한다면, 촉매 물질(126)의 작용에 의하여 도 9와 같이 침전물 박막(107)이 형성되어 전극(102) 표면을 덮게 된다.

이후, 순환 전압 전류법을 사용해서 목표 물질(125)의 양을 정량적으로 분석하는 단계까지는 제1 실시예의 바이오센서의 경우와 동일하게 진행한다.

이후 표면 재생 단계를 실시한다. 먼저, 침전물 박막 제거용 시약을 처리하여 침전물 박막(107)을 제거하여 도 10에 도시되어 있는 바와 같이 침전물 박막이 제거되어 재생된 바이오 센서(200)를 형성한다. 이 때 사용되는 침전물 박막 제거용 시약은 제1 실시예에서 설명한 특성을 만족시키는 시약을 사용한다.

이어서, 제2 바이오 물질 감지막(120)을 제1 바이오 물질 감지막(110)으로부터 분리 제거한다. 리간드(104)와 경쟁적으로 리셉터(113)에 결합할 수 있는 리간드(109)가 완충 용액에 희석되어 있는 시약을 사용하여 리셉터(113)를 환치함으로써 도 11과 같이 제1 바이오 물질 감지막(110)이 노출되도록 한다. 환치 반응에 사용되는 시약내의 리간드(109)는 제1 바이오 물질 감지막(110)에 부동화되어 있는 리간드(104)와 동일 물질일 수도 있고, 이와 경쟁적으로 리셉터(113)에 결합할 수 있는 다른 물질일 수도 있다.

또, 제1 실시예에서 설명한 바와 마찬가지로 침전물 박막 제거 시약이 리간드(104)와 경쟁적으로 상기 리셉터(113)에 결합하여 리셉터(113)을 환치할 수 있는 바인더를 더 포함하여 침전물 박막 제거와 목표 물질 분리가 동시에 진행되도록 할 수도 있다.

이와 같은 재생 과정을 거칠 경우 제1 바이오 물질 감지막(110) 위에 원하는 목표 물질을 검출할 수 있는 새로운 바인더를 포함하는 제2 바이오 물질 감지막을 새로 형성하여 감지 작업을 수행할 수 있다. 즉, 다양한 형태의 목표 물질을 검출할 있는 바이오센서를 매우 쉽고도 용이하게 재 제작하여 바이오 물질의 감지에 사용할 수 있다.

이하 본 발명에 따른 바이오센서의 제조예 및 이를 이용한 감지 및 재생 방법에 대한 구체적인 실험예들을 설명한다. 그러나 이 실험예들에서 언급된 구체적인 수치 및 시약의 조성 성분 및 함량 등은 각 공정 조건에 따라 변화될 수 있음은 물론이다.

<실험예 1: 바이오센서의 제조>

금이 증착된 실리콘 기판을 피란(piranha) 용액으로 세척하고, 세척된 기질 시편을 디티오프로피온산 비스 N-히드록시숙신이미드에스테르가 DMSO에 5mM의 농도로 용해되어 있는 용액에 담근 후 2시간 동안 반응시켜 자기조립박막을 수득하였다. 얻어진 자기조립박막을 에탄올로 세척하고, G4에 해당하며 64개의 아민 반응기를 포함하는 폴리(아미도아민) 덴드라이머가 0.022mM의 농도로 용해된 에탄올 용액에 1시간 담그어 덴드라이머 자기 조립 단분자막을 제조하였다.

이어서, 알데히드기로 수식된 IgG에 대한 항원(10μg/㎖) 용액에 덴드라이머 자기 조립 단분자막을 1시간 담그어 IgG에 대한 항원이 부동화된 바이오센서를 완성하였다.

<실험예 2: 목표 항체에 대한 바이오센서의 노출>

퍼옥시다아제로 표지된 IgG (10μg/ 1㎖ 인산염 완충용액) 용액을 바이오센서 표면에 적하한 후, 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 은/염화은 기준 전극, 백금선 보조 전극 그리고 목표 항체에 노출된 바이오센서의 전극을 작업전극으로 하여 순환 전압 전류법으로 전기 화학적 측정을 하였다. 작업 전극은 100μM의 페로센 메탄올 (ferrocene methanol)이 용해되어 있는 전해질 완충 용액이 들어있는 전기 화학적인 셀에 위치시켜서 측정하였다. 측정된 결과가 도 12의 ① 번 그래프이다. ① 번 그래프로부터 바이오센서의 전극 표면이 열린 구조로 형성되어 전기 화학적 활성종이 쉽게 산화됨을 확인할 수 있었다.

<실험예 3: 침전 반응의 유도>

퍼옥시다아제의 기질과 침전기질인 4-클로로-1-나프톨이 용해되어 있는 침전 반응 유도 용액을 목표 항체에 노출된 바이오센서의 표면에 처리하여 침전 반응을 유도시켰다. 이어서 침전 반응이 완료된 후 실험예 2에서 설명한 바와 마찬가지로 순환 전압 전류법으로 측정하였다. 그 결과가 도 12의 ②번 그래프이다. ②번 그래프로부터 침전물 박막의 누적에 의하여 바이오센서의 표면이 닫혀 산화전류가 크게 감소한 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 4: 침전물 박막의 제거>

중량비로 5%인 에탄올과 95%인 인산염 완충용액을 침전 반응이 일어난 바이오센서에 적하한후 25℃에서 5분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 바이오센서의 표면을 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 12의 ③번 그래프이다. ③번 그래프로부터 침전물 박막이 완전히 제거되어 바이오센서의 표면이 다시 열린 구조로 되어 표면 재생이 일어난 것을 관찰할 수 있었다.

<실험예 5: 재침전 반응의 유도>

실험예 4에서 침전물 박막이 제거된 바이오센서에 대해서 실험예 3과 동일한 시약 및 반응 조건으로 재침전 반응을 진행한 후, 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 12의 ④번 그래프이다. ④번 그래프로부터 전극이 다시 닫힌 구조에 대한 신호를 나타냄을 보이는 것을 확인할 수 있었으며 이로부터 바이오 물질 감지막의 표면에 결합된 생체물질(IgG)들의 활성이 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.

<실험예 6: 침전물 박막 제거 및 환치 반응의 유도>

바이오센서의 준비 및 목표 물질에의 노출 그리고 침전 반응의 유도까지는 실험예 1 내지 실험예 3과 동일하게 진행하여 각 단계별로 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 13에 도시되어 있다. ①번 그래프는 표면 침전 반응 이전의 바이오센서의 측정 그래프로 바이오센서의 표면이 열린 구조로 형성되어 전기화학적 활성종이 쉽게 산화되는 상태임을 확인할 수 있었고, ②번 그래프는 침전 반응 이후의 측정 그래프로, 침전물 박막의 누적에 의해 바이오센서의 표면이 닫혀 산화 전류가 크게 감소한 상태임을 확인할 수 있었다.

이어서, 실험예 4와 동일한 방법으로 침전물 박막을 제거한 후, IgG에 대한 항원(1mg/㎖)의 완충용액을 처리하여 바이오센서의 바이오물질 감지막에 결합한 IgG 의 환치 반응을 10분간 연속적으로 진행한 후, 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 13의 ③번 그래프이다. 침전물 박막 제거만 실시한 이후에 측정한 도 12의 ③번 그래프와 비교해볼 때, 산화 전류가 더 많이 흐르고 있음을 알 수 있으며, 이로부터 바이오센서 표면의 침전물 박막 제거와 함께 바이오 물질 감지막에 특이적으로 결합한 목표 물질인 IgG가 환치되어 제거되었음을 확인할 수 있었다.

계속해서 실험예 3과 동일한 시약 및 반응 조건으로 재침전 반응을 진행한 후, 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 13의 ④번 그래프이다. 전극이 열린 구조에 대한 신호를 나타내고 있음을 알 수 있다. 이는 침전 반응을 일으킬 수 있는 촉매 효소가 표지된 IgG가 바이오 물질 감지막으로부터 제거되었기 때문에 나타나는 당연한 결과임을 알 수 있다.

마지막으로, 바이오센서의 재사용시의 감지 감도 유지 여부를 알아보기 위해 상술한 재생 단계들을 거친 바이오센서의 표면에 대해 실험예 2 및 실험예 3과 동일한 방법으로 목표 물질에의 노출 그리고 침전 반응의 유도를 진행한 후 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 13의 ⑤번 그래프이다. ⑤번 그래프로부터 전극이 다시 닫힌 구조에 대한 신호를 나타냄을 알 수 있다. 이로부터 본 발명에 따라 재생된 바이오센서가 신규 감지에 대해서도 다시 유효한 특성을 가짐을 확인할 수 있었다.

<비교예>

바이오센서의 준비 및 목표 물질에의 노출 그리고 침전 반응의 유도까지는 실험예 1 내지 실험예 3과 동일하게 진행하고 침전물 박막의 제거를 순수유기 용매인 에탄올 100%로 진행하고, 다시 실험예 5와 동일하게 재침전 반응까지 진행한 후, 각 단계별로 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 14에 도시되어 있다. ①번 그래프는 침전 반응 전, ②번 그래프는 침전 반응 후, ③번 그래프는 순수 유기 용매로 침전물 박막 제거 후, ④ 번 그래프는 재침전 반응 후에 각각 측정한 결과이다. ③번 그래프로부터 침전물 박막이 제거되었음을 확인할 수 있으나, ④번 그래프로부터 재 침전 반응이 일어나지 않음을 알 수 있다. 이는 도 15에 도시되어 있는 바와 같이, 바이오 물질 감지막(110) 표면에 결합되어 있던 단백질인 항체(IgG) 및 표지 효소들이 활성이 없어진 항체 및 표지 효소(130)로 변성되었기 때문으로 해석된다. 따라서, 순수 유기 용매만으로는 본 발명에 따른 재생반응을 효과적으로 진행할 수 없음을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 바이오센서는 바이오 물질의 검출 이후에 바이오물질 감지막에 부동화된 목표 물질막의 활성에 영향을 주지 않으면서 목표 물질막을 유지한 상태로 표면 재생하는 것이 가능할 뿐만 아니라, 특이 결합된 목표 물질막을 유리시키되 바이오물질 감지막을 재사용시 고감도를 그대로 유지할 수 있도록 표면 재생이 가능하다.

도1 은 본 발명의 제1 실시예에 따른 전기 화학적 바이오센서의 모식도이다.

도 2는 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오센서의 감지 및 재생 과정을 나타내는 흐름도이다.

도 3 내지 도 6은 도 2의 각 흐름도에 대응하는 바이오센서의 모식도들이다.

도 7은 본 발명의 제2 실시예에 따른 전기 화학적 바이오센서의 모식도이다.

도 8 내지 도 11은 본 발명의 제 2실시예에 따른 바이오센서의 감지 및 재생 과정을 나타내는 모식도들이다.

도 12는 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오센서의 침전반응 전,후, 재생 반응 후 및 재침전 반응 후에 순환 전압 전류법으로 전기 화학적 측정을 한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 13은 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오센서의 침전반응 전,후, 침전물박막 제거 및 환치 반응에 의한 재생반응 후 그리고 재침전 반응 후에 순환 전압 전류법으로 전기 화학적 측정을 한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 14는 비교예에 따라 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오센서의 침전반응 전,후, 재생 반응 후 및 재침전 반응 후에 순환 전압 전류법으로 전기 화학적 측정을 한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 15는 비교예에 따라 재생 반응을 할 경우 항체 및 표지효소들이 활성이 없어진 상태로 되는 경우를 나타내는 모식도이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

101: 기판 102: 전극

103: 덴드라이머 자기 조립 단일막 104: 바인더

105: 목표 물질 106: 표지된 촉매 물질

107: 침전물 박막 110: 바이오물질 감지막

Claims (24)

1. 기판 위에 형성된 전극과,

   상기 전극 위에 형성되고, 목표 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제1 바인더가 부동화되어 있는 바이오물질 감지막과,

   상기 침전물 박막을 제거하는 데 사용되고, 에탄올, 메탄올 및 디메틸술폭사이드로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 유기 용매 2 내지 5 중량%와 잔량의 완충 용액으로 이루어지는 제1 시약을 포함하고,

   상기 바이오물질 감지막은 상기 목표 물질에 표지된 촉매 물질의 촉매 작용에 의하여 침전물 박막 형성이 가능하고,

   상기 전극은 상기 침전물 박막에 의하여 그 유효 면적이 변화 가능한 것을 특징으로 하는 바이오센서.
2. 제1 항에 있어서, 상기 제1 시약은 상기 제1 바인더와 경쟁적으로 상기 목표 물질에 결합하여 상기 목표 물질을 환치할 수 있는 제2 바인더를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
3. 제1 항에 있어서, 상기 제1 바인더와 경쟁적으로 상기 목표 물질에 결합하여 상기 목표 물질을 환치할 수 있는 제2 바인더와 완충 용액을 포함하는 제2 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
4. 제1 항에 있어서, 상기 바이오물질 감지막은

   상기 전극 상에 형성되고, 상기 제1 바인더가 부동화되어 있는 덴드라이머 자기 조립 단일막인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
5. 제4 항에 있어서, 상기 덴드라이머 자기 조립 단일막은

   상기 전극 상에 형성된 자기조립 단일막; 및

   상기 자기 조립 단일막 위에 형성되고 상면에 상기 제1 바인더가 부동화되어 있는 덴드라이머 단일막을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
6. 제1 항에 있어서, 상기 바이오물질 감지막은

   상기 전극 상에 형성되고, 2 이상의 리간드 결합 부위를 가지는 리셉터와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드가 부동화되어 있는 덴드라이머 자기 조립 단일막을 포함하는 제1 바이오물질 감지막; 및

   상기 제1 바이오물질 감지막 상부에 형성되고 상기 리간드와 결합된 상기 리셉터, 상기 리셉터에 상기 리간드를 매개로 하여 부동화되어 있는 상기 제1 바인더를 포함하는 제2 바이오물질 감지막을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
7. 제6 항에 있어서, 상기 침전물 박막 및 상기 제2 바이오물질 감지막을 제거함으로써 상기 제1 바이오물질 감지막의 표면 재생이 가능하도록 하기 위하여, 상기 제1 시약은 상기 제1 바이오물질 감지막에 부동화되어 있는 상기 리간드와 경쟁적으로 상기 리셉터에 결합하여 상기 리셉터를 환치할 수 있는 리간드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
8. 제6 항에 있어서, 상기 제1 시약과 순차적으로 처리하여 상기 제2 바이오물질 감지막을 제거함으로써 상기 제1 바이오물질 감지막의 표면 재생이 가능하도록 하기 위하여, 상기 리간드와 경쟁적으로 상기 리셉터에 결합하여 상기 리셉터를 환치할 수 있는 리간드와 완충 용액을 포함하는 제2 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
9. 제6 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 바이오틴이고, 상기 리셉터는 아비딘 또는 스트렙트아비딘인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
10. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서 상기 제1 바인더와 상기 목표 물질 쌍은 항원-항체, 호르몬-호르몬 리셉터, 폴리뉴클레오타이드-상보적인 폴리뉴클레오타이드, 렉틴-당쇄, 지질-지질 결합 단백질 또는 멤브레인-멤브레인 결합 단백질, 폴리뉴클레오타이드-폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 리셉터-리간드, 약-타켓, 단백질-단백질, 단백질-폴리뉴클레오타이드, DNA-DNA 또는 DNA-RNA 인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
11. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 시약은 수용액에 불용성인 상기 침전물 박막을 제거하기 위한 시약인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
12. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서 상기 제1 시약 및 제2 시약 중 적어도 하나는 상기 바이오물질 감지막 및 상기 목표 물질의 활성에 영향을 주지 않는 시약인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
13. 기판 상의 전극 위에 형성되고, 목표 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 바인더가 부동화되어 있는 바이오물질 감지막을 포함하는 바이오 센서로, 상기 목표 물질에 표지된 촉매 물질의 촉매 작용에 의하여 형성된 침전물 박막에 의한 상기 전극의 유효 면적의 감소에 의해 생성되는 전기화학적 신호로 상기 목표 물질의 유무 또는 그 양을 감지하는 바이오 센서를 제공하는 단계; 및

    에탄올, 메탄올 및 디메틸술폭사이드로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 유기 용매 2 내지 5 중량%와 잔량의 완충 용액으로 이루어진 제1 시약을 처리하는 단계를 포함하는 바이오센서의 재생 방법.
14. 제13 항에 있어서, 상기 제1 시약은 상기 바인더와 경쟁적으로 상기 목표 물질에 결합하여 상기 목표 물질을 환치할 수 있는 바인더를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 재생 방법.
15. 제13 항에 있어서, 상기 제1 시약 처리 단계 이후에 상기 바인더와 경쟁적으로 상기 목표 물질에 결합하여 상기 목표 물질을 환치할 수 있는 바인더와 완충 용액을 포함하는 제2 시약을 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 재생 방법.
16. 제13 항에 있어서, 상기 바이오물질 감지막은 상기 전극 상에 형성되고, 상기 바인더가 부동화되어 있는 덴드라이머 자기 조립 단일막인 것을 특징으로 하는 바이오센서의 재생 방법.
17. 제16 항에 있어서, 상기 덴드라이머 자기 조립 단일막은

    상기 전극 상에 형성된 자기조립 단일막; 및

    상기 자기 조립 단일막 위에 형성되고 상면에 상기 바인더가 부동화되어 있는 덴드라이머 단일막을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 재생 방법.
18. 제13 항에 있어서, 상기 바이오물질 감지막은

    상기 전극 상에 형성되고, 2 이상의 리간드 결합 부위를 가지는 리셉터와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드가 부동화되어 있는 덴드라이머 자기 조립 단일막을 포함하는 제1 바이오물질 감지막; 및

    상기 제1 바이오물질 감지막 상부에 형성되고 상기 리간드와 결합된 상기 리셉터, 상기 리셉터에 상기 리간드를 매개로 하여 부동화되어 있는 상기 바인더를 포함하는 제2 바이오물질 감지막을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 재생 방법.
19. 제18 항에 있어서, 상기 제1 시약 처리 단계시 상기 제1 시약이 제1 바이오물질 감지막에 부동화되어 있는 상기 리간드와 경쟁적으로 상기 리셉터에 결합하여 상기 리셉터를 환치할 수 있는 리간드를 더 포함하여 상기 침전물 박막 및 상기 제2 바이오물질 감지막을 제거하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 재생 방법.
20. 제18 항에 있어서, 상기 제1 시약 처리 단계 이후에 상기 리간드와 경쟁적으로 상기 리셉터에 결합하여 상기 리셉터를 환치할 수 있는 리간드와 완충 용액을 포함하는 제2 시약을 처리하는 단계를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 재생방법.
21. 제18 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 바이오틴이고, 상기 리셉터는 아비딘 또는 스트렙트아비딘인 것을 특징으로 하는 바이오센서의 재생방법.
22. 제13 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서 상기 바인더와 상기 목표 물질 쌍은 항원-항체, 호르몬-호르몬 리셉터, 폴리뉴클레오타이드-상보적인 폴리뉴클레오타이드, 렉틴-당쇄, 지질-지질 결합 단백질 또는 멤브레인-멤브레인 결합 단백질, 폴리뉴클레오타이드-폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 리셉터-리간드, 약-타켓, 단백질-단백질, 단백질-폴리뉴클레오타이드, DNA-DNA 또는 DNA-RNA 인 것을 특징으로 하는 바이오센서의 재생방법.
23. 제13 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서 상기 침전물 박막은 수용액에는 불용성인 것을 특징으로 하는 바이오센서의 재생방법.
24. 제13 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서 상기 제1 시약 및 제2 시약 중 적어도 하나는 상기 바이오물질 감지막 및/또는 상기 목표 물질의 활성에 영향을 주지 않는 시약인 것을 특징으로 하는 바이오센서의 재생방법.