KR101104417B1 - 단백질 ｇ 변형체를 이용한 항체의 특이적 공유결합 커플링방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 G의 Fc 결합도메인에 있어서, 특정 부위가 시스테인(cystein)으로 치환된 Fc 결합도메인을 포함하는 단백질 G(protein G) 변형체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 단백질 G 변형체의 시스테인 변성 부분에 UV 크로스링커(cross-linker)를 선택적으로 결합시킨 단백질 G 변형체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 단백질 G 변형체와 항체를 UV 크로스 링킹하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 단백질 G 변형체와 항체의 결합물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 결합물을 이용하여 항원을 스크리닝 또는 분석하는 방법을 제공한다. 나아가 본 발명은 이러한 단백질 G 변형체를 고체지지물질의 표면에 결합시킴으로써 제조된 바이오 칩(biochip) 또는 바이오 센서(biosensor)를 제공하며, 이에 대한 제조방법을 제공한다. 아울러 본 발명은 상기 바이오 칩 또는 바이오센서를 이용하여 항체를 고정화하고 항원을 분석하는 방법을 제공한다.

단백질 G(protein G), UV 크로스링커(cross-linker), 항체 변형, 항체 고정 화

Description

단백질 Ｇ 변형체를 이용한 항체의 특이적 공유결합 커플링 방법{METHOD FOR SPECIFIC COVALENT COUPLING OF ANTIBODY USING A PHOTOACTIVABLE PROTEIN G VARIANT}

본 발명은 단백질 G의 Fc 결합도메인에 있어서, 특정 부위가 시스테인으로 치환된 Fc 결합도메인을 포함하는 단백질 G 변형체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 단백질 G 변형체의 시스테인 변성 부분에 UV 크로스링커를 선택적으로 결합시킨 단백질 G 변형체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 단백질 G 변형체와 항체를 UV 크로스 링킹하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 단백질 G 변형체와 항체의 결합물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 결합물을 이용하여 항원을 스크리닝 또는 분석하는 방법을 제공한다. 나아가 본 발명은 이러한 단백질 G 변형체를 고체지지물질의 표면에 결합시킴으로써 제조된 바이오 칩 또는 바이오 센서를 제공하며, 이에 대한 제조방법을 제공한다. 아울러 본 발명은 상기 바이오 칩 또는 바이오센서를 이용하여 항체를 고정화하고 항원을 분석하는 방법을 제공한다.

항체는 항원에 매우 특이적으로 결합하기 때문에 질병의 진단 및 치료에 관련된 의학적 연구와 생물학적인 물질을 분석하는데 광범위하게 사용되어왔다 (Curr. Opin. Biotechnol. 12 (2001) 65-69, Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001) 40-45). 최근에는 면역학적 측정법의 일환으로 항체를 고체지지물질에 고정화하고 전류, 저항, 질량의 변화 및 광학적인 특징 등을 측정하는 면역센서의 개발도 활발히 진행되고 있다 (affinity biosensors. vol. 7: Techniques and protocols). 이러한 항체를 이용한 면역 에세이(immuno-assay) 개발에 있어서 필수적인 과정이 항체의 고체지지물질이나 다른 화학적 생물학적 물질들과의 커플링과정이다. 이들 커플링을 통하여 항체는 고체지지물질에 고정화될 수 있고 또한 다양한 물질들로 태깅이 가능하게 된다.

다양한 고체지지물질에 항체를 고정화시키거나 항체를 태깅할 경우 변형된 항체의 항원결합 활성을 유지하는 것이 매우 중요하다. 단백질과 잘 결합시켜 재현성이 좋고 적용범위가 넓은 화학적인 방법(Langumur, 1997, 13, 6485-6490)이 많이 사용되고 있으며, 그 중에서도 공유결합을 통한 항체의 커플링 방법이 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 이러한 화학적 공유결합에 있어서 대부분의 경우 항체의 아민기를 이용하기 때문에 변형된 항체가 고체 지지대 위에서 방향성을 잃거나 항원과 결합하는 부분의 변형이 일어나 활성을 잃게 되는 경우가 있다(Analyst 121, 29R-32R). 물론 항체의 탄수화물 사슬(carbohydrate chain)이나 이황화 결합(disulfide bonds)들을 이용한 커플링 방법들이 알려져 있으나 이 방법들은 커플링 전에 항체에 강한 산화나 환원 등의 화학적 처리를 하는 것이 필요하다. 항체 처리를 최소화하면서 항원결합부위과 다른 특이적 항체부분에 커플링 할 수 있는 방법의 개발은 항체를 이용한 다양한 에세이 발전에 중요한 부분을 차지하고 있다.

이에 본 발명자는 상기와 같은 새로운 항체 커플링 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, UV 크로스 링커인 벤조페논(benzophonone)이 선택적으로 태그된 단백질 G 변형체를 제조하였으며 이 변형체를 이용하여 항체의 Fc 영역에 선택적으로 공유결합 커플링이 가능하게 하였다. 이러한 새로운 단백질 G 변형체를 이용하여 항체의 화학적 처리과정을 생략하고 선택적, 특이적으로 항체를 태깅 또는 고정화시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 단백질 G의 Fc 결합 도메인에 있어서, 21Val, 29Ala, 47Asp으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환된 Fc 결합 도메인을 포함하는 단백질 G 변형체를 제공하는 것이다.

보다 구체적으로 본 발명의 목적은,

Tx-Ly-(시스테인이 도입된 단백질 G-Fc 결합도메인)n-Qz

(T 및 Q는 펩타이드 태그 단백질, L은 링커이고, x, y 또는 z는 각각 0 또는 1이며, n은 1 내지 3이다)으로 구성되는 시스테인 변성된 단백질 G 변형체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 시스테인 변성된 부위에 UV 크로스 링커 복합체가 추가적으로 결합된 단백질 G 변형체를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 UV 크로스링커가 단백질 G의 아미노산 부위인 21Val, 29Ala 및 47Asp에 선택적으로 태그된 단백질 G 변형체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 시스테인 변성된 부위에 UV 크로스 링커 복합체가 추가적으로 결합된 단백질 G 변형체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 G 변형체를 고체지지물질의 표면에 결합시킴으로써 제조된 바이오칩 또는 바이오센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오칩 또는 바이오센서의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 G 변형체를 이용하여 입자표면에서 항체의 공유결합을 유도하는 항체의 고정화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오칩 또는 바이오센서를 이용하여 항원을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 양태로서, 단백질 G의 Fc 결합도메인에 있어 특정 부위의 아미노산이 시스테인(cystein)으로 치환된 단백질 G 변형체를 제공한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 첫 번째 양태로서,

Tx-Ly-(시스테인이 도입된 단백질 G-Fc 결합 도메인)n-Qz

(T 및 Q는 펩타이드 태그 단백질, L은 링커이고, x, y 또는 z는 각각 0 또는 1이며, n은 1 내지 3이다)로 구성되는 시스테인 변성된 단백질 G 변형체를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 단백질 G 는 그 기원이 특별히 제한되지 아니하며, 항체 결합력을 보유하는 한 천연형의 단백질 G에 아미노산이 결실, 부가 또는 치환 등이 일어난 형태도 본 발명의 목적에 부합되게 사용될 수 있다. 단백질 G는, 바람직하게는 스트렙토코카이(streptococci) 단백질 G이다.

Fc 도메인은 면역글로불린 또는 T세포 수용체의 일정한 아미노산 배열을 가진 부위로써, 항원과의 결합에는 관여하지 않는다. 일정한 수의 아미노산 잔기를 하나의 구분으로 하여 -S-S- 루프에 의해 고차구조를 형성하며, 각 구분은 펩타이드 결합으로 연결되어 있다.

단백질 G의 Fc 결합 도메인은 단백질 G가 항체의 Fc와 결합하는 부위인 것으로 알려진 도메인으로서, 스트렙토코카이(streptococci)의 단백질 G를 구성하는 도메인이며, 단백질 G는 그룹 G 스트렙토코카이(streptococci)에서 분리된 박테리아 세포벽 단백질(cell wall protein)중 일부이다. 이 도메인은 상기 서술한 포유동물의 항체의 Fc 영역 및 Fab 영역과 결합하는 것으로 알려져 있으며(J. Immuunol. Methods 1988, 112,113-120), 항체의 Fc 부분에 대한 결합력이 Fab 부분에 대한 결합력보다 약 10배 정도 높다고 알려져 있다. 천연의 단백질 G는 시퀀스 되어 그 DNA 서열이 공지되어 있다. 스트렙토코칼(streptococcal) 단백질 G 와 스타필로코 칼(staphylococcal) 단백질 A는 그람 양성 세균들(Gram-positive bacteria)에서 발견되는 세포 표면과 관련된 다양한 단백질 중 하나로, 면역 글로불린 항체에 결합하는 특징이 있다. 그 중에서도 스트렙토코칼 단백질 G 변형체가 스타필로코칼 단백질 A보다 더 유용하게 이용되고 있는데, 이는 스트렙토코칼 단백질 G 변형체가 보다 넓은 범위의 포유동물의 항체와 결합할 수 있어, 항체의 수용체로 사용하기에 더 적합하기 때문이다.

단백질 G의 Fc 결합 도메인 생물체에 따라 2개 또는 3개를 갖는다. 이러한 도메인은 각각 B1, B2 또는 경우에 따라 C1, C2, C3로 명명되며, 본 발명의 목적상 단백질 G의 항체 결합 도메인 Fc 결합 능력을 보유하는 한, 그 전체서열이거나 또는 일부 서열일 수 있다. 또한 이러한 아미노산은 결실, 부가, 치환이 일어난 것일 수 있다. 스트렙토코카이 단백질 G-B1 영역은 3개의 베타-쉬트(β sheet)와 1개의 알파-헬릭스(a-helix)로 구성되는데, 그 중 C-말단의 3번째 베타-쉬트와 알파-헬릭스가 항체 Fc와의 결합에 관여한다. B1의 아미노산 서열과 B2의 아미노산 서열을 비교하면, 4개의 서열의 차이가 있으나 구조상의 차이는 거의 없다. 본 발명의 구체적인 하나의 실시예로서, 본 발명자는 B1 영역의 경우, N-말단 쪽에 10개의 아미노산을 제거한 형태를 사용하였는데, 10개의 아미노산이 제거된 형태는 항체와의 결합 기능에 아무런 영향이 없음이 알려져 있다(Biochem. J. (1990) 267, 171-177, J. mol. Biol (1994) 243, 906-918, Biochemistry (2000) 39, 6564-6571).

본 발명의 목적상 Fc 결합 도메인은 B1, B2가 단독으로 또는 C1, C2, C3가 각각 단독으로 사용될 수 있으며, 동종(homo-multimer)이나 이종(hetero-multimer)간에 멀티머(multimer) 형태로 결합한 것일 수 있다. 발명의 일 실시예로서, 본 발명자는 스트렙토코칼 단백질 G의 유전자 중 항체와 결합하는 결합 도메인(B1, B2)만을 사용하였다.

본 발명의 용어 '시스테인이 도입된 단백질 G-Fc 결합도메인'이란 단백질 G의 Fc 결합도메인에 있어서 특정 부위의 아미노산이 시스테인으로 치환된 단백질 G 변형체를 의미한다. 본 발명은, 단백질 G의 Fc 결합도메인 중 특정 부위의 아미노산이 시스테인으로 치환된 단백질 G 변형체를 제공한다. 시스테인으로 치환되는 아미노산 서열 부위는 Fc 결합 도메인 중 항원 결합부위에 영향을 전혀 미치지 않거나 거의 미치지 않는 부위라면 어느 부위라도 가능하며, 바람직하게는 21Val, 29Ala, 47Asp로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 시스테인 치환한다. 더욱 바람직하게는 21Val, 29Ala 부위 중 어느 한 부위 이상을 시스테인으로 치환하는 것이며, 더더욱 바람직하게는 모든 부위를 시스테인으로 치환하는 것이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 21Val 및 29Ala 아미노산을 시스테인으로 치환한 단백질 G 변형체를 제공한다.

상기와 같은 단백질 G 변형체는 당해 기술 분야에 널리 알려진 기술, 예를 들어 펩타이드 합성법 또는 유전공학적 방법에 제조할 수도 있으며, 유전공학적 방법에 의해 특히 효율적으로 제조할 수 있다. 유전공학적 방법은 유전자조작에 의해 원하는 단백질을 대장균(E. coli) 등의 숙주세포에서 다량으로 발현시키는 방법으로서 이에 관한 기술은 공지문헌에 상세히 기술되어 있다(molecular biotechnology: Principle and Application of Recombinant DNA ; ASM Press: 1994, J. chem. Technol. Biotechnol. 1993, 56, 3-13). 상기와 같은 공지 기술들을 사용하여 본 발명에서 사용되는 단백질 G 변형체를 암호화하는 핵산 서열을 적절한 발현벡터에 포함시키고, 상기 발현벡터로 적절한 숙주세포를 형질전환시킨 후에 이 숙주세포를 배양시킴으로써 용이하게 제조할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Fc 결합도메인을 두 부위로 나누어 21번 및 29번 아미노산을 시스테인으로 치환한 서열을 제조하는 한편 각 부위의 말단에 제한 효소 절단 부위를 도입, 총 3번의 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 두 생산물을 주형으로 하여 변성된 Fc 결합 도메인의 유전자를 얻어 벡터에 삽입함으로써 시스테인으로 치환된 단백질 G의 시스테인 변성 도메인을 수득하였다.

본 발명에서 사용되는 T 태그는 단백질 G 내부에 삽입된 것이 아니고 단백질 G가 고체지지물질에 부착될 때 방향성을 제공하기 위해 사용될 수 있다. T 태그는 그 크기나 종류가 제한되지 아니하며, 바람직하게는 바이오틴 시그날링 펩타이드, 히스티딘 펩타이드(his), 헤마글루티닌(HA), 플래그(Flag), 금 결합 펩타이드(gold binding peptide) 및 형광단백질의 종류인 EGFP(enhanced GFP(Green Fluorescent Protein)), 파랑색 형광 단백질(EBFP(Enhanced Blue Fluorescent Protein), EBFP2, Azurite, mKalama1), 하늘색 형광 단백질(ECFP(Enhanced Cyan Fluorescent Protein), Cerulean, CyPet) 및 노랑색 형광 단백질 유도체들(YFP(Yellow Fluorescent Protein), Citrine, Venus, YPet), BFP 유도체(Blue Fluorescent Protein derivatives)등 어떠한 태그라도 사용될 수 있다. 또한 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline phosphatase), 페록시데이즈(Peroxidase)등의 시그날 증폭 효소도 상용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 하나의 실시예로서, 바이오틴 태그 시그날 펩타이드를 포함하는 시스테인 변성된 Fc 결합 도메인 변형체 (도 2)들을 제조하였다.

본 발명에서 사용되는 링커(L)는 단백질 G 변형체와 T 태그를 연결하는 기능을 수행한다. 본 발명의 단백질 G 변형체에서 태그(T)는 링커 없이 단백질 G에 직접 공유결합으로 연결될 수도 있으나, 링커(L)를 통하여 연결될 수도 있다. 링커는 단백질 G와 시스테인 사이에 삽입되는 것으로 임의의 서열을 가진 펩타이드이며, 아미노산 서열의 개수에는 제한이 없으나, 아미노산 2개 내지 10개로 구성된 펩타이드이면 족하다.

본 발명에서 단백질 G 변형체는 Q 태그를 더 포함할 수 있으며, Q 태그는 G 변형체의 분리를 용이하게 하기 위한 추가적인 태그일 수 있다. 이러한 Q 태그는 G 단백질의 C-말단에 추가로 포함될 수 있다. 바람직하게 Q 태그는 단백질 정제를 위한 태그로 사용될 수 있으며, 공지된 태그를 제한 없이 사용할 수 있다. 따라서 Q 태그는 상기 T 태그와 마찬가지로 그 크기나 종류가 제한되지 아니하며, 바람직하 게는 바이오틴 시그날링 펩타이드, 히스티딘 펩타이드(his), 헤마글루티닌(HA), 플래그(Flag), 금 결합 펩타이드(gold binding peptide) 및 형광단백질의 종류인 EGFP(enhanced GFP(Green Fluorescent Protein)), 파랑색 형광 단백질(EBFP(Enhanced Blue Fluorescent Protein), EBFP2, Azurite, mKalama1), 하늘색 형광 단백질(ECFP(Enhanced Cyan Fluorescent Protein), Cerulean, CyPet) 및 노랑색 형광 단백질 유도체들(YFP(Yellow Fluorescent Protein), Citrine, Venus, YPet), BFP 유도체(Blue Fluorescent Protein derivatives)등 어떠한 태그라도 사용될 수 있다. 또한 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline phosphatase), 페록시데이즈(Peroxidase) 등의 시그날 증폭 효소도 상용 될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 시스테인 변성된 단백질 G 변형체의 티올(thiol)기에 선택적으로 반응하는 UV 크로스 링커 복합체를 결합시킴으로써 단백질 G 변형체를 제조할 수 있다. UV 크로스 링커 복합체는 UV 크로스 링커, 사이드 링커 및 반응기로 구성되어 있다.

본 발명에서 사용되는 용어인 'UV 크로스 링커'란 UV 조사에 의하여 두 물질을 결합시키는 물질로서, 구체적으로 UV 조사에 의하여 항체의 Fc부분과 본 발명의 단백질 G 변형체를 공유결합 시키는 역할을 하는 물질을 말한다. UV 크로스 링커를 구성하는 화합물의 예로는 벤조페논(benzophenone), 아릴아자이드(aryl azide)와 이들의 변형체들을 들 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 벤조페논을 UV 크로스링커로 사용하였다.

또한 '반응기'란 시스테인으로 치환된 Fc 결합 도메인 부분의 시스테인과 반응하여 UV 크로스 링커를 결합시키기 위해 도입되는 활성 부위로서, UV 크로스 링커를 시스테인 변성된 단백질 G 변형체에 결합시키는 기능을 수행하며, 시스테인의 티올기에 특이적으로 반응할 수 있는 반응기라면 종류에 제한되지 않고 어떠한 반응기라도 사용할 수 있다. 시스테인과 특이적으로 반응하는 반응기는 바람직하게는, 말레이미드(maleimide)이다.

'사이드 링커'란 UV 크로스 링커와 반응기를 연결하기 위해 도입되는 화합물이다. 본 발명에서 사용되는 UV 크로스 링커와 반응기를 연결해주는 사이드 링커는, 티올기에 특이적으로 반응하는 반응기가 다양한 사이드 링커를 통해 UV 크로스 링커와 연결되도록 하여준다. 이 사이드 링커의 종류 또한 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 카본 체인(carbon chain) 또는 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol)이다. 더욱 바람직하게는 에틸렌 글라이콜(ethylene glycol)이며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 유연성과 수용성을 증가시키기 위하여 에틸렌글라이콜(EG) 사이드 링커를 사용하였다.

'UV 크로스 링커 복합체'란 상기 세 구성요소가 화학적으로 연결된 복합체를 의미하는데, 상기와 같은 방법으로 제조된 UV 크로스 링커 복합체는 그 내부에 시 스테인과 결합 할 수 있는 반응기, 예를 들어 말레이미드를 가지고 있어 시스테인으로 변성된 단백질 G 변형체의 티올기에 선택적으로 반응하여 결합 될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 UV 크로스 링커로서 벤조페논이 21Val과 29Ala 아미노산 부분에 태그된 단백질 G 변형체를 제조하였다.

시스테인 티올기에 특이적으로 반응하는 UV 크로스링커 복합체는 UV를 쬐어주는 경우 항체와 공유결합하게 된다. 따라서 이러한 항체의 커플링을 통해 항체를 이용한 다양한 에세이를 실시할 수 있게 된다.

상기의 단백질 G 변형체와 항체의 수용액 상태에서의 UV 크로스 링킹은 항체에 특이적인 반응이기 때문에 수용액의 조성에 제한이 없으며 다른 단백질도 포함될 수 있다.

본 발명은 하나의 양태로서, 상기 시스테인 변성된 단백질 G 변형체에 UV 크로스 링커 복합체를 결합시킨 단백질 G 변형체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 단백질 G 변형체의 제조방법은 상기에서 언급한 바와 같은 시스테인 변성 단백질 G 변형체의 환원단계와 환원제 제거 단계, UV 크로스 링커 복합체와의 반응단계를 포함하며, 마지막으로 반응하지 않은 UV 크로스 링커 복합체를 제거함으로써 정제하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 단백질 G 변형체의 제조 방법을 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질 G 변형체를 고체지지물질의 표면에 결합시킴으로써 제조된 바이오칩 또는 바이오센서를 제공한다.

고체지지물질은 상기의 단백질 G 변형체가 고정된 고체 표면 위에 항체의 UV 크로스링킹 고정화 방법을 제공하기 위하여 사용되는 것으로써, 단백질 고정화가 가능한 기질이면 그 종류에는 제한이 없고 박막이나 입자 등 어떤 구조체의 표면에도 가능하다. 바람직하게는 고체지지물질은 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘 및 금속으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 유리 또는 금의 표면을 사용할 수 있다. 구체적인 하나의 실시예로서, 본 발명자는 골드와 유리슬라이드 그리고 마이크로 입자표면위에서의 단백질 G의 고정화 그리고 항체의 UV 크로스링킹 고정화를 실시하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 바이오칩 또는 바이오센서의 제조방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 단백질 G 변형체를 이용하여 입자표면에서 항체의 공유결합을 유도하는 항체의 고정화 방법을 제공한다. 구체적인 하나의 실시예로서, 본 발명자는 PBS 버퍼, BSA가 포함된 용액상태에서 UV를 사용하여 크로스 링킹을 실시하였다. 크로스 링킹으로 결합되지 않고 남은 단백질 G 변형체의 경우는 투석이나 겔-여과(Gel-filtration)등을 이용하여 제거할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항체 고정화 방법을 이용하여 항원을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오칩 또는 바이오센서는 면역센서의 일종으로서 당해 기술 분야에 널리 알려져 있는 면역센서를 이용한 항원 분석 방법이면 모두 적용가능하므로 이러한 방법을 사용하여 항원을 분석할 수 있다. 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명을 이용한 방법을 사용하여 항원을 분석할 수 있다.

본 발명에 따른 단백질 G 변형체들은 항체에 특이적으로 결합하고 UV에 의해 항체와 공유결합을 형성한다. 상기 변형체를 이용하여 항체의 특이적 태깅(tagging)이 가능하고 또한 바이오칩 및 바이오센서의 표면에 방향성 있는 공유결합을 통한 항체 고정화를 가능하게 하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 시스테인 변성 스트렙토코칼 제조

도 2는 본 발명에서 테스트된 단백질 G 변성체들을 보여준다. 먼저 Fc 결합 도메인의 21Val과 29Ala를 시스테인으로 변성(FcBD; 도2)하기 위하여 3번의 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다. 첫 번째 PCR product는 Fc 결합도메인(FcBD)의 아미노산 1번부터 27번을 포함하며 21Cys이 도입되고 N-말단에 NdeI 제한 효소 절단 부위를 도입하였다. 두 번째 PCR product는 Fc 결합도메인의 아미노산 23번부터 55번을 포함하여 29Cys가 도입되고 C-말단에 XhoI 제한 효소 절단 부위를 도입하였다. 마지막 PCR반응에서는 얻어진 두 PCR products를 템플레이트로 하고 첫 번째 PCR반응의 센스 프라이머와 두 번째 PCR반응의 안티센스 프라이머를 이용하여 21Val과 29Ala를 시스테인으로 변성된 FcBD의 유전자를 얻고 NdeI과 XhoI두 제한 효소반응을 이용하여 pET21a 벡터에 삽입한다.

RCRI: 5' 프라이머 1: 센스

5-GGGAATTCCATATGACTTACAAACTTGTTATT-3

PCRI: 3' 프라이머 2: 안티센스

5-TTC TGC AGT TTC TGC GTC GCA TGC-3

RCRII: 5' 프라이머 1: 센스

5-GCA GAA ACT GCA GAA AAA TGC TTC--3

PCRII: 3' 프라이머 2: 안티센스

5-GAGCTCGAGTTCAGTTACCGTAAAGGTCTTAGTC-3

두 개의 Fc 결합도메인의 21Val이 시스테인으로 변성(2XFcBD; 도2)된 단백질의 제조를 위하여 두 번의 RCR 반응을 실시하였다. 첫 번째 PCR product는 N-말단 NdeI 절단부위와 21Val이 시스테인으로 변성 하나의 Fc 결합도메인 그리고 C-말단에 7개의 아미노산을 포함하고 두 번째 PCR product는 N-말단에 8개의 아미노산과 21Val이 시스테인으로 변성 하나의 Fc 결합도메인 그리고 C-말단에 XhoI 절단부위를 포함하게 된다. 이 두 PCR product들을 각각의 제한효소로 절단한 후 blunt end 결합을 통해 pET21a 벡터에 삽입한다.

RCRI: 5' 프라이머 1: 센스

5-GGGAATTCCATATGACTTACAAACTTGTTATT-3

PCRI: 3' 프라이머 2: 안티센스

5-CGC ATC GAT CAC TTC TGG TTT TTC AGT TAC CGT AAA GGT CTT-3

RCRII: 5' 프라이머 1: 센스

5-TCT GAA TTA ACA CCA GCC GTG ACAACT TAC AAA CTT GTT ATT AAT GG-3

PCRII: 3' 프라이머 2: 안티센스

5-GAGCTCGAGTTCAGTTACCGTAAAGGTCTTAGTC-3

N-말단 바이오틴 삽입을 위하여 바이오틴 시그날링 펩타이드(GLNDIFEAQKIEWHE)를 단백질 G 변형체 N-말단에 도입하고 pProExHTa 벡터에 삽입한다. pET21a에 삽입된 단백질들은 E. coli BL21에서 발현되었고 pProExHTa 벡터에 삽입된 바이오틴 태그 단백질의 경우는 AVB101에서 50 μM 바이오틴이 포함된 미디어에서 발현 되었다. 1 mM의 IPTG (이소프로필 베타-디-티오갈락토피라노사이드, isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 25에서 단백질 발현을 유도하였다. 14시간 후, 세포를 원심 분리하여 얻은 대장균을 초음파 (Branson, Sonifier450, 3 KHz, 3 W, 5 min)로 파쇄한 후, 전체 단백질 용액을 수득하였고 원심분리를 통해 용해성 분획 단백질 용액과 비용해성 분획 단백질로 분리하여 각각의 용액을 얻었다. 단백질 용액을 정제하기 위해서 IDA excellulose로 충진되어진 컬럼에 헥사 히스티딘이 결합되어 있는 재조합 유전자를 발현시킨 세포를 파쇄한 용액을 로딩하였다. 히스티딘이 결합 되어 있는 재조합 단백질을 용리 용액(50mM Tris-Cl, 0.5M 이미다졸, 0.5M NaCl, pH8.0)으로 용리시켰다. 얻어진 단백질 용액을 다시 한번 정제하기 위해 Q cellulose로 충진된 컬럼에 로딩하고 1M NaCl로 용리한후 용리된 단백질 용액은 2 mM DTT가 포함된 PBS 완충액 (phosphate-buffered Saline,pH7.4)으로 투석하였다.

실시예 2 : 말레이미도 - 에틸렌글라이콜 - 벤조페논 (Maleimido-EG-benzophenone)의 제조

도 3은 말레이미도-에틸렌글라이콜-벤조페논(maleimido-EG-benzophenone) 2의 합성방법을 보여준다. 화합물 4의 합성 방법은 본 발명자에 의해서 대한민국 특허출원 제10-2007-132998호로 출원되었으며 화합물 3의 경우는 발표된 방법에 따라 합성되었다 (Biochemistry (1993) 32, 2741-2746). 0.3 g의 화합물 4를 TFA(trifluoroacetic acid)와 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)가 1:1로 섞인 10 mL용액에 녹여 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 반응 후 낮은 기압에서 유기용매를 제거하고 메틸렌 클로라이드에 녹인 후, 다시 유기용매를 제거하는 과정 을 세 번 반복하여 남아있는 TFA를 모두 제거한다. 약 0.14 g의 비보호(deprotected) 화합물 4가 얻어졌다. 0.1 g (0.4 mmol)의 비보호 화합물 4와 0.15 g (0.46 mmol)의 화합물 3을 20 mL의 메틸렌 클로라이드에 녹이고 0.08 g (0.8 mmol)의 트라이에틸아민(triethylamine)과 소량의 DMAP(dimethylaminopyridine)를 질소 하에서 가한 후 상온에서 10시간 동안 반응하였다. 낮은 기압에서 유기용매를 제거한 후 20 mL의 메틸렌 클로라이드에 다시 녹여 물로 두 번 추출하여 얻어진 혼합물은 아세톤(acetone)과 메틸렌 클로라이드의 1:3 용매를 이용한 실리카 컬럼을 이용하여 정제하였다. 90 mg (47% yield)의 말레이미도-에틸렌글라이콜-벤조페논 2를 합성하였다.

실시예 3 : 단백질 G 변형체 제조

단백질 G 변형체를 제조하기 위하여 시스테인 변성된 Fc 결합도메인들을 말레이미도-에틸렌글라이콜-벤조페논 2(maleimido-EG-benzophenone 2)와 반응, 시스테인의 티올기를 벤조페논으로 변성시켰다 (도 4). 시스테인 변성 단백질들은 2 mM DTT에 보관되어 그 환원상태를 유지하고 화합물 2와 반응 직전 탈염(desalting) 컬럼을 이용하여 DTT를 제거한다. 화합물 2와 변성 단백질 간의 반응은 상온에서 1시간 동안 이루어지고 반응 후 남아있는 화합물 2는 다시 탈염 컬럼을 이용하여 제거한다. UV 크로스링커인 벤조페논으로 변성된 단백질과 변성 전 단백질은 SDS-PAGE상에서 다르게 이동하여 모든 시스테인 변성 Fc 결합도메인들이 벤조페논과 결합되어있는 것을 확인하였다.(도 5)

도 5에 개시된 레인의 설명은 다음과 같다;

레인 1: 시스테인 변성 Fc 결합 도메인 (FcBD),

레인 2: 화합물 2와 반응한 FcBD (FcBD-BP),

레인 3: 시스테인 변성 두 개의 Fc 결합 도메인 (2XFcBD),

레인 4: 화합물 2와 반응한 2XFcBD (2XFcBD-BP)

실시예 4 : 항체와 단백질 G 변형체간의 UV 크로스링킹

수용액 상에서 항체와 제작된 단백질 G 변형체들간의 UV 크로스링킹을 확인하였다.

구체적으로, 50 ug/mL 항체 PBS용액에 약 5 배 정도의 단백질 G 변형체를 가하고 30분간 상온에서 결합시킨 후 365 nm UV light를 이용하여 얼음상태에서 30분 또는 1시간 동안 크로스 링킹 반응을 실시하였다. 이들 크로스 링킹 반응물을 SDS-PAGE로 환원상태에서 분리 분석하였다.(도 6가) 항체의 중사슬(heavy chain)만을 FcBD-BP가 크로스링킹 하는 것을 볼 수 있어 단백질 G 변형체가 항체의 Fc부분에 크로스링킹이 되는 것을 확인하였다. 또한 상업화되어있는 말레이미도 벤조페논(maleimido benzophenone) 1을 이용하여 단백질 G 변형체를 제작하여 크로스링킹을 실시 하였을때 그 크로스링킹 효율이 매우 떨어지는 것을 볼 수 있어 벤조페논(benzophenone)과 말레이미드(maleimide) 사이에 에틸렌 글라이콜(ethylene glycol) 링커의 중요성을 보여주었다.

전체 항원에서 단백질 G 변형체의 크로스링킹 효율을 분석하기 위하여 크로스 링킹 반응물을 SDS-PAGE로 비환원상태에서 다시 분석하였다.(도 6나) 비환원상태에서 항체는 이황화결합(disulfide bond)를 유지하여 중사슬(heavy chain)과 경사슬(light chain)들의 연결 상태를 유지한다. Fc 부분의 두 개의 단백질 G 결합부분을 포함하고 있어 항체에 한 개 또는 두 개의 FcBD-BP가 크로스링킹된 항체 결합체가 확인되었으며 반응항체 중 75%이상이 FcBD-BP와 크로스링킹 된 것이 확인되었다.

실시예 5 : 단백질 G 변형체를 이용한 항체의 바이오틴 태깅

단백질 G 변형체를 이용하여 항체의 특이적 Fc 부분 바이오틴 태깅을 실시하였고 태깅된 항체의 표면 결합 반응을 실시간으로 감지할 수 있는 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서 (SPR)를 통해 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 측정하였다.

구체적으로, CRP(C-reactive protein)에 대한 항체를 상기 설명된 수용액상에서의 UV 크로스링킹 방법을 이용하여 바이오틴 태그 FcBD (biotin-FcBD-BP)와 크로스링킹 시켰다. 반응하지 않은 비오틴-Fc 결합 도메인(biotin-FcBD-BP)는 투석(dialysis)나 혹은 겔-여과(gel-filtration)방법을 이용하여 항체로부터 분리하였다. CRP에 대한 항체는 또한 NHS-EZ-biotin을 이용하여 랜덤하게 바이오틴 태깅되었다. 이들 바이오틴 태깅된 항체는 중성화된 스트렙트아비딘(Neutravidin)이 고정화된 바이오센서에 가해졌으며 바이오틴 항체의 결합 그리고 CRP의 결합을 SPR 센서를 이용하여 관찰하였다.(도 7)

그 결과, 바이오틴 스트렙트아비딘(Neutravidin) 결합을 통하여 바이오틴 태그된 항체들이 센서 표면에 안정하게 고정화되는 것을 볼 수 있었다. 그러나 biotin-FcBD-BP를 통해 바이오틴 태그된 항체의 경우 랜덤하게 바이오틴 태그된 항체에 비해 1.5 - 2배 정도 많은 항체가 표면에 고정화되는 것을 볼 수 있었다. 또한 항체 고정에 이은 항원 CRP의 결합에 있어서도 biotin-FcBD-BP를 통해 바이오틴 태그된 항체의 경우 랜덤하게 바이오틴 태그된 항체에 비해 3 - 4배 정도 많은 CRP와 결합하였다. 이는 biotin-FcBD-BP를 통한 항체 바이오틴 태깅이 Fc에 특이적으로 이루어져 기존에 방법에 비해 효율적인 항체 고정화를 이루고 있음을 보여준다.

실시예 6 : 고체 표면에서의 고정화를 위한 항체와 단백질 G 변형체간의 UV 크로스링킹

단백질 G 변형체를 이용하여 고체 표면에서 UV 크로스링킹을 통한 항체의 공유결합 고정화방법을 개발하였다.

구체적으로, 글래스 또는 금(gold) 표면을 단백질 G (2XFcBD-BP), 또는 비활성 단백질 G (2XFcBD), 그리고 BSA로 결합시켰다. 이들 표면위에 50 ug/mL의 PBS Cy3 레블 (label) 항체 용액을 가하고 30분간 결합반응 시킨 후 365 nm UV light를 한시간동안 가하여 크로스링킹 반응을 실시하였다. 공유결합으로 고정화되지 않은 단백질들은 10 mM NaOH를 1분 동안 가하여 제거 한 후 공유결합으로 고정화된 Cy3- 항체를 형광스캐너를 이용하여 형광 시그널을 측정하였다.

그 결과, 오직 단백질 G 변형체가 고정화된 표면 위에서만 항체가 공유결합하는 것을 알 수 있었다.(도 8가)

또한 이 실험에서는 300 um의 스팟들을 가지고 있는 마스크를 이용하여 항체의 공유결합 고정화의 부분 조절을 실시하였다. 글래스 또는 금 표면을 단백질 G (2XFcBD-BP)로 커버한 후 항체와 반응시키고 UV 크로스 링킹을 위의 마스크를 통하여 실시하였다. 골드 표면에서의 항체 고정은 SPR 이미징 방법을 통하여 글래스 표면에서의 Cy3-항체 고정화는 형광 스케너를 통하여 관찰하였으며 그 결과 300 um 스팟들을 통한 부분만이 항체고정화가 이루어진 것을 관찰하였다.(도 8나)

실시예 7 : 입자 표면에서의 고정화를 위한 항체와 단백질 G 변형체간의 UV 크로스링킹

단백질 G 변형체를 이용하여 마이크로 입자 표면에서 UV 크로스링킹을 통한 항체의 공유결합 고정화방법을 개발하였다.

구체적으로, 카복실(carboxyl)기를 표면에 포함하는 작은 자성 입자 DYNAL(Dynabeads MyOneTM Carboxylic Acid)의 표면을 단백질 G 변형체(2XFcBD-BP)로 NHS/EDC 반응을 통하여 결합시켰다. 이들 자성 입자를 50 ug/mL PBS 항체와 결합시킨 후 입자 용액을 365 nm UV light로 한 시간 크로스링킹하고 입자에 비공유결합된 항체와 공유결합된 항체를 단백질 전기영동 (SDS-PAGE)로 분석하였다.

그 결과, UV 크로스 링킹을 실시하지 않은 입자의 경우 대부분의 항체들이 10 mM NaOH에 의해서 입자로부터 분리되었으나 UV 크로스링킹을 실시한 입자의 경우 반 이상의 항체들이 공유결합으로 입자에 결합되어 있었다.(도 9)

도 9에 개시된 레인의 설명은 다음과 같다;

레인 1: 항체 결합 후, UV 크로스링킹 없이 10 mM NaOH 세척으로 입자에서 분리된 항체,

레인 2: 항체 결합 후, 한 시간 UV 크로스링킹 반응 후 10 mM NaOH 세척으로 입자에서 분리된 항체,

레인 3: UV 크로스링킹 없이 10 mM NaOH 세척 후 입자에 공유결합으로 남아있는 항체,

레인 4: 한 시간 UV 크로스링킹 반응 후, 10 mM NaOH 세척 후 입자에 공유결합으로 남아있는 항체

도 1은 단백질 G의 항체결합 도메인과 항체의 Fc 영역 결합체의 크리스탈 구조와 항체결합 도메인 중 UV 크로스링커 결합부분을 푸른색으로 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에서 사용한 단백질 G 항체결합 도메인의 아미노산 서열과 크로스링킹에 사용된 단백질 G 변형체들을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에서 사용한 벤조페논-에틸렌글라이콜-말레이미드 (Benzophenone-EG-maleimide) 화합물의 합성방법을 나타내고 있다.

도 4는 Fc 결합 도메인을 UV 크로스링커로 변형시키는 방법과 단백질 G 변형체를 이용한 항체와의 크로스링킹방법의 모식도이다.

도 5는 단백질 G 변형체들과 UV 크로스링커와 반응후 얻어진 단백질 G 변형체들을 단백질 전기영동 (SDS-PAGE)로 분석한 사진이다.

도 6은 단백질 G 변형체와 항체의 UV 크로스링킹 결과를 (가) 환원(reducing)상태와 (나) 비환원(non-reducing)상태에서 단백질 전기영동 (SDS-PAGE)로 분석한 사진이다.

도 7은 중성화된 스트렙트아비딘 (Neutravidin)이 고정화된 바이오센서에 CRP에 대한 항체와 항원인 CRP를 반응하여 얻은 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 나타내는 그래프이다. CRP에 대한 항체는 NHS-EZ-biotin과 반응하거나 바이오틴을 포함한 단백질 G 변형체와의 UV 크로스링킹을 통해 바이오틴으로 테깅(tagging)되었다.

도 8(가)는 유리표면에 단백질 G와 단백질 G 변형체 그리고 BSA를 고정화 하고 Cy3로 레블된 항체를 결합시킨 후 UV 크로스링킹을 실시한 후 마지막으로 비공유결합으로 결합된 항체를 10 mM NaOH로 씻어낸 후 형광스캐너를 이용하여 공유결합된 항체를 확인한 이미지 사진이다. (나)는 골드와 유리표면에 단백질 G 변형체를 고정화하고 항체를 결합시킨 후 300 um의 홀(hole)을 가지는 마스크(mask)를 이용하여 UV 크로스링킹을 실시, 그 결과 공유결합된 항체를 표면 플라즈몬 공명과 형광 이미징을 통해 각각 확인한 이미지 사진이다.

도 9는 단백질 G와 단백질 G 변형체로 각각 입혀진 자성 입자에 항체를 결합시키고 UV 크로스링킹을 실시한 후 비공유결합된 항체와 공유결합된 항체를 단백질 전기영동 (SDS-PAGE)로 분석한 사진이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> METHOD FOR SPECIFIC COVALENT COUPLING OF ANTIBODY USING A PHOTOACTIVABLE PROTEIN G VARIANT <130> PA080179 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for RCR1 <400> 1 gggaattcca tatgacttac aaacttgtta tt 32 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for RCR1 <400> 2 ttctgcagtt tctgcgtcgc atgc 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for RCR2 <400> 3 gcagaaactg cagaaaaatg cttc 24 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for RCR2 <400> 4 gagctcgagt tcagttaccg taaaggtctt agtc 34

Claims (22)

1. 하기 식으로 표현되는 시스테인(cystein) 변성된 단백질 G 변형체에서 시스테인 변성 Fc 결합도메인은 21Val, 29Ala, 47Asp으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산을 시스테인으로 치환한 것인 단백질 G 변형체.

   Tx - Ly - (시스테인이 도입된 단백질 G-Fc 결합도메인)n - Qz

   (T 및 Q는 펩타이드 태그 단백질, L은 링커이고, x, y 또는 z는 각각 0 또는 1이며, n은 1 내지 3이다).
2. 삭제
3. 하기 식으로 표현되는 시스테인(cystein) 변성된 단백질 G 변형체에 있어서, 티올(thiol)기에 선택적으로 반응하는 UV 크로스 링커 복합체를 추가적으로 결합시킨 단백질 G 변형체.

   Tx - Ly - (시스테인이 도입된 단백질 G-Fc 결합도메인)n - Qz

   (T 및 Q는 펩타이드 태그 단백질, L은 링커이고, x, y 또는 z는 각각 0 또는 1이며, n은 1 내지 3이다).
4. 제3항에 있어서, UV 크로스 링커 복합체는 UV 크로스 링커, 사이드 링커 및 반응기로 구성된 것을 특징으로 하는 단백질 G 변형체.
5. 제4항에 있어서, UV 크로스 링커는 벤조페논(benzophenone), 아릴 아자이드(aryl azide) 또는 그들의 변성체(derivatives)인 단백질 G 변형체.
6. 제4항 또는 5항에 있어서, 반응기는 말레이미드 또는 할로아세틸(haloacetyl)인 단백질 G 변형체.
7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 반응기와 UV 크로스 링커를 연결하는 사이드 링커는 카본 체인(carbon chain) 또는 에틸렌 글라이콜(ethylene glycol)인 단백질 G 변형체.
8. 하기 식으로 표현되는 시스테인(cystein) 변성된 단백질 G 변형체의 시스테인 티올기중 어느 하나 이상의 티올기가 UV 크로스 링커 복합체에 의해 변성된 단백질 G 변형체.

   Tx - Ly - (시스테인이 도입된 단백질 G-Fc 결합도메인)n - Qz

   (T 및 Q는 펩타이드 태그 단백질, L은 링커이고, x, y 또는 z는 각각 0 또는 1이며, n은 1 내지 3이다)
9. 제1항 또는 제3항에 있어서, T 태그는 바이오틴, 헥사 히스티딘(hexa histidine) 펩타이드, 헤마글루티닌(HA), Flag, 금 결합 펩타이드(gold binding peptide), GFP(Green Fluorescent Protein) EGFP(enhanced GFP), BFP(Blue Fluorescent Protein) EBFP(Enhanced BFP), EBFP2, BFP 유도체, Azurite, mKalama1, ECFP(Enhanced Cyanide Fluorescent Protein), Cerulean, CyPet, YFP(Yellow Fluorescent Protein), Citrine, Venus, YPet, 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline phosphatase) 및 페록시데이즈(peroxidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 태그를 갖는 단백질 G 변형체.
10. 제1항 또는 제3항에 있어서, Q 태그는 바이오틴, 헥사 히스티딘(hexa histidine) 펩타이드, 헤마글루티닌(HA), Flag, 금 결합 펩타이드(gold binding peptide), GFP(Green Fluorescent Protein) EGFP(enhanced GFP), BFP(Blue Fluorescent Protein) EBFP(Enhanced BFP), EBFP2, BFP 유도체, Azurite, mKalama1, ECFP(Enhanced Cyanide Fluorescent Protein), Cerulean, CyPet, YFP(Yellow Fluorescent Protein), Citrine, Venus, YPet, 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline phosphatase) 및 페록시데이즈(peroxidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 태그를 갖는 단백질 G 변형체.
11. 21Val, 29Ala, 47Asp으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환된 시스테인 변성 Fc 결합도메인을 제작하는 단계를 포함하는 제1항의 시스테인 변성된 단백질 G 변형체를 제조하는 방법.
12. 삭제
13. a) 하기 식으로 표현되는 시스테인 변성된 단백질 G 변형체를 제작하는 단계;

    Tx - Ly - (시스테인이 도입된 단백질 G-Fc 결합도메인)n - Qz

    (T 및 Q는 펩타이드 태그 단백질, L은 링커이고, x, y 또는 z는 각각 0 또는 1이며, n은 1 내지 3이다)

    b) 상기 G 변형체의 티올기에 선택적으로 반응하는 UV 크로스 링커 복합체를 제작하는 단계; 및

    c) 상기 G 변형체의 티올기에 UV 크로스 링커 복합체를 반응시켜 제3항의 단백질 G 변형체를 제작하는 단계;

    d) 상기 단백질 G 변형체의 UV 크로스 링커 복합체에 항체를 처리하는 단계; 및

    e) UV를 조사하여 UV 크로스 링커 복합체와 항체를 결합시키는 단계를 포함하는, 제3항의 단백질 G 변형체와 항체를 UV 크로스 링킹 하는 방법.
14. 제13항의 방법에 의해 제조된, 단백질 G 변형체와 항체의 결합물.
15. 제14항의 단백질 G 변형체와 항체의 결합물에 항원을 처리하는 단계; 및 상기 항체에 특이적으로 결합하는 항원을 검출하는 단계를 포함하는, 항원을 스크리닝 또는 분석하는 방법.
16. 제1항 또는 제3항의 단백질 G 변형체를 고체지지물질의 표면에 결합시킴으로써 제조된 바이오칩 또는 바이오센서.
17. 제16항에 있어서, 상기 고체지지물질은 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘 및 금 속으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 고체지지물질로 이루어진 바이오칩 또는 바이오센서.
18. 제16항에 있어서, 상기 바이오칩 또는 바이오센서는 금 박막 또는 금 나노입자인 바이오칩 또는 바이오센서.
19. 제16항에 있어서, 고체지지물질의 표면에 결합된 단백질 G 변형체에 항체가 추가적으로 결합된 바이오칩 또는 바이오센서.
20. a) 하기 식으로 표현되는 시스테인 변성된 단백질 G 변형체를 제작하는 단계;

    Tx - Ly - (시스테인이 도입된 단백질 G-Fc 결합도메인)n - Qz

    (T 및 Q는 펩타이드 태그 단백질, L은 링커이고, x, y 또는 z는 각각 0 또는 1이며, n은 1 내지 3이다)

    b) 상기 G 변형체의 티올기에 선택적으로 반응하는 UV 크로스 링커 복합체를 제작하는 단계; 및

    c) 상기 G 변형체의 티올기에 UV 크로스 링커 복합체를 반응시키는 단계를 포함하는, 제3항의 시스테인 변성된 단백질 G 변형체를 제작하는 방법.
21. 제11항 또는 제20항의 방법으로 단백질 G 변형체를 제작하는 단계; 및 상기 단백질 G 변형체를 고체지지물질의 표면에 결합시키는 단계를 포함하는 바이오칩 또는 바이오센서의 제조방법.
22. 제19항의 바이오칩 또는 바이오센서에 항원을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계; 상기 바이오칩 또는 바이오센서의 항체에 항원이 특이적으로 결합하는 단계; 및 상기 항체-항원의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 제19항의 바이오칩 또는 바이오센서를 이용하여 항원을 분석하는 방법.

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