KR20200068877A

KR20200068877A - 면역 바이오센서 재생용 조성물, 이를 포함하는 생체물질 검출용 키트 및 이를 이용한 면역 바이오센서의 재생 방법

Info

Publication number: KR20200068877A
Application number: KR1020180155763A
Authority: KR
Inventors: 박민; 전다슬
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2020-06-16
Also published as: KR102200173B1

Abstract

본 발명은 면역 바이오센서 재생용 조성물, 상기 면역 바이오센서 재생용 조성물을 포함하는 생체 물질 검출용 키트 및 면역 바이오센서의 재생방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 트윈-20(tween-20)이 함유된 pH 2.5의 글리신 용액을 유효성분으로 포함하는 면역 바이오센서 재생용 조성물, 검출하고자 하는 생체 물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 표면에 고정시킨 면역 바이오센서 및 2%의 트윈-20(tween-20) 및 pH 2.5의 0.1M 글리신 용액이 함유된 면역 바이오센서 재생용 버퍼를 포함하는 생체 물질 검출용 키트 및 면역 바이오센서의 재생방법에 관한 것이다.

Description

면역 바이오센서 재생용 조성물, 이를 포함하는 생체물질 검출용 키트 및 이를 이용한 면역 바이오센서의 재생 방법{Composition for regeneration of immune biosensor, kit for detection of bio materials comprising the same and regeneration method of immune biosensor for recycle using the composition}

본 발명은 면역 바이오센서 재생용 조성물, 상기 면역 바이오센서 재생용 조성물을 포함하는 생체 물질 검출용 키트 및 면역 바이오센서의 재생방법에 관한 것이다.

바이오센서는 크게 분자 인식층(molecular recognition layer), 신호 변환기(signal transducer) 및 신호 발생층(signal-generating part)으로 구성이 되어있으며, 바이오센서 중에서 특이적인 항원-항체 결합반응을 이용하는 분자 인식층을 포함하고 있는 바이오센서를 면역센서로 분류하고 있다. 면역센서는 면역 친화층(immunoaffinity layer)에 결합되어 있는 항체가 타겟 분석대상 물질과 결합하여 발생하는 물질적 변화를 신호 변환기를 통해 신호화 시킨다. 타겟 분석대상 물질인 타겟 항원과 결합하는 특이적 항체는 Y자 형태의 구조를 가지며, 항원과 결합하는 부위는 이중의 2개 말단 Fab 영역과 항원과 결합하지 않는 다른쪽 가지의 말단 Fc 영역으로 구성되어 있으며, 항체의 이러한 구조적 특징 때문에 2 차원적 기질에 랜덤하게 고정화될 경우, 고정화된 항체들 중에서 결합에 적합한 배향을 갖는 항체가 20% 미만인 것으로 알려져 있다.

따라서 항체와 항원간의 반응이 충분히 일어나지 못할 수 있는 문제점을 극복하기 위하여, 항체의 배향 제어(orientation control)를 통한 면역센서의 민감도를 향상시키려는 연구가 진행되고 있고, 특히 항체의 구조적 특성에 근거하여 Fc 부분과 결합하는 분자인 단백질 A(protein A)를 이용한 항체 배양 제어 연구가 진행되고 있는데, 단백질 A는 스타필로코커스 아우레우스(staphylococcus aureus) 유래의 막 결합 단백질로 5개의 도메인을 가지고 있으며, 이중 B 도메인에서 유래한 Z-도메인은 항체 Fc 부분과의 결합 특이성 때문에 항체 배향 제어 연구의 대상이 되고 있다.

한편, 바이오센서는 바이오 물질들 간의 특이적이고 안정한 결합력을 신호검출의 원리로 분석한다. 그러나 이와 같은 특이적이고 안정한 결합에 기인하여 현재까지 개발된 바이오센서들은 한번 사용하면 재생이 불가능한 한계가 있어 비경제적인 문제점이 있다. 한 번의 특이적 결합반응이 유도되고 나면 사용된 바이오센서의 표면은 비가역적으로 측정 대상물에 의하여 변형되기 때문이다.

따라서 경제적 효과를 위한 방안으로 바이오센서를 재생할 수 있는 연구가 진행되고 있으나, 바이오물질을 인지(감지)할 수 있는 감지막 전체가 제거되는 문제점이 발생하여 바이오물질 감지막을 새로 형성하기 위한 추가의 시간 및 비용이 소요되고 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로 Paper based chip, inkjet printed chip 등과 같이 저가 칩 등이 개발되었으나, 여전히 개발된 제품들은 1회 사용만 가능할 뿐 재사용은 불가능하다.

특히 SPR(Surface Plasomon Resonance) 바이오센서 등과 같이 귀금속 신호 변환기를 사용해야 하는 바이오센서는 비용 절감을 위해 재활용 기술의 개발이 더욱 절실히 필요하지만, 아직까지 SPR 바이오센서의 비용을 절감시킬 수 있는 재활용 방법이 개발되지 못하고 있다.

이에 본 발명자들은 민감도 및 정확도가 우수할 뿐만 아니라 재사용이 가능하도록 하여 경제적인 측면에서도 가격을 낮출 수 있는 효율적인 바이오센서를 개발하기 위해 연구하던 중, Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막(OM)을 SPR 바이오센서에 코팅하고 항체(capture antibody)를 처리하여 항체의 배향이 제어된(orientation control)된 면역 친화층을 형성하도록 하였고, 상기 면역 친화층을 반복 사용할 수 있는 재생용 버퍼를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-0480339호

따라서 본 발명의 목적은, 트윈-20(tween-20)이 함유된 pH 2.5의 글리신 용액을 유효성분으로 포함하는 면역 바이오센서 재생용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 검출하고자 하는 생체 물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 표면에 고정시킨 면역 바이오센서; 및 2%의 트윈-20(tween-20) 및 pH 2.5의 0.1M 글리신 용액이 함유된 면역 바이오센서 재생용 버퍼를 포함하는, 생체 물질 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 검출하고자 하는 생체 물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 표면에 고정시킨 면역 바이오센서를 이용하여 면역 반응을 수행한 후, 트윈-20(tween-20)이 함유된 pH 2.5의 글리신 용액을 포함하는 면역 바이오센서 재생용 조성물로 상기 면역 바이오센서를 세척하는 단계를 포함하는, 면역 바이오센서의 재생방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 트윈-20(tween-20)이 함유된 pH 2.5의 글리신 용액을 유효성분으로 포함하는 면역 바이오센서 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물의 총 함량을 기준으로, 상기 트윈-20은 2%의 농도로 포함되어 있고 상기 글리신은 0.1M 농도로 포함되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역 바이오센서는 SPR(SURFACE PLASMON RESONANCE) 바이오센서, QCM (QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE) 바이오센서, SAW(SURFACE ACOUSTIC WAVE) 바이오센서 및 FPW(FLEXURAL PLATE WAVE) 바이오센서로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역 바이오센서는 면역 친화층을 포함하며, 상기 면역 친화층은 Z-도메인이 자가 표지된(autodisplaying) 대장균의 외부 세포막(outer membrane)으로 코팅되어 있는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은, 검출하고자 하는 생체 물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 표면에 고정시킨 면역 바이오센서; 및 2%의 트윈-20(tween-20) 및 pH 2.5의 0.1M 글리신 용액이 함유된 면역 바이오센서 재생용 버퍼를 포함하는, 생체 물질 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재생용 버퍼는 면역 바이오센서에 의한 면역 반응이 완료된 후, 상기 면역 바이오센서에 처리하여 4번~8번 상기 면역 바이오센서를 반복하여 사용하도록 하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체 물질은 항원, 항체, 펩타이드, 단백질, 박테리아, 바이러스, 및 진균으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한 본 발명은, 검출하고자 하는 생체 물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 표면에 고정시킨 면역 바이오센서를 이용하여 면역 반응을 수행한 후, 트윈-20(tween-20)이 함유된 pH 2.5의 글리신 용액을 포함하는 면역 바이오센서 재생용 조성물로 상기 면역 바이오센서를 세척하는 단계를 포함하는, 면역 바이오센서의 재생방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물의 총 함량을 기준으로 상기 트윈-20은 2%의 농도로 포함되어 있고, 상기 글리신은 0.1M 농도로 포함되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재생은 면역 바이오센서 재생용 조성물로 면역 반응이 완료된 면역 바이오센서를 세척하여, 상기 면역 바이오센서를 4번~8번 반복 사용하는 것일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 면역 바이오센서 재생용 조성물은 Z-도메인이 자가 표지된(autodisplaying) 대장균의 외부 세포막(outer membrane)으로 코팅된 면역친화층을 갖는 면역 바이오센서에 적용할 경우, 면역 바이오센서를 여러 차례 반복적으로 사용하여도 신뢰도가 높고 정확성이 우수한 분석 결과를 얻을 수 있어 재생에 의한 경제적인 효과가 있으며, Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막의 사용으로 항체의 배향을 제어할 수 있어 분석대상 물질에 대한 특이성 및 민감성을 향상시킬 수 있어 검출 효율을 증진시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 각기 다른 pH 조건 하에서 재생 처리를 통한 최적의 재생 조건을 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 계면활성제로서 SDS(2a) 및 Tween-20(2b)을 각기 다른 농도로 처리한 조건에서의 재생 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 재생 전 후의 Z-도메인이 자가 표지된 대장균을 현미경으로 관찰한 사진으로서, (a) 및 (b)는 재생 처리 전의 광학 현미경 관찰사진 및 형광 현미경 관찰사진을 나타낸 것이고, (c) 및 (d)는 재생 처리 후의 광학 현미경 관찰사진 및 형광 현미경 관찰사진을 나타낸 것이다.
도 4는 Z-도메인이 자가 표지된 대장균 세포를 기반으로 한 면역분석 결과를 나타낸 것으로, 재생 처리 횟수에 따른 면역분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막(OM)을 기반으로 한 면역분석 결과를 나타낸 것으로, 재생 처리 횟수에 따른 면역분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 SPR 바이오센서용 재생 면역 친화성 층에 대한 SRP 반응 신호값을 확인한 것으로, (a)는 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막(OM)을 이용한 실험군의 결과를 나타낸 것이고, (b)는 Z-도메인이 표지되지 않은 대장균의 외부 세포막(OM)을 이용한 대조군의 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 면역 바이오센서 재생용 조성물 및 이를 이용한 면역 바이오센서의 재생 방법을 제공함에 특징이 있다.

면역 바이오센서는 시료 내의 분석 대상물을 센서 표면에 선택적으로 흡착한 후, 흡착량을 전기신호로 출력하는 모든 기기를 의미하며, 이러한 면역 바이오센서는 여러 성분이 함유된 시료 내에서 분석 대상물만을 선택적으로 인식 및 흡착하는 분자 인식층(molecular recognition layer), 인식된 흡착량을 전기신호화 하는 신호 변환기(signal transducer) 및 신호를 발생시키는 신호 발생층(signal-generating part)으로 구성된다.

상기 분자 인식층은 인식 및 흡착하고자 하는 분석 대상물을 선택적으로 인지하는 항체를 센서 표면에 결합시킨 것이며, 상기 분자 인식층에 고정된 항체는 분석 대상물을 특이적으로 흡착 또는 결합하게 되고, 이와 같이 분자 인식층에 분석 대상물이 흡착 또는 결합하면 다양한 물리적인 변화가 발생한다. 신호 변환기는 상기와 같이 분자 인식층에 결합된 항체와 분석 대상물 간의 특이적 결합에 의하여 발생한 물리적 변화를 전기 신호화시키는 장치로서, 신호화된 물리적 변화는 신호 발생층(signal-generating part)을 통해 수치화 또는 이미지화 된다.

한편, 앞서 종래기술에서도 언급한 바와 같이 현재까지 개발된 바이오센서는 대부분 1회용으로 사용 후, 재활용하지 못하고 버려지고 있으며, 특히 고가의 금속을 기판으로 하는 바이오센서의 경우, 경제적인 측면에서 비효율적인 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 바이오센서, 특히 면역 바이오센서를 재생할 수 있는 방법을 연구하던 중, 항원-항체의 면역반응을 통한 면역센싱이 완료된 후, 사용하였던 바이오센서를 다시 효과적으로 재생할 수 있는 면역 바이오센서 재생용 조성물을 고안하였다.

또한, 바이오센서를 이용하여 분석대상물질의 검출 효율을 증진시키기 위해서는, 충분한 밀도의 항체가 면역 친화층 표면에 코팅되어야 하고, 코팅된 항체는 결합에 적합한 배향을 가져야 한다. 이러한 분석대상물질에 직접 결합하거나 또는 신호를 증폭시킬 수 있는 입자를 결합시키는 항체는 구조적인 특징을 가지고 있다. 즉, 항체가 분석 대상물을 결합하는 부위는 Y 자형 구조의 끝부분에 국소적으로 존재한다. 따라서 센서 표면에 흡착된 분석 대상물질에 효과적으로 결합하기 위해서는 항체의 결합 부위가 바깥쪽의 방향성으로 배향되어야 한다.

이에 본 발명에서는 분석대상물질의 검출 효율을 증진시키기 위한 방법으로, 항체 배향 조절을 통한 면역 바이오센서의 감도 향상을 위해 단백질 A의 Z-도메인을 사용하였는데, 구체적으로 단백질 A의 Z-도메인이 자가 표지된(autodisplaying) 대장균의 외부 세포막(OM;outer membrane)을 기판에 코팅하고 항체(capture antibody)를 처리하여 항체의 배향이 제어된(orientation control)된 면역 친화층을 갖는 면역 바이오센서를 제조하여 사용하였다.

본 발명에서 상기 단백질 A는 항체 결합 단백질로서 이뮤노글로불린 등의 면역 단백질과 선택적 친화성이 높은 단백질이며, 그 기원에 무관하게 모든 종류의 생물체에서 유래한 단백질 A를 모두 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)속에서 유래한 단백질 A (Accession No. P38507)을 사용하였다.

또한 상기 단백질 A의 Z-도메인은 단백질 A 가 미생물의 세포 외벽 표면에 발현 가능하면서도, 다양한 면역 단백질, 특히 IgG 등과 특이적이고 강력한 친화성을 나타내는 부위로서, 미생물로부터 발현시켜 정제하여 사용할 수도 있고, 또는 합성하여 사용할 수도 있다. 바람직하게 상기 본 발명에 따른 단백질 A의 Z-도메인은 서열번호 1로 기재된 펩타이드 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 서열번호 2의 염기서열(폴리뉴클레오티드)에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 표면발현기술을 이용하여 Z-도메인을 대장균의 외막에 발현하도록 하였다. 자가 표지(Autodisplay)는 일종의 표면발현기술 중 하나로, 그람 음성 박테리아의 외막(outermembrane)에 타겟 단백질을 AIDA-I(adhesin involved in diffuse adherence)과 같은 자동트랜스퍼(autotransporter)에 융합하여 발현시킨다. 이때 타겟 단백질의 N-말단은 신호 펩타이드와 연결되고, C-말단은 링커, β-barrel과 연결되어 발현된다. 신호 펩타이드는 발현된 단백질이 내막(inner membrane)을 통과하여 페리플라즘(periplasm)으로 이동할 수 있게 한다. 이렇게 발현된 타겟 단백질은 별도의 인위적인 처리 박테리아의 외부 세포막( outermembrane)에 β-barrel을 통해 C-말단이 고정된 타입 Va 분비 기작을 통해 secretion mechanism을 통해 정착하게 된다.

IgG 결합능을 가지는 Z-도메인이 자가 표지를 통하여 대장균 외부 세포막에 발현되면, Z-도메인의 방향은 항상 같은 구조를 이루기에, 여기에 항체( capture antibody)를 처리하게 되면 항체의 Fc부분이 대장균의 외부 세포막 쪽으로 배향되어 항원 결합 사이트를 노출시킬 수 있게 되므로, 궁극적으로 항체의 배향 조절을 통해 바이오센서의 감도를 향상 시킬 수 있다.

이에 본 발명에서는 단백질 A의 Z 도메인 코딩 유전자를 발현 벡터에 클로닝하였고, 상기 발현 벡터로 미생물로서 대장균을 선택하여 형질전환시키고, 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 대장균의 외부 세포막에 단백질 A의 Z 도메인이 발현된 대장균을 제조한 후, 상기 대장균으로부터 Z 도메인이 자가 표지된 외부 세포막을 분리한 다음, 이를 마이크로플레이트 표면 상에 코팅하여 사용하였다.

따라서 본 발명에 따른 상기 면역 바이오센서 재생용 조성물은 Z-도메인이 자가 표지된(autodisplaying) 대장균의 외부 세포막(outer membrane)으로 코팅되어 형성된 면역 친화층을 갖는 면역 바이오센서의 재생을 위한 용도로 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 ‘면역 친화층’이란, 항원-항체 반응이 일어날 수 있도록 기판(예컨대, 마이크로플레이트) 상에 Z-도메인이 자가 표지된(autodisplaying) 대장균의 외부 세포막(outer membrane)으로 코팅되어 형성된 층을 의미하며, 상기 ‘분자 인식층’은 분석대상 물질을 선택적으로 인식하고 분석대상 물질과 특이적 결합 및 항원-항체반응이 일어나는 곳으로, 상기 ‘면역 친화층’에 캡쳐 항체(capture antibody)가 처리된 층을 의미한다.

본 발명에서 상기 ‘면역 바이오센서’란, 본 발명에 따른 상기 면역 친화층을 갖는 분자 인식층, 인식된 흡착량 또는 반응정도를 신호화 하는 신호 변환기(signal transducer) 및 신호를 발생시키는 신호 발생층(signal-generating part)으로 구성되며, 항원-항체의 면역반응 센싱을 통해 분석대상물질을 검출하는 장치이다.

또한 본 발명의 면역 바이오센서는 항원-항체의 면역 반응을 이용하여 분석대상물질을 검출할 수 있는 것으로, 상기 면역 바이오센서의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, SPR(SURFACE PLASMON RESONANCE) 바이오센서, QCM (QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE) 바이오센서, SAW(SURFACE ACOUSTIC WAVE) 바이오센서 또는 FPW(FLEXURAL PLATE WAVE) 바이오센서일 수 있고, 바람직하게는 SPR(SURFACE PLASMON RESONANCE) 바이오센서일 수 있다.

한편, 본 발명에서 제공하고자 하는 상기 면역 바이오센서 재생용 조성물은 트윈-20(tween-20)이 함유된 pH 2.5의 글리신 용액을 유효성분으로 포함한다.

구체적으로 상기 조성물은, 조성물 총 함량 기준 트윈-20은 2%(w/w)의 농도로 포함되어 있고, 상기 글리신은 0.1M 농도로 포함되어 pH가 2.5가 유지되는 조성물이다.

본 발명의 일실시예에서는, 면역 바이오센서의 재생이 가능한 최적의 pH 조건을 확립하기 위한 실험을 수행하였는데, 재생용 조성물의 pH를 글리신으로 각각 3.0, 2.8, 2.5, 2.3 및 2.0이 되도록 제조한 후, 면역 바이오센서를 이용하여 1차 면역반응 종료 후, 재생용 조성물을 바이오센서에 처리하여 재생하는 단계를 수행한 다음, 2차 면역반응을 수행하였다.

그 결과, pH 2.5의 조건에서만 1차 및 2차 반응의 결과가 거의 유사한 값으로 나타났고, 다른 pH 조건에서는 1차와 2차의 반응 결과가 상당한 차이를 보이는 것으로 나타났다.

pH 2.5 미만으로 더 낮은 조건에서 재생처리를 수행한 경우, 1차 반응결과에 비해 2차 반응결과가 더 낮은 결과 값을 보였는데, 이는 pH 2.5 미만의 너무 낮은 조건 하에서는 바이오센서에 코팅되어 있는 Z-도메인 및 이에 결합되어 있는 항체의 구조가 너무 심하게 변화되어 항체와 분석대상물 간의 결합반응이 감소되었기 때문이며, 또한 대장균 단백질 및 대장균 세포의 손상이 발생하였기 때문이다.

또한, pH 2.5를 초과하는 높은 pH 조건에서는 1차 반응결과에 비해 2차 반응결과가 더 높은 결과 값을 보였는데, 이는 재생처리가 완전하게 일어나지 않아 1차 반응 후, 항체에 결합된 반응물 또는 비 특이적 물질들이 완벽하게 제거되지 못하고 남아있어 2차 반응 시 결과 값을 높인 것이다.

따라서 본 발명에 따른 면역 바이오센서를 여러 차례 반복 사용할 뿐만 아니라 우수한 민감도 및 정확한 분석 값을 얻기 위해서는 반드시 pH 2.5의 재생용 조성물을 처리해야만 한다는 것을 알 수 있었다.

또한, 최적의 면역 바이오센서 재생용 조성물의 조건 규명을 위해, 계면활성제의 종류 및 함량이 미치는 영향을 분석하였는데, 이를 위해 계면활성제로서 트윈-20 및 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 사용하였고, 각각의 첨가량을 달리한 재생용 조성물을 사용하여 면역 바이오센서의 재생능을 분석하였다.

그 결과, SDS를 사용한 경우에는 SDS의 첨가량을 달리한 모든 실험군에서 1차 반응 후, 재생 처리를 수행하고 2차 면역반응을 수행한 결과, 반응 값이 0.5에서 0.05 이하로 90% 이상의 감소율을 보여, 1차 반응에 사용하였던 바이오센서를 재사용할 수 없음을 알 수 있었다. 이는 SDS의 강력한 변성작용으로 인해 대장균 세포가 손상되고 외부 세포막에 자가 표지된 Z-도메인 역시 변성되어 항체 고정능력을 상실하였기 때문이다. 따라서 SDS의 사용은 부적절하다는 것을 알 수 있었다.

한편, 트윈-20의 계면활성제를 사용한 실험군들에서는, 트윈-20을 1%(w/w)의 농도로 사용한 군을 제외하고는 모두 1차와 2차의 반응값이 차이를 보이는 것으로 나타났다. 그러나, 트윈-20을 1%(w/w)의 함량으로 첨가된 pH 2.5의 글리신 용액의 재생용 조성물을 처리한 군에서는 1차 및 2차 반응값이 거의 유사한 수준으로 검출되었다.

따라서 이러한 결과를 통해, 2%의 트윈-20(tween-20) 및 pH 2.5의 0.1M 글리신 용액이 함유된 재생용 조성물만이 정확한 분석 값을 도출할 수 있는 면역 바이오센서의 재생을 위한 버퍼 조성물로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

또한 본 발명은, 검출하고자 하는 생체 물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 표면에 고정시킨 면역 바이오센서; 및 2%의 트윈-20(tween-20) 및 pH 2.5의 0.1M 글리신 용액이 함유된 면역 바이오센서 재생용 버퍼를 포함하는, 생체 물질 검출용 키트를 제공함에 특징이 있다.

상기 검출하고자 하는 생체 물질은 통상적으로 면역 바이오센서를 이용하여 검출할 수 있는 모든 물질을 의미하며, 이에 제한되지는 않으나, 항원, 항체, 펩타이드, 단백질, 박테리아, 바이러스, 진균류 등 일 수 있다.

상기 본 발명의 생체 물질 검출용 키트를 이용하여 생체 물질을 검출하는 방법에 있어서, 예컨대, 특정 항체를 검출하고자 하는 경우, 상기 항체를 포함하는 시료를 본 발명에 따른 단백질 A의 Z 도메인이 자가 표지된 미생물의 외부 세포막과 반응시켜 상기 항체와 Z 도메인 간의 결합을 유도하는 단계, 및 상기 항체와 결합한 미생물의 외부 세포막 표면에 상기 항체와 특이적으로 결합하는 항원이 고정된 바이오센서를 적용하여 바이오센서 상의 항원 간 반응 유도 단계를 통해, 특정 항체를 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 생체 물질 검출용 키트를 이용하여 특정 항원을 검출하고자 하는 경우, 검출하고자 하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 단백질 A의 Z 도메인이 자가 표지된 미생물의 외부 세포막에 고정된 면역 바이오센서를 준비하고, 여기에 상기 검출하고자 하는 항원을 처리하여 항원-항체 간 면역반응을 유도함으로써, 특정 항원을 검출할 수 있다.

본 발명의 키트에 적용 가능한 시료는 생물체로부터 분리되거나 환경 중에서 얻어진 모든 시료일 수 있으며, 예컨대, 혈액, 체액, 세포, 조직 등의 생체 시료 또는 음용수, 토양 등도 포함될 수 있다.

나아가 본 발명은, 검출하고자 하는 생체 물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 표면에 고정시킨 면역 바이오센서를 이용하여 면역 반응을 수행한 후, 트윈-20(tween-20)이 함유된 pH 2.5의 글리신 용액을 포함하는 면역 바이오센서 재생용 조성물로 상기 면역 바이오센서를 세척하는 단계를 포함하는, 면역 바이오센서의 재생방법을 제공함에 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명에 따른 면역 바이오센서 재생용 조성물을 이용한 본 발명의 면역 바이오센서에 대한 재생능을 분석하였는데, 자동 표지된 Z- 도메인이 없는 외부 세포막 층으로 코팅된 바이오센서 및 본 발명에 따른 자동 표지된 Z- 도메인을 갖는 외부 세포막 층으로 코팅된 바이오센서에 대해 급성 염증성 CRP를 분석 대상 물질로 하여 면역반응을 수행하고, 본 발명의 면역 바이오센서 재생용 조성물로 재생처리를 한 후, 다시 면역반응을 수행하는 과정을 수차례 반복 하여, 본 발명의 재생용 조성물이 면역 바이오센서를 몇 회나 반복하여 사용할 수 있는지 확인하였다.

그 결과, 자동 표지된 Z- 도메인을 갖는 외부 세포막 층으로 코팅된 본 발명의 바이오센서는 5회의 CPR 바이오 센싱(분석) 과정 동안에 각 반응 시, 결과값의 차이가 2 % 미만으로 나타나, 통계적으로 유의미한 차이가 없음을 의미하는 것으로 매우 높은 신뢰도를 갖는 신호값을 산출할 수 있음을 알 수 있었고, 우수한 재생능을 확인할 수 있었다. 또한 자동 표지된 Z- 도메인이 없는 외부 세포막층으로 코팅된 바이오센서와 비교하여 본 발명의 바이오센서는 항-CRP 및 CRP 처리 후, SPR 신호 증가가 검출되지 않았는데, 이는 SPR 바이오센서의 면역 친화성층 상에 항체 또는 분석물질의 비특이적 결합이 없음을 의미한다.

따라서 본 발명의 면역 바이오센서 재생용 조성물은 본 발명의 면역 친화성 층에 대해 반복적인 면역반응을 수행하여도 신뢰도가 높은 분석값을 도출할 수 있어 우수한 재생능을 가짐을 확인할 수 있었고, 자동 표지된 Z- 도메인을 갖는 외부 세포막에 기반한 본 발명의 면역 친화성 층은 항체 결합 친화력을 그대로 유지하고 있어, 재생 과정에서 항체 결합력의 활성 손실 없이 우수한 재생능을 가지고 있음을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명의 면역 바이오센서 재생용 조성물을 이용한 면역 바이오센서의 재생은 면역 반응이 완료된 면역 바이오센서를 본 발명의 재생용 조성물로 세척하여 재생처리 할 경우, 최소 4회 이상 면역 바이오센서를 반복 사용할 수 있으며, 바람직하게는 4회~8회 반복 사용할 수 있다.

이와 같이 본 발명의 면역 바이오센서 재생용 조성물은 면역 바이오센서를 수차례 재생할 수 있으므로, 경제적인 효과를 도출할 수 있으며, 특히 SPR(Surface Plasomon Resonance) 바이오센서 등과 같이 귀금속 신호 변환기를 사용해야 하는 바이오센서는 비용 절감에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<준비예>

시약준비

하기 본 발명의 실험에서 사용된 시약은 다음과 같다. HRP(Materials Horseradish peroxidase), CRP(C-reactive protein), 인간 IgG (hIgG), 트윈-20, 글리신, 이소프로필 β-D-1- 티오갈락토피라노사이드(IPTG), 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), SDS 및 염산은 머크사(Darmstadt, Germany)로부터 구입하여 사용하였다. 토끼 폴리클로날 항-HRP 항체, 토끼 폴리클로날 항-CRP 항체, 플루오레세인 이소 티오시아네이트가 결합된 염소 폴리클로날 항-CRP(anti-CRP(FITC)) 항체 및 플루오레세인 이소티오시안이 표지된 염소 폴리클로날 항-인간(anti-human(FITC)) 항체는 Abcam사 (Cambridge, UK)로부터 구입하여 사용하였다. LPS 용액(대전, 한국)에서 인산 완충 식염수(PBS)를 취하여 항체 용해 버퍼로 사용하였고, 96 웰 마이크로 플레이트는 SPL Life Science(Pocheon, Korea)사로부터 구입하여 사용하였다. 3,3 ',5,5'- 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 키트는 Thermo Fisher Scientific 사(Waltham, US)에서 입수하여 사용하였다.

<실험방법>

① Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 배양 및 외부 세포막의 분리

S. aureus에서 단백질 A의 B-도메인으로부터 PCR로 증폭하여 제작한 펩타이드인 Z-도메인을 클로닝하여 Z-도메인이 자가 표지된 벡터인 pET-Z-18-3을 제조하였다. Z-도메인이 자가 표지된(autodisplaying) pET-Z-18-3 플라스미드를 대장균(BL21(DE3))으로 일렉트로포레이션 방법을 통해 형질감염시켰다. 형질감염된 대장균은 37℃에서 암피실린이 함유된 LB(Luria-Bertani) 배지로 밤새도록 배양하였고, 이후 100배 희석한 신선한 LB 배지를 이용하여 세척하였다. 형질감염된 대장균의 배양은 600nm의 파장에서 OD가 0.7이 될 때까지 교반하면서 배양하였다. 자가 표지된 Z-도메인의 발현유도(induction)을 위해, 1 mM IPTG를 상기 대장균에 첨가하고 30℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 수집하고 PBS로 세척하였다. Z-도메인이 발현된 대장균으로부터 외부 세포막을 분리하기 위해, 먼저 대장균의 세포벽인 단단한 펩티도글리칸 층을 200μg/mL의 리소자임(lysozyme)을 처리하여 가수분해시켜 스페로플라스트(spheroplast) 형태가 되도록 하였다. 또한, 리소자임의 페리플라즘(periplasm)으로의 침투를 돕기 위해 20 mM sucrose 및 0.2 mM EDTA를 처리하여 삼투작용이 증가하도록 하였고, 세포막 표면의 전하를 조절하였다. 페로플라스트(spheroplast 형성 후) 대장균의 외부 세포막 50 mM Tris-HCl pH 8.0에서 10 mM MgCl₂를 포함한 2 % Triton X-100 용액을 첨가하여 리포솜으로 분리하였고, 분리된 외부 세포막 입자들은 20,000 rpm으로 연속적인 원심분리를 수행하여 최종적으로 외부 세포막을 분리하였으며 PBS 버퍼로 용해시켰다.

② 대장균 세포 및 그 외부 세포막을 기반으로 한 재생 분석(Regenerative assays)

대장균 세포 기반의 재생 가능성 여부의 분석을 위해, Z- 도메인이 자가 표지된 대장균 세포를 OD 600의 값이 1.0이 되도록 PBS로 현탁시켰다. 이후 1.0 μg /mL 농도의 항-HRP 항체가 함유된 PBS 용액에 Z- 도메인이 자가 표지된 대장균 세포 100μL를 첨가하여 1시간 동안 반응시키고 PBS로 대장균 세포를 2회 세척하였다. 그런 뒤 10-ng/mL HRP를 첨가하고 1시간 동안 반응시켰으며, 세척 후 100㎕의 재생 버퍼를 HRP가 결합된 대장균 세포에 첨가하여 2분 동안 반응시켰다. 재생반응 후, 대장균 세포는 3회 세척한 다음, 100μL의 PBS로 현탁시켰다. 이렇게 재생 처리된 대장균 세포는 다시 HRP 면역 분석을 위한 새로운 고체 지지체로 사용하였다. 대장균 세포 면역 측정은 4회 반복 수행하였고, 결합된 HRP의 정량분석을 위해 발색반응용 TMB 용액을 사용하였다. 100 ㎕의 TMB 용액을 대장균 세포에 30분 동안 처리하고 2M의 황산용액으로 반응을 중지시켰다. 이후, 마이크로 플레이트 판독기(Molecular Devices, USA)를 사용하여 450 nm의 파장에서 OD 값을 측정하였다.

또한, 대장균의 외부 세포막(OM; outer cell membrane)을 기반으로 한 재생분석은 다음과 같은 방법을 통해 수행하였다.

상기 방법으로 분리한 외부 세포막 300 μg/mL를 96 월 마이크로플레이트에 분주하고 2시간 동안 배양하여 마이크로플레이트 표면 상에 외부 세포막이 형성되도록 하였다. 이후 외부 세포막 층이 마이크로플레이트 표면 상에 형성되면 PBS로 3회 세척하고 1.0 μg/mL 농도의 항- HRP 항체를 1시간 동안 반응시켰다. 이후 상기 마이크로플레이트를 3회 세척하였고, 10 ng/mL HRP 시료를 처리한 후 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후, 100㎕의 재생 버퍼로 2분 동안 반응시키고 항체 및 항원들을 PBS를 이용하여 즉시 용출시켰다. 재생된 OM 층이 코팅된 마이크로플레이트를 사용하여 HRP 면역 분석을 4 회 반복 수행하였고, 결합된 HRP의 정량분석을 위해 TMB 용액을 이용하여 30분 동안 반응시켰으며, 황산 용액으로 반응을 중지시키고 450 nm 파장에서 OD 값을 측정하였다

③ 표면 플라즈몬 공명분석 (SPR; surface plasmon resonance 분석)

SRP 분석을 위해 시판되는 SRP 바이오센서 시스템(Reichert Technologies Life Science (Buffalo, US))을 이용하여 분석하였다. 또한, 베어 콜드 칩(bare gold chip)은 OM 기반의 재생 바이오센싱 분석에 사용하였다. SPR 유체 챔버의 부피는 7 μL이 되도록 하였고, 골드 칩 표면에 면역친화성 층이 형성되도록 300μg/mL 농도의 분리한 OM 용액을 10분 동안 7μL/min의 유속으로 처리하였다. 이후 PBS로 10분 동안 세척하였고, 상기 골드 칩의 표면에 OM 층이 형성되면 1μg/mL의 항-CRP 항체를 5분 동안 처리하여 상기 OM 층의 자동 표지된 Z-도메인과 결합되도록 하였다. 그런 뒤, 세척하고 1μg/mL CRP 샘플을 5분 동안 처리하였다. 이후 자동 표지된 Z-도메인을 갖는 OM의 면역친화성 층의 재생을 위해, 재생 용액을 7μg/mL의 유속으로 2분 동안 처리하였고, 재생 처리 후 SPR 바이오센서의 골드 칩 상에 상기 재생된 OM 층을 사용하여 CRP 바이오 센싱을 4회 반복 수행하였다. CRP 처리 전 SPR 신호로부터 CRP 처리 후의 SPR 신호 값을 차감하여 CRP를 정량화 하였고, 재생률은 OM 층 형성 후 SPR 신호와 재생 후 SPR 신호를 비교하여 계산하였다.

<실시예 1>

최적의 재생 처리 조건 규명

<1-1> 최적의 pH 조건 확립

본 발명자들은 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 OM을 이용한 면역결합층(immunoaffinity layer)에 대한 최적의 재생 처리 조건 규명을 위해, 먼저 최적의 산성 조건을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

일반적으로 바이오센서의 재생(재활용)을 위해, 단백질-단백질간의 특이적 결합을 제거하기 위한 방법으로 단백질 구조 변형법 또는 다른 경쟁물질(competitor)의 처리를 통한 용출 방법을 사용한다. 그러나 경쟁물질의 처리는 용출 후, 다시 경쟁물질을 제거해야 하는 번거로움이 있는 문제점이 있다. 이에 본 발명자들은 면역학적 분석을 재생방법으로서, 구조 변형의 방법을 적용하였다. Z-domain은 protein A의 5개 도메인 중 B-domain을 모티브로 한 제작된 펩타이드로서 protein A와 마찬가지로 항체의 Fc 부분과 결합하는 특이성을 가지고 있다. Protein A는 항체 정제에 널리 사용되고 있으며, protein A 레진 기반의 친화성 크로마토그래피를 사용하는 경우, 결합된 protein A-항체 복합체를 용출하기 위해 산성 버퍼를 사용한다.

이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 재생 효과의 극대화를 위한 최적의 산성 조건을 확인하기 위해, pH 2.0~3.0까지 0.1M 글리신 버퍼를 사용하여 재생 효과 정도를 분석하였다. 이때 분석을 위한 분석물질로 HRP를 사용하였다. Z-domain이 표면 발현된 대장균에 1μg/mL의 anti-HRP 항체를 처리하고, 10 ng/mL의 HRP를 처리한 후, 다양한 pH의 글리신 버퍼를 각각 5분간 처리하여 재생처리 과정을 수행하였고, 이후 다시 anti-HRP 및 HRP 반응 과정을 수행하였다. 대장균에 결합된 HRP는 TMB 반응을 통하여 450 nm 파장에서 OD값을 측정하여 정량하였다.

그 결과, 처음 대장균 기반의 HRP 면역분석 결과, 0.69였던 OD값이 pH 2.0, 2.3, 2.5, 2.8, 3.0의 각기 다른 pH의 글리신 버퍼를 처리함에 따라 각각 0.22, 0.23, 0.26, 0.37, 0.59로 OD값이 감소하는 것으로 나타났다. 글리신 버퍼 처리 후, 다시 2차로 HRP 면역분석을 수행한 결과, pH 2.0, 2.3, 2.5, 2.8, 3.0 처리 조건에서 OD값은 1.19, 0.89, 0.70, 0.56, 0.58로 각각 측정되었다.

분석 결과, 1차 면역분석에서 pH가 낮을수록 표면 발현된 Z-domain과 이에 결합된 항체 구조의 변화가 심하게 변형되어 Z-domain-antibody의 친화력이 감소되는 것을 알 수 있었고, pH가 높아질수록 2차 HRP 처리 결과의 OD 값은 증가하는 경향을 보였는데, 이는 pH가 높은 경우, 재사용 효과가 완벽하게 일어나지 않아서 용출되지 않은 HRP 복합체가 Z-domain에 계속 붙어있어 2차로 처리된 HRP의 결과 값이 높아지는 것으로 나타났다.

또한, pH가 너무 낮은 경우, 낮은 pH로 인해 대장균 단백질의 손상 및 대장균 세포의 손상이 야기될 수 있고, 이로 인해 2차 HRP 면역분석의 OD값이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.

그러므로 버퍼 처리 후에도 안정적으로 용출이 일어나서 OD값이 감소하고 대장균의 손상이 유발되지 않는 2차 HRP 면역분석 결과가 1차 면역분석 결과와 동일하게 나오는 최적의 pH 조건은 2.5임을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

<1-2> 최적의 계면활성제 종류 및 첨가량 확립

본 발명자들은 결합된 항체를 효과적으로 용출함으로써 바이오 센서의 재생 효과를 최대화시킬 수 있는 계면활성제의 종류를 확인하기 위해, SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 tween-20을 각각 다른 농도로 처리하여 재생 성능을 분석하였다.

SDS는 anionic surfactant로 단백질을 변성시키는 특징을 갖는데, 본 발명에서는 pH 2.5인 글리신 버퍼 조건 하에서 SDS를 각각 2, 1, 0.5, 0.1%의 농도로 사용하여 재생 성능을 살펴보았다.

그 결과, SDS를 첨가한 경우, 모든 농도에서 재생 전후의 OD값이 0.50에서 0.05이하로 10% 이하로 감소하는 것으로 나타났다. 한편, 재생처리 후 다시 anti-HRP와 HRP를 처리하였을 때 OD값이 증가하지 않았다. 또한 SDS가 첨가된 재생 버퍼를 처리한 다음, 세척을 위해 대장균을 원심분리하면 펠렛의 크기가 육안으로 확인될 만큼 줄어드는 것으로 나타났다. 이는 SDS의 강력한 변성작용으로 대장균의 세포가 손상되었고, 세포 외막에 자가 표지된 Z-domain 역시 변성되어 항체를 고정시키는 능력이 상실되었음을 의미한다(도 2a 참조).

따라서 자가 표지된 Z-domain기반의 면역결합 층의 재사용을 위해서는 SDS는 적합하지 않다는 것을 알 수 있었다.

이에 본 발명자들은 다른 계면활성제인 tween-20를 선택하였고, 각각 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%의 다른 농도를 사용하여 pH 2.5의 0.1 M 글리신 버퍼 조건 하에서 재생 성능 분석을 수행하였다.

그 결과, 1차 HRP 면역분석 결과 값에 비하여 재생처리를 하였을 때, HRP가 잘 용출되어 OD 450 값이 감소하는 것으로 나타났으며, Tween-20를 첨가하지 않은 군에서는 재생 처리 과정을 통하여 신호 값이 35%로 감소하는 것으로 나타났다. 반면, 2%와 5%의 tween-20를 사용하여 재생 처리한 경우, 25% 미만으로 신호 값이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 재생 처리 후, 다시 HRP 면역반응을 진행하였을 때, 다른 농도의 tween-20 처리 군에 비해 2% tween-20 처리 군이, 재생 처리 전과 후의 OD 450 값의 차이가 5% 미만으로 가장 작은 것으로 나타났다. 한편, 5% tween-20을 처리한 경우, 2차 반응 결과 신호 값이 28.4% 감소하는 것으로 나타나 높은 농도의 tween-20은 대장균 세포의 손상을 유발할 수 있음을 알 수 있었고, 반면, 2% 미만의 tween-20를 처리한 경우에는 재생 처리 이후의 OD 450값이 13% 이상 증가하는 것으로 나타나, 이는 재생 처리 과정에서 anti-HRP-HRP 복합체가 자가 표지된 Z-domain에서 완전하게 용출되지 않았음을 알 수 있었다(도 2b 참조).

따라서, 반복적인 면역분석에도 정확한 분석 값을 도출할 수 있는 재생 처리 조건은 tween-20의 계면활성제를 사용하되, 2%의 농도로 사용해야 함을 알 수 있었다.

<1-3> 형광현미경을 통한 확인

상기 <1-1> 및 <1-2>의 실험을 통해 도출된 최적의 재생 처리 조건을 재확인하기 위해, 형광현미경 분석을 수행하였다. 구체적으로 Z-domains이 자가 표지된 대장균 세포에 3μg/mL의 hIgG를 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 이후 3 μg/mL의 anti-human(FITC) 항체를 1시간 동안 처리하였다. 이러한 반응을 통해 hIgG- anti-human(FITC)의 면역복합체가 결합된 Z-domains이 자가 표지된 대장균 세포에 본 발명에 따른 재생용 버퍼(2%의 tween-20이 첨가된 0.1M 글리신 용액(pH 2.5)) 의 처리 전후를 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 재생 버퍼를 처리하기 전의 Z-domains이 자가 표지된 대장균에서는 hIgG-anti-human(FITC) 면역복합체의 결합에 의한 형광이 관측되었다(도 3b 참조). 한편, 본 발명의 재생 버퍼를 처리한 후에는 형광 신호가 사라지는 것을 확인할 수 있었다(도 3d 참조). 이는 본 발명의 재생 버퍼 처리에 의해 자가 표지된 Z-domains와 결합된 면역복합체가 용출되었음을 의미하는 것으로, 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 Z-domain이 표면 발현된 대장균 기반의 면역분석 과정에서, 재생 효능의 최대화를 위한 조건은 2% tween-20 이 포함된 0.1 M 글리신 용액(pH 2.5)이라는 것을 재확인 할 수 있었다.

<실시예 2>

본 발명의 재생 버퍼를 이용한 바이오 센서의 재생 성능 확인

<2-1> Z-domain이 자가 표지된 대장균 기반의 면역분석

본 발명에 따른 재생 버퍼를 Z-domain이 자가 표지된 대장균 기반의 HRP 면역분석용 바이오센서에 적용하였을 때의 재생능 분석을 수행하였다.

재생 분석은 총 5회의 HRP 면역분석 방법으로 진행하였고, 이를 위해 4번의 재생 버퍼 처리 과정을 수행하였다. 또한 대조군으로 재생 버퍼 처리 과정없이 순차적으로 anti-HRP, HRP를 처리한 군을 사용하였고, 각각의 실험은 3번 반복 수행하였다.

분석 결과, 1번째 HRP 면역분석 값과 비교하여 2번째, 3번째, 4번째, 5번째 HRP 면역분석 값은 각각 7.3%, 10.0%, 33.7%, 24.3% 감소한 것으로 나타났다. 이때 t-test를 통한 p value를 계산하면 각각 0.58, 0.42, 0.05, 0.15였다. 또한 첫 번째 재생 처리 후 OD 값에 비하여 2번째, 3번째, 4번째 재생 처리 후의 OD값은 각각 16.2%, 12.9%, 28.4% 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해, 3번째 HRP 결과까지는 처음의 결과와 오차가 10%이하인 것을 확인할 수 있었다. 한편, 재생 처리 과정 없이 계속적으로 anti-HRP와 HRP를 처리한 경우, 처음 분석 결과와 비교하여 각각 7.6%, 30.7%, 39.7%, 111.1%로 증가하는 것으로 나타났고, 이때의 t-test를 통한 p value는 각각 0.57, 0.08, 0.03, 0.01로 나타났다(도 4 참조). 따라서 4번 이상으로 anti-HRP 및 HRP를 재생처리 없이 사용하게 되면, 통계적으로 유의미하게 다른 결과 값이 나올 수 있는 우려가 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 재생 과정을 통한 anti-HRP-HRP 면역복합체의 자가 표지된 Z-domains의 용출 없이 추가적으로 면역복합체가 계속적으로 결합함에 따라 신호 값이 지속적으로 증가하는 것이므로 정확한 결과 값을 도출할 수 없게 된다.

한편, 대장균 세포 기반의 면역분석에서 분석 횟수와 재생처리의 횟수가 증가할수록 OD 450값이 감소하는 것으로 나타났는데, 이는 버퍼 교체와 세척을 위한 원심분리 과정에서 야기되는 세포의 손실에서 발생하는 문제점인 것으로 사료된다. 따라서 계속적인 면역분석과 재생처리의 반복은 고형의 지지체인 대장균 세포의 손실을 일으키고 이는 전반적인 OD 450값의 감소를 일으키게 된다.

이에 본 발명에서는 면역분석과 재생처리의 반복 과정에도 불구하고 이러한 문제점이 발생하지 않도록 Z-domain이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막 만을 분리하여 이를 마이크로플레이트의 표면에 코팅처리 하는 방법을 확립하였다.

<2-2> Z-domain이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막(OM) 기반의 면역분석

이에, Z-domain이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막이 코팅된 마이크로플레이트를 이용한 면역분석을 수행하였다. 이때 마이크로플레 상에 형성된 외부 세포막(OM) 층의 표면에는 IgG에 결합할 수 있는 자가 표지된 Z-domain를 가지고 있으며, 항체를 처리하여 면역결합층(immunoaffinity layer)를 형성할 수 있다. 이렇게 마이크로플레이트 표면에 OM 층을 형성하면 세척을 위한 별도의 원심분리 단계가 필요하지 않고 따라서 결과값(신호)를 감소시키는 문제점도 해소할 수 있다.

Z-domain이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막이 코팅된 마이크로플레이트를 이용한 면역분석을 위해, 마이크로플레이트 표면에 OM 층을 형성한 후, anti-HRP를 처리하여 면역결합층을 형성하고, 이후에 10 ng/mL의 HRP를 처리하고 이를 TMB 반응 후 450 nm에서 OD 측정을 통해 정량하였다.

4번의 재생 처리 과정을 수행하고 5번의 HRP 면역분석을 수행하였으며, 대조군으로 재생 처리 없이 anti-HRP, HRP를 처리한 결과와 비교하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 1번째의 HRP 분석 값과 비교하여 2번째 HRP 분석 값은 5.1% 감소하였고, 3번째, 4번째, 5번째 HRP 분석 값은 각각 9.5%, 9.8%, 24.5% 증가하였으나, 이때 t-test를 통한 p value 값은 각각 0.14, 0.15, 0.14, 0.08로서, 재생 처리 과정을 통한 5번의 HRP 분석값은 통계적으로 유의미하게 다르지 않음을 알 수 있었다. 또한 재생 과정 후에는 OD값이 HRP 분석 값에 비해 20% 미만으로 낮아짐을 확인하였다.

한편, 재생 과정 없이 계속적으로 anti-HRP와 HRP를 처리한 경우에는 처음 분석 결과와 비교하여 각각 65.0%, 94.4%, 117.4%, 127.6% 증가하는 것으로 나타났고, 이때의 t-test를 통한 p value는 모두 0.0001 미만으로 나타나, 재생 처리 없이 반복적인 분석을 수행하게 되면, 통계적으로 유의미하게 다른 결과 값이 산출된다는 것을 알 수 있었다.

따라서 이러한 결과는 본 발명에서 고안한, OM층 기반의 면역분석을 수행할 경우, 원심분리에 따른 세포 손실의 문제 및 이로 인한 결과 값의 지속적인 증가현상을 유발시키지 않을 수 있음을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 재생 사용에 따른 경제적 효과와 정확한 분석 값을 얻을 수 있는 바이오센서로서, Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막을 분리하고 이를 마이크로플레이트 상에 코팅된 기판을 사용하고, 반복적인 항원-항체 반응이 가능하도록 재생용 버퍼로서 2% tween-20 이 포함된 0.1 M 글리신 용액(pH 2.5)을 사용할 경우, 재생 성능을 최대화할 수 있음을 확인하였으며, 이러한 조건 하에서는 4회 이상의 재생 처리를 수행함에도 불구하고 정확한 분석 결과를 도출할 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 3>

SPR 바이오센서용 면역친화층의 제조 및 이의 재생능 분석

< 3-1> SPR 바이오센서용 면역친화층의 제조

상기 실시예에서 분리한 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막(OM)을 이용한 면역친화층(분자 인식층)을 제조하였고, 이의 재생능을 분석하였다. 본 발명에 따른 재생 가능한 SPR 바이오센서는 종래 SPR 바이오센서의 구조 및 제조방법이 동일하되, 면역친화층(분자 인식층)으로 Z-도메인이 자가 표지된 대장균의 외부 세포막이 코팅된 층을 사용하였고, 재생 용액으로 상기 실시예에서 최적의 조건으로 확립한 2% tween-20 이 포함된 0.1 M 글리신 용액(pH 2.5)을 사용한 사용하였다.

또한, SPR 바이오센서는 evanescence field-based 광학 바이오센서로서, SPR 바이오 센서의 evanescence field의 두께는 100nm 미만으로, 이것은 면역 친화성 층(면역결합층)이 SPR 바이오센서를 사용하여 측정 할 때 100nm 보다 얇아야 한다는 것을 의미한다. 본 발명에서는 Z- 도메인이 자동 표지되는 대장균의 OM을 리소자임과 Triton X-100을 사용하여 리포솜 형태로 분리하였고, 2 차원의 골드 기판(SPR 바이오센서의 트랜스 듀서) 상에 적층하였다. 이때 OM 층은 SPR 측정이 가능하도록 2nm의 두께가 되도록 하였다. 대장균의 외부 세포막(OM)은 리포폴리사카라이-인지질의 2중층 구조를 가지고 있으며, OM 내부층의 지질 단백질은 펩티도글리칸에 부착되어 중간에 공간이 형성된 상태를 갖는다. 리포솜으로 분리된 외부 세포막(OM)의 외부 표면은 자가-표지된 Z- 도메인 및 친수성 리포폴리사카라이드를 함유하고 있으며, 안쪽 표면에는 지질 단백질을 함유하고 있다. 이와 같이 대장균으로부터 분리된 OM은 금과 같은 소수성 기판 상에 층을 형성할 때, OM의 소수성 내부 표면은 소수성 기판과 접촉하게 되고, OM의 외부에 자동 표지된 Z-도메인은 표면 상에 노출되어진다. 따라서, 본 발명에서 제조된 면역친화성 층은 방향 제어성을 가지며 자동 표지된 Z-도메인을 갖는다.

이에 본 발명자들은 상기와 같이 OM층을 Z- 도메인이 자가 표지된 OM 층을 기반으로 하는 면역친화성층의 SPR 바이오센서로서의 사용 가능성 및 재생능을 분석하는 실험을 하기와 같이 수행하였다.

<3-2> 본 발명의 면역친화층에 대한 재생능 확인

급성 염증성 CRP을 분석대상 물질로 선택하여 사용하였다. CRP는 골관절염, 류마티스성 관절염, 감염, 혈관염, 종양과 같은 염증성 질환 진단을 위한 바이오 마커로 널리 사용되고 있다. 먼저, SPR 바이오센서의 표면 상에 상기 <3-1>의 방법과 같이 대장균의 외부 세포막(OM)을 이용하여 OM층을 코팅처리한 후, 항 -CRP 항체를 5 분 동안 첨가하여 반응시켰다. 이후, 농도 1 μg/mL의 CRP를 첨가 하여 반응시켰다. 반응 후, CRP를 측정한 다음, SPR 바이오센서는 상기 본 발명에서 확립한 최적화된 버퍼인 2% tween-20 이 포함된 0.1 M 글리신 용액(pH 2.5)로 세척하여 재생처리 하였다. 재생처리 후, anti-CRP와 CRP에 대한 분석을 수행하였고, 이러한 재생 단계를 4회 반복하였으며, CRP 바이오 센싱 분석은 5 회 반복 수행하였다. 이때 자동 표지된 Z- 도메인이 없는 OM 층으로 코팅된 SPR 바이오센서를 대조군으로 사용하였다. SPR 반응은 재생 처리 중에 계속적으로 모니터링 하였다.

분석 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 자동 표지된 Z- 도메인을 갖는 OM 층 주입 시, SPR 반응 값은 증가하는 것으로 나타났고, 세척 단계 후, OM층에 의한 SPR 반응값은 4708 A.U로 계산되었다.

OM은 다양한 단백질, 지질 다당류 및 인지질을 함유하고 있어 OM층의 SPR 신호가 상당히 높은 것으로 나타났다. 또한, OM층 형성 후, 항-CRP 항체 및 CRP를 순차적으로 첨가하여 CRP 바이오 센싱 반응을 수행하였고, 반응 후에는 자동 표지된 Z- 도메인을 갖는 OM 기반의 면역친화성 층을 재생 버퍼를 이용하여 재생처리하였다. CRP 면역분석 동안에 SPR 반응은 증가하는 것으로 나타났고, 1회 재생 처리 후의 값은 최초 OM층 형성 후의 SPR 신호값과 거의 유사한 수준의 값으로 나타났다. OM층 형성에 따른 SPR의 값을 비교하면, 4차 재생 단계에 따른 신호의 차이는 각각 33.03, 33.84, 69.54 및 14.88로 계산되었고, 이 값은 OM 층의 SPR 신호의 0.7 %, 0.7 %, 1.5 % 및 0.3 %에 불과한 것으로 나타났다. 즉 이러한 결과는 본 발명에 따른 최적의 재생버퍼는 자동 표지된 Z- 도메인을 갖는 OM 기반의 면역 친화성 층을 효율적이면서 안정하게 재생시킬 수 있음을 나타낸다.

또한, 항-CRP의 처리에 의한 SPR 반응과 비교하여, CRP 처리 후 각 바이오 센싱 사이클의 신호 차이는 각각 236.71, 205.93, 226.43, 205.92 및 218.57로 나타났고, SPR 바이오 센싱의 반복성은 6.09 %의 변동 계수로 계산되었다. 이러한 결과는 본 발명의 면역 친화성 층의 재생이 좋은 반복성을 나타낸다는 것을 의미하며, 자동표지된 Z- 도메인을 갖는 OM에 기반한 본 발명의 면역 친화성 층은 항체 결합 친화력을 그대로 유지하고 있어, 재생 과정에서 항체 결합력의 활성도 손실이 없어 우수한 재생능을 가지고 있음을 알 수 있었다.

한편, 자동 표지된 Z- 도메인이 없는 OM층과 비교하여 본 발명의 자동 표지된 Z- 도메인을 갖는 OM층은 항 -CRP 및 CRP 처리 후, SPR 신호의 증가가 검출되지 않았으며, 이는 SPR 바이오센서의 OM층 상에 항체 또는 분석물질의 비특이적 결합이 없음을 의미한다. 감소된 비특이적 결합은 노이즈를 감소시키고 SPR 바이오 센싱의 신뢰성을 증가시킬 수 있다. 이러한 결과는 5회의 CPR 바이오 센싱(분석) 과정 동안, 자동 표지된 Z- 도메인을 갖는 OM에 기반한 본 발명의 면역 친화성 층이 2 % 미만의 차이값을 가지므로, 매우 높은 정확도의 신호값을 산출할 수 있음을 의미한다.

따라서 본 발명자들은 대장균으로부터 분리된 자동 표지된 Z-도메인을 갖는 OM층으로 코팅된 면역 친화성 층을 포함하는 SPR 바이오 센서를 본 발명의 재생 버퍼로 사용할 경우, 최소 4회 이상의 재생이 가능하여 경제적 효과를 도출할 수 있을 뿐만 아니라, 반복적인 재생 과정에서도 항체 결합력의 활성을 잃지 않고 그대로 유지할 수 있어 우수하고 정확한 반응 값을 도출할 수 있는 효과가 있으며, 나아가 자동 표지된 Z-도메인을 갖는 OM층의 코팅은 특정 방향으로 방향성이 조절되어 있어 SPR 바이오센서의 감도를 향상시킬 수 있는 효과가 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Hallym University <120> Composition for regeneration of immune biosensor, kit for detection of bio materials comprising the same and regeneration method of immune biosensor for recycle using the composition <130> P180027KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein sequence of Z-domain <400> 1 Val Ala Leu Ala Ser Pro Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Pro His Glu Ala 1 5 10 15 Ser Asn Leu Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Asn Gly Leu Asn Ala Ser Asn 20 25 30 Ala Leu Ala Pro His Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Ile Leu Glu Leu Glu 35 40 45 His Ile Ser Leu Glu Pro Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Ser Asn Gly 50 55 60 Leu Gly Leu Gly Leu Asn Ala Arg Gly Ala Ser Asn Ala Leu Ala Pro 65 70 75 80 His Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Ser Glu Arg Leu Glu Leu Tyr Ser 85 90 95 Ala Ser Pro Ala Ser Pro Pro Arg Ser Glu Arg Gly Leu Asn Ser Glu 100 105 110 Arg Ala Leu Ala Ala Ser Asn Leu Glu Leu Glu Ala Leu Ala Gly Leu 115 120 125 Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Asn Ala Ser 130 135 140 Pro Ala Leu Ala Gly Leu Asn Ala Leu Ala Pro Arg Ala Leu Tyr Ser 145 150 155 160 <210> 2 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Z-domain <400> 2 gtagacaaca aattcaacaa agaacaacaa aacgcgttct atgagatctt acatttacct 60 aacttaaacg aagaacaacg aaacgccttc atccaaagtt taaaagatga cccaagccaa 120 agcgctaacc ttttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg ctcaggcgcc gaaa 174

Claims

트윈-20(tween-20)이 함유된 pH 2.5의 글리신 용액을 유효성분으로 포함하는, 면역 바이오센서 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물의 총 함량을 기준으로, 상기 트윈-20은 2%의 농도로 포함되어 있고 상기 글리신은 0.1M 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 면역 바이오센서 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 면역 바이오센서는 SPR(SURFACE PLASMON RESONANCE) 바이오센서, QCM (QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE) 바이오센서, SAW(SURFACE ACOUSTIC WAVE) 바이오센서 및 FPW(FLEXURAL PLATE WAVE) 바이오센서로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 면역 바이오센서 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 면역 바이오센서는 면역 친화층을 포함하며, 상기 면역 친화층은 Z-도메인이 자가 표지된(autodisplaying) 대장균의 외부 세포막(outer membrane)으로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 면역 바이오센서 재생용 조성물.
검출하고자 하는 생체 물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 표면에 고정시킨 면역 바이오센서; 및
2%의 트윈-20(tween-20) 및 pH 2.5의 0.1M 글리신 용액이 함유된 면역 바이오센서 재생용 버퍼를 포함하는,
생체 물질 검출용 키트.
제5항에 있어서,
상기 면역 바이오센서는 면역 친화층을 포함하며, 상기 면역 친화층은 Z-도메인이 자가 표지된(autodisplaying) 대장균의 외부 세포막(outer membrane)으로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 생체 물질 검출용 키트.
제5항에 있어서,
상기 면역 바이오센서는 SPR(SURFACE PLASMON RESONANCE) 바이오센서, QCM (QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE) 바이오센서, SAW(SURFACE ACOUSTIC WAVE) 바이오센서 및 FPW(FLEXURAL PLATE WAVE) 바이오센서로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생체 물질 검출용 키트.
제5항에 있어서,
상기 재생용 버퍼는 면역 바이오센서에 의한 면역 반응이 완료된 후, 상기 면역 바이오센서에 처리하여 4번~8번 상기 면역 바이오센서를 반복하여 사용하도록 하는 것을 특징으로 하는, 생체 물질 검출용 키트.
제5항에 있어서,
상기 생체 물질은 항원, 항체, 펩타이드, 단백질, 박테리아, 바이러스, 및 진균으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생체 물질 검출용 키트.
검출하고자 하는 생체 물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 표면에 고정시킨 면역 바이오센서를 이용하여 면역 반응을 수행한 후, 트윈-20(tween-20)이 함유된 pH 2.5의 글리신 용액을 포함하는 면역 바이오센서 재생용 조성물로 상기 면역 바이오센서를 세척하는 단계를 포함하는,
면역 바이오센서의 재생방법.
제10항에 있어서,
상기 조성물의 총 함량을 기준으로 상기 트윈-20은 2%의 농도로 포함되어 있고, 상기 글리신은 0.1M 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 면역 바이오센서의 재생방법.
제10항에 있어서,
상기 재생은 면역 바이오센서 재생용 조성물로 면역 반응이 완료된 면역 바이오센서를 세척하여, 상기 면역 바이오센서를 4번~8번 반복 사용하는 것을 특징으로 하는, 면역 바이오센서의 재생방법.
제10항에 있어서,
상기 면역 바이오센서는 면역 친화층을 포함하며, 상기 면역 친화층은 Z-도메인이 자가 표지된(autodisplaying) 대장균의 외부 세포막(outer membrane)으로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는, 면역 바이오센서의 재생방법.
제10항에 있어서,
상기 면역 바이오센서는 SPR(SURFACE PLASMON RESONANCE) 바이오센서, QCM (QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE) 바이오센서, SAW(SURFACE ACOUSTIC WAVE) 바이오센서 및 FPW(FLEXURAL PLATE WAVE) 바이오센서로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 면역 바이오센서의 재생방법.