KR20170036395A - 면역화학적 분석에서 표적 특이적 신호증폭을 담당하는 범용성 재조합 2차 항체 유사체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역화학적 분석에서 신호증폭과 항체의 표면 고정을 담당하는 범용성 재조합 2차 항체 유사체에 관한 것으로서, 아스코르베이트 퍼록시다제 2(ascorbate peroxidase 2; APEX2) 단백질 및 1차 항체의 Fc 부위에 결합하는 항체 결합 도메인(antibody-binding domain, ABD) 단백질이 융합된 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체를 제공한다. 본 발명의 범용성 재조합 2차 항체 유사체는 값싸고 대량생산이 가능하며, 면역화학적 분석에서 2차 항체를 대체할 수 있으므로, 그 활용도가 매우 높을 것으로 예상된다.

Description

면역화학적 분석에서 표적 특이적 신호증폭을 담당하는 범용성 재조합 2차 항체 유사체{Recombinant Secondary Antibody Mimic as a Target-specific Signal Amplifier in Immunoassays}

본 발명은 면역화학적 분석에서 표적 특이적 신호증폭을 담당하는 범용성 재조합 2차 항체 유사체에 관한 것이다.

면역화학적 분석에서는 일반적으로 표적(target)에 특이적인 1차 항체(primary antibodies) 및 효소와 접합 되어 있는 2차 항체(enzyme-conjugated secondary antibodies)로 구성되어 있다. 1차 항체와 2차 항체 모두 소동물에서 생성, 분리하여 사용함으로써 그 비용과 시간이 많이 드는 단점이 존재한다. 특히 1차 항체는 표적 특이성을 결정하는 반면, 2차 항체는 표적과 무관하게 표적에 결합되어 있는 1차 항체의 Fc 부위와 결합하여 신호를 증폭시킴으로써 미량의 시료를 매우 높은 감도로 측정할 수 있게 한다. 2차 항체는 표적 특이성이 없으므로, 1차 항체와 결합하는 특성을 지닌 대체 물질을 적은 비용으로 빠르게 생산할 수 있다면, 면역화학적 분석의 비용과 시간을 획기적으로 줄일 수 있다.

기존의 바이오센서 소재들은 각각의 표적에 특이적인 탐침(probe)에 초점을 맞추어왔지만, 대부분 한, 두가지 표적에만 사용되어진다는 단점이 있다. 본 발명에서는 한정된 표적 특이적인 탐침을 개발하는 대신에 표적에 결합하는 다양한 종류의 탐침(primary antibodies)을 모두 인식하여 범용으로(universally) 신호를 증폭시킬 수 있는 시스템을 구축하고, 소동물에서 생산하는 대신 값싼 대장균 발현 시스템을 이용하여 대량생산을 이룸으로써 면역화학적 분석의 장점을 그대로 유지하거나 향상시킴으로써 비용과 시간을 획기적으로 절약할 수 있다.

한국공개특허 제10-2009-0117406호(2009.11.12)

본 발명의 목적은 아스코르베이트 퍼록시다제 2(ascorbate peroxidase 2; APEX2) 단백질 및 1차 항체의 Fc 부위에 결합하는 항체 결합 도메인(antibody-binding domain, ABD) 단백질이 융합된 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체를 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 2차 항체 유사체 생산방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 2차 항체 유사체를 이용한 면역화학적 분석방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아스코르베이트 퍼록시다제 2(ascorbate peroxidase 2; APEX2) 단백질 및 1차 항체의 Fc 부위에 결합하는 항체 결합 도메인(antibody-binding domain, ABD) 단백질이 융합된 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체를 제공한다.

또한, 본 발명은 APEX2 단백질을 코딩하는 유전자 및 ABD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체를 이용한 면역화학적 분석방법을 제공한다.

본 발명은 면역화학적 분석에서 표적 특이적 신호증폭을 담당하는 범용성 재조합 2차 항체 유사체에 관한 것으로서, 1차 항체의 Fc 부위와 선택적으로 강하게 결합을 하는 항체 결합 도메인(antibody-binding domain, ABD)과 아스코르베이트 퍼록시다제 2(ascorbate peroxidase 2; APEX2)를 융합하여 면역화학적 분석에서 2차 항체를 대체할 수 있는 값싸고 대량생산이 가능한 범용성 재조합 2차 항체 유사체를 개발하였다.

도 1은 재조합 2차 항체 유사체인 APEX2-ABD의 제작 및 위치-특이적 신호 증폭자로서 TSA에 적용한 모식도이다.
도 2는 금 QCM 센서 상의 APEX2-ABD (굵은 선) 및 APEX2 (점선)의 QCM 공진 주파수 변화 (-ΔF) 프로파일을 나타낸다(얇은 화살표). APEX2-ABD (굵은 선) 및 APEX2 (점선)의 단일층 상에 토끼 IgGs (A) 및 마우스 IgGs (B)를 적층한 후의 프로파일을 나타낸다. 세척 완충액 및 IgG 첨가는 각각 채워진 화살표 및 열린 화살표로 표시하였다. 고정화된 금 SPR 센서에 있어서, 토끼 IgGs (C) 및 마우스 IgGs (D)에 결합하는 APEX2-ABD에 대한 SPR 분석 결과를 나타낸다. 세척 완충액 및 IgG 첨가는 각각 채워진 화살표 및 얇은 화살표로 표시하였다. (E) 표시된 항체에 대한 해리 상수(dissociating constant; K _d)와, 결합(associating; k _on) 및 해리(dissociating; k _off) 비율 상수 수치를 나타낸다.
도 3은 fAPEX2-ABD (A, C), fAPEX2-ABD/Anti-Her2 rabbit IgGs (B) 및 fAPEX2-ABD/Anti-CD44 mouse IgGs (D)로 처리한 SKBR3 세포 (A, B) 및 SCC-7 세포 (C, D)의 형광 현미경 분석 이미지를 나타낸다. DAPI (왼쪽 열), 플루오레세인(fluorescein) (중간 열) 및 병합 (오른쪽 열) 이미지를 나타낸다.
도 4는 APEX2-ABD에 대한 Amplex^? Red (AR) 과산화수소/퍼록시다제 (hydrogen peroxide/ peroxidase) 분석 결과를 나타낸다. (A) 다양한 APEX2-ABD 농도로 30분 동안 590 nm에서의 형광 세기(530 nm에서 여기)를 관측하였다. (B) 반응 15분 후에, 다양한 APEX2-ABD 농도에 대한 형광 세기 수치를 플롯하였다. 삽입 그림은 낮은 농도의 APEX2-ABD 형광 세기를 나타낸다. 25μM의 AR 및 H₂O₂를 첨가하여 반응을 수행하였다. (C) 다양한 AR 및 H₂O₂ 농도로 30분 동안 590 nm에서의 형광 세기(530 nm에서 여기)를 관측하였다. (D) 반응 15분 후에, H₂O₂ 농도에 대한 형광 세기 수치를 플롯하였다. 삽입 그림은 낮은 농도의 H₂O₂ 형광 세기를 나타낸다. 상기 반응은 500 pM APEX2-ABD 및 AR을 첨가하여 수행하였고, H₂O₂는 1:1 화학양론(stoichiometry)으로 유지되었다.
도 5는 fAPEX2-ABD/Anti-Her2 rabbit IgGs (A-D) 및 fAPEX2-ABD/Anti-CD44 mouse IgGs (E-H)로 처리한 SKBR3 세포 (A-D) 및 SCC-7 세포 (E-H) 각각의 형광 현미경 분석 이미지를 나타낸다. TSA 처리 전 (B, F) 및 TSA 처리 후 (C, G). DAPI (A, E), 플루오레세인(fluorescein) (B, F), Alexa-555 (C, G) 및 병합 (D, H) 이미지를 나타낸다.

이에, 본 발명은 1차 항체의 Fc 부위와 선택적으로 강하게 결합을 하는 항체 결합 도메인(antibody-binding domain, ABD)과 아스코르베이트 퍼록시다제 2(ascorbate peroxidase 2; APEX2)를 융합하여 면역화학적 분석에서 2차 항체를 대체할 수 있는 값싸고 대량생산이 가능한 범용성 재조합 2차 항체 유사체를 개발하였다. 상기 재조합 2차 항체 유사체 APEX2-ABD를 이용하여, 수정 진동자 마이크로밸런스(Quartz crystal microbalance; QCM) 및 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance; SPR) 분석을 수행하였다. APEX2-ABD의 퍼록시다제(peroxidase) 활성은 Amplex Red 과산화수소/퍼록시다제 (hydrogen peroxide/ peroxidase) 분석을 이용하여 확인하였다. 겨자무 퍼록시다제(horseradish peroxidase; HRP)-접합 2차 항체 대신에 APEX2-ABD를 티라미드 신호 증폭(Tyramide signal amplification; TSA) 분석에 적용하여 유용성을 검증하고 본 발명을 완성하였다(도 1).

본 발명은 아스코르베이트 퍼록시다제 2(ascorbate peroxidase 2; APEX2) 단백질 및 1차 항체의 Fc 부위에 결합하는 항체 결합 도메인(antibody-binding domain, ABD) 단백질이 융합된 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체를 제공한다.

바람직하게는, 상기 APEX2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 상기 ABD 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 APEX2 단백질을 코딩하는 유전자 및 ABD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

바람직하게는, 상기 APEX2 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시될 수 있으며, 상기 ABD 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.

본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택 성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다. 바람직하게는 상기 미생물은 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 발현벡터를 미생물에 도입하여 형질전환하는 방법은 바람직하게 본 발명의 DNA를 포함하는 발현 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposemmediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기 침공법(electroporation) 등의 공지 방법으로 미생물에 도입하여 형질전환시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하여 APEX2-ABD 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 APEX2-ABD 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체에 1차 항체를 특이적으로 결합시키는 단계; 및 상기 1차 항체에 특이적인 항원을 처리하여 항원-항체 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는 면역화학적 분석방법을 제공한다.

상기 면역화학적 분석방법은 항원-항체의 특이적 결합을 확인할 수 있는 방법은 모두 가능하며, 가시적(visually), 광학적(optically), 전기화학적(electrochemically) 방법을 통한 면역화학적 분석방법일 수 있다.

바람직하게는, 단순 간접 ELISA(Simple indirect ELISA) 또는 티라미드 신호 증폭(Tyramide signal amplification; TSA) 면역염색법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 재조합 2차 항체 유사체(APEX2- ABD )의 구축, 발현 및 정제

항체 결합 도메인(antibody-binding domain, ABD, 58개의 아미노산)을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였고, 유연성 링커(flexible linker)로서 27개의 추가적인 아미노산을 가진 아스코르베이트 퍼록시다제 2(ascorbate peroxidase 2; APEX2)의 C-말단에 접합하여, pTRC99A 박테리아 발현 벡터 내로 삽입하였다. 재조합된 플라스미드 DNA는 competent E. coli 균주 BL21(DE)로 형질전환시켰다. 1개의 단일 콜로니를 골라 5mL의 Luria Broth에서 증폭시킨 후, 1L LB 배지에 접종하였다. APEX2-ABD의 발현은 420 μM 이소프로필 p-D-1-티오갈락토피라노시드(isopropyl p-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)를 첨가하여 30℃에서 밤새도록 유도하였다. 박테리아 세포는 원심분리하여 배지로부터 펠렛을 얻었고, 30 mL 용해 완충액(50 mM sodium phosphate 및 100 mM sodium chloride, pH 6.5)에 재현탁시켰다. 박테리아 세포벽의 가수분해를 촉진시키기 위해, 부유액을 라이소자임 (50 μg/ml)으로 처리하였고, 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 용액은 30초 간격으로 10분 동안 초음파처리하였고, 4℃에서 1시간 동안 12000 g로 원심분리하였다. 고정 금속 친화 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography; IMAC)를 사용하여 APEX2-ABD를 추가적으로 정제하였다. 여과된 추출물은 1 mL Ni-NTA agarose affinity column HisTrap^TM (GE healthcare, code number 17-5319-01) 상에 로딩하였고, 5 내지 100% 용출 완충액 (20 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride 및 1 M imidazole pH 7.4)의 선형 구배(linear gradient)을 통해 용출시켰다. 프리 이미다졸은 집중적인 완충 용액 (50 mM sodium phosphate 및 100 mM sodium chloride, pH 6.5) 투석을 통해 제거하였고, 정제된 APEX2-ABD는 UV/가시광선 분광광도계 및 SDS-PAGE로 분석하였다.

2. 수정 진동자 마이크로밸런스(Quartz crystal microbalance ; QCM ) 측정

면역글로불린에 대한 APEX2-ABD 및 APEX2의 결합 능력을 확인하기 위해서, Q-Sense E4 및 standard gold QCM sensors (Q-Sense, Sweden)가 사용되었다. 정량 펌프(peristatic pump)의 플로우 모드(flow mode)를 사용하였고, 챔버의 온도는 25.0±0.1℃에서 유지되었다. 각 샘플 용액은 일정한 유량의 정량 펌프를 통해 측정 챔버 내에 주입되었다. 우선, 측정 챔버는 포스페이트 완충액 (100 mM NaCl 및 50 mM sodium phosphate, pH 7.4)으로 평형을 유지하였다. 그 후, 단일층을 형성시키기 위해서, 1 mg/ml APEX2 또는 APEX2-ABD 용액을 주입하였다. 완충액을 사용하여 신호 평형을 유지시킨 후, 포스페이트 완충액에 녹인 0.2 mg/ml 토끼, 마우스 또는 랫트 IgGs를 주입하였다. 각 단계에서 약하게 결합하거나 비-특이적으로 결합한 물질을 제거하기 위해서, QCM chips을 포스페이트 완충액으로 집중적으로 씻어냈다. 7개의 하모닉(5, 15, 25, 35, 45, 55 및 65 MHz)에서 공진 주파수(Resonance frequencies)를 동시에 측정하였다. 명확성을 위해 3번째 오버톤(overtone)의 표준화된 주파수만을 나타냈다.

3. 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance; SPR ) 분석

SPR 실험은 Biacore 3000 device 상의 CM-5 표준 금 칩으로 25℃에서 수행하였는데, 작용 용액으로는 여과된 PBS 완충액을 사용하였다. CM-5 센서 칩은 카르복시메틸화된 덱스트란으로 코팅되었는데, 상기 분자는 표준 아민-커플링 화학을 통해 센서 칩의 표면 상에 토끼, 마우스 또는 랫트 IgGs로 커플링될 수 있다. 센서 칩 표면 상에 항체를 고정시키기 위해, 0.1 mg/mL의 토끼, 마우스 또는 랫트 IgGs를 짧은 시간에 주입한 후, 덱스트란 표면 상의 카르복실기를 활성화시키기 위해 60 μL EDC (0.5 mg/ml) 및 NHS (0.5 mg/ml)의 1:1 혼합물은 10 μL/min 유속으로 칩 상에 주입하였다. 0.1 mg/mL의 토끼, 마우스 또는 랫트 IgGs를 첨가하였다. 잔여 반응성 카르복실화기는 1M 에탄올아민 (pH 8.0)으로 차단되었고, IgG 고정화된 CM-5 센서 칩은 작용 완충액으로 평형화되었다. 다양한 농도의 APEX2-ABD 또는 APEX2 (0.08, 0.16, 0.3, 0.6 및 1.2 μM)는 IgG 고정화된 CM-5 센서 칩에 5 μL/min 유속으로 3분 동안 로딩된 후, 동일한 유속으로 7분 동안 작용 완충액으로 씻어냈다. 반응성 유닛은 실시간으로 관측하였고, 해리 상수는 BIAevaluation software를 이용하여 Langmuir (1:1) model에 SPR 데이터를 적용하여 구했다.

4. 세포 배양 및 형광 공초점 현미경 분석

SKBR-3은 10% 우태아혈청, 1% 스트렙토마이신, 25mM HEPES 및 25mM NaHCO₃가 포함된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 배지에서 5% CO₂ 및 95% 공기의 습윤 조건, 37℃로 배양되었다. SCC-7 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 RPMI1640에서 배양되었다. SK-BR-3 및 SCC-7 세포 (8×10⁴/well)는 현미경 커버글라스 (18 mm Φ) 상에 부착하여 12-웰 배양 플레이트(SPL, 30012)에서 배양하였다. 형광 공초점 이미지 분석을 위해, 세포는 PBS에 녹인 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정시켰고, 0.1% Tween-20이 포함된 PBS로 세 번 씻어냈다. APEX2-ABD 및 APEX2는 플루오레세인-5-말레이미드(fluorescein-5-maleimide; F5M)로 표지하였다. 백그라운드에 대한 fAPEX2-ABD 또는 fAPEX2의 비-특이적 결합을 방지하기 위해서, 샘플 처리 전에 차단 시약 (5% BSA, 5% FBS 및 0.5% Tween-20 in PBS)을 첨가하였고, 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. Anti-HER2 rabbit IgG (Abcam), anti-CD44 mouse IgG 및 anti-CD44 rat IgG (Biolegend)를 fAPEX2-ABD 또는 fAPEX2와 혼합하였고, fAPEX2-ABD/IgG 형태의 복합체를 세포 배양 플레이트에 첨가하였으며, 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 프리 IgGs 및 약하게 결합하는 단백질은 0.1% Tween-20이 포함된 PBS 완충액으로 3번 씻어냈다. 밀봉 전에, 샘플-처리된 세포는 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 염색하였다. 형광 세포 이미지는 Olympus Fluoview FV1000 (UOBC) 공초점 현미경을 사용하여 얻어냈다.

5. Amplex ^? Red 과산화수소/ 퍼록시다제 (hydrogen peroxide/ peroxidase ) 분석

APEX2-ABD의 퍼록시다제 활성을 확인하기 위해서, Amplex ^? Red reagent (Molecular probe ^? , cat# A12222)를 사용하여 플레이트-수준 분석을 수행하였는데, 상기 시약은 과산화수소에 의해 산화되면 붉은색 형광 산물인 레조루핀(resorufin)으로 전환된다. 분석을 위한 APEX2-ABD의 최적 농도를 결정하기 위해서, 11개 APEX2-ABD의 다양한 농도(0, 15, 31, 62.5 125, 250 및 500 pM, 1, 2 및 4 nM) 샘플 100 μL를 96 웰-플레이트에 분주한 후, 100 μL 반응 용액(50 μM Amplex Red^? 및 50 μM H₂O₂)을 각 웰에 첨가하였다. APEX2-ABD를 검출할 수 있는 H₂O₂ 최소량을 결정하기 위해서, 반응 용액을 순차적으로 희석하였고(0, 195, 390, 781 nM 및 1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200 μM of H₂O₂), 상기 희석액들은 96-웰 플레이트에 로딩하였다. 최종적으로 100 μL의 1 μM APEX2-ABD(최종농도 500 pM)를 첨가하였다. 형광 세기는 luorescence microplate reader (Tecan Group Ltd., Infinite^? 200)로 30분 동안 관측되었는데, 이는 70,000 유닛의 형광 세기에 대한 검출 한계를 가진다. 모든 데이터는 3번 독립적인 반복 실험을 통해 얻어냈다.

6. 티라미드 신호 증폭( Tyramide signal amplification; TSA ) 분석

TSA 분석에 사용된 모든 세포는 상기에서 언급한 대로 준비하였다. 1차 항체 결합 및 APEX2-ABD/IgG 복합체 결합을 1시간 동안 상온에서 수행하였고, 세포는 0.1 % Tween-20이 포함된 PBS로 3번 씻어냈다. 샘플은 티라미드 작용 용액 (tyramide stock 및 0.0015% H₂O₂ in amplification buffer)으로 처리하였고, 상온에서 15분 동안 반응시켰다.

< 실시예 1> 1차 항체의 Fc 부위에 선택적으로 결합하는 2차 항체 유사체 플랫폼 구축

퍼록시다제 활성 및 항체 결합 능력을 모두 갖는 이중 기능성 융합 단백질을 제작하기 위해서, 본 발명자들은 pTRC99A 발현 벡터 내에 APEX2가 코딩된 유전자를 제작한 후, 단백질 A의 항체 결합 도메인(antibody-binding domain; ABD)을 코딩하는 유전자를 C-말단에 삽입하였다. 본 발명자들은 APEX2 및 APEX2 변이체 발현을 위해 pTRC99A 발현 벡터를 사용하였는데, 이는 APEX2 내 헴(heme) 결합이 이의 촉매활성에 결정적인데, pTRC99A 발현 벡터에 의해 조절되는 APEX2의 늦은 발현은 효과적인 헴(heme) 결합을 유도하기 때문이다. 형태적 유연성을 제공하기 위해서, 27개 아미노산의 긴 링커(KDPNSGGGLVARGSGGGCGGGTGGGSGGG)를 APEX2 및 ABD 사이에 삽입하였는데, 이는 입체 장애(steric hindrance)를 최소화시켰고, 기능적 독립성을 가지게 하였다. 또한, 형광 프로브와 같은 특이적인 화학 접합을 가능하게 하는 사이트로서, 링커에 1개의 시스테인 잔기를 포함시켰다. APEX2 및 항체-결합 도메인과 APEX2의 융합단백질(APEX2-ABD)은 E. coli에서 수용성 세포기질 단백질로 과발현되었다. APEX2 및 APEX2-ABD 모두 N-말단에 His 태그를 갖기 때문에, 상기 단백질들은 고정-금속 친화 크로마토그래피(immobilized-metal affinity chromatography; IMAC)를 사용하여 각각 정제되었다. 비록 APEX2- 및 APEX2-ABD는 헴(heme)과 결합하여 서서히 방출되지만, APEX2-ABD는 4℃에서 적어도 1달 이상 온전히 유지되었다. 정제된 APEX2 및 APEX2-ABD는 SDS-PAGE 상에서 각각 29425.0 Da 및 38191.0 Da의 분자량을 갖는 단일 밴드로 분리되었다. APEX2 및 APEX2-ABD의 흡광도 및 2차 구조는 UV/Vis 및 원편광 이색성(circular dichroism; CD) 분광광도계로 확인하였다. 본 발명자들은 단백질 및 헴(heme)의 존재하에서 나타나는 280 nm 및 404 nm에서 각각 강한 흡광도 피크를 확인하였다. APEX2-ABD에서 404 nm/280 nm의 비율은 2.2의 수치를 나타냈다. APEX2 및 APEX2-ABD의 CD 스펙트럼은 잘-접힌(well-folded) 단백질의 형태 특성을 가진다. 195-205 nm에서 APEX2-ABD의 타원율 증가는 융합된 ABD의 높은 나선형 함량(helical contents)으로 인한 것으로 보인다(4개의 나선형 번들구조).

< 실시예 2> APEX2 - ABD와 항체의 결합능 분석

본 발명자들은 APEX2-ABD의 항체-결합능을 분석하기 위해, 수정 진동자 마이크로밸런스(Quartz crystal microbalance; QCM) 및 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance; SPR)을 사용하였는데, 이는 분석물에 추가적인 표지 없이도 실시간으로 이분자 상호작용을 측정할 수 있다. 많은 다른 단백질 복합체와 같이, APEX2 및 APEX2-ABD 모두 금 센서 상에 효과적으로 적층되는 것으로 나타났다(도 2A 및 2B). 공진 주파수(Resonance frequencies; F)는 APEX2 또는 APEX2-ABD의 첨가에 따라 크게 감소하였고, 샘플의 연속적인 흐름 하에서 고원-형태의 그래프를 나타냈다(도 2A 및 2B). 상기 결과는 금 센서와 단백질 복합체의 결합이 강하게 일어나고, 안정적인 APEX2 또는 APEX2-ABD 단일층을 형성하여 금 센서의 표면이 완전히 포화되었다는 것을 나타낸다(도 2A 및 2B). 다음으로, 본 발명자들은 토끼(도 2A), 마우스(도 2B) 및 랫트 IgGs 용액을 각각 QCM 금 센서 상에 형성된 APEX2 또는 APEX2-ABD 단일층에 첨가하였다. APEX2-ABD-단일층화된 QCM 금 센서의 공진 주파수는 크게 감소한 반면(도 2A 및 2B, 굵은선), APEX2-단일층화된 QCM 금 센서는 큰 차이를 보이지 않았다((도 2A 및 2B, 점선). 상기 결과는 APEX2-ABD가 금-센서에 방향-조절 방식으로 결합하고, 이는 마우스, 토끼 및 랫트 IgGs를 포함하는 다양한 형태의 IgGs를 효과적으로 포획할 수 있다는 것을 나타낸다.

또한, 본 발명자들은 여러 항체들에 대한 APEX2-ABD의 친화도를 정량적으로 확인하고, 여러 IgGs에 대한 결합 친화도를 비교하기 위해서, 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance; SPR) 분석을 수행하였다. QCM 분석과 반대로, 본 발명자들은 우선 다양한 항체들을 CM-5 SPR 센서 상에 고정화시킨 후, 실험 과정에서 APEX2 또는 APEX2-ABD를 첨가하였다. 본 발명자들은 토끼(도 2C), 마우스(도 2D) 및 랫트로부터 유래한 3가지 타입의 다클론 항체를 CM-5 센서 상에 각각 고정화시켰다. 다음으로, 잔여 반응성 아민 그룹 및 다른 샘플 사이의 원하지 않는 접합을 방지하기 위해서, 1M 에탄올아민 용액을 주입하였다. SPR 반응 유닛(response units; RU)은 APEX2 첨가에 따라서는 변화가 없었지만, APEX2-ABD에 있어서는 농도-의존적 방식으로 점차 증가하였다(↓, 도 2C 및 2D). 여러 종에서 유래한 IgGs는 약간 다른 해리 상수(dissociation constants)를 나타냈다. 토끼 IgGs는 6.79×10^-7 M의 해리 상수로 APEX2-ABD와 가장 강하게 결합하였다. 또한, 마우스 및 랫트 IgGs는 APEX2-ABD에 대한 친화도가 유사한 것으로 나타났다(각 해리상수 16.5×10^-7 및13.3×10^-7M, 도 2E).

< 실시예 3> in vitro 에서 형광 세포 이미지 분석을 통한 APEX2 - ABD의 항체 결합능 확인

본 발명자들은 형광 세포 이미지 분석을 통하여, in vitro에서 결합된 항체에 의해 APEX2-ABD/IgG 복합체가 표적을 특이적으로 인지하고, 선택적으로 결합하는지 확인하였다. 본 발명자들은 표적 세포주와 관련된 IgGs 뿐만 아니라, 2개의 다른 세포주인 SKBR-3 및 SCC-7도 준비하였다. SKBR-3 (도 3B) 및 SCC-7 세포주(도 3D)에 대해, anti-HER2 IgGs (토끼) 및 anti-CD44 IgGs (마우스 또는 랫트)가 각각 사용되었다. APEX2-ABD는 플루오레세인-5-말레이미드(fluorescein-5-maleimide)을 사용하여 표지되었고(fAPEX2-ABD), fAPEX2-ABD/IgG 복합체를 제작하기 위해서 항체와 혼합하였다. 온전한 활성을 유지시키기 위해서, 항체는 어떠한 형광 염료로도 표지하지 않았다. 2개의 세포주 각각은 fAPEX2-ABD/IgGs 복합체로 처리되었다. fAPEX2-ABD 단독으로 처리된 세포의 경우, 어떠한 녹색 형광도 관찰할 수 없었고(도 3A 및 3C), 명백한 녹색 형광 세포 이미지는 fAPEX2-ABD/IgG 복합체로 처리한 샘플에서만 관찰할 수 있었다(도 3B 및 3D). 상기 결과는 IgGs의 기원과는 무관하게, APEX2-ABD의 ABD 부위가 IgGs의 Fc 부위에 결합한다는 것을 나타낸다.

< 실시예 4> APEX2 - ABD의 과산화수소/ 퍼록시다제 (hydrogen peroxide/ peroxidase) 분석

APEX2-ABD의 촉매 활성을 측정하기 위해서, 본 발명자들은 리포터 분자로서 Amplex^? Red reagent (AR)인 N-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진(N-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)을 사용하였다. 퍼록시다제 효소는 과산화수소(hydrogen peroxide; H₂O₂)의 존재하에서 비-형광 AR을 형광 레조루핀(resorufin)으로 산화시키는 것으로 알려져 있다. 미량의 H₂O₂를 검출하기 위해서, 겨자무 퍼록시다제(horseradish peroxidase; HRP)는 Amplex^? Red 과산화수소/퍼록시다제 분석에서 널리 사용되고 있다. H₂O₂ 존재 하에서 AR이 레조루핀(resorufin)으로 전환되어 형광 세기가 증가하는 것은 APEX2-ABD의 퍼록시다제 활성을 확인하기에 좋은 수단일 수 있다. 이에, 본 발명자들은 우선 APEX2-ABD 농도를 달리하여 여분의 AR 및 H₂O₂ (각 25μM)와 반응시키고, 590 nm 파장에서 형광 세기 변화를 관측하였다(도 4A). 590 nm에서의 형광 세기는 빠르게 증가하는 것으로 관측되었고, 500 pM 농도의 APEX2-ABD에서 반응 약 15분 후에 최고치에 도달하는 것으로 확인되었다. 500 pM 이상의 APEX2-ABD 농도에서는 상기 신호가 포화되었다. 본 발명자들은 APEX2-ABD 각각의 농도에 따라 반응 15분 후에 형광 세기를 플롯팅하였고, 일직선으로 증가하는 것으로 나타났다(도 4B). 또한, AR 및 H₂O₂ 농도-의존적 방식으로 형광 세기는 일직선으로 증가하였고, APEX2-ABD 복합체는 1 μM 정도의 낮은 H₂O₂ 농도에서도 검출할 수 있었다(도 4C 및 4D).

< 실시예 5> 티라미드 신호 증폭( Tyramide signal amplification; TSA ) 분석에 있어서 APEX2 - ABD의 적용

본 발명자들은 방향-조절 방식으로 APEX2-ABD가 퍼록시다제 활성 및 항체-결합 능력을 모두 갖는 것으로 확인하였다. 상기 2가지 기능을 함께 활용하기 위해서, 본 발명자들은 APEX2-ABD 복합체를 티라미드 신호 증폭(Tyramide signal amplification; TSA) 분석에 HRP-접합 2차 항체 대용으로 적용하였다. TSA 분석은 세포 및 조직의 적용에 있어 민감도를 크게 향상시켜 널리 사용되는 항체-기반 고농도 이미지 분석이다. 이는 in situ에서 표적 단백질 또는 핵산 서열을 고-밀도로 표지하기 위하여, 퍼록시다제의 촉매 활성을 활용한 효소-매개 검출 방법이다. 분석에 있어서, 염료-접합 티라미드 유도체는 표적-특이적 표지 시약으로 적용하였다. 표적 사이트 상에 활성화된 염료-접합 티라미드 유도체의 증착은 형광 신호의 국지적인 향상을 나타낸다. TSA 분석에 있어 HRP-접합 2차 항체는 위치-특이적 신호 증폭자로서 작용하는 주요 인자이다. 이들은 특이적 표적 위치에 결합하여 1차 항체와 선택적으로 결합하고, 형광 염료-접합된 티라미드 유도체를 국지적으로 활성화시킨다. 인접 단백질의 국지적인 표지는 형광 신호를 상당히 향상시키는 결과를 나타낸다.

본 발명자들은 세포 이미지 분석에 사용했던 동일한 세포주/항체 세트를 적용하였다. 상기 2개의 세포주, 즉 SKBR-3 및 SCC-7는 fAPEX2-ABD/IgG로 처리하였다(i.e. SKBR-3 with fAPEX2-ABD/anti-HER2 rabbit IgG 및 SCC-7 with fAPEX2-ABD/anti-CD44 mouse IgG). 상기 처리된 세포주는 Alexa-555-접합 티라미드 및 0.0015% H₂O₂ 혼합물로 10분 동안 반응시켰다. 도 5에 나타낸 형광 현미경 분석 이미지는 fAPEX2-ABD/anti-HER2 rabbit IgG 및 fAPEX2-ABD/anti-CD44 mouse IgG가 적절한 표적 세포인 SKBR-3 및 SCC-7과 각각 결합한다는 것을 나타낸다(도 5B 및 5F). 하지만, Alexa-555-접합 티라미드 및 H₂O₂의 처리에 따라, SKBR-3 및 SCC-7 세포주 모두에서 매우 강한 붉은색 형광 신호가 관측되었다. 이는 퍼록시다제 효소인 APEX2에 의해 매개되는 붉은색 형광 염료에 의한 표적 세포의 다중 표지로 인해 관측된 것으로 보인다(도 5C 및 5G). 또한, 녹색 및 붉은색 형광 신호는 각각 겹쳐서 나타났다(도 5D 및 5H). 상기 결과는 APEX2-ABD/IgG 복합체가 이의 표적 세포를 인지하고, 복합체 내 항체에 의해 이들과 효과적으로 결합한다는 것을 나타낸다. 또한, 이들은 H₂O₂ 존재하에서 표적 세포의 인접한 표면 단백질을 표지하기 위한 Alexa-555-접합된 티라미드를 활성화시키는데, 이는 붉은색 형광 신호를 상당히 증폭시킨다.

<110> UNIST Academy-Industry Research Corporation <120> Recombinant Secondary Antibody Mimic as a Target-specific Signal Amplifier in Immunoassays <130> ADP-2015-0306 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> APEX2 <400> 1 Ala His His His His His His Ser Ala Ala Gly Ser Gly Gly Arg Asp 1 5 10 15 Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Lys Ser Tyr Pro Thr Val Ser Ala 20 25 30 Asp Tyr Gln Asp Ala Val Glu Lys Ala Lys Lys Lys Leu Arg Gly Phe 35 40 45 Ile Ala Glu Lys Arg Cys Ala Pro Leu Met Leu Arg Leu Ala Phe His 50 55 60 Ser Ala Gly Thr Phe Asp Lys Gly Thr Lys Thr Gly Gly Pro Phe Gly 65 70 75 80 Thr Ile Lys His Pro Ala Glu Leu Ala His Ser Ala Asn Asn Gly Leu 85 90 95 Asp Ile Ala Val Arg Leu Leu Glu Pro Leu Lys Ala Glu Phe Pro Ile 100 105 110 Leu Ser Tyr Ala Asp Phe Tyr Gln Leu Ala Gly Val Val Ala Val Glu 115 120 125 Val Thr Gly Gly Pro Lys Val Pro Phe His Pro Gly Arg Glu Asp Lys 130 135 140 Pro Glu Pro Pro Pro Glu Gly Arg Leu Pro Asp Pro Thr Lys Gly Ser 145 150 155 160 Asp His Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Ala Met Gly Leu Thr Asp Gln 165 170 175 Asp Ile Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Ile Gly Ala Ala His Lys 180 185 190 Glu Arg Ser Gly Phe Glu Gly Pro Trp Thr Ser Asn Pro Leu Ile Phe 195 200 205 Asp Asn Ser Tyr Phe Thr Glu Leu Leu Ser Gly Glu Lys Glu Gly Leu 210 215 220 Leu Gln Leu Pro Ser Asp Lys Ala Leu Leu Ser Asp Pro Val Phe Arg 225 230 235 240 Pro Leu Val Asp Lys Tyr Ala Ala Asp Glu Asp Ala Phe Phe Ala Asp 245 250 255 Tyr Ala Glu Ala His Gln Lys Leu Ser Glu Leu Gly Phe Ala Asp Ala 260 265 270 <210> 2 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ABD <400> 2 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 1 5 10 15 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser 20 25 30 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 35 40 45 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 3 <211> 819 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APEX2 <400> 3 atggcacacc accaccacca ccactccgcg gccggctccg gcggccgcga ctacaaggat 60 gacgacgata agggaaagtc ttacccaact gtgagtgctg attaccagga cgccgttgag 120 aaggcgaaga agaagctcag aggcttcatc gctgagaaga gatgcgctcc tctaatgctc 180 cgtttggcat tccactctgc tggaaccttt gacaagggca cgaagaccgg tggacccttc 240 ggaaccatca agcaccctgc cgaactggct cacagcgcta acaacggtct tgacatcgct 300 gttaggcttt tggagccact caaggcggag ttccctattt tgagctacgc cgatttctac 360 cagttggctg gcgttgttgc cgttgaggtc acgggtggac ctaaggttcc attccaccct 420 ggaagagagg acaagcctga gccaccacca gagggtcgct tgcccgatcc cactaagggt 480 tctgaccatt tgagagatgt gtttggcaaa gctatggggc ttactgacca agatatcgtt 540 gctctatctg ggggtcacac tattggagct gcacacaagg agcgttctgg atttgagggt 600 ccctggacct ctaatcctct tattttcgac aactcatact tcacggagtt gttgagtggt 660 gagaaggaag gtctccttca gctaccttct gacaaggctc ttttgtctga ccctgtattc 720 cgccctctcg ttgataaata tgcagcggac gaagatgcct tctttgctga ttacgctgag 780 gctcaccaaa agctttccga gcttgggttt gctgatgcc 819 <210> 4 <211> 171 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABD <400> 4 gataacaaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 60 ctgaacgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagccagagc 120 gcgaacctgc tggcggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa a 171

Claims (10)

1. 아스코르베이트 퍼록시다제 2(ascorbate peroxidase 2; APEX2) 단백질 및 1차 항체의 Fc 부위에 결합하는 항체 결합 도메인(antibody-binding domain, ABD) 단백질이 융합된 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체.
2. 제1항에 있어서, 상기 APEX2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체.
3. 제1항에 있어서, 상기 ABD 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체.
4. APEX2 단백질을 코딩하는 유전자 및 ABD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
5. 제4항에 있어서, 상기 APEX2 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시되고, 상기 ABD 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
6. 제4항 또는 제5항에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
8. 제6항에 따른 재조합 미생물을 배양하여 APEX2-ABD 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및
   상기 APEX2-ABD 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체 생산방법.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 APEX2-ABD 재조합 2차 항체 유사체에 1차 항체를 특이적으로 결합시키는 단계; 및
   상기 1차 항체에 특이적인 항원을 처리하여 항원-항체 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는 면역화학적 분석방법.
10. 제10항에 있어서, 상기 면역화학적 분석방법은 단순 간접 ELISA(Simple indirect ELISA) 또는 티라미드 신호 증폭(Tyramide signal amplification; TSA) 면역염색법인 것을 특징으로 하는 면역화학적 분석방법.
    

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