CN117264076A - 标记多肽、修饰多肽、这些多肽的制造方法、含这些多肽的试剂及目标物质的测定方法 - Google Patents
标记多肽、修饰多肽、这些多肽的制造方法、含这些多肽的试剂及目标物质的测定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117264076A CN117264076A CN202310594024.3A CN202310594024A CN117264076A CN 117264076 A CN117264076 A CN 117264076A CN 202310594024 A CN202310594024 A CN 202310594024A CN 117264076 A CN117264076 A CN 117264076A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fab
- peg
- polypeptide
- alp
- linker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 255
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 246
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 246
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 66
- 239000013076 target substance Substances 0.000 title claims description 45
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title description 78
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 196
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 100
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims abstract description 85
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 78
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 claims abstract 25
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 239
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 58
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 58
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 54
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 claims description 49
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 claims description 49
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 44
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 claims description 40
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 36
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 22
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 19
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 19
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 18
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 18
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 10
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 6
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 4
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 227
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 227
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 169
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 148
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 144
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 71
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 58
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 55
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 45
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 239000000047 product Substances 0.000 description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 35
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 35
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 31
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 30
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 28
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 28
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 28
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 28
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 28
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 26
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 25
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 24
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 22
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 21
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 21
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 19
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 16
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 16
- -1 maleimide modified biotin Chemical class 0.000 description 16
- VLARLSIGSPVYHX-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O VLARLSIGSPVYHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 15
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 14
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 14
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 13
- 150000003857 carboxamides Chemical group 0.000 description 13
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 13
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 13
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 11
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 10
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 9
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 8
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 8
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 7
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 7
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 7
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- 125000005549 heteroarylene group Chemical group 0.000 description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- BIKSKRPHKQWJCW-UHFFFAOYSA-N 3,4-dibromopyrrole-2,5-dione Chemical group BrC1=C(Br)C(=O)NC1=O BIKSKRPHKQWJCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 5
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical group C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000002514 liquid chromatography mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical group [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 150000003949 imides Chemical group 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 3
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 3
- KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[5-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CC=1OC(=NN=1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QBLRHWLVSHLMSP-UHFFFAOYSA-N 3-bromopyrrole-2,5-dione Chemical group BrC1=CC(=O)NC1=O QBLRHWLVSHLMSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N Butadiene Chemical group C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 2
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GKQLYSROISKDLL-UHFFFAOYSA-N EEDQ Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)OCC)C(OCC)C=CC2=C1 GKQLYSROISKDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 2
- 108010027044 HIV Core Protein p24 Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 241001495137 Streptomyces mobaraensis Species 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 125000000732 arylene group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 125000002993 cycloalkylene group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 125000005179 haloacetyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 2
- AUTOLBMXDDTRRT-JGVFFNPUSA-N (4R,5S)-dethiobiotin Chemical compound C[C@@H]1NC(=O)N[C@@H]1CCCCCC(O)=O AUTOLBMXDDTRRT-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001917 2,4-dinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C(=C1*)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JQXYBDVZAUEPDL-UHFFFAOYSA-N 2-methylidene-5-phenylpent-4-enoic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)CC=CC1=CC=CC=C1 JQXYBDVZAUEPDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical group [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002126 Acrylic acid copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical group CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N N-benzoyl-Ferrioxamine B Chemical compound CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAQMYDQNMFBZNA-UHFFFAOYSA-N N-biotinyl-L-lysine Natural products N1C(=O)NC2C(CCCCC(=O)NCCCCC(N)C(O)=O)SCC21 BAQMYDQNMFBZNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 101710097340 RNA polymerase sigma factor RpoD Proteins 0.000 description 1
- 101710198277 RNA polymerase sigma factor sigA Proteins 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 1
- WGLPBDUCMAPZCE-UHFFFAOYSA-N Trioxochromium Chemical compound O=[Cr](=O)=O WGLPBDUCMAPZCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000058281 Ulmus pumila Species 0.000 description 1
- 235000001547 Ulmus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- XECAHXYUAAWDEL-UHFFFAOYSA-N acrylonitrile butadiene styrene Chemical compound C=CC=C.C=CC#N.C=CC1=CC=CC=C1 XECAHXYUAAWDEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000122 acrylonitrile butadiene styrene Polymers 0.000 description 1
- 239000004676 acrylonitrile butadiene styrene Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000005303 alkyl halide derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- BAQMYDQNMFBZNA-MNXVOIDGSA-N biocytin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCC[C@H](N)C(O)=O)SC[C@@H]21 BAQMYDQNMFBZNA-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 125000002529 biphenylenyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3C12)* 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229910000423 chromium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 125000004976 cyclobutylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004977 cycloheptylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004956 cyclohexylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004978 cyclooctylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004979 cyclopentylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004980 cyclopropylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960000958 deferoxamine Drugs 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- UKWLRLAKGMZXJC-QIECWBMSSA-L disodium;[4-chloro-3-[(3r,5s)-1-chloro-3'-methoxyspiro[adamantane-4,4'-dioxetane]-3'-yl]phenyl] phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].O1OC2([C@@H]3CC4C[C@H]2CC(Cl)(C4)C3)C1(OC)C1=CC(OP([O-])([O-])=O)=CC=C1Cl UKWLRLAKGMZXJC-QIECWBMSSA-L 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 125000004404 heteroalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940116886 human interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001698 laser desorption ionisation Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920003145 methacrylic acid copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940117841 methacrylic acid copolymer Drugs 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000004957 naphthylene group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 125000006574 non-aromatic ring group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005565 oxadiazolylene group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000843 phenylene group Chemical group C1(=C(C=CC=C1)*)* 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- WCYJXDMUQGVQQS-UHFFFAOYSA-N pyridine;ruthenium Chemical compound [Ru].C1=CC=NC=C1 WCYJXDMUQGVQQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005551 pyridylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005576 pyrimidinylene group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229940080237 sodium caseinate Drugs 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 125000005156 substituted alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005649 substituted arylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005717 substituted cycloalkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 125000000383 tetramethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 125000005730 thiophenylene group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000005559 triazolylene group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
- C07K16/1054—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV gag-pol, e.g. p17, p24
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明旨在提供使对于多肽以高效率结合标记变得可能的手段。作为含分子量1100以上的聚乙二醇链的接头使用,通过经所述接头将多肽中的谷氨酰胺残基和标记结合,解决所述的课题。
Description
【技术领域】
本发明涉及标记多肽及其制造方法。本发明涉及修饰多肽及其制造方法。本发明涉及含标记多肽或修饰多肽的试剂。本发明涉及目标物质的测定方法。
【背景技术】
转谷氨酰胺酶(TG)是以多肽中的谷氨酰胺残基作为底物,催化在所述谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链和伯胺的氨基之间形成酰胺键的反应的酶。更具体而言,在TG催化的反应中,处于多肽中的谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链的氨基和伯胺缩合而所述伯胺所具有的取代基转移到谷氨酰胺残基,生成氨。近年知晓,利用TG,使含谷氨酰胺残基的多肽结合如药物或标记一样的功能性物质的技术。
例如,在专利文献1中记载了,使向重链的C末端附加含谷氨酰胺残基的肽标签的抗体和与具有氨基的接头连接的抗癌药在TG的存在下反应而得到结合有抗癌药的抗体。在利用TG的多肽向功能性物质的结合中,一般使用两端具有官能团的二官能性接头。作为二官能性接头的官能团,选择作为TG催化的反应中的胺供体的氨基(-NH2)和用于使功能性物质与接头共价键合的任意的官能团。多肽中的谷氨酰胺残基和功能性物质经这样的接头结合。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】美国专利申请第2018/0037921号说明书
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
本发明人尝试了使用记载在先前文献1的接头,使多肽中的谷氨酰胺残基结合功能性物质,但不必然以充分的效率发生结合。从而,本发明旨在提供使对于多肽以高效率结合标记变得可能的手段。
【用于解决课题的手段】
本发明人发现,通过作为二官能性接头而使用具有巯基(-SH)及氨基的聚乙二醇(PEG)链之中PEG链部分的分子量1100以上的接头,可在多肽中的谷氨酰胺残基有效结合所述接头及标记,从而完成本发明。
本发明提供含具有下式(I)所示的侧链的谷氨酰胺残基的标记多肽。
【化1】
(式中,(C)是谷氨酰胺残基的α碳,X是直链亚烷基,Y是PEG链,Z是标记,L是间隔物或连接键,PEG链的分子量是1100以上。)
本发明提供含具有下式(II)所示的侧链的谷氨酰胺残基的修饰多肽。
【化2】
(式中,(C)是谷氨酰胺残基的α碳,X是直链亚烷基,Y是PEG链,PEG链的分子量是1100以上。)
本发明提供含上述的标记多肽或修饰多肽的试剂。本发明提供目标物质的测定方法,其包括形成上述的标记多肽和目标物质的免疫复合体的工序,检测由免疫复合体中所含的标记发生的信号的工序。
本发明提供修饰多肽的制造方法,其包括:通过在转谷氨酰胺酶的存在下,使含谷氨酰胺残基的多肽和下式(VI)所示的接头接触,在谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链结合接头的工序,取得由羧酰胺侧链和接头的结合生成的修饰多肽的工序,在修饰多肽中上述谷氨酰胺残基的侧链由上式(II)所示。
NH2-X-Y-SH(VI)
(式中,X是直链亚烷基,Y是PEG链,PEG链的分子量是1100以上。)
本发明提供标记多肽的制造方法,包括:通过在转谷氨酰胺酶的存在下,使含谷氨酰胺残基的多肽和上式(IV)所示的接头接触,向谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链结合接头的工序,取得由羧酰胺侧链和接头的结合生成的修饰多肽的工序,通过使修饰多肽和具有马来酰亚胺基的标记接触,在与修饰多肽结合的接头结合标记的工序,取得由修饰多肽和标记的结合生成的标记多肽的工序,在标记多肽中谷氨酰胺残基的侧链由上式(I)所示。
【发明的效果】
由本发明,通过使用具有氨基及巯基的接头,使以高的效率向多肽结合标记变得可能。
【附图的简单的说明】
【图1A】是显示本实施方式的试剂的一例的图。
【图1B】是显示本实施方式的试剂盒的一例的图。
【图2A】是显示SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的由Infusion法的质谱分析(Infusion MS)的结果的图。
【图2B】是显示不同批的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的InfusionMS的结果的图。
【图2C】是显示SH-PEG-NH2接头(2K)(Biopharma PEG Scientific Inc公司)的Infusion MS的结果的图。
【图2D】是显示SH-PEG-NH2接头(2K)(Creative PEGWorks公司)的Infusion MS的结果的图。
【图3】是显示csF001-5Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的由TG的反应后的生成物的尺寸排除柱层析(SEC)分析的结果的图。
【图4】是显示在不同的pH的csF001-5Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的由TG的反应后的生成物的SEC分析的结果的图。
【图5】是显示csF028-22Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的由TG的反应后的生成物的SEC分析的结果的图。
【图6】是显示csF001-5Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头(3.5K)(Sigma-Aldrich公司)的由TG的反应后的生成物的SEC分析的结果的图。
【图7】是显示自csF001-5Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液的由SEC及非还原SDS-PAGE的分析的结果的图。
【图8A】是显示自csF001-5Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液的SEC分析的结果的图。
【图8B】是显示分取的级分的由非还原SDS-PAGE的分析的结果的图。
【图8C】是显示分取的级分的SEC分析的结果的图。
【图9】是显示自csF028-22Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液的SEC分析的结果的图。
【图10A】是显示从自csF028-22Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液分取的级分的SEC分析的结果的图。
【图10B】是显示从自csF028-22Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液分取的级分的由非还原SDS-PAGE的分析的结果的图。
【图11A】是显示sF001-5Fab'和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液的SEC分析的结果的图。
【图11B】是显示从sF001-5Fab'和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液分取的级分的由非还原SDS-PAGE的分析的结果的图。
【图12】是显示从sF001-5Fab'和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液分取的级分的SEC分析的结果的图。
【图13A】是显示由使用Fab-PEG-ALP及(Fab')n-ALP的各自的酶联免疫吸附法(ELISA)测定HIV-1p24之时的信号的值的坐标图。
【图13B】是显示由使用Fab-PEG-ALP及(Fab')n-ALP的各自的ELISA测定HIV-1p24之时的噪声的值的坐标图。
【图13C】是显示由使用Fab-PEG-ALP及(Fab')n-ALP的各自的ELISA测定HIV-1p24之时的信号/噪声(S/N)比的坐标图。
【图14】是显示由使用Fab-PEG-ALP及(Fab')n-ALP的各自的ELISA测定人血清之时的背景的坐标图。
【图15】是显示HBs628Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的由TG的反应后的生成物的SEC分析的结果的图。
【图16A】是显示自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰生物素的偶联反应液的SEC分析的结果的图。
【图16B】是显示从自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰生物素的偶联反应液分取的级分的由非还原SDS-PAGE的分析的结果的图。
【图16C】是显示从自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰生物素的偶联反应液分取的级分的SEC分析的结果的图。
【图17A】是显示HBs628Fab-Q标签的非还原样品的液相层析质谱分析(LC-MS)的结果的图。
【图17B】是显示HBs628Fab-Q标签的还原的样品的LC-MS的结果的图。
【图18】是显示HBs628Fab-Q标签和其SH-PEG-Fab及生物素-PEG-Fab的非还原样品的LC-MS的结果的图。
【图19】是显示HBs628Fab-Q标签及其SH-PEG-Fab的还原的样品的LC-MS的结果的图。
【图20】是显示自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液的SEC分析的结果的图。
【图21】是显示将自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液和各原料由非还原SDS-PAGE分析的结果的图。
【图22】是显示csF001-25Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的由TG的反应后的生成物的SEC分析的结果的图。
【图23A】是显示自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和Alexa488-马来酰亚胺的偶联反应液的SEC分析的结果的图。
【图23B】是显示确认脱盐及纯化自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和Alexa488-马来酰亚胺的偶联反应液的级分的SEC中的UV及荧光吸收的结果的图。
【图24A】是显示csF001-25Fab-Q标签和其SH-PEG-Fab及Alexa488-PEG-Fab的还原的样品的LC-MS的结果的图。
【图24B】是图24A中所示的分析结果的放大图。
【图25】是显示抗CD20 Fab-Q标签和别批的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的由TG的反应后的生成物的SEC分析的结果的图。
【图26A】是显示对R-藻红蛋白(R-PE)和EMCS试剂的反应液进行SEC分析的结果的图。
【图26B】是显示对R-PE和EMCS试剂的反应液进行逆相HPLC分析的结果的图。
【图27】是显示自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰R-PE的偶联反应液的SEC分析的结果的图。左侧小图是利用UV(280nm)的层析谱。右侧小图是对于偶联反应液的利用UV(280nm)及荧光(激发波长565nm/荧光波长574nm)的层析谱。
【图28】是显示从自sF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液分取的级分的SEC分析的结果的图。左侧小图是利用UV(280nm)的层析谱。右侧小图是利用荧光(激发波长565nm/荧光波长574nm)的层析谱。
【图29】是显示自抗CD20 Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰R-PE的偶联反应液的SEC分析的结果的图。左侧小图是利用UV(280nm)的层析谱。右侧小图是对于偶联反应液的利用UV(280nm)及荧光(激发波长565nm/荧光波长574nm)的层析谱。
【图30】是显示从自抗CD20 Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液分取的级分的SEC分析的结果的图。左侧小图是利用UV(280nm)的层析谱。右侧小图是利用荧光(激发波长565nm/荧光波长574nm)的层析谱。
【图31A】是显示将csF001-25Fab-Q标签和抗原的相互作用由Biacore(商标)T200(Cytiva公司)测定的结果的图。
【图31B】是显示将自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和抗原的相互作用由Biacore(商标)T200测定的结果的图。
【图31C】是显示将csF001-25Fab-Q标签和抗原的相互作用由Biacore(商标)T200测定的结果的图。与图31A在测定日上不同。
【图31D】是显示将自csF001-25Fab-Q标签的Alexa488-PEG-Fab和抗原的相互作用由Biacore(商标)T200测定的结果的图。
【图32A】是显示使用自csF001-25Fab-Q标签的Fab-PEG-R-PE、(Fab-PEG)2-R-PE及(Fab-PEG)3-R-PE的各自进行由ELISA的测定(抗原的添加无)的结果的图。
【图32B】是显示使用自csF001-25Fab-Q标签的Fab-PEG-R-PE、(Fab-PEG)2-R-PE及(Fab-PEG)3-R-PE的各自进行由ELISA的测定(有抗原的添加)的结果的图。
【图33】是显示由使用自抗CD20 Fab-Q标签的Fab-PEG-R-PE、(Fab-PEG)2-R-PE及(Fab-PEG)3-R-PE的各自的FCM法测定表达CD20的细胞的结果的图。
【图34A】是显示SH-PEG-NH2接头(3.5K)(Sigma-Aldrich公司)的Infusion MS的结果的图。
【图34B】是显示SH-PEG-NH2接头(5K)(Sigma-Aldrich公司)的Infusion MS的结果的图。
【图35A】是显示csF001-25Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头(3.5K)(Sigma-Aldrich公司)的由TG的反应后的生成物的SEC分析的结果的图。
【图35B】是显示csF001-25Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头(5K)(Sigma-Aldrich公司)的由TG的反应后的生成物的SEC分析的结果的图。
【图35C】是显示csF001-25Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头(3.5K)(Sigma-Aldrich公司)及SH-PEG-NH2接头(5K)(Sigma-Aldrich公司)的各自的由TG的反应后的生成物的由非还原SDS-PAGE的分析的结果的图。
【图36A】是显示自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(3.5K)-Fab和Alexa488-马来酰亚胺的偶联反应液的SEC分析的结果的图。
【图36B】是显示确认脱盐及纯化自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(3.5K)-Fab和Alexa488-马来酰亚胺的偶联反应液的级分的SEC中的UV及荧光吸收的结果的图。
【图37A】是显示自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(5K)-Fab和Alexa488-马来酰亚胺的偶联反应液的SEC分析的结果的图。
【图37B】是显示确认脱盐及纯化自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(5K)-Fab和Alexa488-马来酰亚胺的偶联反应液的级分的SEC中的UV及荧光吸收的结果的图。
【图38】是显示csF001-5Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头(400Da)(Nanocs Inc.公司)的由TG的反应后的生成物的SEC分析的结果的图。
【图39】是显示自csF001-5Fab-Q标签的SH-PEG(400Da)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液的SEC分析的结果的图。
【图40】是显示csF001-5Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头(1K)(Creative PEGWorks公司)的由TG的反应后的生成物的SEC分析的结果的图。
【图41】是显示自csF001-5Fab-Q标签的SH-PEG(1K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液的SEC分析的结果的图。
【具体实施方式】
本实施方式的标记多肽含具有上式(I)所示的侧链的谷氨酰胺残基。在所述标记多肽中,附加标记之前的多肽中的谷氨酰胺残基和标记经具有PEG链的二官能性接头结合。具体而言,所述标记多肽可通过利用TG催化的反应,使多肽的谷氨酰胺残基结合作为二官能性接头具有巯基及氨基的PEG链之后,使所述接头的巯基和具有马来酰亚胺基的标记反应得到(详细内容参照后述的标记多肽的制造方法的说明)。
在式(I)中,(C)是标记多肽中的谷氨酰胺残基的α碳。式(I)所示的侧链具有向所述谷氨酰胺残基的侧链结合接头及标记的结构。本实施方式的标记多肽是可成为附加标记之前的多肽中的TG的底物的谷氨酰胺残基变为具有上式(I)所示的侧链的谷氨酰胺残基的多肽。即,标记多肽的氨基酸序列含具有上式(I)所示的侧链的谷氨酰胺残基以外与附加标记之前的多肽相同。在标记多肽中,多肽的种类不特别限定。例如,标记多肽可为抗体、抗原、配体、受体等的任意的蛋白质。在它们之中,也优选抗体。
在本说明书中“抗体”这样的用语还包含抗体片段。作为抗体片段,可举出例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd'、Fv、scFv、结构域抗体(dAb)、还原型IgG(rIgG)、轻链、重链抗体、重链抗体的可变区域(VHH)、双抗体、三链抗体等。抗体也可为单克隆抗体及多克隆抗体之任一者。抗体的来源不特别限定,可为来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、马、骆驼、羊驼、鸡、鸵鸟、鲨等的动物的抗体。抗体的同种型可为IgG、IgM、IgE、IgA等之任一者,优选为IgG。与标签特异性地结合的抗体可为市售的抗体,也可为由现有技术领域中公知的方法制作的抗体。
在附加标记之前的多肽中,可成为TG的底物的谷氨酰胺残基可为例如,存在于所述多肽的表面,羧酰胺侧链向多肽的外侧的谷氨酰胺残基。或者,也可向附加标记之前的多肽附加含谷氨酰胺残基的肽标签(以下,也称为“Q标签”)。Q标签通过在指定的氨基酸序列中含谷氨酰胺残基,所述谷氨酰胺残基可成为TG的底物。一般而言,多肽中的全部谷氨酰胺残基未必会成为TG的底物,所以优选附加Q标签。Q标签本身是公知的,例如在专利文献1中也记载。Q标签中所含的氨基酸残基数优选为3以上、更优选为4以上。另外,Q标签中所含的氨基酸残基数优选为20以下,更优选为15以下,最优选为10以下。Q标签的氨基酸序列之中,1个或2个是谷氨酰胺残基。从保护Q标签免于被肽酶切断的观点来看,Q标签的C末端的氨基酸残基优选为脯氨酸残基。作为Q标签,可举出例如,GVLNLAQSP(SEQ ID NO:1)、GLLQGP(SEQID NO:2)、LLQGP(SEQ ID NO:3)等的氨基酸序列的肽标签。
在附加标记之前的多肽中,附加Q标签的位置不特别限定,优选为多肽的N末端或C末端、更优选为多肽的C末端。多肽是例如全长抗体、Fab、Fab'或F(ab')2之时,Q标签可附加在重链或轻链的C末端。向多肽附加Q标签的方法不特别限定。例如,也可使用交联剂或接头使Q标签与多肽共价键合。或者,也可由公知的基因重组法制作多肽和Q标签的融合多肽。
优选为标记多肽是多肽和含具有上式(I)所示的侧链的谷氨酰胺残基的肽标签的融合多肽。即,标记多肽是附加Q标签的多肽,可为可成为所述Q标签中的TG的底物的谷氨酰胺残基变为具有上式(I)所示的侧链的谷氨酰胺残基的多肽。更优选为标记多肽是抗体和含具有上式(I)所示的侧链的谷氨酰胺残基的肽标签的融合多肽。
在上式(I)中,“(C)-(CH2)2-(C=O)-”来源于多肽中的谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链,“-NH-X-Y-S-”来源于具有作为二官能性接头的巯基及氨基的PEG链。其中,X是直链亚烷基,直链亚烷基的碳原子数优选为2以上10以下,更优选为2以上8以下,最优选为2以上6以下。关于X,直链亚烷基优选不具有取代基。更优选为X是碳原子数2以上6以下的非取代的直链亚烷基。
在上式(I)中,Y是分子量是1100以上的PEG链。由于PEG是聚合物,在标记多肽的调制中使用的,具有巯基及氨基的PEG可为分子量范围广的多个分子的集合体。从而,在由这样的PEG调制的标记多肽的分子量中有宽度。在本说明书中,“PEG链的分子量是1100以上”是指标记多肽中的PEG链部分的分子量的最小值是1100。关于Y,PEG链的分子量的下限优选为1200、1300、1400或1500。另外,关于Y,PEG链的分子量的上限是例如20000、10000、7500、7000、6500、6000或5500。PEG链的分子量例如,可通过在与多肽结合之前的阶段,将具有作为二官能性接头的巯基及氨基的PEG链用质谱分析法分析研究。作为质谱分析法,可举出例如Infusion MS、LC-MS、飞行时间型质谱分析(TOF-MS)、基质支援激光脱离离子化质谱分析(MALDI-MS)等。质谱分析的条件可适宜确定。例如,在由Infusion MS分析时,条件的详细如后述的实施例。
由质谱分析测定的PEG链的分子量的分析结果之中,将含的最多的分子量称为“最频分子量”(Most Abundant Molecular Weight)。关于Y,PEG链的最频分子量的下限是例如1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000或2050。关于Y,PEG链的最频分子量的上限是例如18000、15000、12000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3500或3000。另外,可基于质谱分析的结果而算出PEG链的重量平均分子量。例如,在与多肽结合之前的阶段,将具有作为二官能性接头的巯基及氨基的PEG链由Infusion MS分析时,可从强度最高的同位素分子峰的分子量值及强度算出PEG链的重量平均分子量。由Infusion MS的分析的条件的详细如后述的实施例。关于Y,PEG链的重量平均分子量优选为1300以上,更优选为1700以上。关于Y,PEG链的重量平均分子量的下限是例如1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000或2050。关于Y,PEG链的重量平均分子量的上限优选比20000低,例如为15000、12000、10000、8000、7000、6000、5000、4500、4000、3500、3000或2500。
Y的结构由下式(III)所示。式(III)中,n是25以上的整数,优选为39以上的整数。
-(OCH2CH2)n-或-(CH2CH2O)n-(III)
在上式(III)中,n的下限优选为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41。更优选为n的下限是31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。另外,n的上限是例如455、228、171、159、147、136、125、113、102、90、79、68或56。
在上式(I)所示的侧链中,下式(IV)所示的结构的部分来源于具有马来酰亚胺基的标记。Z是标记,L是将酰亚胺环的氮原子和Z结合的间隔物、或者连接键。关于L,连接键是指酰亚胺环的氮原子和Z间不经其他原子而直接键合。
【化3】
标记是可附加在多肽的物质,与“标记物质”同义。标记可为能进行特异性的检测的物质,或者,其本身发生信号的物质(以下,也称为“信号发生物质”)、或催化其他物质的反应而发生信号的物质。能特异性的检测的物质只要是存在可与所述物质特异性地结合的物质或得到,就不特别限定。作为能特异性的检测的物质,可举出例如生物素类、半抗原、寡核苷酸等。生物素类与亲和素类特异性地结合。作为半抗原,可举出例如2,4-二硝基苯基(DNP)基团。DNP与抗DNP抗体特异性地结合。寡核苷酸与具有与其碱基序列互补的序列的寡核苷酸特异性地结合。
在本说明书中“生物素类”包含生物素和其类似物。作为生物素的类似物,可举出例如脱硫生物素、生物胞素等。在本说明书中“亲和素类”包含亲和素和其类似物。作为亲和素的类似物,可举出例如链霉亲和素、来源于榆木茸的亲和素样蛋白质(Tamavidin(注册商标))、慢生根瘤亲和素(Bradavidin)、根瘤亲和素(Rhizavidin)等。
作为信号发生物质,可举出例如荧光物质、放射性同位素、化学发光物质等。作为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质,可举出例如酶。酶通过与适合的底物反应,发生光、色等的信号。作为酶,可举出例如碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。作为荧光物质,可举出例如Alexa Fluor(注册商标)、异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明等的荧光染料、GFP等的荧光蛋白质等。作为放射性同位素,可举出例如125I、14C、32P、99mTc、225Ac等。作为化学发光物质,可举出钌吡啶络合物、吖啶鎓酯等。由于难以以放射性同位素本身作为标记结合,也可以含放射性同位素并且具有马来酰亚胺基的化合物作为标记使用。例如,可举出含125I、14C或32P并且附加马来酰亚胺基的核酸、糖类及寡肽等。另外,也可使用向能配位99mTc、225Ac等的金属元素的鳌合剂附加马来酰亚胺基的马来酰亚胺衍生物。通过使99mTc、225Ac等配位于鳌合剂的部分,可以所述马来酰亚胺衍生物作为信号发生物质利用。作为鳌合剂,可举出例如去铁胺。
优选的标记是生物素类、酶、荧光染料、荧光蛋白质及半抗原。作为酶,特别优选ALP。
在上式(I)中,L是将酰亚胺环的氮原子和Z结合的间隔物之时,L由例如-(CH2)n-R-(C=O)-NH-、-(CH2)n-R-NH-(C=O)-、-(CH2)n-R-(C=O)-、-(CH2)n-R-(C=O)-O-、-(CH2)n-R-O-(C=O)-、-(CH2)n-R-(C=S)-NH-、-(CH2)n-R-NH-(C=S)-、-(CH2)n-R-O-、-(CH2)n-O-R-、-(CH2)n-R-S-或-(CH2)n-S-R-所示。n是1以上10以下的整数。
R各自独立地为连接键、任选具有取代基的碳原子数1以上10以下的亚烷基、任选具有取代基的碳原子数6以上12以下的亚芳基或杂亚芳基、任选具有取代基的碳原子数3以上8以下的亚环烷基或杂亚环烷基、或者它们的组合。关于R,连接键是指其间不经其他原子而直接键合。
R是碳原子数1以上10以下的亚烷基之时,作为这样的亚烷基,可举出例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基、亚丁基、异亚丁基、亚戊基、新亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、2-乙基亚己基、亚壬基及亚癸基等的基团。在它们之中,也优选碳原子数1以上4以下的亚烷基。R是具有取代基的亚烷基之时,在上述的碳原子数中,不含取代基的碳原子数。
R是亚芳基或杂亚芳基之时,这样的基团只要是也可含选自N、S、O及P的1个以上的杂原子的碳原子数6以上12以下的芳香环即可。例如,可举出亚苯基、亚萘基、亚联苯基、亚呋喃基、亚吡咯基、亚苯硫基、亚三唑基、亚噁二唑基、亚吡啶基、亚嘧啶基等的基团。R是具有取代基的亚芳基或杂亚芳基之时,在上述的碳原子数中,不含取代基的碳原子数。
R是亚环烷基或杂亚环烷基之时,这样的基团只要是也可含选自N、S、O及P的1个以上的杂原子的碳原子数3以上8以下的非芳香环即可。例如,可举出亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环庚基、亚环辛基、亚吡咯烷基、亚哌啶基、亚哌嗪基、亚吗啉基等的基团。R是具有取代基的亚环烷基或杂亚环烷基之时,在上述的碳原子数中,不含取代基的碳原子数。
作为R中的取代基,可举出例如羟基、氰基、烷氧基、硝基、=O、=S、卤素、卤代烷基、杂烷基、羧基烷基、胺、酰胺、硫醚等的基团。R也可有多个取代基。烷氧基表示-O-烷基,此烷基是碳原子数1以上5以下,优选为碳原子数1或2的直链状或支链状的饱和脂肪族烃基。
在1分子的标记多肽中,具有上式(I)所示的侧链的谷氨酰胺残基可为1个,也可为多个。另外,也可多个分子的多肽共有1分子的标记,各多肽形成上式(I)所示的侧链。此时,式(I)的标记多肽,相对于1个Z,“(C)-(CH2)2-(C=O)-NH-X-Y-S-”和上式(IV)含多个连接的结构。作为一例,可举出下式(V)所示的标记多肽。在式(V)中,(C)、X、Y、Z及L的定义与式(I)相同。
【化4】
式(V)所示的复合体向具有2个马来酰亚胺基的1分子的标记结合2分子后述的修饰多肽而形成。式(V)所示的复合体是式(I)所示的标记多肽的一例。标记多肽也可为例如,向具有3个以上的马来酰亚胺基的1分子的标记结合3分子以上的修饰多肽而形成的复合体。这样的复合体通过具有多个马来酰亚胺基的1分子的标记和多个分子的多肽经具有巯基及氨基的PEG链结合来制作。
在本实施方式的标记多肽中,多肽和标记被分子量1100以上的PEG链所隔。由此,在例如多肽是抗体时,有防标记与抗体非特异性地结合的益处。另外,由于分子量1100以上的PEG链是柔性的结构,在多肽是抗体时,通过所述抗体摇动,有变得容易捕获作为目标物质的抗原的益处。另外,如后述的实验例8及其结果所示,使用多肽是抗体的本实施方式的标记多肽,检测血清中的抗原之时,有抑制背景的益处。这被认为是因为,由于在含水的试样中,分子量1100以上的PEG链水和,来源于血清的混杂物与标记多肽非特异性结合被抑制。
本实施方式的修饰多肽含具有上式(II)所示的侧链的谷氨酰胺残基。在所述修饰多肽中,结合有多肽的谷氨酰胺残基和具有巯基的PEG链。具体而言,修饰多肽可利用TG催化的反应,通过使多肽的谷氨酰胺残基结合作为二官能性接头具有巯基及氨基的PEG链得到(细节参照后述的修饰多肽的制造方法的说明)。
当使修饰多肽和具有马来酰亚胺基的标记接触时,修饰多肽的巯基和标记的马来酰亚胺基反应而生成标记多肽。即,修饰多肽是用于得到作为最终生成物的本实施方式的标记多肽的中间体。
在式(II)中,(C)是修饰多肽中的谷氨酰胺残基的α碳。式(II)所示的侧链具有向所述谷氨酰胺残基的侧链结合具有具有巯基及氨基的PEG链的结构的二官能性接头的结构。本实施方式的修饰多肽是可成为结合所述接头之前的多肽中的TG的底物的谷氨酰胺残基变为具有上式(II)所示的侧链的谷氨酰胺残基的多肽。即,修饰多肽的氨基酸序列含具有上式(II)所示的侧链的谷氨酰胺残基以外与结合接头之前的多肽相同。在修饰多肽中,多肽的种类不特别限定,与对标记多肽所述的相同。即,修饰多肽可为抗体、抗原、配体、受体等的任意的蛋白质。在它们之中,也优选抗体。
式(II)中的X及Y的详细与对标记多肽所述的相同。在1分子的修饰多肽中,具有上式(II)所示的侧链的谷氨酰胺残基可为1个,也可为多个。
如上所述,一般而言,巯基容易被氧化,在具有巯基的分子间形成容易地二硫键。因此,在在标记多肽调制时,通过向修饰多肽的巯基附加如乙酰基一样的保护基,可抑制二硫键的形成。一方面,在修饰多肽中,抑々末端的巯基难以受氧化,有几乎无在修饰多肽间形成二硫键的益处。这被认为是因为,由修饰多肽中的分子量1100以上的PEG链的水和提升修饰多肽的分散性而难发生巯基彼此的接触。由上述的益处,在修饰多肽中,预先保护其巯基不是必然必要的。即,当使用所述修饰多肽时,变得无需巯基保护及保护基的除去等的操作,能使标记多肽的调制作业简便化。
本发明的进一步的的实施方式涉及修饰多肽的制造方法。在此制造方法中,首先,通过在TG的存在下,使含谷氨酰胺残基的多肽和上式(VI)所示的接头接触,在所述谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链结合上述的接头。
TG本身是公知的酶,市售。TG可为从生物体或生物体试样提取及纯化的天然的酶,也可为由基因重组法得到的酶。另外,TG的来源不特别限定,也可使用来源于任何生物的TG。优选为,使用来源于微生物(例如茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis))的TG。
多肽只要是含可成为TG的底物的谷氨酰胺残基,就不特别限定。例如,多肽可选自抗体、抗原、配体、受体等的任意的蛋白质。在它们之中,也优选抗体。含可成为TG的底物的谷氨酰胺残基的多肽也可为附加上述的Q标签的多肽。优选的多肽是抗体和Q标签的融合多肽。
上式(VI)所示的接头是具有具有巯基及氨基的PEG链这样的构成的二官能性接头。关于式(VI)中的X及Y的细节,关于本实施方式的标记多肽,与对式(I)中的X及Y所述的相同。式(VI)所示的接头本身是公知的,市售。PEG链的分子量可由质谱分析研究。质谱分析及其条件的详细如上所述。在使用市售的接头时,PEG链的分子量也可为厂商或供给业者公开的值。此时,公开的接头的分子量优选为2000以上。
上式(VI)所示的接头由分子量1100以上的PEG链的水和提升分散性,被认为难以发生巯基彼此的接触。因此,所述接头末端的巯基难以受氧化,几乎无在修饰多肽间形成二硫键。从而,在将上述的多肽和式(VI)所示的接头结合的工序中,没必要预先保护所述接头的巯基。另外,由于几乎无由二硫键的形成的巯基的损失,可定量并且有效率地进行修饰多肽和具有马来酰亚胺基的标记的反应。
上式(VI)所示的接头可为游离体,也可为与无机酸(例如盐酸)的盐。优选为上式(VI)所示的接头是与无机酸(例如盐酸)的盐。如上所述,由于所述接头具有分子量1100以上的PEG链,即使是游离体,难发生接头间的二硫键。在接头是与无机酸的盐时,不仅是PEG链的水和,由静电相互作用也可提升接头的分散性。
在TG的存在下的含谷氨酰胺残基的多肽和上式(VI)所示的接头的接触优选在适合的水性介质中进行。例如,通过将TG的溶液、多肽的溶液和接头的溶液混合,可使这些接触。混合的顺序不特别限定。作为水性介质,可举出例如水、生理盐水、缓冲液等。作为缓冲液,可举出例如磷酸缓冲生理盐水(PBS)、Tris-HCl、Good缓冲液等。在使用来源于微生物的TG时,水性介质的pH优选中性附近(pH6.5以上8.5以下),更优选pH8以上8.5以下。也可使二甲基亚砜(DMSO)含于水性溶剂。含TG的水性溶剂中的DMSO浓度优选为20w/v%以下,更优选为10w/v%以下。
在上述的接触中,优选使含由上述的混合得到的TG、多肽及接头的溶液在进行TG催化的反应的条件下温育。这样的条件本身是公知的。例如,温度是4℃以上37℃以下,优选为20℃以上37℃以下。温育时间,可对应于温度而适宜确定,例如是1小时以上24小时以下。在10℃以下的低的温度进行接触时,优选使时间变长(例如8小时以上)。在上述的接触中,由TG的作用,多肽中的谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链的氨基与接头中的氨基交换而形成酰胺键,接头与所述侧链结合。由此,生成本实施方式的修饰多肽。
接下来,取得由羧酰胺侧链和接头的结合生成的修饰多肽。例如,也可通过将含酶反应后的TG、多肽及接头的溶液由使用适合的柱的SEC或亲和性层析纯化,除去酶及未反应成分而取得修饰多肽。未反应成分是例如,不与接头结合的多肽、及不与多肽结合的接头。根据需要,也可对含取得的修饰多肽的溶液进行脱盐及浓缩。
本发明的进一步的的实施方式涉及标记多肽的制造方法。在此制造方法中,首先,通过在TG的存在下,使含谷氨酰胺残基的多肽和上式(VI)所示的接头接触,在所述谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链结合上述的接头。接下来,取得由羧酰胺侧链和接头的结合生成的修饰多肽。这些工序的详细与对修饰多肽的制造方法所述的相同。另外,标记的详细与对标记多肽所述的相同。
通过使取得的修饰多肽和具有马来酰亚胺基的标记接触,在与所述修饰多肽结合的接头结合标记。由于修饰多肽具有上式(II)所示的侧链,所述侧链的巯基和标记所具有的马来酰亚胺基反应。由此,形成了硫醚键而向与修饰多肽结合的接头的末端结合标记。
具有马来酰亚胺基的标记优选具有下式(VII)所示的结构。在式(VII)中,Z是标记,L是间隔物或连接键,R1及R2相同或互相不同,是氢原子或溴原子。优选为R1及R2均是氢原子,或者均为溴原子。L及Z的细节,关于本实施方式的标记多肽,与对式(I)所述的相同。在R1和/或R2是溴原子时,具有下式(VII)所示的结构的标记是具有作为马来酰亚胺的衍生物的3,4-二溴马来酰亚胺基或者3-溴马来酰亚胺基的标记。在本说明书中,“马来酰亚胺基”这样的用语还包含3,4-二溴马来酰亚胺基及3-溴马来酰亚胺基。
【化5】
具有上式(VII)所示的结构的标记可通过将标记和具有马来酰亚胺基及指定的反应基的二官能性接头结合来制作。这样的二官能性接头本身是公知的,市售。指定的反应基可对应于具有标记的官能团而适宜确定。例如,在标记具有氨基时,可使用具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯及马来酰亚胺基的二官能性接头。此时,标记的氨基和二官能性接头的NHS酯反应而所述接头与标记结合而得到了具有式(VII)所示的结构的标记。或者,具有式(VII)所示的结构的标记也可为市售的标记。
作为马来酰亚胺基,具有3,4-二溴马来酰亚胺基的标记可例如,根据下述的反应方案而制作(Morais M.等,Bioconjugatin,Methods and Protocols(Methods Mol Biol,2019,2033SpringerLink),Chapter 2,pp.15-24参照)。在下述的反应方案中,作为具有马来酰亚胺基的标记,得到了具有式(VIII)所示的结构的标记。下述的反应方案及式(VIII)中,AcOH表示醋酸,DBM-C2-酸表示中间体,EEDQ表示缩合剂的1-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉,MeCN表示乙腈,Z是标记。
【化6】
1个3,4-二溴马来酰亚胺基可与2个巯基的各自反应而形成硫醚键。从而,通过使用具有3,4-二溴马来酰亚胺基的标记,例如,可对于1分子的标记结合2分子的修饰多肽。即,经3,4-二溴马来酰亚胺基修饰多肽被二聚体化,从而得到了二分子的标记多肽的复合体。例如,在将二分子的修饰多肽和具有1分子的式(VIII)所示的结构的标记结合时,得到了下式(IX)所示的标记多肽的复合体。在式(IX)中,(C)、X、Y、Z及L的定义与式(I)相同。
【化7】
修饰多肽和具有马来酰亚胺基的标记的接触优选在适合的水性介质中进行。例如,通过将修饰多肽的溶液和具有马来酰亚胺基的标记的溶液混合,可使这些接触。作为水性介质,优选缓冲液,可举出例如三乙醇胺缓冲液、PBS、Tris-HCl、Good缓冲液等。水性介质的pH优选pH6.5以上7.5以下。
在上述的接触中,优选使含由上述的混合得到的修饰多肽及标记的溶液在进行巯基和马来酰亚胺基的反应的条件下温育。这样的条件本身是公知的。例如,温度是5℃以上37℃以下,优选为20℃以上30℃以下。温育时间可对应于温度而适宜确定,例如是2小时以上6小时以下。在10℃以下的低的温度进行接触时,优选使时间变长(例如16小时以上)。由上述的接触,修饰多肽的巯基和标记的马来酰亚胺基形成硫醚键而生成标记多肽。
进而,取得由修饰多肽和标记的结合生成的标记多肽。例如,也可通过将含反应后的修饰多肽及标记的溶液由使用适合的柱的SEC纯化,除去未反应成分而取得标记多肽。未反应成分是例如,不与修饰多肽结合的标记、及,不与标记结合的修饰多肽。根据需要,也可将含取得的标记多肽的溶液脱盐及浓缩。
在进一步的的实施方式中,也可代替具有马来酰亚胺基的标记而使用具有卤代乙酰基的标记,在修饰多肽结合标记(参照Greg T.Hermanson,Bioconjugate TechniquesThird Edition,Academic Press,Chapter 3The reaction of Bioconjugation,pp.240-241,2.Thiol reactions,2.1Haloacetyland alkyl halide derivatives)。例如,如下述的反应方案所示,在将修饰多肽和具有式(X)所示的卤代乙酰基的标记(式中,R3是溴原子或碘原子)结合时,得到了下式(XI)所示的标记多肽。在下述的反应方案中,(C)、X、Y、Z及L的定义与式(I)相同。
【化8】
本发明的进一步的的实施方式涉及含标记多肽或修饰多肽的试剂(以下,也称为“本实施方式的试剂”)。在多肽是抗体时,含标记多肽的本实施方式的试剂在后述的本实施方式的测定方法中使用。含修饰多肽的本实施方式的试剂与具有马来酰亚胺基的任意的标记结合而在得到标记多肽的反应中使用。标记多肽及修饰多肽的详细如上所述。
本实施方式的试剂也可将标记多肽或修饰多肽收容在容器中提供于使用者。本实施方式的试剂的一例示于图1A。参照图1A,10表示收容在容器的本实施方式的试剂。试剂中的标记多肽或修饰多肽可为固体(例如粉末、结晶、冷冻干燥品等),也可为液体(例如溶液、悬浮液、乳浊液等)。在将标记多肽或修饰多肽以液体的形态含在试剂中时,作为溶剂,可举出例如上述的水性介质。根据需要,也可向水性介质添加酪蛋白、BSA等的稳定化剂。
本发明的进一步的的实施方式涉及具备含标记多肽或修饰多肽的试剂的试剂盒(以下,也称为“本实施方式的试剂盒”)。在多肽是抗体时,具备含标记多肽的试剂的本实施方式的试剂盒在后述的本实施方式的测定方法中使用。具备含修饰多肽的试剂的本实施方式的试剂与具有马来酰亚胺基的任意的标记结合而在得到标记多肽的反应中使用。标记多肽及修饰多肽的详细如上所述。
本实施方式的试剂盒也可例如,将收容含标记多肽或修饰多肽的试剂的容器捆包到箱中而提供于使用者。在箱中,也可同装附带文书。在附带文书中,也可记载了试剂的组成、标记多肽或修饰多肽的结构、试剂的使用方法、试剂的储存方法等。本实施方式的试剂盒的一例示于图1B。参照图1B,11表示本实施方式的试剂盒,12表示收容含标记多肽或修饰多肽的试剂的容器,13表示捆包箱,14表示附带文书。
本发明的进一步的的实施方式涉及使用本实施方式的标记多肽的目标物质的测定方法(以下,也称为“本实施方式的测定方法”)。在本实施方式的测定方法中使用的标记多肽是抗体和含具有上式(I)所示的侧链的谷氨酰胺残基的肽标签的融合多肽(以下,也称为“本实施方式的标记抗体”)。本实施方式的标记抗体是具有标记,并且与目标物质特异性地结合的抗体,在本实施方式的测定方法中作为检测用抗体使用。检测用抗体是指与目标物质结合而经标记提供能检测的信号的抗体。标记优选催化信号发生物质或其他物质的反应而发生能检测的信号的物质。更优选为标记是酶、荧光染料或荧光蛋白质。本实施方式的标记多肽的详细如上所述。
在本实施方式的测定方法中,首先,形成标记抗体和目标物质的免疫复合体。目标物质可为由标记抗体识别的物质,也可为含这样的物质的有形成分。作为由标记抗体识别的物质,可举出例如蛋白质、寡肽、核酸、脂质、糖链、半抗原等。作为含由标记抗体识别的物质的有形成分,可举出例如细胞、细胞外囊泡、微生物、病毒及它们的片段等。作为细胞外囊泡,可举出例如外泌体、核外颗粒体、微囊泡、微粒子、凋亡小体等。作为微生物,可举出细菌、真菌等。
免疫复合体可通过将可含目标物质的试样和标记抗体混合来形成。试样的种类不特别限定,可举出例如,血液、血浆、血清、淋巴液、唾液等的生物体试样、尿、粪便等的排泄物、河川水、海水、土壤等的环境试样等。免疫复合体的形成优选在溶液中进行。从而,可含目标物质的试样优选为液态。液态的试样不限于溶液,含悬浮液、溶胶等。当试样不是液态时,例如,也可向试样添加适合的水性介质而成液态。在液态的试样中含不溶性的混杂物时,也可由例如离心分离、过滤等的公知的手段从该试样除去混杂物。根据需要,也可将液态的试样用上述的水性介质稀释。标记抗体也优选为由适合的水性介质的液体的形态。对于水性介质,如上所述。
免疫复合体的形成优选为在固相上形成标记抗体和目标物质的免疫复合体。例如,将可含目标物质的试样和标记抗体混合而形成免疫复合体之后,使含所述免疫复合体的溶液与可固定标记抗体或目标物质的固相接触。由此,可在固相上形成免疫复合体。或者,也可通过将目标物质预先固定于固相,使所述固相和标记抗体接触来在固相上形成免疫复合体。
混合中的温度及温育时间的条件只要是适宜于抗原抗体反应的条件,就不特别限定。这样的条件本身是公知的。例如,温度是4℃以上40℃以下,优选为20℃以上37℃以下。温育时间可对应于温度而适宜确定,例如是1分钟以上24小时以下。在10℃以下的低的温度进行接触时,优选使时间变长(例如1小时以上)。
在本实施方式的测定方法中,除了标记抗体之外,也可使用与目标物质特异性地结合的捕获用抗体。捕获用抗体是指通过自身固定于固相而在固相上捕获目标物质的抗体。捕获用抗体优选与标记抗体识别的表位不同。在目标物质有多个相同的表位时,捕获用抗体及标记抗体识别的表位也可为相同的。在进一步使用捕获用抗体时,形成了标记抗体、目标物质和捕获用抗体的夹心免疫复合体。夹心免疫复合体是指含捕获用抗体、目标物质和标记抗体的复合体,捕获用抗体和标记抗体处于与目标物质上的互相不同的部位结合的状态的复合体。
夹心免疫复合体可通过将捕获用抗体、可含目标物质的试样和标记抗体混合来形成。在优选的实施方式中,在固相上形成捕获用抗体、目标物质和标记抗体的夹心免疫复合体。例如,将可含目标物质的试样、捕获用抗体和标记抗体混合而形成夹心免疫复合体之后,使含所述免疫复合体的溶液与可固定捕获用抗体的固相接触。由此,可在固相上形成夹心免疫复合体。或者,也可使用预先固定于固相的捕获用抗体。即,通过将固定于固相的捕获用抗体、可含目标物质的试样和标记抗体混合,可在固相上形成夹心免疫复合体。混合中的温度及温育时间的条件如上所述。
固相只要是能固定目标物质或捕获用抗体的不溶性载体即可。优选为,固相是能固定捕获用抗体的不溶性载体。例如,通过固相和捕获用抗体直接或间接结合,可将捕获用抗体固定化于固相。作为固相和捕获用抗体的直接键,可举出例如,由疏水相互作用向固相表面的吸附或共价键合。例如,在固相是ELISA用微平板时,可由吸附将捕获用抗体固定化于板的孔内。另外,在固相在表面具有官能团时,可由利用官能团的共价键,将捕获用抗体固定化于固相表面。例如,在固相是具有羧基的粒子时,将粒子表面的羧基用1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二酰亚胺(WSC)活化,接下来,与NHS反应而形成NHS酯。进而,当使具有NHS酯的粒子和捕获用抗体接触时,NHS酯和捕获用抗体的氨基反应而捕获用抗体在粒子表面经共价键固定化。
作为固相和捕获用抗体的间接结合,可举出经与捕获用抗体特异性地结合的分子的结合。通过将这样的分子预先固定化于固相表面,可将捕获用抗体固定化于固相。作为与捕获用抗体特异性地结合的分子,可举出例如特异性地识别蛋白A、蛋白G、捕获用抗体的抗体(第二抗体)等。另外,也可使用介于捕获用抗体和固相之间的物质的组合而将两者结合。作为这样的物质的组合,可举出生物素类和亲和素类、半抗原和抗半抗原抗体等的组合。例如,在将捕获用抗体预先用DNP修饰时,可由固定化抗DNP抗体的固相,将捕获用抗体固定化于所述固相。
固相的原料可选自有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等。作为有机高分子化合物,可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-缩水甘油基(甲基)丙烯酸共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚醋酸乙烯基丙烯酸酯等。作为无机化合物,可举出磁性体(氧化铁、氧化铬、钴及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子,可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可将这些中的2种以上组合使用。
固相的形状不特别限定,可举出例如粒子、微平板、微管、试管等。在它们之中,也优选粒子及微平板,特别优选磁性粒子。在固相的形状是粒子时,作为固相,可在上述的免疫复合体的形成中使用粒子的悬浮液。在固相的形状是微平板等的容器时,可在作为固相的容器内进行上述的免疫复合体的形成。在使用能固定捕获用抗体的磁性粒子时,本实施方式的测定方法也可使用HISCL(注册商标)系列(Sysmex株式会社)等的市售的全自动免疫测定装置进行。
接下来,检测由上述的免疫复合体中所含的标记发生的信号。所述标记是与目标物质结合的标记抗体所具有的标记。从而,由免疫复合体中的标记发生的信号反映目标物质的量。在本说明书中“检测信号”含定性检测信号的有无,对信号的强度进行定量,及半定量检测信号的强度。“半定量检测信号的强度”是指将信号强度如“不发生信号”、“弱”、“强”等一样检测为多个阶段。优选为,对由上述的免疫复合体中所含的标记发生的信号的强度进行定量而取得测定值。
信号的检测结果可作为试样中的目标物质的测定结果使用。例如,在对信号的强度进行定量时可以信号强度的测定值本身或从该测定值取得的值作为目标物质的测定值使用。作为从信号强度的测定值取得的值,可举出例如,从该测定值减去阴性对照的测定值或背景的值的值等。阴性对照可适宜选择,可举出例如,不含目标物质的缓冲液等。
也可将信号强度的测定值适用于校准曲线,确定试样中的目标物质的量或浓度的值。校准曲线可从多个校准物的测定值制成。校准物的测定值与试样同样地,将校准物由本实施方式的测定方法测定而得到。校准曲线可通过在X轴设校准物中的目标物质的浓度,在Y轴设测定值(例如信号强度)的XY平面标绘多个校准物的测定值,由最小二乘法等的公知的方法得到直线或曲线来制成。校准物可例如,通过向不含目标物质的缓冲液以任意的浓度添加单离或合成的目标物质调制。作为不含目标物质的校准物,也可使用不含目标物质的缓冲液本身。
本实施方式的测定方法也可由市售的全自动免疫测定装置进行。全自动免疫测定装置是指当使用者设置试样而输入测定开始的指示时,自动进行测定试样的调制及其免疫测定而输出目标物质的测定结果的装置。作为这样的全自动免疫测定装置,可举出例如HISCL(注册商标)-5000或HISCL-2000i等的HISCL系列(Sysmex株式会社)。HISCL系列的装置由作为固相使用磁性粒子的夹心ELISA法进行测定。
在本实施方式中,也可在免疫复合体的形成和信号的检测之间进行除去未反应的游离成分的B/F(Bound/Free)分离。未反应的游离成分是指不构成免疫复合体的成分。例如,可举出不与目标物质结合的剩余的捕获用抗体及本实施方式的标记抗体等。B/F分离的手段不特别限定,当固相是粒子时,可通过由离心分离仅回收捕获免疫复合体的固相来进行B/F分离。当固相是微平板或微管等的容器时,可通过除去含未反应的游离成分的液来进行B/F分离。另外,在固相是磁性粒子时,可通过在用磁铁磁约束磁性粒子的状态下由管嘴吸除含未反应的游离成分的液来进行B/F分离,在自动化的观点是优选的。也可在除去未反应的游离成分之后,将捕获免疫复合体的固相用PBS等的适合的水性介质清洗。
标记抗体所具有的标记是荧光染料或荧光蛋白质之时,由本实施方式的测定方法也可用流式细胞仪进行。在本说明书中“流式细胞仪”包含成像流式细胞仪(IFC)。IFC是指具备CCD摄像机等的摄像部的流式细胞仪。无摄像部的流式细胞仪是向流经流动池内的液中的各有形成分照射光,将从各有形成分发出的散射光和/或荧光检测为光学信号的装置。在有形成分是细胞时,可对各细胞的尺寸,细胞表面的分子或细胞内分子的量的分布等进行测定。IFC是能取得流经流动池内的液中的各有形成分的图像的装置。IFC可例如,在数秒钟至数分钟的短时间内从数千个至数百万个有形成分的各自取得荧光信号、散射光信号、荧光图像及明场图像(也称为透射光图像),定量测定。另外,可由图像处理提取各有形成分的信息。
在由流式细胞仪进行本实施方式的测定方法时,测定的对象可为含由标记抗体识别的物质的有形成分。在由流式细胞仪测定时,免疫复合体也可通过将可含目标物质的试样和标记抗体混合来形成。由此,在存在于有形成分上的目标物质上结合有标记抗体而在有形成分上形成免疫复合体。混合中的温度及温育时间的条件如上所述。
由免疫复合体中所含的标记发生的信号的检测由流式细胞仪进行。即,向流式细胞仪的流动池导入免疫复合体,由所述流式细胞仪检测信号。在流式细胞仪中,在形成了免疫复合体的有形成分之一个通过流动池之时,向所述有形成分照射光。进而,检测从所述有形成分发出的荧光信号。在利用流式细胞仪的本实施方式的测定方法中,由于使用作为标记而具有荧光染料或荧光蛋白质的标记抗体,检测到从荧光染料或荧光蛋白质释放的荧光信号。进而,基于检测的荧光信号而取得荧光信息。根据需要,也可检测自有形成分的散射光信号,基于所述散射光信号而取得散射光信息。作为散射光,可举出前方散射光(例如,光接收角度0°~约20°的散射光)及侧方散射光(例如,光接收角度约20°~约90°的散射光)。
流式细胞仪的光源不特别限定,可适宜选择例如荧光染料或荧光蛋白质的激发适宜的波长的光源。作为光源,使用例如半导体激光源、氩激光源、He-Ne激光源、汞灯等。
作为荧光信息,可举出例如,荧光的脉冲峰、脉宽、脉冲面积、透过率、斯托克斯位移、比率、经时变化及与它们相关的值等。作为散射光信息,可举出例如,散射光的脉冲峰、脉宽、脉冲面积、透过率、斯托克斯位移、比率、经时变化及与它们相关的值等。
在流式细胞仪是IFC时,荧光信息也可为例如,从由IFC拍摄的图像取得的基于荧光信号的值。在由IFC拍摄的粒子的荧光图像中,构成显示荧光信号的区的各象素具有对应于荧光信号强度的像素值。从而,从图像取得的基于光学信号的值也可为例如,基于构成显示荧光信号的区的象素的值。作为这样的值,可举出例如荧光强度、最大荧光强度、总荧光信号强度、荧光信号面积值等。“荧光强度”是在含免疫复合体的有形成分的荧光图像中,构成显示荧光信号的区的象素的像素值的平均值。“最大荧光强度”是在含免疫复合体的有形成分的荧光图像中,构成显示荧光信号的区的象素的像素值之中的最大值。“总荧光信号强度”是在含免疫复合体的有形成分的荧光图像中,构成显示荧光信号的区的象素的像素值的合计值。“荧光信号面积值”是在含免疫复合体的有形成分的荧光图像中,构成显示荧光信号的区的象素的数。
也可基于取得的荧光信息而检测含免疫复合体的有形成分。荧光信息是荧光的脉冲峰、从荧光图像取得的荧光强度等的数值所示的信息之时,含免疫复合体的有形成分的荧光信息的值比未形成免疫复合体的有形成分的荧光信息的值变大。从而,可将取得的荧光信息的值与指定的阈值比较,基于该比较结果而提取含免疫复合体的有形成分的测定数据。例如,可将取得的荧光信息的值在指定的阈值以上的有形成分检测为含免疫复合体的有形成分。指定的阈值不特别限定,可适宜确定。例如,将不含目标物质的缓冲液或含已知不存在目标物质的有形成分的试样由使用流式细胞仪的本实施方式的测定方法测定,取得荧光信息的值。也可以此得到的值作为指定的阈值。
接下来,将本发明由实施例详细地说明,本发明不限定于这些实施例。
【实施例】
【材料及方法】
对于在后述的实验例中使用的材料及方法,接下来说明。方法的细节也在个别的实验例中说明。
【1.抗体】
(1.1)附加Q标签的抗p24 Fab抗体的调制
(1.1.1)抗p24抗体(sF001-5、sF028-22及产生sF001-25)的杂交瘤的建立
通过以小鼠(ddY,5周龄、雌)作为宿主,以重组型HIV p24蛋白作为抗原,建立抗p24抗体(sF001-5、sF028-22、产生sF001-25)的杂交瘤。即,以FCA(弗氏完全佐剂)及FIA(不完全弗氏佐剂)作为佐剂,向小鼠(ddY;5周龄、雌)免疫重组型HIV p24蛋白。安乐杀确认到血中的抗体价的升高的小鼠之后,用剖检摘出脾脏。摘出的脾脏细胞用PEG法与小鼠骨髓瘤细胞细胞融合,用含有HAT的培养基选定杂交瘤。再者,通过用ELISA法评价分泌到各杂交瘤的培养上清中的抗体,建立作为抗p24抗体产生sF001-5、sF028-22、及sF001-25的各自的杂交瘤。
(1.1.2)sF001-5、sF028-22、及sF001-25的调制
调制来源于小鼠杂交瘤的sF001-5、sF028-22、及sF001-25。即,通过将在上述建立的sF001-5、sF028-22、及产生sF001-25的杂交瘤细胞用SFM培养基培养,使sF001-5、sF028-22、及sF001-25各自分泌于培养基中。通过将用过滤滤器除去细胞的培养上清供于使用Protein G载体的柱层析,纯化sF001-5、sF028-22、及sF001-25而得到各抗体。
(1.1.3)附加Q标签的抗p24 Fab抗体的调制
嵌合体sF001-5(以下,简写为“csF001-5”)、嵌合体sF028-22(以下,简写为“csF028-22”)、及嵌合体sF001-25(以下,简写为“csF001-25”)的Fab抗体是将来源于小鼠杂交瘤的sF001-5、sF028-22及sF001-25的超可变部位和人IgG1、κ同种型的Fab的恒定区连接。向这些嵌合体Fab抗体的重链C末端插入Q标签序列而得到附加Q标签的抗p24 Fab抗体(以下,也称为“csF001-5Fab-Q标签”、“csF028-22Fab-Q标签”及“csF001-25Fab-Q标签”)。接下来显示含插入的Q标签序列的定常部位的氨基酸序列及编码其的碱基序列(加下划线部是Q标签序列)。
轻链的氨基酸序列
轻链的碱基序列
重链的氨基酸序列
重链的碱基序列
对于编码csF001-5Fab-Q标签、csF028-22Fab-Q标签及csF001-25Fab-Q标签的轻链的多核苷酸,将sF001-5、sF028-22及sF001-25的轻链的可变区域和human IgG的轻链κ的恒定区的各自由PCR法扩增之后,将各片段用Overlap PCR法连接而得到。对于编码重链的多核苷酸,以human IgG1的CH1区域作为模板,将用引物向C末端附加Q标签序列的片段和用PCR法扩增的sF001-5、sF028-22及sF001-25的重链的可变区域的片段用Overlap PCR法连接而得到。将调制的PCR产物各自用TA克隆法导入pcDNA3.4(Thermo Fisher Scientific公司),构建编码csF001-5_LC(嵌合体化的sF001-5中的轻链)、csF028-22_LC、及csF001-25_LC的质粒。再者,构建编码csF001-5_HC_Fab-Q标签(向嵌合体化的sF001-5中的重链的Fab的C末端附加Q标签)、csF028-22_HC_Fab-Q标签、及csF001-25_HC_Fab-Q标签的质粒。接下来,通过向Expi-293cell(Thermo Fisher Scientific公司)共转染编码重链及轻链的各自的质粒,使csF001-5Fab-Q标签、csF028-22Fab-Q标签及csF001-25Fab-Q标签作为重组型蛋白表达于培养上清中。各自使用Protein G柱纯化在上清中表达的csF001-5Fab-Q标签、csF028-22 Fab-Q标签及csF001-25Fab-Q标签。
(1.2)附加Q标签的抗HBs628Fab抗体的调制
产生(1.2.1)抗HBs628抗体的杂交瘤的建立
由KOHLER及Milstein的方法(KOHLER G.及Milstein C.,Nature,256,495-497(1975)参照),使用HBs628抗原而制作产生小鼠抗HBs628抗体的杂交瘤。
(1.2.2)附加Q标签的HBs628Fab抗体
附加Q标签的HBs628Fab抗体(以下,也称为“HBs628Fab-Q标签”)是来源于小鼠杂交瘤的HBs628的Fab部分之中,向其重链C末端插入Q标签序列。接下来显示含插入的Q标签序列的定常部位的氨基酸序列及编码其的碱基序列(加下划线部是Q标签序列)。
轻链的氨基酸序列
轻链的碱基序列
重链的氨基酸序列
重链的碱基序列
编码HBs628Fab-Q标签的轻链的多核苷酸从杂交瘤的RNA用5'-RACE法克隆,通过PCR法扩增而得到。编码HBs628Fab-Q标签的重链的多核苷酸从杂交瘤的RNA用5'-RACE法克隆,将用引物在C末端附加Q标签序列的片段用PCR法扩增而得到。将调制的PCR产物用TA克隆法导入pcDNA3.4(Thermo Fisher Scientific公司),构建编码HBs628Fab-Q标签的质粒。接下来,通过向Expi-293cell(Thermo FisherScientific公司)转染所述质粒,使HBs628Fab-Q标签作为重组型蛋白表达于培养上清中。使用Capture Select LC-λ(mur)affinity柱(Thermo Fisher Scientific公司)纯化上清中表达的HBs628Fab-Q标签。
(1.3)附加Q标签的抗CD20 Fab抗体的调制
附加Q标签的抗CD20 Fab抗体(以下,也称为“抗CD20Fab-Q标签”)是来源于人的抗CD20 Fab部分之中,向其重链C末端插入Q标签序列。接下来显示超可变部位和含插入的Q标签序列的定常部位的氨基酸序列及编码其的碱基序列(加下划线部是Q标签序列)。
轻链的氨基酸序列
轻链的碱基序列
重链的氨基酸序列
重链的碱基序列
用全合成构建编码向pcDNA3.4(Thermo Fisher Scientific公司)各自插入编码轻链Fab的多核苷酸和向重链Fab的C末端插入Q标签序列的序列的多核苷酸的抗CD20Fab-LC、抗CD20 Fab-HC-Q标签的表达质粒。接下来,通过向Expi-293cell(Thermo FisherScientific公司)转染本质粒,使抗CD20Fab-Q标签作为重组型蛋白表达于培养上清中。使用CaptureSelect(商标)κXL Pre-packed Column(Thermo FisherScientific公司)纯化上清中表达的抗CD20Fab-Q标签。
【2.具有氨基及巯基的PEG接头(SH-PEG-NH2接头)】
作为SH-PEG-NH2接头,购入(a)HS-PEG2K-NH2,HCl Salt,average Mn 2000(Sigma-Aldrich公司)、(b)SH-PEG-NH2,MW 2K(Biopharma PEG Scientific Inc公司)、(c)HS-PEG-NH2,MW2K(Creative PEGWorks公司)、(d)HS-PEG-NH2,HCl Salt,average Mn 3500(Sigma-Aldrich公司)、(e)HS-PEG-NH2,HCl Salt,average Mn 5000(Sigma-Aldrich公司)、(f)Thiol PEG-NH2,average Mn 400Da(Nanocs Inc.公司)及(g)HS-PEG-NH2,MW 1kDa(Creative PEGWorks公司)。另外,购入与上述(a)的接头不同批的HS-PEG2K-NH2,HClSalt,average Mn 2000(Sigma-Aldrich公司)(以下,也称为(a')的接头)。(a)、(a')、(b)及(c)的接头作为平均分子量2000的制品被销售。以下,(a)、(a')、(b)及(c)的各接头也称为“SH-PEG-NH2接头(2K)”。(d)的接头作为平均分子量3500的制品被销售。以下,(d)的接头也称为“SH-PEG-NH2接头(3.5K)”。(e)的接头作为平均分子量5000的制品被销售。以下,(e)的接头也称为“SH-PEG-NH2接头(5K)”。(f)的接头作为平均分子量400的制品被销售。以下,(f)的接头也称为“SH-PEG-NH2接头(400Da)”。(g)的接头作为平均分子量1000的制品被销售。以下,(g)的接头也称为“SH-PEG-NH2接头(1K)”。(a)、(a')、(b)、(d)、及(e)的接头是盐酸盐,(c)、(f)及(g)的接头是游离体。各接头的结构如下所述。
【化9】
【(a)、(a')、(b)、(d)及(e)的接头】
【(c)、(f)及(g)的接头】
以下,结合有SH-PEG-NH2接头的Fab抗体以下也称为“SH-PEG-Fab”。特别是,结合有上述(a)、(a')、(b)及(c)之任一者的SH-PEG-NH2接头的各Fab抗体以下也称为“SH-PEG(2K)-Fab”。另外,将结合有上述(d)、(e)、(f)及(g)的SH-PEG-NH2接头的Fab抗体以下也各自称为“SH-PEG(3.5K)-Fab”、“SH-PEG(5K)-Fab”、“SH-PEG(400Da)-Fab”及“SH-PEG(1K)-Fab”。
【3.具有马来酰亚胺基及NHS酯的交联剂(EMCS试剂)】
从株式会社同仁化学研究所购入EMCS试剂(制品名:EMCS、CAS编号:55750-62-5)。分子式及分子量是C14H16N2O6=308.29,结构如下所述。
【化10】
【4.标记】
(4.1)具有马来酰亚胺基的生物素
从株式会社同仁化学研究所购入生物素-PEAC5-马来酰亚胺(制品名:Biotin-PEAC5-maleimide、CAS编号:374592-98-0)。分子式及分子量是C26H41ClN6O5S=585.16,结构如下所述。
【化11】
(4.2)具有马来酰亚胺基的荧光染料
从Thermo Fisher Scientific公司购入Alexa488-马来酰亚胺(制品名:AlexaFluor(商标)488C5 Maleimide、CAS编号:500004-82-0)。分子式及分子量是C30H25N4NaO12S2=720.66,结构如下所述。
【化12】
(4.3)R-藻红蛋白(R-PE)
从One Biotech公司购入R-PE(制品名:OB1)。
(4.4)碱性磷酸酶(ALP)
从ORIENTAL酵母株式会社购入来源于牛小肠的ALP(制品名:ALP-55)。
【5.转谷氨酰胺酶(TG)】
作为TG,纯化使用作为来源于微生物的转谷氨酰胺酶的ACTIVA(注册商标)KS-CT(味之素株式会社)。以下,纯化的酶也称为“BTG酶”。
【6.由Infusion法的质谱分析(Infusion MS)】
为了确认与上述(a)、(a')、(b)、(c)、(d)及(e)的各SH-PEG-NH2接头的分子量分布缔合的有无,对于这些接头而进行由Infusion MS的分析。作为MS装置,使用Q Exactive(Thermo Fisher Scientific公司)。离子化模式是positive。向BTG酶反应液(50mM Tris,2mM EDTA,pH8.2、或者20mM Tris,2mM EDTA,150mM NaCl,pH8.2)溶解上述的各SH-PEG-NH2接头之后,用含有0.1%蚁酸的30%乙腈溶液稀释100倍而调制测定样品。从具有重复结构的各SH-PEG-NH2接头的质谱分析的结果,对于S/N是5以上的峰,从强度最高的各同位素峰的分子量及强度算出重量平均分子量。另外,从MS峰确认其分子量幅。
【7.对象蛋白质的定量法】
各种Fab抗体及它们的衍生物的定量通过由SEC分析的Abs280峰面积值算出来进行。作为参照,使用重组型人白细胞介素6(rhIL-6)(吸光系数0.43)。
【8.非还原SDS-PAGE分析】
将各种Fab抗体及它们的衍生物由下述的条件的非还原SDS-PAGE分析。
10~20%聚丙烯酰胺凝胶:e-PAGEL(ATTO株式会社)
电泳装置:PAGERUN(ATTO株式会社)
电泳条件:20mA、80分钟
样品缓冲液:NuPAGE LDS Sample Buffer(Invitrogen)
【实验例1:使用BTG酶的由SH-PEG-NH2接头(2K)的Fab抗体的修饰】
(1)SH-PEG-NH2接头(2K)和Fab抗体的结合
使用BTG酶,使csF001-5Fab-Q标签、csF028-22Fab-Q标签、csF001-25Fab-Q标签及HBs628Fab-Q标签的各自结合上述(a)的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)。另外,使抗CD20Fab-Q标签结合上述(a')的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)。具体而言,如以下。使csF001-5Fab-Q标签或HBs628Fab-Q标签以成为10μM的方式溶解于MES缓冲液(50mM MES,2mM EDTA,pH7.0),与50当量的SH-PEG-NH2接头(2K)及0.1U/mL的BTG酶一同于25℃温育3小时。再者,BTG酶的活性由Hydroxam法(Folk J.E.及Cole P.W.,J.Biol.Chem.241,5518-5525(1966)参照)进行。由SEC分析反应的进行。
作为用于提高SH-PEG-NH2接头(2K)的导入效率的探讨,在Tris缓冲液(20mMTris、2mM EDTA、150mM NaCl、pH8.2或pH8.5)中,对于10μM的csF001-5Fab-Q标签、csF028-22Fab-Q标签及csF001-25Fab-Q标签,各自添加50当量的接头,于室温反应5小时。进而,对在pH8.2及pH8.5的反应生成物和在pH7.0的反应生成物的SEC分析的结果进行比较。
以下将提高导入效率的上述的反应条件(pH8.2或8.5)适应于全部Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头的反应。反应液之中,对于csF001-5Fab-Q标签的反应液,由Amicon10K(Merch公司)脱盐及浓缩,除去SH-PEG-NH2接头。对于csF028-22Fab-Q标签的反应液,用Superdex 200Increase 10/300分取,用Amicon10K(Merch公司)浓缩。对于HBs628Fab-Q标签的反应液,用Superdex 75Increase 10×300mm分取,用Amicon10K(Merch公司)浓缩。对于csF001-25Fab-Q标签及抗CD20Fab-Q标签的反应液,由Protein G柱脱盐及纯化之后,用Amicon10K(Merch公司)浓缩。
(2)SEC分析
对与CSF001-5Fab-Q标签、csF028-22Fab-Q标签、csF001-25Fab-Q标签及其SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的反应液进行SEC分析。对于csF028-22Fab-Q标签及SH-PEG-NH2接头(2K),还进行分取。条件如下所述。
柱:Superdex 200Increase 10×300mm(Cytiva公司)
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:Arg-SEC Mobile Phase(Standard,NACALAI TESQUE株式会社)
流速:0.8ml/min
检测:UV 280nm,FL(Ex:295nm/Em:335nm)
(3)SEC分析及分取
对于与HBs628Fab-Q标签及SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的反应液,在下述的条件下分析及分取。
柱:Superdex 75Increase 10×300mm(Cytiva公司)
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:Arg-SEC Mobile Phase(Strong,NACALAI TESQUE株式会社)
流速:0.8ml/min
检测:UV 280nm,FL(Ex:295nm/Em:335nm)
(4)由Protein G的SH-PEG-Fab的分取
在下述的条件下分取自csF001-25Fab-Q标签及抗CD20 Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab。
柱:HiTrap(商标)Protein G HP Column(1mL、Cytiva公司)
溶剂A:20mM磷酸缓冲液、150mM NaCl、pH7.0
溶剂B:0.1M甘氨酸、pH2.7
流速:0.8ml/min
检测:UV 280nm,FL(Ex:295nm/Em:335nm)
【实验例2:自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG-Fab的生物素标记】
(1)SH-PEG-Fab的生物素标记
将自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab如以下一样生物素标记。将使用BTG酶的HBs628Fab-Q标签和上述(a)的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的反应液由Amicon10K(Merch公司)脱盐及浓缩而得到含SH-PEG-Fab的浓缩液。50mM MES、2mM EDTA缓冲液(pH7.0)中,对于SH-PEG-Fab 10μM,以成为100当量的方式添加生物素-PEAC5-马来酰亚胺,于5℃一晚反应。用SEC纯化反应液。以下也将SH-PEG-Fab和马来酰亚胺标记生物素的反应生成物称为“生物素-PEG-Fab”。生物素-PEG-Fab是式(I)的结构(式中,X是亚乙基、Y是PEG链、Z是生物素、L是间隔物)。
(2)生物素-PEG-Fab的SEC分析及分取
在下述的条件下分析及分取自HBs628Fab-Q标签的生物素-PEG-Fab。
柱:Superdex 75Increase 10×300mm
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:Arg-SEC Mobile Phase(Strong,NACALAI TESQUE株式会社)
流速:0.8ml/min
检测:UV 280nm,FL(Ex:295nm/Em:335nm)
(3)由蛋白印迹(WB)法的分析
将HBs628Fab-Q标签和其SH-PEG(2K)-Fab及生物素-PEG-Fab由上述的非还原SDS-PAGE分离后,如以下一样用WB法分析。将Fab(5~10ng相当)用SDS-PAGE(10~20%聚丙烯酰胺凝胶)分离之后,用iBlot 2干印迹装置(Thermo Fisher Scientific公司)转印到PVDF膜(Invitrogen公司)。将转印后的PVDF膜在含有1%脱脂乳的TBST(10mM Tris,150mM NaCl,0.05% Tween20,pH 7.4)中,于室温封闭1小时。将封闭的PVDF膜用TBST清洗(10分钟×3次)。向PVDF膜添加用含有1%脱脂乳的TBST稀释为1:20,000的HRP-ConjugatedStreptavidin(Thermo Fisher Scientific公司),于室温反应1小时。将PVDF膜用TBST清洗(10分钟×3次)。向PVDF膜添加ECL Prime Western Blotting Detection Reagent(Cytiva公司),用Amersham Imager 680(Cytiva公司)检测生物素标记的有无。
(4)LC-MS分析
自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG-Fab的MS分析用2种方法进行。即,对于非还原及还原后的样品而进行分析。还原条件对于Fab 10μg加过量85mM TCEP(三(2-羧基乙基)膦),于5℃放置一晚之后,LC-MS分析。分析条件如下所述。
柱:Develosil C18(3μm,2mmID×100mmL、野村化学株式会社)
分析温度:25℃
溶剂A:0.1%蚁酸
溶剂B:0.1%蚁酸、100%乙腈
梯度:B10%~B60%1min的梯度
流速:100μL/min
LC装置:LC-20A(株式会社岛津制作所)
MS装置:Q Exactive(Thermo Fisher Scientific公司)
离子化模式:positive
【实验例3:SH-PEG-Fab的ALP标记】
(1)ALP的马来酰亚胺修饰
为了在自csF001-5Fab-Q标签、csF028-22Fab-Q标签及HBs628Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab的ALP标记中使用,如以下一样将ALP用马来酰亚胺修饰。将ALP以成为10μM的方式溶解于25M三乙醇胺缓冲液(1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH7.0)。向ALP溶液添加20当量的EMCS试剂而于37℃温育1小时。将反应液用PD10柱(Cytiva公司)脱盐之后,由Amicon10K浓缩。
(2)SH-PEG(2K)-Fab的ALP标记
(2.1)自csF001-5Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab的标记
将自csF001-5Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab如以下一样ALP标记。将20μM的SH-PEG(2K)-Fab和10μM的马来酰亚胺修饰ALP在25mM三乙醇胺缓冲液(1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH7.0)中,于5℃温育一晚。将反应液用使用Superdex 200Increase(Cytiva公司)的HPLC分析之后,各自纯化及分取向1分子的ALP所具有的1个马来酰亚胺基结合Fab的ALP标记Fab(以下,称为“Fab-PEG-ALP”)、向1分子的ALP所具有的2个马来酰亚胺基的各自结合Fab的ALP标记Fab(以下,称为“(Fab-PEG)2-ALP”)、及,向1分子的ALP所具有的3个马来酰亚胺基的各自结合Fab的ALP标记Fab(以下,称为“(Fab-PEG)3-ALP”)。Fab-PEG-ALP是1分子的ALP和1分子的Fab的复合体,(Fab-PEG)2-ALP是1分子的ALP和2分子的Fab的复合体,(Fab-PEG)3-ALP是1分子的ALP和3分子的Fab的复合体。Fab-PEG-ALP、(Fab-PEG)2-ALP及(Fab-PEG)3-ALP各自是式(I)的结构(式中,X是亚乙基、Y是PEG链、Z是ALP、L是间隔物)。
(2.2)自csF028-22Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab的标记
将自csF028-22Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab如以下一样ALP标记。将SH-PEG(2K)-Fab用Amicon10K(Merch公司)在25mM三乙醇胺缓冲液(1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,150mMNaCl,pH7.0)中浓缩而进行缓冲液更换。将得到的20μM的反应液和6.7μM的马来酰亚胺修饰ALP在25mM三乙醇胺缓冲液(1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH7.0)中,于5℃温育一晚。将反应液用使用Superdex200Increase(Cytiva公司)的HPLC分析之后,各自纯化及分取Fab-PEG-ALP、(Fab-PEG)2-ALP及(Fab-PEG)3-ALP。由上述的对象蛋白质的定量法进行各ALP标记Fab的定量。以终浓度成为0.1%的方式向各ALP标记Fab的溶液添加BSA(Proliant公司)。
(2.3)自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab的标记
将自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab如以下一样ALP标记。将SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP(以下,也称为“(Mal)n-ALP”)以表1中所示的摩尔比在25mM三乙醇胺缓冲液(1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH7.0)中于5℃温育一晚。将反应液用使用Superdex 200Increase(Cytiva公司)的HPLC分析之后,各自纯化及分取Fab-PEG-ALP、(Fab-PEG)2-ALP及(Fab-PEG)3-ALP。再者,(Mal)n-ALP表示附加n个(n是1以上的整数)的马来酰亚胺基的1分子的ALP。
【表1】
反应条件 | SH-PEG-Fab(μM) | (Mal)n-ALP(μM) |
1 | 10 | 5 |
2 | 10 | 10 |
3 | 10 | 20 |
(3)Fab-PEG-ALP、(Fab-PEG)2-ALP及(Fab-PEG)3-ALP的SEC分析及分取
(3.1)自csF001-5Fab-Q标签及HBs628Fab-Q标签的ALP-PEG-Fab的分析条件
柱:Superdex 200Increase 10×300mm
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:Arg-SEC Mobile Phase(Standard、NACALAI TESQUE株式会社)
流速:0.8ml/min检测:UV 280nm,FL(Ex:295nm/Em:335nm)
(3.2)Fab-PEG-ALP、(Fab-PEG)2-ALP及(Fab-PEG)3-ALP的分析及分取的条件
柱:Superdex 200Increase 10×300mm
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:25mM三乙醇胺缓冲液(1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH7.0)
流速:0.8ml/min
检测:UV 280nm,FL(Ex:295nm/Em:335nm)
【实验例4:由随机标记法的Fab'的ALP标记】
(1)ALP的马来酰亚胺修饰
为了在不具有Q标签的Fab'的ALP标记中使用,如以下一样将ALP用马来酰亚胺修饰。使ALP以成为20μM的方式溶解于D-PBS(-)(pH7.4)。向ALP溶液添加30当量的EMCS试剂,于37℃温育1小时。将反应液用PD10柱(Cytiva公司)脱盐,在0.1M三乙醇胺缓冲液(1mMMgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH7.0)中进行缓冲液更换。其后,由Amicon50K浓缩。
(2)自全长抗体的F(ab')2的制作及SEC分取
向McIlvaine缓冲液(pH3.8)各自溶解sF001-5至其成为6.67μM、溶解胃蛋白酶(Sigma公司)至其成为0.95μM,于37℃温育3小时。其后,通过添加10v%的1M Tris-HCl(pH8.5)来中和,停止反应。由Amicon10K浓缩生成物之后,使用Superdex 200Increase(Cytiva公司)纯化及分取F(ab')2。将得到的F(ab')2溶液再次由、Amicon10K浓缩。即使进行此操作,也确认到抗体的物质量相当的反应性不降低。分取的条件如下所述。
柱:Superdex 200Increase 10×300mm
纯化装置:AKTAgo(Cytiva公司)
分析温度:室温
溶剂:0.1M磷酸缓冲液(1mM EDTA·2Na,pH6.0)
流速:0.5ml/min
检测:UV 280nm
(3)从F(ab')2的Fab'的制作及SEC分取
使上述(2)中制成的F(ab')2以成为20μM的方式溶解于0.1M磷酸缓冲液(1mMEDTA·2Na,pH6.0)。向F(ab')2溶液添加1500当量的2-巯基乙基胺试剂(NACALAI TESQUE株式会社),于37℃温育90分钟。其后,使用Superdex 200Increase(Cytiva公司),仅分取及纯化生成的sF001-5Fab'的级分,由Amicon10K浓缩。分取的条件如下所述。
柱:Superdex 200Increase 10×300mm
纯化装置:AKTAgo(Cytiva公司)
分析温度:室温
溶剂:0.1M磷酸缓冲液(1mM EDTA·2Na,pH6.0)
流速:0.5ml/min
检测:UV 280nm
(4)Fab'的ALP标记(随机标记法)
由Fab'中的半胱氨酸残基和马来酰亚胺修饰ALP的偶联ALP标记Fab'。具体而言,如以下。将44μM的sF001-5Fab'和8.8μM的马来酰亚胺修饰ALP在0.1M三乙醇胺缓冲液(1mMMgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH7.0)中于5℃温育一晚。其后,使用Superdex200Increase(Cytiva公司)分取及纯化生成的偶联体(以下,称为“(Fab')n-ALP”)。分取的条件如下所述。再者,(Fab')n-ALP表示向ALP所具有的n个(n是1以上的整数)的马来酰亚胺基的各自结合Fab'的复合体。
柱:Superdex 200Increase 10×300mm
纯化装置:AKTAgo(Cytiva公司)
分析温度:室温
溶剂:0.1M三乙醇胺缓冲液(1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH7.0)
流速:0.5ml/min
检测:UV 280nm
将含纯化的(Fab')n-ALP的样品由非还原SDS-PEGE及SEC分析。SEC分析的条件如下所述。
柱:Superdex 200Increase 10×300mm
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:Arg-SEC Mobile Phase(Standard、NACALAI TESQUE株式会社)
流速:0.8ml/min
检测:UV 280nm,FL(Ex:295nm/Em:335nm)
【实验例5:由Alexa488-马来酰亚胺的SH-PEG-Fab的荧光标记】
(1)SH-PEG-Fab和Alexa488-马来酰亚胺的结合
将自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab如以下一样用荧光染料标记。将SH-PEG(2K)-Fab用Amicon10K(Merch公司)浓缩,在50mM磷酸钠缓冲液(2mM EDTA,pH7.0)中进行缓冲液交换。将6μM反应液和120μM的Alexa488-马来酰亚胺在50mM磷酸钠缓冲液(2mMEDTA,pH7.0)中,于5℃温育一晚。使用Superdex200Increase(Cytiva公司)由HPLC分取及分析被反应液中的Alexa488标记的Fab(Alexa488-PEG-Fab)。以下也将SH-PEG-Fab和Alexa488-马来酰亚胺的反应生成物称为“Alexa488-PEG-Fab”。Alexa488-PEG-Fab是式(I)的结构(式中,X是亚乙基、Y是PEG链、Z是Alexa488、L是间隔物)。
(2)SEC分取的条件
柱:Superdex 200Increase 10×300mm
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:50mM磷酸缓冲液、2mM EDTA、pH7.0
流速:0.8ml/min
检测:UV 280nm
(3)SEC分析的条件
柱:Superdex 200Increase 10×300mm
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:Arg-SEC Mobile Phase(Standard、NACALAI TESQUE株式会社)
流速:0.8ml/min检测:UV 280nm
FL(Ex.495nm/Em.519nm)PMT Super Low
(4)LC-MS分析
将自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab及Alexa488-PEG-Fab如以下一样LC-MS分析的1M Tris(pH7.5)中,用200当量的TCEP于37℃还原2小时之后,对样品进行LC-MS分析。分析条件如下所述。
柱:PLRP-1000column(2μm×100mmL、PL laboratory公司)
分析温度:25℃
溶剂A:0.1%蚁酸
溶剂B:0.1%蚁酸、100%乙腈
梯度:B10%~B60%1min的梯度
流速:100μL/min
LC装置:LC-20A(株式会社岛津制作所)
MS装置:Q Exactive(Thermo Fisher Scientific公司)
离子化模式:positive
【实验例6:由R-PE的SH-PEG-Fab的荧光标记】
(1)R-PE的马来酰亚胺修饰
为了在自csF001-25Fab-Q标签及抗CD20 Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab的R-PE标记中使用,如以下一样将R-PE用马来酰亚胺修饰。向50mM磷酸钠缓冲液(2mM EDTA、pH7.0)透析取代R-PE。进而,向5μM R-PE溶液添加400μM的EMCS试剂而于37℃温育1小时。将反应液用PD10柱(Cytiva公司)脱盐之后,由Amicon3K浓缩。以下也将得到的马来酰亚胺修饰R-PE称为“(Mal)n-R-PE”。(Mal)n-R-PE表示附加n个(n是1以上的整数)的马来酰亚胺基的1分子的R-PE。
(2)SH-PEG-Fab和马来酰亚胺修饰R-PE的结合
将自csF001-25Fab-Q标签及抗CD20 Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab如以下一样用荧光染料标记。将SH-PEG(2K)-Fab用Amicon10K(Merch公司)浓缩,在50mM磷酸钠缓冲液(2mM EDTA,pH7.0)中进行缓冲液更换。将6μM反应液和2μM的(Mal)n-R-PE在50mM磷酸钠缓冲液(2mM EDTA,pH7.0)中,于5℃温育一晚。将L-半胱氨酸以终浓度成为0.1mM的方式添加到反应液中而封端未反应的马来酰亚胺基。其后,使用Superdex 200Increase(Cytiva公司)由HPLC分析。各自纯化及分取向1分子的R-PE所具有的1个马来酰亚胺基结合Fab的R-PE标记Fab(以下,称为“Fab-PEG-R-PE”)、向1分子的R-PE所具有的2个马来酰亚胺基的各自结合Fab的R-PE标记Fab(以下,称为“(Fab-PEG)2-R-PE”)及向1分子的R-PE所具有的3个马来酰亚胺基的各自结合Fab的R-PE标记Fab(以下,称为“(Fab-PEG)3-R-PE”)。另外,对它们另行进行SEC分析。分取及分析的条件如下所述。再者,Fab-PEG-R-PE是1分子的R-PE和1分子的Fab的复合体,(Fab-PEG)2-R-PE是1分子的R-PE和2分子的Fab的复合体,(Fab-PEG)3-R-PE是1分子的R-PE和3分子的Fab的复合体。Fab-PEG-R-PE、(Fab-PEG)2-R-PE及(Fab-PEG)3-R-PE各自是式(I)的结构(式中,X是亚乙基、Y是PEG链、Z是R-PE、L是间隔物)。
(3)SEC分取的条件
柱:Superdex 200Increase 10×300mm
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:50mM磷酸缓冲液、2mM EDTA、pH7.0
流速:0.8ml/min
检测:UV 280nm
(4)SEC分析的条件
柱:Superdex 200Increase 10×300mm
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:Arg-SEC Mobile Phase(Standard、NACALAI TESQUE株式会社)
检测:UV 280nm
FL(Ex.565nm/Em.574nm)PMT Super Low
【实验例7:ALP标记抗体的ALP活性测定】
如下测定自实验例3中调制的csF028-22Fab-Q标签的Fab-PEG-ALP、(Fab-PEG)2-ALP及(Fab-PEG)3-ALP的ALP活性。将校准物(生物化学自动分析装置;由日立7170赋予活性值的ALP-55(ORIENTAL酵母株式会社))和稀释得在校准曲线范围内的各ALP标记抗体以CDP-star(Thermo Fisher Scientific公司)作为底物测定ALP活性。通过向各种测定受试体的ALP活性乘以稀释倍率来算出各ALP标记抗体的ALP活性值,对对于未修饰ALP的比活性进行比较。
【实验例8:含Fab-PEG-ALP及(Fab')n-ALP的试剂的性能评价】
由以自实验例3中调制的csF001-5Fab-Q标签的Fab-PEG-ALP及实验例4中调制的(Fab')n-ALP的各自作为检测用抗体使用的免疫学测定法测定HIV p24抗原。对测定结果进行比较,探讨含Fab-PEG-ALP及(Fab')n-ALP的各自的试剂的性能。测定由全自动免疫测定装置HISCL(注册商标)-2000i(Sysmex株式会社)进行。
(1)试剂的调制
除了作为检测用抗体试剂的R3试剂之外,使用HIV1 p24抗原·HIV抗体试剂盒“HISCL(注册商标)HIV Ag+Ab试剂”(Sysmex株式会社)中所含的R1试剂(生物素标记抗体)、R2试剂(链霉亲和素固定化磁性粒子)、R4试剂(化学发光底物稀释液)及R5试剂(化学发光底物)、或者基于这些试剂的制造法的方法而制作的试剂。R3试剂使用Fab-PEG-ALP或(Fab')n-ALP如以下一样调制。将Fab-PEG-ALP及(Fab')n-ALP各自用0.1M三乙醇胺缓冲液(3% BSA,0.5%酪蛋白钠,1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH6.5)稀释,以成为表2中所示的浓度的方式调整。将各抗体溶液用Millex-GS 0.22μm(Merck公司)过滤而作为R3试剂。各抗体的ALP活性与实验例7同样算出。
【表2】
(2)受试体的调制
将HIV p24抗原(abcam公司)用D-PBS(0.1% BSA,pH7.4)及人合并血清(日水株式会社)的各自稀释而制作10pg/mL、100pg/mL及1000pg/mL的抗原浓度的受试体。另外,以D-PBS(0.1% BSA,pH7.4)及人合并血清本身作为不含抗原(0pg/mL)受试体使用。
(3)测定
将上述(1)的R1~R5试剂设置于HISCL-2000i(Sysmex株式会社),对上述(2)中调制的8种受试体进行测定。由HISCL-2000i的测定程序如下。将受试体(20μL)和R1试剂(50μL)混合之后,添加R2试剂(30μL)。对得到的混合液中的磁性粒子进行集磁而除去上清,加HISCL清洗液(300μL)而清洗磁性粒子。除去上清,向磁性粒子添加R3试剂(100μL)而进行混合。对得到的混合液中的磁性粒子进行集磁而除去上清,加HISCL清洗液(300μL)而清洗磁性粒子。除去上清,向磁性粒子添加R4试剂(50μL)及R5试剂(100μL),对化学发光强度进行测定。
【实验例9:Alexa488标记抗体的抗原结合能的评价】
将自实验例5中调制的csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab及Alexa488-PEG-Fab的抗原结合能由使用Biacore(商标)T200(Cytiva公司)的表面等离子体共振(SPR)反应测定。为了比较,还对csF001-25Fab-Q标签进行测定。具体而言,如以下。在传感器芯片CM5(Cytiva公司)上用胺偶联固定化附带在Human Fab Capture Kit(Cytiva公司)的HumanFab Binder。作为配体,使SH-PEG(2K)-Fab、Alexa488-PEG-Fab及未标记Fab(csF001-25Fab-Q标签)各自结合。作为分析物,使重组型蛋白的HIV-1p24(Prospec公司)反应。相互作用解析由Biacore T200 Evaluation software,使用1:1Binding反应模型实施。使用的装置、试剂及反应条件如下所述。
[装置及试剂]
装置:Biacore(商标)T200(Cytiva公司)
传感器芯片:传感器芯片CM5(Cytiva公司)
捕获剂试剂盒:人Fab捕获剂试剂盒(Cytiva公司)
偶联试剂盒:胺偶联试剂盒(Cytiva公司)缓冲液:HBS-EP+缓冲液(Cytiva公司)
[配体捕获剂]
配体:SH-PEG(2K)-Fab、Alexa488-PEG-Fab及未修饰Fab(csF001-25Fab-Q标签)
流速:30μL/min
添加时间(Contact time):60sec
[样品]
分析物:HIV-1p24(Prospec公司)(2.5~80nM)
流速:30μL/min
添加时间(Contact time):30sec
解离时间:300sec
[再生]
再生缓冲液:10mM甘氨酸-HCl pH2.1
流速:30μL/min
添加时间(Contact time):30sec
【实验例10:R-PE标记抗体的抗原结合能】
将自实验例6中调制的csF001-25Fab-Q标签的Fab-PEG-R-PE、(Fab-PEG)2-R-PE及(Fab-PEG)3-R-PE的抗原结合能如以下一样由ELISA测定。将Fab-PEG-R-PE、(Fab-PEG)2-R-PE及(Fab-PEG)3-R-PE的各自以R-PE的荧光强度成为同程度的方式稀释而调制检测用试剂。在使抗His标签抗体固定化的黑色96孔微平板上,作为抗原,使附加His标签的重组型HIV-1p24(Prospec公司)于室温反应1小时。为了比较,还准备未添加抗原的抗His标签抗体固定化微平板。进而,用含有清洗液(0.05% Tween 20的生理盐水)清洗各孔。将各检测用试剂供于微平板的孔,于室温反应1小时。用清洗液清洗各孔之后,用荧光板读取器(激发波长488nm、荧光波长578nm)检测微平板中的R-PE标记抗体。
【实验例11:含R-PE标记抗体的试剂的性能评价】
由以自实验例6中调制的抗CD20 Fab-Q标签的Fab-PEG-R-PE、(Fab-PEG)2-R-PE及(Fab-PEG)3-R-PE的各自作为检测用抗体使用的流式细胞术(FCM)法测定表达CD20的细胞。对测定结果进行比较而探讨含各R-PE标记抗体的试剂的性能。在具体性的测定程序中,如以下。将Fab-PEG-R-PE、(Fab-PEG)2-R-PE及(Fab-PEG)3-R-PE的各自在稀释缓冲液(2%FBS,2mM EDTA/D-PBS(pH7.4))中以R-PE的荧光强度成为同程度的方式稀释而调制检测用试剂。在各检测用试剂中搅拌表达CD20的Ramos细胞,于4℃反应30分钟。用离心沉淀细胞,用稀释缓冲液清洗细胞。用BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪(Becton,Dickinson andCompany公司)检测与Ramos细胞表面的CD20结合的各R-PE标记抗体。
【实验例12:由SH-PEG-NH2接头(3.5K)及SH-PEG-NH2接头(5K)的Fab抗体的修饰】
(1)SH-PEG-NH2接头(3.5K)及SH-PEG-NH2接头(5K)和Fab抗体的结合使用BTG酶,使csF001-25Fab-Q标签结合上述(d)的SH-PEG-NH2接头(3.5K)(Sigma-Aldrich公司)及上述(e)的SH-PEG-NH2接头(5K)(Sigma-Aldrich公司)的各自。具体而言,如以下。使csF001-25Fab-Q标签以成为10μM的方式溶解于Tris缓冲液(20mM Tris,2mM EDTA,150mM NaCl,pH8.2),与100当量的SH-PEG-NH2接头(3.5K)或SH-PEG-NH2接头(5K)及0.1U/mL的BTG酶一同于5℃温育一晚。再者,BTG酶的活性由Hydroxam法进行。由SEC分析反应的进行。对于各接头的反应液,由Protein G柱脱盐及纯化之后,用Amicon10K(Merch公司)浓缩。SEC分析的条件如下所述。
(2)SEC分析的条件
柱:Superdex 200Increase 10×300mm(Cytiva公司)
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:Arg-SEC Mobile Phase(Standard、NACALAI TESQUE株式会社)
流速:0.8ml/min
检测:UV 280nm,FL(Ex:295nm/Em:335nm)
【实验例13:由Alexa488-马来酰亚胺的SH-PEG-Fab的荧光标记】
(1)SH-PEG-Fab的荧光标记
将自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(3.5K)-Fab及SH-PEG(5K)-Fab如以下一样用荧光染料标记。将各SH-PEG-Fab用Amicon10K(Merch公司)浓缩,在25mM三乙醇胺缓冲液(1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH7.0)中进行缓冲液更换。将6μM反应液和120μM的Alexa488-马来酰亚胺在25mM三乙醇胺缓冲液(1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH7.0)中,于5℃温育一晚。将反应液中的Alexa488-PEG-Fab使用Superdex 200Increase(Cytiva公司)由HPLC分析。SEC分析的条件如下所述。
(2)SEC分析的条件
柱:Superdex 200Increase 10×300mm(Cytiva公司)
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:Arg-SEC Mobile Phase(Standard、NACALAI TESQUE株式会社)
流速:0.8ml/min
检测:UV 280nm
FL(Ex.565nm/Em.574nm)PMT Super Low
【实验例14:由SH-PEG-NH2接头(400Da)的Fab抗体的修饰】
(1)SH-PEG-NH2接头(400Da)和Fab抗体的结合
使用BTG酶,使csF001-5Fab-Q标签结合上述(f)的SH-PEG-NH2接头(400Da)(Nanocs Inc.公司)。具体而言,如以下。使csF001-5Fab-Q标签以成为10μM的方式溶解于Tris缓冲液(20mM Tris,2mM EDTA,150mM NaCl,pH8.2),与50当量的SH-PEG-NH2接头(400Da)及0.1U/mL的BTG酶一同于5℃温育一晚。再者,BTG酶的活性由Hydroxam法进行。将反应液由Superdex 200Increase(Cytiva公司)脱盐及纯化之后,用Amicon10K(Merch公司)浓缩。
(2)SH-PEG(400Da)-Fab的ALP标记
将10μM的SH-PEG(400Da)-Fab和5μM的马来酰亚胺修饰ALP在25mM三乙醇胺缓冲液(1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH7.0)中,于5℃温育一晚。将反应液用使用Superdex 200Increase(Cytiva公司)的HPLC分析。SEC分析的条件如下所述。
(3)SEC分析的条件
柱:Superdex 200Increase 10×300mm(Cytiva公司)
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:Arg-SEC Mobile Phase(Standard、NACALAI TESQUE株式会社)
流速:0.8ml/min
检测:UV 280nm
FL(Ex.295nm/Em.335nm)
【实验例15:由SH-PEG-NH2接头(1K)的Fab抗体的修饰】
(1)SH-PEG-NH2接头(1K)和Fab抗体的结合
使用BTG酶,使HBs628Fab-Q标签结合上述(g)的SH-PEG-NH2接头(1K)(CreativePEGWorks公司)。具体而言,如以下。使HBs628Fab-Q标签以成为10μM的方式溶解于MES缓冲液(50mM MES,2mM EDTA,pH7.0),与50当量的SH-PEG-NH2接头(1K)及0.1U/mL的BTG酶一同于25℃温育3小时。由SEC分析反应的进行。再者,BTG酶的活性由Hydroxam法进行。将反应液由Amicon10K(Merch公司)脱盐、浓缩及纯化。
(2)SH-PEG(1K)-Fab的ALP标记
将10μM的SH-PEG(1K)-Fab和5μM的马来酰亚胺修饰ALP在25mM三乙醇胺缓冲液(1mM MgCl2,0.1mM ZnCl2,150mM NaCl,pH7.0)中,于5℃温育一晚。将反应液用使用Superdex 200Increase(Cytiva公司)的HPLC分析。SEC分析的条件如下所述。
(3)SEC分析的条件
柱:Superdex 200Increase 10×300mm(Cytiva公司)
HPLC装置:Chromaster(注册商标)(株式会社日立HighTech科学)
分析温度:室温
溶剂:Arg-SEC Mobile Phase(Standard、NACALAI TESQUE株式会社)
流速:0.8ml/min
检测:UV 280nm
FL(Ex.295nm/Em.335nm)
[结果]
对于上述的各实验的结果,接下来说明。
【1.SH-PEG-NH2接头(2K)的Infusion MS分析的结果】
将上述(a)、(a')、(b)及(c)的各SH-PEG-NH2接头(2K)由Infusion MS分析的结果示于图2A、B、C及D。图2A、B及D中,箭头是指表示分子量的最小值的峰、表示最频分子量的峰、及表示分子量的最大值的峰。上述(a)、(a')、(b)及(c)的接头的最频分子量各自是2014.2、2058.2、1397.8及1617.9。另外,基于分析结果而算出各接头的重量平均分子量。如从图2A、B、C及D得知,各接头的重量平均分子量及分子量分布不同。具体而言,如下所述。再者,重量平均分子量是对于(a')以外的接头,由S/N是5以上的MS峰算出的值,对于(a')的接头,由S/N是1.5以上的MS峰算出的值。
·上述(a)的接头:重量平均分子量2095.2、分子量分布1838.1~2410.4
·上述(a')的接头:重量平均分子量2029.5、分子量分布1794.1~2454.4
·上述(b)的接头:重量平均分子量1460.0、分子量分布1177.7~1794.1
·上述(c)的接头:重量平均分子量1611.9、分子量分布1221.7~2058.2
任何接头,作为除官能团(SH-CH2CH2-及-NH2)的PEG链部分的分子量,均为1100以上。另外,作为除官能团的PEG链部分的重量平均分子量是1300以上。添加BTG酶反应液(NaCl未添加、pH8.2)之后的SH-PEG-NH2接头(2K)确认不到经二硫化物(S-S)结合的二聚体化,仅检测到与PEG链的分子量分布相关的单体的MS光谱。从而表明,上述(a)、(a')、(b)及(c)的SH-PEG-NH2接头(2K)均在BTG酶反应溶液中未缔合。
【2.使用BTG酶的由SH-PEG-NH2接头(2K)的csF001-5Fab-Q标签的修饰(实验例1)】
csF001-5Fab-Q标签和上述(a)的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的由BTG酶的反应后的生成物的SEC分析的结果示于图3。具体而言,脱盐及浓缩的反应液的层析谱。图中,“+SH-PEG-NH2”是指添加SH-PEG-NH2接头(2K)的反应液的分析结果,“-SH-PEG-NH2”是指未添加SH-PEG-NH2接头(2K)的反应液的分析结果。如图3所示,在未添加接头时,在Fab的峰上确认不到变化。即,未发生Q标签中的Gln残基和Fab上的Lys残基之间的Fab彼此的分子间缔合。一方面,在添加接头时,保留时间18.5分钟附近的未修饰Fab的峰减少,在作为高分子量侧的保留时间17.5分钟附近新确认1个变动的峰。这表明,在直链结构的SH-PEG-NH2接头1分子经Q标签结合的SH-PEG-Fab中,表观的尺寸升高,作为分离的峰观察。实际上,所述峰与未修饰Fab峰相比宽域是因为接头中的PEG链具有如图2A~D所示宽的分子量分布。从峰面积换算的反应效率是约73%。这是与过去被BTG酶高分子PEG接头修饰时同样的倾向(Sato H.等,Biochemistry,35(40)13072-13080(1996)参照)。
再者,为了提高以BTG酶的导入效率,将反应pH设为7.5~8.2及8.5时的分析结果示于图4。图中,“SH-PEG”表示上述(a)的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)。如图4所示,SH-PEG-NH2接头的氨基对于BTG酶中的活性SH基团和Fab-Q标签中的Gln侧链的硫醚键中间体的亲核性升高,其反应效率从73%各自提升至约95%及约96%,确认能定量导入。这表明,在pH7.0,与以往同样地,反应效率是约73%,所以,通过将BTG酶反应的pH设在8~8.5附近,可定量进行SH-PEG-NH2接头的导入。
【3.使用BTG酶的由SH-PEG-NH2接头(2K)的csF028-22Fab-Q标签的修饰(实验例1)】
在提高导入效率的反应条件(pH8.2或8.5)的csF028-22Fab-Q标签和上述(a)的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的由BTG酶的反应后的生成物的SEC分析的结果示于图5。图中,“SH接头+”是指添加SH-PEG-NH2接头(2K)的反应液的分析结果,“SH接头-”是指未添加SH-PEG-NH2接头(2K)的反应液的分析结果。如图5所示,在未添加接头时,与csF001-5Fab-Q标签同样,在Fab的峰上确认不到变化。即,未发生Q标签中的Gln残基和Fab上的Lys残基之间的Fab彼此的分子间缔合。一方面,在添加接头时,保留时间19.3分钟附近的未修饰Fab的峰减少,在作为高分子量侧的保留时间18.2分钟附近新确认变动的宽域的峰。这表明,尽管在直链结构的SH-PEG-NH2接头1分子经Q标签结合的SH-PEG-Fab中,表观的尺寸升高,不完全分离,作为分离的峰观察。再者,所述峰与未修饰Fab峰相比宽域是因为接头中的PEG链具有宽的分子量分布。再者,由于与未修饰体峰不完全地分离,反应效率是96%。实际、分取后的峰是宽域的1峰。
【4.使用BTG酶的由SH-PEG-NH2接头(3.5K)的csF001-5Fab-Q标签的修饰(实验例12)】
在提高导入效率的反应条件下的csF001-5Fab-Q标签和上述(d)的SH-PEG-NH2接头(3.5K)(Sigma-Aldrich公司)的由BTG酶的反应后的生成物的SEC分析的结果示于图6。图中,“SH接头+”是指添加SH-PEG-NH2接头(3.5K)的反应液的分析结果,“SH接头-”是指未添加SH-PEG-NH2接头(3.5K)的反应液的分析结果。在未添加接头时,与csF001-5Fab-Q标签同样,在Fab的峰上确认不到变化。即,未发生Q标签中的Gln残基和Fab上的Lys残基之间的Fab彼此的分子间缔合。一方面,在添加接头时,保留时间19.3分钟附近的未修饰Fab的峰减少,在作为高分子量侧的保留时间17.8分钟附近新确认变动的宽域的峰。这表明,尽管在直链结构的SH-PEG-NH2接头1分子经Q标签结合的SH-PEG-Fab中,表观的尺寸升高,不完全分离,作为分离的峰观察。再者,所述峰与未修饰Fab峰相比宽域是因为接头中的PEG链具有宽的分子量分布。再者,反应效率是约84%,相比使用SH-PEG-NH2接头(2K)的反应些许降低。这被认为是因为,由于SH-PEG-NH2接头(3.5K)比SH-PEG-NH2接头(2K)分子链长还更长,BTG酶的基质反应性多少降低。实际上,分取后的峰是宽域的1峰。
【5.自csF001-5Fab-Q标签的SH-PEG-Fab的ALP标记(实验例3)】
(1偶联反应液的SEC分析
自csF001-5Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab、马来酰亚胺修饰ALP((Mal)n-ALP)、及它们的偶联反应液的SEC分析的结果和它们的非还原SDS-PAGE的结果示于图7。图中,“Fab+SH-PEG”是指SH-PEG(2K)-Fab的溶液的分析结果,“ALP+EMCS”是指含马来酰亚胺修饰ALP的溶液的分析结果,“Fab:ALP(1:1)偶联”及“偶联”是指SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液的分析结果。尽管Fab和ALP的混合比仅为1:1,来源于SH-PEG(2K)-Fab的峰(保留时间约17.5分钟)仅残留20%左右,来源于(Mal)n-ALP的峰(保留时间约15.3分钟)也减少。进而,确认到推定为对于1分子ALP结合1分子Fab的主峰(Fab-PEG-ALP、保留时间约13.5分钟)、推定为结合2分子Fab的副峰((Fab-PEG)2-ALP、保留时间约12.5分钟)。实际上,当还考虑各自的原料及反应液的非还原SDS-PAGE(相当于由作为二聚体的ALP单体(ALP(m))的生成物的条带)的结果时,对于未修饰ALP,由Fab的偶联体的峰分离性非常地高。这是因为,通过Fab分子经直链PEG分子与ALP结合,起因于表观的尺寸变大。
(2)偶联反应峰的SEC分取及取得的级分的SEC分析
对于自csF001-5Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液而进行由SEC的分取,取得的各级分的由非还原SDS-PAGE及SEC的分析的结果示于图8A~C。在图8A中得出如下结论,被虚线包围的2个峰以保留时间快速的顺序是ALP和2分子的Fab结合的ALP标记Fab((Fab-PEG)2-ALP)及1分子的ALP和1分子的Fab结合的ALP标记Fab(Fab-PEG-ALP)。实际上,在图8B中,对于Fab-PEG-ALP,检测到ALP(m)(分子量约6万)的条带和处于被认为结合1分子Fab的分子量10万~13万左右的位置的2个条带。考察到,由于对于对于ALP(m)检测到2个条带,对ALP分子的马来酰亚胺修饰是对所述ALP分子中的Lys残基的侧链的随机修饰,由SH-PEG-Fab经SH-PEG向ALP的结合部位表观生成2种尺寸的Fab-ALP单体结合体种。实际上,过去报告了这样直链高分子PEG链的随机的1分子结合体在电泳中作为2个条带确认的事例(参照Sato H.,Advanced Drug Delivery Reviews,54,487-504(2002))。这被认为是与Fab经SH-PEG结合的ALP上的EMCS接头对于ALP分子随机修饰导致的影响。对于(Fab-PEG)2-ALP,在电泳中几乎确认不到未修饰ALP的条带。主要是成为上述的分子量约10万~13万左右的2条带的Fab-PEG-ALP。再者,被认为在分子量约20万左右的位置检测到1个来源于(Fab-PEG)2-ALP的条带。这些结果是合理的。其中,作为对Fab-PEG-ALP进行性能评价。如图8C所示,任何纯化物均在SEC分析中成为1峰,纯度高。再者,从纯化物的电泳条带推定的分子量在各蛋白质的分子量和更高分子侧被检测到被认为是因为由经直链高分子PEG(2K)的结合,作为结合体分子的表观的尺寸变大。
【6.自csF028-22Fab-Q标签的SH-PEG-Fab的ALP标记(实验例3)】
(1)偶联反应液的SEC分析
自csF028-22Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab、马来酰亚胺修饰ALP((Mal)n-ALP)、及它们的偶联反应液的SEC分析的结果示于图9。图中,“偶联”是指SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液的分析结果。尽管Fab和ALP的混合比仅为3:1,来源于SH-PEG(2K)-Fab的峰(保留时间约18.4分钟)仅残留30%左右,来源于(Mal)n-ALP的峰(保留时间约15.3分钟)也仅残留10%左右。反应效率与其他ALP偶联同样高。进而,除了推定为Fab-PEG-ALP的副峰(保留时间约14.8分钟)及推定为(Fab-PEG)2-ALP的副峰(保留时间约13.8分钟)之外,确认到推定为对于1分子ALP结合3分子Fab的主峰((Fab-PEG)3-ALP、保留时间约12.8分钟)。
(2)偶联反应峰的SEC分取及取得的级分的SEC分析
对于自csF028-22Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP((Mal)n-ALP)的偶联反应液而进行由SEC的分取,取得的各级分的由非还原SDS-PAGE及SEC的分析的结果示于图10A及B。如图10A所示,在分取的各级分中,观察到相当于基于推定的Fab结合数的ALP单体修饰体表征的条带。在图10B中得出如下结论,各峰以保留时间快速的顺序是(Fab-PEG)3-ALP、(Fab-PEG)2-ALP及Fab-PEG-ALP。(Fab-PEG)3-ALP及(Fab-PEG)2-ALP的纯度高,与此相比,Fab-PEG-ALP的纯度略低。但是,主生成物均作为主峰确认。
【7.sF001-5Fab'和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应(实验例4)】
sF001-5Fab'和(Mal)n-ALP的偶联反应液的SEC分取时的层析谱和取得的各级分的通过非还原SDS-PAGE的分析结果示于图11A及B。在自csF001-5Fab的SH-PEG-Fab的ALP标记(参照实验例3)中,SH-PEG-Fab和(Mal)n-ALP的摩尔比是1:1,与此相比,在此反应中以Fab':ALP=5:1的偶联比率进行。结果,如图11A所示,未反应的(Mal)n-ALP的峰的面积比偶联体的峰的面积大。这是指处于sF001-5Fab'中的Cys残基的侧链的SH基团和(Mal)n-ALP的偶联效率与自csF001-5Fab的SH-PEG-Fab和(Mal)n-ALP的偶联效率相比低。实际上,在SH-PEG接头法和随机标记法的各自中使用的ALP的马来酰亚胺修饰率作为EMCS试剂的添加量,前者相对于20当量,后者高达30当量。另外,伴随实际的EMCS修饰,也观察到多个SDS-PAGE的条带,所以被认为由随机标记法的偶联反应中的ALP的马来酰亚胺修饰率也高。本结果表明,相对于随机标记法,由SH-PEG接头法的SH-PEG-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联效率的高度显著。
ALP作为2个75kDa的分子合起来的150kDa的二聚体存在,如图11B所示,在SDS-PAGE中作为单体观察,在70kDa附近观察到条带。一方面,在偶联体中100kDa以上观察到多个条带。与经PEG-SH接头的结合体不同,偶联体反映表观的尺寸,被认为生成Fab 1分子结合体、2分子结合体、再者多个结合的结合体的条带。再者,在高分子量侧的偶联体中,由于在还原后,未设置氧化工序,有一部分、Fab'的H链L链间的S-S被还原的状态下,有还生成向Fab'分子结合2个ALP单体的可能性。但是,从分取级分几乎检测不到来源于未标记ALP的条带,所以在以下的评价中使用的(Fab)n-ALP中几乎未混入未标记ALP。此(Fab)n-ALP纯化样品的SEC分析结果示于图12。与自csF001-5Fab的SH-PEG-Fab和ALP的均质复合体((Fab-PEG)2-ALP及Fab-PEG-ALP)的SEC分析的结果(参照图5)不同,在图12中,(Fab)n-ALP的SEC峰是宽域,Fab结合数每的峰分离性低。这是因为,前者通过Fab和ALP经PEG链结合,表观的分子量变大,用SEC的分离性升高,与此相比,由于在(Fab)n-ALP中是经短链的EMCS接头的结合体,表观的分子量未变大,分离性低。另外是因为,Fab的结合数每的各峰是对于(Fab-PEG)2-ALP及Fab-PEG-ALP的各自是宽域,Fab-PEG是仅与铰链部选择性的PEG链末端SH基团的结合体,与此相比,在由随机标记法的偶联体中,通过Fab的结合部位存在铰链部Cys残基、及链间Cys残基等多个所,ALP结合体结构更杂合。
【8.ALP标记抗体的ALP活性测定(实验例7)】
ALP分子本身和自csF028-22Fab-Q标签的Fab-PEG-ALP、(Fab-PEG)2-ALP及(Fab-PEG)3-ALP的ALP比活性示于表3。如表3所示,各ALP标记抗体,即使对于ALP分子的Fab-PEG结合数增加,其比活性未降低。从而表明,由本实施方式的制造方法能调制保持ALP活性的ALP标记多肽。再者,比活性超100%被认为因级分样品的纯度影响。
【表3】
/ | ALP | Fab-PEG-ALP | (Fab-PEG)2-ALP | (Fab-PEG)3-ALP |
分子量 | 150,000 | 202,000 | 254,000 | 306,000 |
ALP比活性(U/nmol) | 785 | 902 | 857 | 797 |
ALP比活性(对ALP%) | 100% | 115% | 109% | 102% |
【9.含Fab-PEG-ALP及(Fab')n-ALP的试剂的性能评价(实验例8)】
(1)R3试剂的反应性
以自csF001-5Fab-Q标签的Fab-PEG-ALP和由随机标记法得到的(Fab')n-ALP的各自作为R3试剂使用,将测定D-PBS(0.1% BSA,pH7.4)基团的受试体的结果分为信号、噪声(也称为背景)及信号/噪声(S/N)比,示于图13A~C。图中,横轴的抗体浓度表示与各抗体结合的ALP的活性。由于HISCL(注册商标)HIV Ag+Ab试剂的测定值(count)依赖于抗原浓度升高,在图13A的坐标图中,信号的值越高,表示与抗原的反应性越高。相反,在图13B的坐标图中,噪声的值越低,表示特异性越高。在(Fab')n-ALP中,比较信号变大,噪声也变大。作为结果,如图13C所示,在(Fab')n-ALP中,表示检测用试剂的灵敏度的S/N比变低。一方面,对于自csF001-5Fab-Q标签的Fab-PEG-ALP,信号及噪声均比(Fab')n-ALP变小。特别是,噪声与(Fab')n-ALP相比被抑制得非常地低。作为结果,表示灵敏度的S/N比在0.5U/mL中显示(Fab')n-ALP的4倍以上的值。再者,相对于Fab-PEG-ALP的相同的ALP活性值,(Fab')n-ALP的方显示高的信号值被认为是因对于1分子ALP平均结合多个分子的Fab。从以上的结果,通过使用由本实施方式的制造方法得到的酶标记抗体,期待体外诊断药的灵敏度的提升。
(2)由来源于血清的成分的背景升高的抑制
为了对背景进行比较,以自csF001-5Fab-Q标签的Fab-PEG-ALP和(Fab')n-ALP的各自作为R3试剂使用,对D-PBS(0.1% BSA,pH7.4)及人合并血清进行测定的结果示于图14。在PBS基团的受试体的测定中,自csF001-5Fab-Q标签的Fab-PEG-ALP的方比(Fab')n-ALP背景降低如上所述,如图14所示,对人血清中的背景进行比较的结果,其差异变得进一步显著。即,在(Fab')n-ALP中,在血清中其背景升高5.6倍,与此相比,在Fab-PEG-ALP中是1.26倍,几乎确认不到升高。由于血清中含各种各样的蛋白质或脂质,从而比缓冲液基的受试体背景变高的情况多。在结果中,相对于结构不均一的(Fab')n-ALP,经SH-PEG接头的Fab-PEG-ALP可抑制来源于血清的背景升高的要因被认为Fab-PEG-ALP是除了结构均质之外,经水和由亲水性高的直链PEG接头构成的分子种。虽未图示,通过背景降低,在Fab-PEG-ALP中,对于灵敏度,也是在p24抗原的全浓度域升高,最大30倍左右提升。
【10.自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG-Fab的调制及其生物素标记(实验例1及2)】
(1)使用BTG酶的由SH-PEG-NH2接头(2K)的HBs628Fab-Q标签的修饰
对HBs628Fab-Q标签和上述(a)的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的由BTG酶的反应后的生成物进行SEC分析的结果示于图15。图中,“+SH-PEG-NH2”是指添加SH-PEG-NH2接头(2K)的反应液的分析结果,“-SH-PEG-NH2”是指未添加SH-PEG-NH2接头(2K)的反应液的分析结果。如图15所示,在未添加接头时,与csF001-5Fab-Q标签同样,在Fab的峰上确认不到变化。即,未发生Q标签中的Gln残基和Fab上的Lys残基之间的Fab彼此的分子间缔合。一方面,在添加接头时,保留时间12.3分钟附近的未修饰Fab的峰减少,在作为高分子量侧的保留时间11.5分钟附近新确认1个变动的峰。这表明,在直链结构的SH-PEG-NH2接头1分子经Q标签结合的SH-PEG-Fab中,表观的尺寸升高,作为分离的峰观察。再者,所述峰与未修饰Fab峰相比宽域是因为接头中的PEG链具有宽的分子量分布。从峰面积换算的反应效率是约72%,与csF001-5Fab-Q标签的结果同程度。
(2)自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG-Fab的生物素标记
分取csF001-5Fab-Q标签和上述(a)的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的反应液的SEC分析中的保留时间11.5分钟的峰而分析的结果和分取含SH-PEG-Fab的浓缩液和生物素-PEAC5-马来酰亚胺的反应液的SEC分析中的峰而进行分析的结果示于图16A及B。在各反应液的SEC分析中分取的峰是图16A中的被虚线包围的峰。参照图16B,从csF001-5Fab-Q标签和SH-PEG-NH2接头(2K)的反应液及其分取样品的非还原SDS-PAGE分析结果提示,作为生成物的SH-PEG-Fab,相对于未反应Fab,在40KDa附近在高分子量侧微少变动(→表示的条带)、结合有1分子的SH-PEG-NH2接头。再者,在电泳中,通过在一部分H链和L链不连接的20KDa附近检测到2个条带。这是由SH-PEG-NH2接头(2K)的结合改变Fab的包装结构,由一部分接头的SH基还原。实际,即使将Fab和SH-PEG-NH2接头(2K)在反应液中在BTG酶未添加的状态下放置,Fab的H链L链间的S-S键也不被还原(Data not shown)。参照图16C,纯化样品是SEC纯度高的1峰。
参照图16B,从SH-PEG-Fab和生物素-PEAC5-马来酰亚胺的反应液及其分取样品的非还原SDS-PAGE分析结果,与SH-PEG-Fab同样地,在40KDa附近,相对于未修饰Fab检测到微少变动的1条带。条带强度反映反应液的SEC分取的层析谱中的修饰级分的峰强度比。另外,几乎检测不到来源于SH-PEG-Fab中确认的H链和L链的条带,可确认到再构成Fab的S-S键。这被认为是因为,由生物素-PEAC5-马来酰亚胺的修饰,SH-PEG-Fab的包装结构稳定,构成一部分切的链间S-S键。还表明,仅此生物素修饰体反应液、及其分取体,在非还原SDS-PAGE中的生成物的位置确认到高的强度的条带,SH-PEG-Fab被生物素标记。
【11.自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG-Fab及生物素-PEG-Fab的LC-MS分析(实验例2)】
(1)HBs628Fab-Q标签的LC-MS分析的结果
HBs628Fab-Q标签的非还原及还原的样品的LC-MS光谱示于图17A及B。参照图17A,在非还原样品的LC-MS中,观察到HBs628Fab-Q标签的+20~+41价的多价离子。有一部分的Cys残基有成为还原状态的可能性,是反映测量分子量的光谱。一方面,参照图17B,在还原的样品的LC-MS中,观测到L链和H链的多价离子。另外,对于L链,观察到切断N末端的2残基的切断物。这表明,尽管L链和H链的N末端被焦谷氨酰化,是设计的骨架结构体。
(2)SH-PEG-Fab及生物素-PEG-Fab的LC-MS分析的结果
HBs628Fab-Q标签和其SH-PEG-Fab及生物素-PEG-Fab的非还原样品的LC-MS光谱示于图18。对于SH-PEG-Fab及生物素-PEG-Fab的各自,图18的中段及下段的光谱中,观察到▼所示的多价离子。信号反映PEG链的分子量分布,作为宽域的信号被观察到。非还原的SH-PEG-Fab及生物素-PEG-Fab的测量平均分子量(数平均分子量)各自是48710及49223。与未修饰HBs628Fab-Q标签的测量平均分子量(数平均分子量)的差异各自是2141和2654。从而提示,SH-PEG-Fab及生物素-PEG-Fab各自平均结合有1个SH-PEG链(2K)及1个生物素-PEG链(2K)。
HBs628Fab-Q标签及其SH-PEG-Fab的还原的样品的LC-MS光谱示于图19。由还原观测L链和H链的多价离子。SH-PEG-Fab的L链的光谱图案与HBs628Fab-Q标签无异。一方面,SH-PEG-Fab的H链反映PEG链的分子量分而作为宽域的信号被观察到(参照附弧“⌒”的位置)。以上的结果显示,由BTG酶催化的反应,1分子的上述(a)的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)与HBs628Fab-Q标签的H链结合。由此知晓,抗体中的内在Gln残基除了Fc部分的糖链除去后的Gln295之外,不成为BTG酶的底物(国际公开第2012/059882号及Jeger S.等,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,49,9995-9997(2010)参照)。从而提示,1分子的SH-PEG-NH2接头(2K)与HBs628Fab-Q标签的Q标签中的Gln残基结合。
【12.自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG-Fab的ALP标记(实验例3)】
对于自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP((Mal)n-ALP)的偶联反应液而进行由SEC的分取,取得的各级分的SEC分析的结果示于图20。另外,将所述偶联反应液和各原料由非还原SDS-PAGE分析的结果示于图21。参照图20,由Fab和ALP的混合比2:1、1:1或1:2的反应液的SEC分析中的峰面积比算出的SH-PEG-Fab的残留率无大的差异,大致80%左右反应。对于SH-PEG-Fab的(Mal)n-ALP的添加摩尔比越高,来源于(Fab-PEG)2-ALP的保留时间约12.3分钟的峰面积的比例越升高。从而表明,SH-PEG-Fab与csF001-5Fab-Q标签的结果同样,与马来酰亚胺修饰ALP的反应效率由PEG接头效果升高。还表明,通过控制该反应摩尔比,可对于ALP调整Fab的结合比例。再者,在3种反应条件,(Mal)n-ALP峰的残留率是添加的SH-PEG-Fab的摩尔比越高越降低,是合理的。参照图21,从各自的原料及反应液的非还原SDS-PAGE(相当于由作为二聚体的ALP单体的生成物的条带)的结果,对于(Mal)n-ALP的SH-PEG-Fab的添加比率越高,被认为是SH-PEG-Fab结合于ALP单体的条带数越增加。另外,还从高分子量域的条带的比例升高,表明可从非还原SDS-PAGE的结果调整Fab和如ALP一样的蛋白质彼此的偶联比率。
【13.自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG-Fab的调制及其荧光标记(实验例1及5)】
(1)使用BTG酶的由SH-PEG-NH2接头(2K)的csF001-25Fab-Q标签的修饰在提高导入效率的反应条件下的csF001-25Fab-Q标签和上述(a)的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的由BTG酶的反应之后,脱盐及浓缩的反应液的SEC分析的结果示于图22。图中,“Fab”是指未添加SH-PEG-NH2接头(2K)的反应液的分析结果。保留时间19.8分钟附近的未修饰Fab的峰几乎消失,在作为高分子量侧的保留时间18.9分钟附近新确认变动的峰。反应效率从峰面积是93%。
(2)由Alexa488-马来酰亚胺的SH-PEG-Fab的荧光标记
对自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和Alexa488-马来酰亚胺的反应液进行SEC分析的结果示于图23A及B。图23A中,上的层析谱是添加20当量Alexa488-马来酰亚胺的反应液的分析结果,下的层析谱是未添加Alexa488-马来酰亚胺的反应液的分析结果。参照图23A显示,保留时间见不到差异,未发生由荧光团标记的凝集等。另外表明,在未添加Alexa488-马来酰亚胺的反应液中,在以下的层析谱中也未确认来源于SH-PEG链接头彼此的缔合的峰,也未发生缔合。对于添加Alexa488-马来酰亚胺的反应液的脱盐及纯化级分,将SEC分析用UV及荧光吸收确认的结果,如图23B所示,生成物显示来源于Alexa488的荧光吸收。从而表明,未制作SH-PEG-Fab和Alexa488-马来酰亚胺以1对1结合的Alexa488-PEG-Fab。
【14.自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG-Fab及Alexa488-PEG-Fab的LC-MS分析(实验例5)】
csF001-25Fab-Q标签及其SH-PEG-Fab及Alexa488-PEG-Fab的还原的样品的LC-MS光谱示于图24A及B。图24B是图24A的放大图。由SH-PEG-NH2接头(2K)的结合,SH-PEG-Fab的L链的光谱图案与csF001-25Fab-Q标签无异。一方面,SH-PEG-Fab的H链的多价离子(参照↓印付的位置)反映PEG链的分子量分而作为宽域的信号被观察到(参照附▼的位置)。结果表明,由BTG酶催化的反应,1分子的SH-PEG-NH2接头(2K)与csF001-25Fab-Q标签的H链结合。如上所述,知晓抗体中的内在Gln残基除了Fc部分的糖链除去后的Gln295之外,不成为BTG酶的底物,从而提示1分子的上述(a)的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)与HBs628Fab-Q标签的Q标签中的Gln残基结合。再者,由Alexa488-马来酰亚胺的结合,来源于H链的多价离子的宽域的PEG链的光谱几乎消失,观察到反映1分子的Alexa488的结合的变动(参照附▼的位置)。结果表明,Alexa488-PEG-Fab是1分子的Alexa488经SH-PEG接头结合的Fab。
【15.使用BTG酶的由SH-PEG-NH2接头(2K)的抗CD20 Fab-Q标签的修饰(实验例1)】
在提高导入效率的反应条件下的抗CD20 Fab-Q标签和上述(a')的SH-PEG-NH2接头(2K)(Sigma-Aldrich公司)的由BTG酶的反应之后,脱盐及浓缩的反应液的SEC分析的结果示于图25。图中,“Fab-Q标签”是指未添加SH-PEG-NH2接头(2K)的反应液的分析结果。保留时间20.2分钟附近的未修饰Fab的峰几乎消失,在作为高分子量侧的保留时间19.0分钟附近新确认变动的峰。反应效率从峰面积是77%。尽管在提高导入效率的条件下进行反应,与其他Fab-Q标签相比,反应效率低被认为或许是由于Q标签的C末端未混入脯氨酸残基,容易受肽酶的影响,在Fab-Q标签原料中含Q标签被切断。
【16.SH-PEG-Fab的R-PE标记(实验例6)】
(1)R-PE的马来酰亚胺修饰
将R-PE和EMCS试剂的反应液用SEC及逆相HPLC分析的结果示于图26A及B。参照图26A,由与EMCS试剂的反应得到的马来酰亚胺修饰R-PE的峰与未修饰R-PE相比,保留时间确认不到大的差异。从而,提示保持R-PE的结构。一方面,在该逆相HPLC的分析结果中,如图26B所示,推定为作为R-PE的主构成单元的α亚基及β亚基的峰由EMCS修饰,在保留时间后方宽域化。从而,判断为可调制结合多个疏水性高的EMCS试剂的马来酰亚胺修饰体((Mal)n-R-PE)。再者,对于峰的归属,从峰面积值的尺寸,以后方峰作为分子量大的β亚基,以前方峰作为分子量小的α亚基,这些是暂定的。
(2)自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG-Fab和马来酰亚胺修饰R-PE的偶联反应
自sF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab、(Mal)n-R-PE、及它们的偶联反应液的SEC分析的结果示于图27。尽管Fab和R-PE的混合比仅为3:1,来源于SH-PEG(2K)-Fab的峰(保留时间约19.2分钟)减少,来源于(Mal)n-R-PE的峰(保留时间约16.0分钟)也仅残留约7%。即,反应效率高。从推定PEG效果(表观的分子量升高)的保留时间,除了推定为Fab-PEG-R-PE的峰(保留时间约14.8分钟)之外,确认到推定为(Fab-PEG)2-R-PE的峰(保留时间约13.4分钟)及推定为(Fab-PEG)3-R-PE的峰(保留时间约12.8分钟)。
(3)偶联反应峰的SEC分取及取得的级分的SEC分析
对于自sF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液而进行由SEC的分取,对取得的各级分进行SEC分析的结果示于图28。从图28得出如下结论,各峰以保留时间快速的顺序是(Fab-PEG)3-R-PE、(Fab-PEG)2-R-PE及Fab-PEG-R-PE。处于Fab-PEG的结合数越增加,其UV峰面积相当的荧光强度越降低的倾向,反映推测的结合体结构。(Fab-PEG)3-ALP及(Fab-PEG)2-ALP的纯度高,与此相比,Fab-PEG-ALP的纯度略低。但是,主生成物均作为主峰确认。生成物的峰伴随与R-PE的反应,确认到来源于PE的荧光吸收。
(4)自抗CD20 Fab-Q标签的SH-PEG-Fab和马来酰亚胺修饰R-PE的偶联反应自抗CD20 Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab、(Mal)n-R-PE、及它们的偶联反应液的SEC分析的结果示于图29。尽管Fab和R-PE的混合比仅为3:1,来源于SH-PEG(2K)-Fab的峰(保留时间约19.2分钟)减少,来源于(Mal)n-R-PE的峰(保留时间约15.8分钟)也所剩无几。即,反应效率高。从推定PEG效果(表观的分子量升高)的保留时间,除了推定为Fab-PEG-R-PE的峰(保留时间约14.8分钟)之外,确认到推定为(Fab-PEG)2-R-PE的峰(保留时间约13.4分钟)及推定为(Fab-PEG)3-R-PE的峰(保留时间约12.8分钟)。生成物的峰伴随与R-PE的反应,确认到来源于PE的荧光吸收。
(5)偶联反应峰的SEC分取及取得的级分的SEC分析
对于自抗CD20 Fab-Q标签的SH-PEG(2K)-Fab和马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应液而进行由SEC的分取,对取得的各级分进行SEC分析的结果示于图30。从图30得出如下结论,各峰以保留时间快速的顺序是(Fab-PEG)3-R-PE、(Fab-PEG)2-R-PE及Fab-PEG-R-PE。处于Fab-PEG的结合数越增加,其UV峰面积相当的荧光强度越降低的倾向,反映推测的结合体结构。(Fab-PEG)3-ALP及(Fab-PEG)2-ALP的纯度高,与此相比,Fab-PEG-ALP的纯度略低。但是,主生成物均作为主峰确认。生成物的峰伴随与R-PE的反应,确认到来源于PE的荧光吸收。
【17.Alexa488标记抗体的抗原结合能的评价(实验例9)】
将csF001-25Fab-Q标签和其SH-PEG(2K)-Fab及Alexa488-PEG-Fab对抗原的相互作用由Biacore(商标)T200(Cytiva公司)测定结果示于表4及图31A~D。再者,由于SH-PEG(2K)-Fab及Alexa488-PEG-Fab的测定日各自不同,分开示结果。如表4所示,SH-PEG(2K)-Fab及Alexa488-PEG-Fab的KD值均与未修饰Fab(csF001-25Fab-Q标签)的KD值确认不到差异。另外,如图31A~D所示,在传感图的图案中也确认不到大的差异。从而,本标记方法无对抗原结合能的影响。
【表4】
样品 | KD(M) |
Fab | 1.5×10-9 |
SH-PEG(2K)-Fab | 1.5×10-9 |
样品 | KD(M) |
Fab | 1.3×10-9 |
Alexa488-PEG-Fab | 1.3×10-9 |
【18.R-PE标记抗体的抗原结合能(实验例10)】
将自csF001-25Fab-Q标签的Fab-PEG-R-PE、(Fab-PEG)2-R-PE及(Fab-PEG)3-R-PE的抗原结合能由ELISA测定的结果示于图32A及B。图32A显示未添加抗原时的结果,图32B显示添加抗原时的结果。参照图32A,在具备检测用试剂的荧光强度(即,具备R-PE标记抗体的摩尔浓度)上,对各稀释倍率中的荧光信号值进行比较。结果,在任何稀释倍率中,均在检测的荧光信号值中确认不到大的差异。一方面,参照图32B,在添加抗原时,对于检测到的荧光信号值,在R-PE标记抗体间确认到差异。具体而言,在相同的稀释倍率中,Fab-PEG-R-PE的荧光信号值最低,(Fab-PEG)2-R-PE的荧光信号值第二高,(Fab-PEG)3-R-PE的荧光信号值变最高。即,Fab-PEG分子的结合数越高,其荧光信号值越高。这被认为是因为,通过向R-PE分子上结合多个Fab-PEG分子,发挥抗原结合中的亲和效果,R-PE分子相当的抗原捕获剂能升高。实际上,通过将检测用试剂中的(Fab-PEG)2-R-PE及(Fab-PEG)3-R-PE的浓度各自设为Fab-PEG-R-PE的约1/3及约1/5,显示与使用Fab-PEG-R-PE时同程度的荧光信号值。结果表明,对于R-PE结合多个Fab-PEG分子的R-PE标记抗体有抗原结合能升高,使每分子换算的抗体-R-PE结合体的荧光信号值增大的效果。
【19.含R-PE标记抗体的试剂的性能评价(实验例11)】
由以自抗CD20 Fab-Q标签的Fab-PEG-R-PE、(Fab-PEG)2-R-PE及(Fab-PEG)3-R-PE的各自作为检测用抗体使用的FCM法测定表达CD20的细胞(Ramos细胞)的结果示于图33。在具备检测用试剂的荧光强度(即,具备R-PE标记抗体的摩尔浓度)上,对各稀释倍率中的荧光信号值进行比较。参照图33,对于检测到的荧光信号值,在R-PE标记抗体间确认到差异。具体而言,在相同的稀释倍率中,Fab-PEG-R-PE的荧光信号值最低,(Fab-PEG)2-R-PE的荧光信号值第二高,(Fab-PEG)3-R-PE的荧光信号值变最高。即,Fab-PEG分子的结合数越高,其荧光信号值越高。这被认为是因为,通过向R-PE分子上结合多个Fab-PEG分子,发挥与细胞上的CD20的结合中的亲和效果,R-PE分子相当的抗原捕获剂能升高。实际上,通过将检测用试剂中的(Fab-PEG)2-R-PE及(Fab-PEG)3-R-PE的浓度各自设为Fab-PEG-R-PE的约1/3及约1/4,显示与使用Fab-PEG-R-PE时同程度的荧光信号值。从而表明,对于R-PE结合多个Fab-PEG分子的R-PE标记抗体可由亲和效果提升FCM中使用的检测用试剂的性能。
【20.SH-PEG-NH2接头(3.5K)及SH-PEG-NH2接头(5K)的Infusion MS分析的结果】
将上述(d)及(e)的各SH-PEG-NH2接头(Sigma-Aldrich公司)由Infusion MS分析的结果示于图34A及B。图中,箭头是指表示分子量的最小值的峰、表示最频分子量的峰、及表示分子量的最大值的峰。上述(d)及(e)的接头的最频分子量各自是3511.1及4699.8。另外,基于分析结果而算出各接头的重量平均分子量。如从图34A及B得知,各接头的重量平均分子量及分子量分布是接近由厂商公开的平均分子量的表征。具体而言,如下所述。
·上述(d)的接头:重量平均分子量3544.2、分子量分布2982.7~4171.5
·上述(e)的接头:重量平均分子量4586.6、分子量分布3951.3~5228.1
添加BTG酶反应液(NaCl未添加、pH8.2)之后的各SH-PEG-NH2接头几乎确认不到经二硫化物(S-S)结合的二量化,检测到与PEG链的分子量分布相关的单体的MS光谱。从而表明,上述(d)及(e)的SH-PEG-NH2接头均未缔合。
【21.由Alexa488-马来酰亚胺的SH-PEG-Fab的荧光标记(实验例12及13)】
(1)使用BTG酶的由SH-PEG-NH2接头(3.5K/5K)的csF001-5Fab-Q标签的修饰
在提高导入效率的反应条件下的csF001-25Fab-Q标签和上述(d)的SH-PEG-NH2接头(3.5K)(Sigma-Aldrich公司)及上述(e)的SH-PEG-NH2接头(5K)(Sigma-Aldrich公司)的各自的由BTG酶的反应之后,脱盐及浓缩的反应液的SEC分析及非还原SDS-PAGE的结果示于图35A~C。参照图35A,保留时间19.8分钟附近的未修饰Fab的峰几乎消失,在作为高分子量侧的保留时间18.4分钟附近(3.5K)及17.9分钟附近(5K)的各自新确认变动的峰。这些保留时间相对于SH-PEG(2K)-Fab,在更高分子侧变动。反应效率从峰面积是98%(3.5K)及92%(5K)。
(2)由Alexa488-马来酰亚胺的SH-PEG-Fab的荧光标记
对自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(3.5K)-Fab和Alexa488-马来酰亚胺的反应液进行SEC分析的结果示于图36A及B。对自csF001-25Fab-Q标签的SH-PEG(5K)-Fab和Alexa488-马来酰亚胺的反应液进行SEC分析的结果示于图37A及B。图36A及37A中,上的层析谱是添加20当量Alexa488-马来酰亚胺的反应液的分析结果,下的层析谱是未添加Alexa488-马来酰亚胺的反应液的分析结果。
参照图36A显示,在反应液的SEC分析中,伴随Alexa488的结合,在保留时间确认到微少的差异(SH-PEG-Fab:约18.6分钟、Alexa488-PEG-Fab:约18.4分钟),未发生由荧光团标记的凝集等。另外,如图36B所示,在反应液的SEC分析中,生成物在保留时间约18.4分钟附近显示来源于Alexa488的荧光吸收。从而显示,可制作SH-PEG(3.5K)-Fab和Alexa488-马来酰亚胺以1对1结合的Alexa488-PEG-Fab。
参照图37A显示,在反应液的SEC分析中,伴随Alexa488的结合,在保留时间确认到微少的差异(SH-PEG-Fab:约18.2分钟、Alexa488-PEG-Fab:约17.9分钟),未发生由荧光团标记的凝集等。另外,如图37B所示,在反应液的SEC分析中,生成物在保留时间约18.0分钟附近显示来源于Alexa488的荧光吸收。从而显示,可制作SH-PEG(5K)-Fab和Alexa488-马来酰亚胺以1对1结合的Alexa488-PEG-Fab。
【22.由SH-PEG-NH2接头(400Da)的Fab抗体的修饰(实验例14)】
(1)使用BTG酶的由SH-PEG-NH2接头(400Da)的csF001-5Fab-Q标签的修饰
对csF001-5Fab-Q标签和上述(f)的SH-PEG-NH2接头(400Da)(Nanocs Inc.公司)的由BTG酶的反应液进行SEC分析(分取)的结果示于图38。如图38所示,在添加SH-PEG-NH2接头(400Da)时,峰顶在保留时间前方微少变动。还有相对于未修饰Fab(csF001-5Fab-Q标签),结合有1分子所述接头的Fab的表观的尺寸在层析谱上无差异的可能性。从而,将分取的级分在以下的与马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应中使用。
(2)SH-PEG(400Da)-Fab的ALP标记
自csF001-5Fab-Q标签的SH-PEG(400Da)-Fab、马来酰亚胺修饰ALP((Mal)n-ALP)、及它们的偶联反应液的SEC分析的结果示于图39。如图39所示,在反应液的SEC分析中,在保留时间约13.8分钟附近检测到新的宽域峰,几乎确认不到来源于Fab反应生成物及(Mal)n-ALP的原料峰面积的降低。从结果得知,几乎未进行SH-PEG(400Da)-Fab和(Mal)n-ALP的偶联反应,即使是偶联体,也微少。从而显示,在本实施方式的标记多肽的制造方法中,SH-PEG-NH2接头(400Da)不适宜。
【23.由SH-PEG-NH2接头(1K)的Fab抗体的修饰(实验例15)】
(1)使用BTG酶的由SH-PEG-NH2接头(1K)的HBs628Fab-Q标签的修饰
对HBs628Fab-Q标签和上述(g)的SH-PEG-NH2接头(1K)(Creative PEGWorks公司)的由BTG酶的反应液进行SEC分析的结果示于图40。如图40所示,在未添加接头时,在Fab的峰确认不到变化。即,未发生Q标签中的Gln残基和Fab上的Lys残基之间的Fab彼此的分子间缔合。一方面,在添加接头时,保留时间18.7分钟附近的未修饰Fab的峰减少,分离性不良,在高分子量侧新确认峰。这被认为是因为,与SH-PEG-NH2接头(2K)的链长相比,SH-PEG-NH2接头(1K)是其一半的链长,即使与Fab-Q标签结合,表观的尺寸未大升高。从而,保留时间约17.7分钟附近的峰推定为SH-PEG(1K)-Fab。除了此峰之外,在保留时间约16.9分钟附近观察到来源于更高分子量的峰。此位置是推定为比由SH-PEG(1K)-Fab的级分的SEC的溶出位置高分子量侧。从而,推测更高分子量侧的所述级分是否是由经SH-PEG接头的SH基彼此的S-S键的缔合生成的PEG-S-S-PEG-Fab。实际、Dickgiesser S.等(BioconjugateChemistry,31,1070-1076(2020)参照)在由BTG酶的反应中,尝试向抗体中的Gln残基作为TG的底物选择性导入具有SH基团的低分子接头Cysteamine(SH-CH2-CH2-NH2),报告由Cysteamine的TG修饰抗体导入有上述Cysteamine中的SH基彼此缔合的二聚体。因此认为,反应后,使用还原剂TCEP完全还原之后,由再氧化进行S-S再构成。从有这样的见解也可知,由推测为由SH-PEG-NH2接头(1K)生成的S-S彼此的缔合的二聚体的形成无不同。即使在偶联反应液中含未反应的Fab-Q标签及PEG-S-S-PEG-Fab,由于它们不具有游离的SH基团,不与(Mal)n-ALP反应,使所述反应液脱盐,在以下的与马来酰亚胺修饰ALP的偶联反应中使用。
(2)SH-PEG(1K)-Fab的ALP标记
自HBs628Fab-Q标签的SH-PEG(1K)-Fab、马来酰亚胺修饰ALP((Mal)n-ALP)、及它们的偶联反应液的SEC分析的结果示于图41。用Fab和ALP的混合比2:1进行偶联反应的结果,如图41所示,来源于(Mal)n-ALP的峰(保留时间约15.2分钟)是43%左右反应,SH-PEG(1K)反应生成物之中,认为来源于SH-PEG-Fab的峰成分(保留时间约17.8分钟)消失,新确认推定为ALP结合1分子的Fab的Fab-PEG-ALP的峰。但是,生成物以此推定为Fab-PEG-ALP的峰(保留时间约13.8分钟)为主,仅微少生成向ALP结合2分子的Fab的(Fab-PEG)2-ALP(保留时间约12.8分钟)。这样,SH-PEG-NH2接头(1K)在与Fab-Q标签反应时,由于接头彼此二聚体化了,与(Mal)n-ALP的偶联效率低。结果显示,经PEG链的分子量1000程度的SH-PEG-NH2接头的Fab-Q标签和(Mal)n-ALP的偶联体是SH-PEG(1K)-Fab和无修饰Fab-Q标签的由SEC的分离性差。另外,通过由接头彼此的缔合的副反应,蛋白质彼此的偶联效率低,SH-PEG-NH2接头(1K)的使用被判断为不实用。
从以上的实验结果得知,由本发明,与使用SH-PEG-NH2接头(400Da)或SH-PEG-NH2接头(1K)时相比,向多肽导入标记的效率高。
【符号的说明】
10:试剂
11:试剂盒
12:第1容器
13:捆包箱
14:附带文书
Claims (30)
1.标记多肽,其含具有下式(I)所示的侧链的谷氨酰胺残基:
【化1】
式中,
(C)是谷氨酰胺残基的α碳,
X是直链亚烷基,
Y是聚乙二醇链,
Z是标记,
L是间隔物或连接键,
所述聚乙二醇链的分子量是1100以上。
2.权利要求1所述的标记多肽,其为抗体和含具有所述侧链的谷氨酰胺残基的肽标签的融合多肽。
3.修饰多肽,其含具有下式(II)所示的侧链的谷氨酰胺残基:
【化2】
式中,
(C)是所述谷氨酰胺残基的α碳,
X是直链亚烷基,
Y是聚乙二醇链,
所述聚乙二醇链的分子量是1100以上。
4.权利要求3所述的修饰多肽,其为抗体和含具有所述侧链的谷氨酰胺残基的肽标签的融合多肽。
5.权利要求1~4之任一项所述的多肽,其中所述聚乙二醇链的重量平均分子量是1300以上。
6.权利要求1~4之任一项所述的多肽,其中所述聚乙二醇链的重量平均分子量是1700以上。
7.权利要求1~4之任一项所述的多肽,其中所述聚乙二醇链由下式(III)所示:
-(OCH2CH2)n-或-(CH2CH2O)n-(III)
式中,n是25以上的整数。
8.权利要求7所述的多肽,其中所述n是39以上的整数。
9.权利要求1~4之任一项所述的多肽,其中所述直链亚烷基的碳原子数是2以上10以下。
10.权利要求1或2所述的标记多肽,其中所述标记是选自下列的至少1种:生物素类、酶、荧光染料、荧光蛋白质及半抗原。
11.权利要求2或4所述的多肽,其中所述抗体是:Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd'、Fv、scFv、dAb、rIgG、轻链、重链抗体、重链抗体的可变区域、双抗体或三链抗体。
12.试剂,其含权利要求1~4之任一项所述的多肽。
13.修饰多肽的制造方法,其包括:
通过在转谷氨酰胺酶的存在下使含谷氨酰胺残基的多肽和下式(VI)所示的接头接触,在所述谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链结合所述接头的工序:
NH2-X-Y-SH(VI)
式中,
X是直链亚烷基,
Y是聚乙二醇链,
所述聚乙二醇链的分子量是1100以上,及
取得由所述羧酰胺侧链和所述接头的结合生成的修饰多肽的工序,
其中在所述修饰多肽中,所述谷氨酰胺残基的侧链由下式(II)所示:
【化3】
式中,
(C)是所述谷氨酰胺残基的α碳,
X是直链亚烷基,
Y是聚乙二醇链,
所述聚乙二醇链的分子量是1100以上。
14.标记多肽的制造方法,其包括:
通过在转谷氨酰胺酶的存在下使含谷氨酰胺残基的多肽和下式(VI)所示的接头接触,在所述谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链结合所述接头的工序:
NH2-X-Y-SH(VI)
式中,
X是直链亚烷基,
Y是聚乙二醇链,
所述聚乙二醇链的分子量是1100以上,
取得由所述羧酰胺侧链和所述接头的结合生成的修饰多肽的工序,
通过使所述修饰多肽和具有马来酰亚胺基的标记接触,在与所述修饰多肽结合的接头结合标记的工序,及
取得由所述修饰多肽和标记的结合生成的标记多肽的工序,
其中在所述标记多肽中,所述谷氨酰胺残基的侧链由下式(I)所示:
【化4】
式中,
(C)是谷氨酰胺残基的α碳,
X是直链亚烷基,
Y是聚乙二醇链,
Z是标记,
L是间隔物或连接键,
所述聚乙二醇链的分子量是1100以上。
15.权利要求13或14所述的制造方法,其中所述含谷氨酰胺残基的多肽是抗体和含谷氨酰胺残基的肽标签的融合多肽。
16.权利要求13或14所述的制造方法,其中所述聚乙二醇链的重量平均分子量是1300以上。
17.权利要求13或14所述的制造方法,其中所述聚乙二醇链的重量平均分子量是1700以上。
18.权利要求13或14所述的制造方法,其中所述聚乙二醇链由下式(III)所示:
-(OCH2CH2)n-或-(CH2CH2O)n-(III)
式中,n是25以上的整数。
19.权利要求18所述的制造方法,其中所述n是39以上的整数。
20.权利要求13或14所述的制造方法,其中所述直链亚烷基的碳原子数是2以上10以下。
21.权利要求14所述的制造方法,其中所述标记是选自下列的至少1种:生物素类、酶、荧光染料、荧光蛋白质及半抗原。
22.权利要求15所述的制造方法,其中所述抗体是选自下列的至少1种:Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd'、Fv、scFv、dAb、rIgG、轻链、重链抗体、重链抗体的可变区域、双抗体及三链抗体。
23.目标物质的测定方法,其包括:
形成权利要求2所述的标记多肽和目标物质的免疫复合体的工序,及
检测由所述免疫复合体中所含的所述标记发生的信号的工序。
24.权利要求23所述的测定方法,其中在所述形成的工序中,在固相上形成所述免疫复合体。
25.权利要求23或24所述的测定方法,其中在所述形成的工序和所述检测的工序之间,还包括除去未反应的游离成分的工序。
26.权利要求23或24所述的测定方法,其中所述目标物质是选自下列的至少1种:蛋白质、寡肽、核酸、脂质、糖链及半抗原。
27.权利要求23或24所述的测定方法,其中所述标记是选自下列的至少1种:酶、荧光染料及荧光蛋白质。
28.权利要求23所述的测定方法,其中
所述标记多肽所具有的标记是荧光染料或荧光蛋白质,
在所述检测的工序中,向流式细胞仪的流动池导入所述免疫复合体,由所述流式细胞仪检测所述信号。
29.权利要求28所述的测定方法,其中所述目标物质是表面具有选自下列的至少1种有形成分:蛋白质、寡肽、核酸、脂质、糖链及半抗原。
30.权利要求29所述的测定方法,其中所述有形成分是选自下列的至少1种:细胞、细胞外囊泡、微生物、病毒及它们的片段。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022-099159 | 2022-06-20 | ||
JP2023012581A JP2024000487A (ja) | 2022-06-20 | 2023-01-31 | 標識ポリペプチド、修飾ポリペプチド、それらのポリペプチドの製造方法、それらのポリペプチドを含む試薬、及び標的物質の測定方法 |
JP2023-012581 | 2023-01-31 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117264076A true CN117264076A (zh) | 2023-12-22 |
Family
ID=89220279
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310594024.3A Pending CN117264076A (zh) | 2022-06-20 | 2023-05-24 | 标记多肽、修饰多肽、这些多肽的制造方法、含这些多肽的试剂及目标物质的测定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117264076A (zh) |
-
2023
- 2023-05-24 CN CN202310594024.3A patent/CN117264076A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Shen et al. | Site-selective orientated immobilization of antibodies and conjugates for immunodiagnostics development | |
US7741128B2 (en) | Cooperative reporter systems, components, and methods for analyte detection | |
AU2003234327B2 (en) | Binary or polynary targeting and uses thereof | |
JP5941615B2 (ja) | ヒトcxcl1タンパク質の免疫学的測定方法 | |
AU2022201442A1 (en) | Antigen-coupled immunoreagents | |
Mahmoud et al. | Advanced procedures for labeling of antibodies with quantum dots | |
WO2011135040A1 (en) | Fluorescent antibody fusion protein, its production and use | |
CN112352055A (zh) | 用于检测和定量溶液中的生物分子或配体的生物发光生物传感器 | |
Rousserie et al. | Detection of carcinoembryonic antigen using single-domain or full-size antibodies stained with quantum dot conjugates | |
KR20090117406A (ko) | 단백질 g 변형체를 이용한 항체의 특이적 공유결합 커플링방법 | |
Yang et al. | Fc-specific biotinylation of antibody using an engineered photoactivatable Z–Biotin and its biosensing application | |
Bae et al. | HRP-conjugated plug-and-playable IgG-binding nanobodies as secondary antibody mimics in immunoassays | |
Puettmann et al. | A monoclonal antibody for the detection of SNAP/CLIP-tagged proteins | |
Pang et al. | Bioscreening specific peptide-expressing phage and its application in sensitive dual-mode immunoassay of SARS-CoV-2 spike antigen | |
US8911954B2 (en) | Polypeptide linker and method of analyzing target material using the same | |
EP1271152A1 (en) | Method of examining cancer by assaying autoantibody against mdm2 and reagent therefor | |
US20170199178A1 (en) | Solid phase labeling method | |
JP2007040834A (ja) | 免疫測定用試薬 | |
US20110009601A1 (en) | Labeled protein and method for obtaining the same | |
CN117264076A (zh) | 标记多肽、修饰多肽、这些多肽的制造方法、含这些多肽的试剂及目标物质的测定方法 | |
Niveleau et al. | Grafting peptides onto polystyrene microplates for ELISA | |
WO2022080486A1 (ja) | ポリペプチド、多量体、固相、被検物質の測定方法および試薬キット | |
Yu et al. | Fc-specific and covalent conjugation of a fluorescent protein to a native antibody through a photoconjugation strategy for fabrication of a novel photostable fluorescent antibody | |
JP2017032411A (ja) | 被検物質の検出方法、検出用試薬キットおよび検出用試薬 | |
US20230408497A1 (en) | Labeled polypeptide, modified polypeptide, production method for these polypeptides, reagent containing these polypeptides, and measurement method for target substance |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |