CN112352055A - 用于检测和定量溶液中的生物分子或配体的生物发光生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物发光生物传感器以及这种生物发光生物传感器在提供通用生物传感器策略中的应用，该策略允许直接在溶液中直接检测生物分子(例如抗体)或配体(例如小分子)。
Description
发明领域
本发明涉及一种生物传感器和检测方法，其中，该生物传感器用于检测和定量生物分子(例如抗体、抗原、蛋白质等)或配体(例如小分子、基于蛋白质的生物标志物等)。特别地，本发明涉及一种生物发光生物传感器和检测方法，其中，该生物发光生物传感器用于检测和定量抗体。本发明进一步涉及生物传感器和检测方法，其中，该生物传感器是与生物分子(例如抗体)缀合的生物传感器，其检测和定量配体，例如小分子或基于蛋白质的生物标志物。
背景
基于抗体的分子识别在生命科学中起着主导作用，范围从诊断和分子成像中的应用到靶向药物的递送和治疗。抗体在众多疾病中是重要的生物标志物，对于传染病、自身免疫性疾病和过敏症的诊断和监测尤其重要。另外，基于抗体的药物疗法制定了一类重要的生物分子药物。例如。治疗性抗体在临床上已应用于抗癌和抗炎治疗。治疗性抗体的初次应答和清除率因个体患者而异并与治疗功效和疾病进展相关，这表明患者特异性的治疗药物监测(TDM)可以通过防止用药过量和服药不足来提高疗效。抗体的检测和定量仍然是床旁检测(point-of-care)中的重要需求。尽管已经开发了多种灵敏的抗体检测策略，但其中许多方法都具有固有的局限性，例如需要多个耗时的温育步骤(ELISA和其他异质、夹心型检测)、多种试剂和/或复杂的设备(例如表面等离子体共振)。
其中将分子识别和信号生成整合在单个蛋白质中的新的通用抗体检测策略将是理想的，特别是对于高通量筛选和床旁检测应用而言。从蛋白质工程的角度来看，关键问题是如何将抗体结合转化为易于检测的信号变化。
一种方法是利用荧光标记的表位，其荧光性质在抗体结合时会改变。但是，由于缺乏酶扩增步骤，这些方法的灵敏度受到能够被可靠检测的荧光探针浓度的限制。另一个缺点是需要专用仪器，如果在资源贫乏地区或医疗中心外部需要诊断，则是特别成问题的。
几个组报道了通过将肽表位插入报告酶(reporter enzyme)内的允许位点开发出变构抗体报告酶(参见：Brennan等，Protein Eng.，1994，7，509；Benito等，J.Biol.Chem.，1996，271，21251；和Ferrer-Miralles等，Journal of Biological Chemistry，2001，276，40087)。但是，这些杂合酶受到催化损害，并且分析物的结合通常会导致活性进一步降低。另一种设计策略是利用抗体诱导的报告酶的寡聚或分裂报告酶的互补(参见：Geddie等，J.Mol.Biol.，2007，369，1052；De las Heras等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2008，370，164；和Fry等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2008，372，542)。这些方法利用抗体的二价性质将两个蛋白质(或蛋白质结构域)组合在一起以形成活性酶。但是，与其亲本酶相比，重组酶的活性通常较低(仅为1-2％)。另一个缺点是传感器的性能取决于传感器的浓度，因此不如单个蛋白质传感器稳健。
代替利用抗体来组合两组分的报告系统(reporter system)，也可以使用抗体结合来破坏两个结构域之间的相互作用。该策略的优点是两个结构域可以是单个蛋白质构建体的一部分。Merkx的小组(Golynskiy等，ChemBioChem，2010，11，2264)在基于
共振能量转移(FRET)原理对基于蛋白质的抗体传感器的设计中提供了原理证明。经由半柔性接头将两个荧光蛋白连系在一起，该接头包含两个与荧光结构域相邻的相同表位。该接头含有两个α-螺旋嵌段，以确保有效地桥接靶标抗体的抗原结合域之间约10nm的距离。因为荧光蛋白包含促进自缔合的突变，所以它们在不存在抗体的情况下形成了分子内结构域相互作用。抗体与接头中的表位的二价结合破坏了荧光结构域之间的相互作用，导致FRET降低。这种FRET传感器的检测局限性在于检测依赖于外部照明并且缺少信号放大步骤。该小组使用了相同的分子开关(molecular switch)原理来控制报告酶与其抑制剂蛋白之间的分子内相互作用，从而可以直接在溶液中进行皮摩尔抗体浓度的酶放大法检测(Banala等，ACSChem.Biol.，2013，8，2127)。但是，报告酶在血清中显示减弱的活性，并且缺乏由双色FRET系统提供的内在校正(intrinsic calibration)。该小组进一步利用相同的原理设计了基于生物发光共振能量转移(BRET)的传感器形式(format)(命名为LUMABS)(Arts等，Anal.Chem.，2016，88，4525)。发射蓝光的荧光素酶(例如，NanoLuc；也称为‘Nluc’)用作供体，并经由半柔性接头与绿色荧光受体蛋白(例如，mNeonGreen)连接，并引入了一个辅助结构域使它们极为靠近。在抗体两侧的接头的二价结合破坏了辅助结构域之间的相互作用，导致BRET降低，并因此发光颜色从绿色变为蓝色。生物发光传感器的主要优势在于它们不需要外部激发，并因此不会受到背景荧光和散射的影响，从而可以在基本黑暗的背景下灵敏地检测传感器信号。最近，Merkx的小组报告了：LUMABS传感器的构建，该传感器专门针对治疗性抗体曲妥珠单抗和包含含二硫键的环肽表位的西妥昔单抗(Van Rosmalen等，Anal.Chem.，2018，DOI：10.1021/acs.analchem.8b00041)；以及半合成LUMABS的开发，其中非天然氨基酸对叠氮苯丙氨酸地引入允许缀合非肽抗原(Arts等，ACS Sens.，2017，2，1730)。
NanoLuc是一种来自深海虾的工程化萤光素酶，是一种小(19kDa)但稳定的蛋白质，与其他萤光素酶相比，它产生增强和持续的发光(Hall，M.P.，等，ACS Chem Biol，2012，7，1848)。因此，NanoLuc代表了用于基于BRET的检测的有吸引力的供体。Merkx小组开发的LUMABS传感器(Arts等，Anal.Chem.，2016，88，452)利用NanoLuc作为供体，mNeonGreen作为受体，其发射峰仅相隔56nm。发射光谱的重叠很大，这意味着在mNeonGreen发射峰处观察到的部分强度来自NanoLuc，这限制了最大比率响应(maximal ratiometric response)。红移更多的荧光受体将是一个很好的选择，因为提高了发射光谱之间的分离，并因此可以实现无抗体状态与结合状态之间发射比率的大的变化。但是，由于NanoLuc与红移的荧光受体之间低效率的BRET，用红色荧光蛋白结构域替代mNeonGreen可能得到动态范围(dynamicrange)较差的LUMABS传感器(Hall等人，ACS Chem.Biol.，2012，7，1848)。
分裂萤光素酶(split luciferase)是一种用于检查蛋白质相互作用和检测体内和体外分析物的有效工具。为了分析分析物，通常将结构域或完整蛋白插入内部片段化的荧光素酶中，导致配体结合，从而导致发射信号发生变化。最近，NanoLuc被分裂为两个片段，一个18kDa的大片段(LBiT)和一个1.3kDa的小片段(SBiT)，并被设计为互补报告子(reporter)(命名为NanoBiT或NB)，用于研究蛋白质相互作用(Dixon等，ACS Chem.Biol.，2016，11，400)。NanoBiT(NB)蛋白质互补测定已用于分析G蛋白相互作用(Christopher等，Anal.Biochem.，2017，522，10)以及病毒进入和释放(Sasaki等，Virus Res.，2018，243，69)。最近开发了基于两个小的肽融合体的三部件NanoBiT互补系统，用于均质免疫测定(Dixon等，Sci Rep.，2017，7，8186)。
本发明提供了不同的生物发光传感器形式，其允许基于互斥的分子内分裂荧光素酶的互补(mutually exclusive intramolecular split luciferase complementation)直接检测溶液中的分析物，特别是抗体，并解决了上述许多局限性。
发明内容
在本发明中，我们提出了一种新方法，该方法允许使用分裂萤光素酶的分子内互补直接在溶液中一步检测生物分子(例如抗体、蛋白质、抗原或适配体等)或生物分子特异性配体(例如小分子或蛋白质生物标志物等)。为此，本发明提供了一种生物传感器，优选为比率型生物传感器，其包括接头，该接头包含第一端和第二端，其中，所述接头的第一端经由第一结合域与第一荧光素酶结构域的一个末端融合，以及所述接头的第二端经由第二结合域与第二荧光素酶结构域融合。所述生物传感器可选地包含第三荧光素酶结构域，其经由间隔基与所述第一荧光素酶结构域的另一个末端融合。所述生物传感器的结合域被配置为结合至生物分子，其中，所述生物传感器以至少两种构象存在，其中所述第二荧光素酶结构域或第三荧光素酶结构域与所述第一荧光素酶结构域结合以形成互补的荧光素酶，并且其中，荧光团与所述第二荧光素酶结构域或第三荧光素酶结构域中的一个相邻地缀合，从而仅在所述两种构象中的一种中提供所述萤光素酶与所述荧光团之间有效的生物发光共振能量转移(BRET)。注意，第三荧光素酶结构域可以与第一荧光素酶结构域融合，但是可替代地可以作为一种组分存在于例如包含本发明的生物传感器的溶液中。
如本文所用，术语“生物分子”或“生物性分子”是指存在于生物体中的分子，其对于某些典型的生物过程如细胞分裂、形态形成或发育是必不可少的，并且可以包括但不限于：大分子，诸如抗体、抗原、适配体、蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸(RNA和DNA片段)；以及小分子，诸如初级代谢产物、次级代谢产物和天然产物。生物分子通常是内源性的，但也可以是外源性的。例如，药物可以是天然产物或半合成的(生物制药)，或者可以是完全合成的。
如本文所用，术语“配体”是指与生物分子形成复合物以用于生物学目的的物质。在蛋白质-配体结合中，配体通常是通过与靶蛋白上的位点结合而产生信号的分子。在DNA-配体结合研究中，配体可以是小分子、离子或蛋白质等。通常，配体与生物分子之间的结合是通过分子间力，诸如离子键、氢键和范德华力而发生的。该对接的关联实际上是通过解离可逆的。
如本文所用，术语“经由”(例如在“经由第一结合域”的背景中使用的)是指这样的配置：其中生物传感器的第一部分与生物传感器的第二部分利用插入(经由)生物传感器的第三部分而融合，其中，生物传感器的第三部分本身被连接到生物传感器的第一部分和第二部分，或者其中，该第三部分被连接到将该生物传感器的第一部分和第二部分连接起来的生物传感器的连接部分。
如本文所用，术语“萤光素酶结构域”是指产生生物发光的氧化性酶(包括其部分或片段)。实例包括(但不限于)分裂萤火虫萤光素酶和NanoLuc(一种源自深海虾的工程化萤光素酶)。萤光素酶结构域可以包含萤光素酶的片段，优选为分裂萤光素酶的片段，其互补片段形成具有萤光素酶活性的互补萤光素酶。这样的片段的实例包括NanoLuc大的分裂荧光素酶片段和NanoLuc小的分裂荧光素酶片段。
可选地，荧光素酶结构域是能够自组装成生物发光复合物的蛋白质结构域或多肽。可选地，荧光素酶结构域是分裂NanoLuc片段。可选地，第一萤光素酶结构域是大的萤光素酶结构域，优选为大的分裂萤光素酶片段。进一步可选地，第二荧光素酶结构域和第三荧光素酶结构域是小的荧光素酶结构域，优选为小的分裂荧光素酶片段。
可选地，第一荧光素酶结构域选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列，或相对于SEQ IDNO：19的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
可选地，第二荧光素酶结构域和第三荧光素酶结构域中的每一个选自由SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3组成的氨基酸序列的组，或相对于SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在本发明的一个实施方案中，第二荧光素酶结构域和第三荧光素酶结构域对于第一荧光素酶结构域的亲和力不同。优选地，与第三荧光素酶结构域的亲和力相比，第二荧光素酶结构域具有更高的亲和力。
可选地，与第三荧光素酶结构域的亲和力相比，第二荧光素酶结构域的亲和力为至少5倍、优选10至1500倍、10至1000倍、10至100倍或10至50倍。
在本发明的一个实施方案中，第三荧光素酶结构域经由间隔基与第一荧光素酶结构域的另一个末端融合。
如本文所用，术语“接头”和“间隔基”是指适用于将第二荧光素酶结构域以及可选地将第三荧光素酶结构域连接至第一荧光素酶结构域的接头。接头和可选的间隔基的长度取决于接头和可选的间隔基与第一荧光素酶结构域的连接位置(它是连接至第一荧光素酶结构域的N-末端还是C-末端)与第一荧光素酶结构域的结合位点的位置。接头和可选的间隔基的内容物(content)取决于接头和可选的间隔基的所需柔性。每个生物传感器和每一目的所需的柔性可以不同。
可选地，间隔基是多肽或多肽片段，并且可以包括至少四个、至少六个、至少八个或至少十个GGS重复。但是，应注意，GGS重复的数量可以根据目的和生物传感器设计而不同。甚至接头的内容物也可以变化，并且不一定限于使用GGS重复。
可选地，接头是诸如多肽或多肽片段的半柔性接头，并且可以包括至少一个(GSG)6的柔性嵌段。进一步可选地，接头还包括至少一个α-螺旋嵌段。更进一步可选地，所述接头还包括至少一个具有六个EAAAK重复的α-螺旋嵌段。更进一步可选地，接头还包括两个α-螺旋嵌段，每个具有六个EAAAK重复。通常，应注意选择半柔性接头，使得接头具有足够的柔性以改变生物传感器的状态，即在两种构象中改变荧光素酶与荧光团之间的BRET。
可选地，半柔性接头选自SEQ ID NO：20的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
可选地，荧光团是在光激发时能够发射红光的荧光化学化合物。进一步可选地，该荧光团是Cy3。
可选地，荧光团被缀合至与第二荧光素酶结构域相邻的生物传感器。进一步可选地，荧光团被缀合至在接头与第二荧光素酶结构域之间的生物传感器。可替代地，荧光团被缀合至与第三荧光素酶结构域相邻的生物传感器。
可选地，生物分子可以包括抗体、抗原、蛋白质或适配体。优选地，生物分子是抗体。
在本发明的第一方面，两个结合域均被配置为与生物分子结合，即，竞争性地结合至生物分子的一个或更多个结合位点。尽管结合域可以是与生物分子的一个或更多个结合位点具有一定亲和力的任何种类的结合域，但是优选使用作为表位的结合域。可选地，两个结合域包含相同的表位，即被配置为与抗体的两个互补位进行分子间结合的表位。
如本文所用，术语“表位”是指结合至抗体的抗原结合位点(即抗体的互补位)的多肽。如本文所用的术语“表位”不限于天然存在的表位本身。如本文所用的术语“表位”可以包括：模拟了表位的模拟表位或包括中间位(meditopes)等的表位样抗体结合肽，诸如适配体和小分子。
如本文所用，术语“中间位”是指通过在恒定结构域与可变结构域之间的界面处的空腔中结合而特异性识别抗体的肽。在例如Van Rosmalen(Anal.Chem.，2018，90，3592)中公开了中间位的实例。
可选地，表位根据要检测的生物分子(例如抗体)而不同。例如，为了检测抗HIV-p17抗体，其两个表位可以选自SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。可替代地，为了检测曲妥珠单抗，其两个表位可以包含模拟表位，并且可以选自SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。进一步可替代地，为了检测西妥昔单抗，其两个表位可以包含中间位，并且可以选自SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列，或者相对于SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。甚至更进一步可替代地，为了检测抗C反应蛋白(CRP)抗体，其两个表位可以选自SEQ ID NO：17(用于检测抗CRP169抗体)或SEQ ID NO：18(用于检测抗CRP36抗体)的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在本发明的第一方面，本发明还涉及一种体外生物分子检测方法，包括以下步骤：
-使样品与本发明的第一方面的生物传感器接触；
-确定在样品存在情况下的生物传感器的发光的变化；以及
-确定在样品存在情况下的所述发光变化，以对存在或不存在生物分子进行定量和/或定性。
通过提供一种生物传感器，该生物传感器具有相互作用的第一荧光素酶结构域和第二荧光素酶结构域并进一步组合了与第一荧光素酶结构域可选地连接的第三荧光素酶结构域，本发明的方法提供了以下可能性：在样品存在的情况下确定发光变化以便定量和/或定性地定义生物分子的存在或不存在。
可选地，本发明涉及一种方法，其中在不存在生物分子的情况下，生物传感器处于无生物分子(关闭)状态，其中至少一些第一荧光素酶结构域与第二荧光素酶结构域互补。在荧光团紧邻第二荧光素酶结构域的情况下，在无生物分子状态下，荧光团极为靠近由第一荧光素酶结构域和第二荧光素酶结构域形成的互补荧光素酶。
可选地，本发明涉及一种方法，其中在存在生物分子的情况下，生物传感器的结合域与生物分子之间的结合改变了生物传感器的无生物分子的(关闭)状态与生物传感器的与生物分子结合的(打开)状态之间的平衡，使得萤光素酶与荧光团之间的BRET发生变化。在荧光团紧邻第二荧光素酶结构域的情况下，相比于处于无生物分子状态的生物传感器，在与生物分子结合的状态下荧光素酶与荧光团之间的BRET降低。
在本发明的第二方面，第一结合域被配置为与生物分子形成缀合系统。在这样的配置中，第二结合域被配置为结合至生物分子的配体结合位点。可选地，生物分子共价结合至生物传感器的第一结合域。进一步可选地，生物分子包含抗体，其中抗体的Fc区共价结合至生物传感器的第一结合域。
如本文所用，术语“缀合系统”、“缀合”、“缀合结合”等是指本发明的生物传感器与生物分子的结合状态，其中，对生物传感器与生物分子之间的亲和力进行选择使得与生物分子结合的配体和待分析样品中存在的任何其他组分不会与在生物传感器与生物分子之间形成的缀合物的结合发生竞争。优选但非必要地，生物传感器与生物分子之间的缀合结合是共价结合。然而，可以对生物传感器与生物分子之间的缀合结合进行选择，使得相比于生物传感器(第二结合域)与生物分子的配体结合位点之间的亲和力，生物传感器与生物分子之间的亲和力足够高。
如本文所用的术语“配体结合位点”是指生物分子的适用于与生物分子特异性配体(例如，小分子或基于蛋白质的生物标志物等)结合的部分。此外，配体结合位点结合至本发明的生物传感器的第二结合域(竞争性结合)。
可选地，生物分子的配体结合位点包括抗体的抗原结合位点。
与本发明的第一方面相似，在本发明的第二方面中，本发明的生物传感器的第二结合域可以被配置为与生物分子结合，即，竞争性地结合至生物分子的结合位点之一。尽管第二结合域可以是与生物分子的一个或更多个结合位点具有一定亲和力的任何种类的结合域，但是优选使用作为表位的结合域。
在本发明的第二方面，本发明进一步涉及体外配体检测方法，包括以下步骤：
-使样品与本发明第二方面的生物传感器接触；
-确定在样品存在情况下的生物传感器的发光的变化；以及
-确定样品存在情况下的所述发光变化，以对存在或不存在配体进行定量和/或定性。
可选地，本发明涉及一种方法，其中，在不存在配体的情况下，生物分子结合至第二结合域，破坏第二萤光素酶结构域与第一萤光素酶结构域的相互作用。在荧光团紧邻第二荧光素酶结构域的情况下，在与生物分子结合的状态下，荧光团与由第一荧光素酶结构域和第三荧光素酶结构域形成的互补荧光素酶不是极为接近，导致互补荧光素酶与荧光团之间的低的BRET。
可选地，本发明涉及一种方法，其中，在存在配体的情况下，生物传感器处于与配体结合的状态，从而允许至少一些第一荧光素酶结构域与第二荧光素酶结构域互补。在荧光团紧邻第二荧光素酶结构域的情况下，相比于在与生物分子结合的状态下的生物传感器，在与配体结合的状态下荧光素酶与荧光团之间的BRET增高。
在本发明的第三方面，本发明涉及包括本发明的生物传感器(本发明的第一方面和第二方面)的部件套件(kit-of-parts)，其中，所述生物传感器包含经由半柔性接头与第二荧光素酶结构域融合的第一荧光素酶结构域，所述半柔性接头在接头端部处含有两个结合域，并且其中，所述部件套件还包含第三荧光素酶结构域。
可选地，部件套件为溶液形式，其至少包含生物传感器和第三荧光素酶结构域。进一步可选地，相比于溶液中存在的生物传感器的浓度，第三荧光素酶结构域的浓度显著更高。
可选地，部件套件包含惰性材料，其上附接了生物传感器和第三荧光素酶结构域。惰性材料可以是适用于检测溶液中生物分子或配体的预期目的的任何种类的材料。本发明的生物传感器与第三荧光素酶结构域的附接配置可以使得第三荧光素酶结构域极为接近生物传感器的第一荧光素酶结构域的结合位点。
详细说明
在本发明中，我们提出了一种新方法，该方法允许利用分裂荧光素酶的分子内互补直接在溶液中一步检测生物分子(或分析靶标，例如抗体)。传感器设计是高度模块化的，包括与两个小的萤光素酶片段融合的大的萤光素酶片段。一个小的萤光素酶片段经由柔性的GGS重复(repeats)接头与大的萤光素酶片段的一个末端融合。另一个小的萤光素酶片段经由半柔性的接头与大的萤光素酶片段的另一末端融合，该半柔性的接头在接头的端部处含有两个抗体结合表位。该蛋白质开关可以以两种构象存在，其中，N端或C端的小片段与大的分裂荧光素酶结构域结合并补充荧光素酶活性。荧光受体染料(也称为“荧光团”)与两个小的荧光素酶结构域之一相邻地缀合，从而仅在两种构象中的一种中产生有效的BRET。抗体与半柔性接头侧面的两个表位序列的二价结合破坏了荧光标记的小荧光素酶结构域的相互作用，这使得通过非荧光标记的小的荧光素酶片段来补充荧光素酶的活性，从而导致萤光素酶与荧光团之间BRET的降低，这可以使用简单的发光读取进行监测。使用抗HIV1p17抗体作为示例性靶标，对分裂荧光素酶片段的分子内亲和力进行优化，以产生一种生物发光传感器，其在存在pM浓度的靶标抗体(Kd＝10pM)的情况下其动态范围达到493％。只需替换表位序列即可获得靶向完全不同的抗体的传感器，并可以通过调节分裂部分的分子内亲和力来进一步定制该传感器的性能。
本发明涉及一种检测方法，其中，使用生物传感器来检测生物分子(例如抗体、抗原、蛋白质等)。特别地，本发明涉及一种使用生物传感器来检测抗体的检测方法。生物传感器为经由柔性GGS重复接头以及在接头端部处具有两个表位的半柔性接头与两个小的分裂荧光素酶片段连接的大的分裂荧光素酶片段。
注意，这些接头的确切长度和内容物取决于生物传感器本身的构象和配置。半柔性接头和柔性接头都应足够长且足够柔性以允许分子内互补。对此，可以改变接头的柔性以进一步优化生物传感器特异性系统。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种体外抗体检测方法。该方法需要使样品与生物传感器接触。该生物传感器包括一个大的萤光素酶片段、两个小的萤光素酶片段、至少一种荧光受体染料、柔性的GGS重复接头以及含有两个对抗体具有亲和力的表位的半柔性接头。该方法还需要确定在样品存在的情况下生物传感器的发光的变化，并将在样品存在的情况下的所述发光变化归因于对抗体存在或不存在的定量或定性。在不存在抗体的情况下，生物传感器处于无抗体状态(关闭状态)，即至少一些大的分裂荧光素酶片段与小的分裂荧光素酶片段经由包含两个表位的半柔性接头连接互补，并且荧光团与互补的荧光素酶位置靠近(极为接近)。换言之，荧光素酶与荧光团之间的BRET相对较高，并且生物传感器显示相对较高的荧光团(例如红光)相对于荧光素酶(例如蓝光)的发光发射比率。存在于抗体中的两个抗原结合域与存在于半柔性接头端部处的两个表位之间的二价结合改变了生物传感器的无抗体状态与抗体结合状态(打开状态)之间的平衡，使得荧光素酶与荧光团之间的BRET降低，并且生物传感器显示出相对较低的红光对蓝光(red to blue light)发光发射比率。
还描述了一种体外抗体检测方法。在这种方法中，使样品与可在无抗体(关闭)状态与抗体结合(打开)状态之间转变(displaceable)的生物传感器接触。该生物传感器包括三个分裂荧光素酶(例如但不限于NanoLuc)片段、两个对抗体具有亲和力的表位、至少一个荧光团(例如但不限于Cy3)、将这两个表位分隔开的半柔性接头以及柔性GGS重复接头。该方法还需要确定在样品存在的情况下的荧光素酶和荧光团的发光，并将样品存在的情况下的荧光素酶和荧光团的发光归因于对抗体存在或不存在定量或定性。在无抗体(关闭)状态下，互补的荧光素酶和荧光团之间的BRET高，因此荧光团(例如红光)相对于荧光素酶(例如蓝光)的发光发射比率高。抗体与两个表位的结合改变了生物传感器的无抗体状态与抗体结合状态之间的平衡，从而将生物传感器从无抗体状态驱动为抗体结合状态，使得互补荧光素酶与荧光团之间的BRET降低，并且观察到低的红光对蓝光的发光发射比率。
还描述了可在无生物分子的(关闭)状态和与生物分子结合的(打开)状态之间转变的生物传感器。该生物传感器包括大的分裂萤光素酶片段、两个小的分裂萤光素酶片段、至少一个荧光团、两个表位、将两个表位分隔开的半柔性接头以及柔性GGS重复接头。
如本文所用，术语“可转变的”是指生物传感器具有不同构象(状态)的适用性。生物传感器的可转变性与小的分裂荧光素酶片段结合至大的分裂荧光素酶片段或位于距离大的分裂荧光素酶片段的结合位点一定距离处的自由度有关，其中所述距离由与相应的小的分裂荧光素酶片段融合的接头(半柔性或柔性接头)确定。
可选地，在不存在抗体的情况下，生物传感器处于关闭状态。进一步可选地，在不存在抗体的情况下，生物传感器处于关闭状态，由此至少一些大的萤光素酶片段与小的萤光素酶片段经由包含两个表位的接头连接互补，并且荧光团与互补萤光素酶位置靠近。更进一步可选地，在关闭状态下，荧光团与互补的荧光素酶位置靠近，使得互补的荧光素酶与荧光团之间的BRET高，并且荧光团(例如红光)相对于荧光素酶(例如蓝光)的发光发射比率高。
可任选地，抗体与两个表位的结合改变了生物传感器的关闭状态(无抗体)与打开状态(抗体结合)之间的平衡，从而将生物传感器从关闭状态驱动至打开状态，使得在互补的荧光素酶与荧光团之间的BRET降低，并且观察到低的荧光团(例如红光)相对于荧光素酶(例如蓝光)的发光发射比率。
可选地，在存在抗体的情况下，生物传感器处于打开状态。进一步可选地，在存在抗体的情况下，存在于所述抗体中的两个抗原结合域与存在于生物传感器中的接头端部处的两个表位之间的二价结合将生物传感器驱动至打开状态。更进一步可选地，在打开状态下，荧光团被与互补的荧光素酶间隔开，从而导致互补的荧光素酶和荧光团之间的BRET降低以及荧光团(例如红光)相对于荧光素酶(例如蓝色)的发光发射比率降低。
可选地，荧光团(例如红光)相对于荧光素酶(例如蓝光)的发光发射比率与对抗体存在或不存在的定量或定性成比例。
可选地，所述大的和小的分裂荧光素酶片段是能够自组装成生物发光复合物的蛋白质结构域或多肽。可选地，分裂萤光素酶片段是分裂NanoLuc片段。
可选地，大的分裂萤光素酶片段选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列，或相对于SEQID NO：19的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
可选地，每个小的分裂荧光素酶片段选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3组成的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在本发明的一个优选实施方案中，两个小的分裂荧光素酶片段对于大的分裂荧光素酶片段的亲和力不同。优选地，相比于经由柔性GGS重复接头与大的分裂荧光素酶片段融合的小的分裂荧光素酶片段的亲和力，经由半柔性接头两侧的两个表位与大的分裂荧光素酶片段融合的小的分裂荧光素酶片段具有更高的亲和力。
可选地，相比于经由柔性GGS重复接头与大的分裂荧光素酶片段融合的小的分裂荧光素酶片段的亲和力，经由半柔性接头两侧的两个表位与大的分裂荧光素酶片段融合的小的分裂荧光素酶片段的亲和力是至少5倍，优选10至1500倍、10至1000倍、10至100倍或10至50倍。
可选地，所述两个表位是多肽或多肽片段，其对抗体具有亲和力并且能够结合(可选地，选择性结合)至抗体，可选地结合至抗体的与抗原结合的片段。
可选地，所述半柔性接头是包含至少一个(GSG)6柔性嵌段的多肽或多肽片段。进一步可选地，所述接头还包括至少一个α-螺旋嵌段。更进一步可选地，所述接头还包括至少一个具有六个EAAAK重复的α-螺旋嵌段。更进一步可选地，所述接头还包括两个α-螺旋嵌段，每个具有六个EAAAK重复。通常应注意，对半柔性接头进行选择使得该接头具有足够的柔性以改变生物传感器的状态，即从无生物分子靶标(biomolecule target-free)状态(其中与半柔性接头融合的小的分裂荧光素酶片段结合至大的分裂荧光素酶片段)变为与生物分子结合的状态(其中半柔性接头侧面的表位结合至生物分子的结合位点(例如抗体的抗原结合位点))。
可选地，每个表位位于半柔性接头的每个相应端部。进一步可选地，大的分裂荧光素酶片段和一个小的分裂荧光素酶片段位于接头的每个相应端部处。更进一步优选地，第一表位和大的分裂荧光素酶片段位于接头的第一端，第二表位和小的分裂荧光素酶片段位于接头的相对的第二端。
可选地，柔性接头是包括至少十个GGS重复的多肽或多肽片段。但是，应注意，GGS重复的数量可以不同。甚至接头的内容物也可以变化，并且不一定限于使用GGS重复。接头的内容物和长度取决于大的分裂萤光素酶片段的构型以及与柔性接头融合的小的分裂萤光素酶片段与大的分裂萤光素酶片段的连接位置(取决于利用大的分裂萤光素酶片段的哪个末端与柔性接头连接)。
可选地，荧光团是在光激发时可以发射红光的荧光化学化合物。进一步可选地，该荧光团是Cy3。
可选地，将荧光团缀合至生物传感器。进一步可选地，荧光团缀合至生物传感器与经由半柔性接头连接的小的分裂荧光素酶片段相邻。进一步可选地，荧光团在半柔性接头与小的分裂荧光素酶片段之间缀合至生物传感器。可替代地，荧光团缀合至生物传感器与经由柔性接头连接的小的分裂荧光素酶片段相邻。在这种可替代的配置中，应注意的是，在无抗体的状态下，互补荧光素酶与荧光团之间的BRET降低，并且观察到低的荧光团(例如红光)相对于荧光素酶(例如蓝光)的发光发射比率，而在在抗体结合状态下，在经由柔性接头连接的小的分裂荧光素酶片段旁边的荧光团与互补的荧光素酶极为接近，导致互补的荧光素酶与荧光团之间的BRET增高。
在本发明的一个实施方案中，荧光团经由与生物传感器中半胱氨酸的游离硫醇基偶联的马来酰亚胺而被并入生物传感器中。可选地，荧光团经由与生物传感器中半胱氨酸的游离硫醇基偶联的马来酰亚胺而在小的分裂荧光素酶片段与半柔性接头之间并入到生物传感器中。换言之，通过在生物传感器的氨基酸序列中引入半胱氨酸来控制荧光团在生物传感器中的位置，即在小的分裂荧光素酶片段之前(在半柔性接头与小的分裂荧光素酶片段之间)和/或之后。
在本发明的另一实施方案中，荧光团经由与生物传感器中的非经典(non-canonical)氨基酸对叠氮苯丙氨酸(pAzF)的叠氮基偶联的炔基(alkyne)而被并入生物传感器中。可选地，荧光团经由与生物传感器中对叠氮苯丙氨酸的叠氮基偶联的炔基在小的分裂荧光素酶片段与半柔性接头之间并入生物传感器中。可选地，使用琥珀终止密码子(TAG)将对叠氮苯丙氨酸在所需的位置处生物正交地并入生物传感器中。换言之，通过在生物传感器的氨基酸序列中引入琥珀终止密码子(TAG)来控制荧光团在生物传感器中的位置，即在小的分裂荧光素酶片段之前(在半柔性接头与小的分裂荧光素酶片段之间)和/或之后。
除了检测抗体之外，本发明的生物传感器以及本发明的检测方法可以同样地应用于其他生物分子的检测。例如，以竞争性方式使用传感器可以检测抗原、小分子和其他生物标志物(例如c反应蛋白)。
同样在本发明中，我们提出了一种新方法，该方法允许利用分裂荧光素酶的分子内互补直接在溶液中一步检测小分子或基于蛋白质的生物标志物等，其中生物传感器缀合至生物分子(例如抗体、抗原、蛋白质、适配体等)，其中生物分子包含用于结合配体(例如小分子或基于蛋白质的生物标志物等)的结合位点。该生物传感器是高度模块化的，包括接头，例如本发明的半柔性接头，所述半柔性接头包含第一端和第二端，其中，所述接头的第一端经由第一结合域与第一荧光素酶结构域(例如本发明的大的(分裂的)荧光素酶结构域)的一个末端融合，并且其中，所述接头的第二端经由第二结合域与第二荧光素酶结构域(例如本发明的小的(分裂的)荧光素酶结构域)融合。该生物传感器可以可选地包含第三荧光素酶结构域(例如本发明的小的(分裂的)荧光素酶结构域)，其经由间隔基(例如本发明的柔性GGS重复接头)与第一荧光素酶结构域的另一个末端融合。第一结合域被配置为与生物分子(例如抗体)形成缀合系统，而第二结合域被配置为与生物分子的配体结合位点(例如抗体的抗原结合位点)结合。该生物传感器以两种构象存在，其中，第二荧光素酶结构域或第三荧光素酶结构域(在存在的情况下)与第一荧光素酶结构域结合以形成互补的荧光素酶并补充荧光素酶活性。此外，将荧光受体染料(荧光团)与第二或第三荧光素酶结构域之一(例如本发明的两个小的荧光素酶结构域之一)相邻地缀合，从而仅在两种构象中的一种中导致荧光素酶与荧光团之间有效的生物发光共振能量转移(BRET)。
在不存在配体(例如小分子或基于蛋白质的生物标志物)的情况下，生物分子缀合至第一结合域，而生物分子的配体结合位点与第二结合域结合，破坏了第二荧光素酶结构域与第一荧光素酶结构域的相互作用，并因此允许第三荧光素酶结构域(在存在的情况下)与第一荧光素酶结构域的相互作用。在第二荧光素酶结构域是荧光标记的荧光素酶结构域的情况下，则通过非荧光标记的第三荧光素酶结构域补充荧光素酶活性导致互补的荧光素酶与荧光团之间的BRET降低，这可以利用简单的发光读取来监测。可替代地，在第三荧光素酶结构域是荧光标记的荧光素酶结构域的情况下，则通过荧光标记的第三荧光素酶结构域补充荧光素酶活性导致互补的荧光素酶与荧光团之间的BRET升高，这可以利用简单的发光读取来监测。
在存在配体的情况下，生物分子(例如抗体)与生物传感器的第二结合域的结合被破坏，从而使第二荧光素酶结构域与第一荧光素酶结构域相互作用。如果第二结合域是荧光标记的荧光素酶结构域，则通过荧光标记的第二荧光素酶结构域补充荧光素酶活性导致荧光素酶与荧光团之间的BRET升高，这可以利用简单的发光读取进行监测。
在本发明的一个实施方案中，提供了缀合抗体的生物传感器。缀合抗体的生物传感器包括接头，例如本发明的半柔性接头，其包含第一端和第二端，其中，所述接头的第一端经由抗体缀合结合域与第一荧光素酶结构域(例如本发明的大的(分裂的)荧光素酶结构域)的一个末端融合，并且其中，所述接头的第二端经由抗体结合表位与第二荧光素酶结构域(例如本发明的小的(分裂的)荧光素酶结构域)融合。该生物传感器可以可选地包含第三荧光素酶结构域，例如本发明的小的(分裂的)荧光素酶结构域，其经由间隔基(例如本发明的柔性GGS重复接头)与第一荧光素酶结构域的另一个末端融合。抗体缀合结合域被配置为与抗体形成缀合系统，而抗体结合表位被配置为与抗体的结合位点(例如抗体的互补位之一)结合。生物传感器以两种构象存在，其中第二荧光素酶结构域或第三荧光素酶结构域(与第一荧光素酶结构域连接或作为存在于例如包含有缀合抗体的生物传感器的溶液中的组分)与第一荧光素酶结构域结合，从而形成互补的荧光素酶并补充荧光素酶活性。此外，将荧光受体染料(荧光团)与第二或第三荧光素酶结构域之一(例如本发明的两个小的荧光素酶结构域之一)相邻地缀合，从而仅在两种构象中的一种中导致荧光素酶与荧光团之间的有效的生物发光共振能量转移(BRET)。优选地，紧邻着第二荧光素酶结构域来缀合荧光团。
可选地，第一结合域或抗体缀合结合域包含抗体Fc区亲和配体。抗体Fc区亲和配体可以选自(天然)免疫球蛋白结合蛋白、免疫球蛋白衍生的产物，诸如免疫球蛋白结合蛋白的工程化形式、人工结合蛋白、(短)肽、适配体和合成的小分子量化合物。此类抗体Fc区亲和配体的实例例如是由Kruljec等所描述的(Bioconjugate Chem.2017，28，2009)。可选地，第一结合域或抗体缀合结合域是免疫球蛋白结合蛋白。进一步可选地，第一结合域或抗体缀合结合域是蛋白G衍生的结构域，其具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列，或相对于SEQ IDNO：16的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
如本文所用，术语“抗体Fc区亲和配体”是指对抗体的至少Fc区结合位点具有亲和力的配体。优选地，本发明的抗体Fc区亲和配体对抗体的Fc区结合位点的亲和力高于配体对相同抗体的另一结合位点(例如Fab区结合位点)的亲和力。
可选地，第二结合域被配置为提供在第二结合域和配体(例如小分子或基于蛋白质的生物标志物)与配体特异性抗体的抗原结合位点的分子间结合之间的竞争。因此，第二结合域可以选自抗体抗原结合位点配体(其包括表位、中间位、模拟表位)、人工结合蛋白、(短)肽或低分子量类似物等。优选地，第二结合域包含抗体结合表位或抗体结合低分子量类似物。
如本文所用，术语“抗体抗原结合位点配体”是指对抗体的至少抗原结合位点具有亲和力的配体。优选地，本发明的抗体抗原结合位点配体对抗体的抗原结合位点的亲和力高于配体对相同抗体的另一结合位点(例如Fab区或Fc区结合位点)的亲和力。为了在本发明的抗体抗原结合位点配体与目标分析物(例如小分子或基于蛋白质的生物标志物)之间提供竞争，配体与抗体的抗原结合位点的结合是可逆的。
可选地，第二结合域是抗体结合表位。例如，抗体结合表位可以选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24组成的氨基酸序列的组，或相对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
可选地，荧光团是在光激发时能够发射红光的荧光化学化合物。进一步可选地，该荧光团是Cy3。
可选地，荧光团被缀合至生物传感器。进一步可选地，荧光团与第二荧光素酶结构域相邻地缀合至生物传感器。进一步可选地，荧光团在接头与第二荧光素酶结构域之间缀合至生物传感器。
在本发明的一个实施方案中，荧光团经由与生物传感器中半胱氨酸的游离硫醇基偶联的马来酰亚胺而被并入到生物传感器中。可选地，荧光团经由与生物传感器中半胱氨酸的游离硫醇基偶联的马来酰亚胺而在第二荧光素酶结构域与接头之间并入到生物传感器中。换言之，通过在生物传感器的氨基酸序列中引入半胱氨酸来控制荧光团在生物传感器中的位置，即在第二荧光素酶结构域之前(在接头与第二荧光素酶结构域之间)和/或之后。
在本发明的另一实施方案中，荧光团经由与生物传感器中的非经典氨基酸对叠氮苯丙氨酸(pAzF)的叠氮基偶联的炔基而被并入到生物传感器中。可选地，荧光团经由与生物传感器中的对叠氮苯丙氨酸的叠氮基偶联的炔基而在第二荧光素酶结构域与接头之间并入到生物传感器中。可选地，利用琥珀终止密码子(TAG)将对叠氮苯丙氨酸在所需的位置处生物正交地并入到生物传感器中。换言之，通过在生物传感器的氨基酸序列中引入琥珀终止密码子(TAG密码子)来控制荧光团在生物传感器中的位置，即在第二结合域之前(在接头与第二结合域之间)和/或之后。
可选地，荧光团是第二结合域的一部分。特别地，在第二结合域包含用于与抗体(其缀合至生物传感器的第一结合域)的抗原结合位点结合的小分子类似物的情况下，则该小分子类似物可以经由荧光团融合至接头。
例如，第二结合域可以包含选自甲氨蝶呤类似物的小分子类似物，以检测化疗药物甲氨蝶呤(MTX)。优选地，荧光团用于将甲氨蝶呤类似物经由荧光团缀合至生物传感器中的半胱氨酸(图7)。
本发明的示例性实施方式
该生物传感器可以含有一个大的分裂萤光素酶片段(LBiT)、两个小的分裂萤光素酶片段(SBiT1和SBiT2)以及合成的荧光团。LBiT经由长的半柔性接头与SBiT2连接，并且将荧光团与SBiT2相邻地引入，从而在不存在其靶标抗体的情况下形成了互补的生物发光复合物，并具有在生物发光复合物与荧光团之间的有效的BRET(图1)。半柔性接头包含特异于目标抗体(antibody of interest)的肽表位，一个紧邻LBiT，另一个紧邻SBiT2。LBiT的另一个末端经由短的柔性接头与SBiT1融合。单个抗体与两个表位的结合将互补的生物发光复合物分开并推开荧光团。同时，LBiT与经由短的柔性接头连系的SBiT1组装在一起，并形成生物发光复合物。这导致生物发光复合物与荧光团之间的BRET效率降低。
可替代地，生物传感器可以通过半柔性接头中包含的紧邻大片段(LargeBit，LBiT)的蛋白G与抗体的Fc区缀合(图5)。通过蛋白G与生物传感器缀合的抗体的抗原结合位点结合至半柔性接头中包含的与小片段2(SmallBit 2，SBiT2)相邻的肽表位(图5A)或小分子类似物(图5B)。目标分析物(例如小分子或蛋白生物标志物)与缀合至生物传感器的抗体的抗原结合位点的结合使小片段2(SBiT2)形成互补的生物发光复合物，从而使荧光团与大片段(LBiT)极为接近。这导致生物发光复合物与荧光团之间的BRET效率增高。
利用分裂NanoLuc证明了本发明技术的可行性。调节LBiT和SBiT之间的亲和力以产生单一蛋白质的生物发光传感器，该传感器可检测pM浓度的特异性抗体并具有大的信号变化，或可检测mM浓度的小分子或蛋白质生物标志物并具有大的信号变化。此外，这些传感器的模块化体系结构允许通过表位序列的简单交换来改变靶标特异性，并通过调整SBiT片段的相对亲和力来系统性地调整传感器响应。
附图说明
图1A显示了一种抗体传感器，该传感器基于分裂荧光素酶片段之间的分子内复合物的由抗体诱导的的破坏，这导致BRET效率发生变化。传感器标记有荧光团(星号)。抗体与半柔性接头中的表位的结合将荧光团和荧光素酶分开，从而将发射的颜色从红色变为蓝色。
图1B显示了NB-LUMABS-1传感器序列的示意性结构。
图2A显示了在不存在(红线；●)和存在(蓝线；■)1.25nM抗HIV1-p17抗体的情况下1pM传感器的发光光谱。(B)传感器浓度为1pM时的抗体滴定。误差线代表平均值±SD(n＝3)。
图2B显示了传感器浓度为1pM时的抗体滴定。误差线代表平均值±SD(n＝3)。
图3显示了NB-LUMABS-2，NB-LUMABS-3，NB-LUMABS-4(图3A)，NB-LUMABS-5，NB-LUMABS-6，NB-LUMABS-7(图3B)的表征，包括不存在(红线；●)和存在(蓝线；■)1.25nM抗HIV1-p17抗体的情况下的1pM传感器的发光光谱，以及传感器浓度为1pM时的抗体滴定。误差线代表平均值±SD(n＝2)。
图4显示了TRAS-NB-LUMSABS-1，TRAS-NB-LUMSABS-1-2和TRAS-NB-LUMSABS-1-3的表征，包括不存在(红线；●)和存在(蓝线；■)1μM曲妥珠单抗的情况下100pM传感器的发光光谱，以及传感器浓度为100pM时的抗体滴定。误差线代表平均值±SD(n＝3)。
图5显示了pG-NB-LUMABS传感器，该传感器可允许原则上任何配体的比率型生物发光检测(ratiometric bioluminescent detection)。图5A显示了作为蛋白质生物标志物实例的CRP检测。图5B示出了对小分子的检测。检测是基于肽表位(图5A)或小分子类似物(图5B)与配体对于配体特异性生物分子(例如单克隆抗体)的分子间结合之间的竞争。图5C显示了pG-NB-LUMABS pET28a(+)载体的示意图，该载体具有用于纯化的N端His标签和C端链霉亲和素标签。
图6显示了CTX-NB-LUMABS变体的表征。在不存在(红线；●)和存在(蓝线；■)8.3μM西妥昔单抗的情况下100pM传感器的发光光谱。在PBS缓冲液(pH7.4，1mg/ml BSA)中对100pM传感器进行抗体滴定。误差线代表平均值±SEM(n＝3)。红线(●)代表对公式1的拟合。
图7显示了用于检测小分子甲氨蝶呤的MTX-pG-NB-LUMABS。
图8显示了在存在和不存在0.8mM未纯化的肽17的情况下2nM pG-NB-LUMABS-17的发光光谱(图8A)，以及随着肽17浓度的增大2nM pG-NB-LUMABS-表位17的发射比率。
传感器设计
图1显示了传感器的常规设计。在此示例中，选择了分裂NanoLuc作为互补报告子，因为互补的复合物是发蓝色光的，并且有多种对LBiT的亲和力在0.7nM至190μM之间的SBiT变体可用(Dixon等，ACS Chem.Biol.，2016，11，400；SEQ ID NO：19)。
在示例性设计中，我们专注于开发用于检测抗HIV1-p17抗体的传感器。该抗体有几个特征明确的线性表位序列，这使其成为开发新型均质抗体检测分析的普遍选择。LBiT与SBiT1之间的接头具有(GGS)10的柔性嵌段。LBiT与SBiT2之间的接头最初具有两个特特异于HIV1-p17抗体的表位(SEQ ID NO：4，Kd＝42nM)，这两个表位被三个(GSG)6柔性嵌段和两个各自具有六个EAAAK重复的α-螺旋嵌段(SEQ ID NO：20)隔开。该接头还基于相同的开关策略用于一些报道的传感器蛋白中(参见：Golynskiy等，ChemBioChem，2010，11，2264；Banala等，ACS Chem.Biol.，2013，8，212；Arts等，Anal.Chem.，2016，88，4525；VanRosmalen等，Anal.Chem.，2018，DOI：10.1021/acs.analchem.8b00041；以及Arts等，ACSSens.，2017，2，1730)。邻近SBiT2处包括一个半胱氨酸残基，用于荧光团缀合。
在一个示例性实施方案中，构建了一种变体(NB-LUMABS-1；SEQ ID NO：6)，其包含Kd为190μM的SBiT1(SEQ ID NO：1)和Kd为2.5μM的SBiT2(SEQ ID NO：2)，以及SBiT2 N末端之前的半胱氨酸残基。在E.coli(大肠杆菌)BL21(DE3)中表达传感器蛋白，并使用N末端His-tag和C末端Strep-tag进行纯化。此两步纯化方案确保了仅分离全长蛋白质，而不会有缺少例如SBiT结构域的截短版本的传感器。传感器蛋白经由硫醇-马来酰亚胺反应与合成荧光团Cy3缀合。
NB-LUMABS-1的生物发光扫描显示，在不存在抗HIV1-p17抗体的情况下，在563nm处的Cy3发射峰值高于在460nm处的NanoLuc发射峰值，发射比率为1.3，表明NB与Cy3之间的BRET非常有效。抗HIV1-p17抗体的添加导致Cy3发射峰值的显著降低，表明BRET效率大大降低。滴定实验提供10.0±0.5pM的表观解离常数(Kd,app)以及218％的大的动态范围(图2)。
调整传感器的性能
为了确定半胱氨酸残基位置的影响，构建了两个变体，其包含在SBiT2 C末端之后的一个半胱氨酸残基(NB-LUMABS-2；SEQ ID NO：7)或者在SBiT2 N末端之前并在SBiT2的C末端之后的两个半胱氨酸残基(NB-LUMABS-3；SEQ ID NO：8)。在不存在抗HIV1-p17抗体的情况下，NB-LUMABS-2显示出相对较低的发射比率(红色相对蓝色)。这表明Cy3远离荧光素酶的底物结合位点。NB-LUMABS-3在无抗体状态下也显示出相对较低的发射比率(红色相对蓝色)。我们假设与两个Cy3基团的缀合可能会影响SBiT2与LBiT的组装。
为了确定LBiT-SBiT亲和力的影响，构建了四个包含不同的SBiT组合的变体。NB-LUMABS-4(SEQ ID NO：9)包含Kd为190μM的SBiT1(SEQ ID NO：1)和Kd为0.18μM的SBiT2(SEQID NO：3)。NB-LUMABS-5(SEQ ID NO：10)包含两个相同的Kd为190μM的SBiT(SEQ ID NO：1)。NB-LUMABS-6(SEQ ID NO：11)包含两个相同的Kd为2.5μM的SBiT(SEQ ID NO：2)。NB-LUMABS-7(SEQ ID NO：12)包含Kd为2.5μM的SBiT1(SEQ ID NO：2)和Kd为0.18μM的SBiT2(SEQID NO：3)。NB-LUMABS-4在不存在抗体的情况下显示出高的发射比例，但其由于抗体的结合而适度降低。在单个传感器蛋白中含有两个相同SBiT的NB-LUMABS-5和-6在无抗体状态下显示出低的发射比率，这表明在这些传感器中SBiT1已经补充了很大一部分传感器蛋白中的NanoLuc的活性。对于NB-LUMABS-7，在无抗体状态下发射比率达到1.8，并且在添加了抗体时发射比率显著降低。动态范围(DR)达到493％。抗体滴定实验得到对这四个传感器变体的表观亲和力在10至15pM之间，这类似于对于NB-LUMABS-1所获得的(图3)。
表1.靶向抗HIV1-p17抗体的各种NB-LUMABS(NB-LUMABS)变体的特性。
调整传感器的选择性
为了挑战我们传感器设计的模块性，我们测试了是否可以将表位序列交换为靶向不同抗体的表位序列。靶向治疗性抗体曲妥珠单抗的传感器(TRAS-NB-LUMABS-1，SEQ IDNO：13；TRAS-NB-LUMABS-1，SEQ ID NO：14；以及TRAS-NB-LUMABS-3，SEQ ID NO：15)是通过用结合曲妥珠单抗的模拟表位(mimitope)QLGPYELWELS(SEQ ID NO：5)替换NB-LUMABS-1，NB-LUMABS-5和NB-LUMABS-7中存在的表位序列而构建的。曲妥珠单抗用于治疗Her2阳性转移性乳腺癌。群体药代动力学表明了清除率存在患者间差异，并且10％的患者具有快速清除率，从而导致药物浓度低于最低有效浓度(Bruno等，CancerChemother.Pharmacol.2005，56，361)。模拟表位对曲妥珠单抗的单价亲和力为294nM。对于这三种传感器，在不含曲妥珠单抗的状态下观察到了有效的BRET(图4)。在TRAS-NB-LUMABS-1中加入1μM曲妥珠单抗导致了BRET适度降低，并且动态范围为37％。当添加大量曲妥珠单抗时，观察到发射比率增大。可能有两分子抗体与一分子传感器结合，因此传感器恢复为关闭状态。在抗体滴定过程中，TRAS-NB-LUMABS-2保持关闭状态。我们认为LBiT和SBiT2之间的亲和力是如此之高，以至于弱的表位亲和力未能导致二价抗体结合。加入了曲妥珠单抗时，TRAS-NB-LUMABS-3呈现出发射比率的适度变化，并且动态范围为36％。曲妥珠单抗的滴定得到TRAS-NB-LUMABS-1的Kd,app为74.0±9.4nM，TRAS-NB-LUMABS-3的Kd,app为85.7±6.3nM。
另外，靶向治疗性抗体西妥昔单抗的传感器(CTX-NB-LUMABS-1，SEQ ID NO：25；CTX-NB-LUMABS-2，SEQ ID NO：26；和CTX-NB-LUMABS-3，SEQ ID NO：27)是分别通过用结合西妥昔单抗的中间位CVFDLGTRRLRC(单价Kd为61nM；SEQ ID NO：23)来替换NB-LUMABS-1和NB-LUMABS-2中存在的表位序列以及用结合西妥昔单抗的中间位CQFDLSTRRLKC(单价Kd为270nM；SEQ ID NO：24)来替换NB-LUMABS-1中存在的表位序列而构建。西妥昔单抗是临床上重要的抗癌治疗抗体。由于西妥昔单抗结合至癌症标志物EGFR上的不连续构象表位，因此没有线性表位序列可用。然而，已鉴定出二硫键连接的环状中间位肽对于西妥昔单抗具有足够的亲和力，并将其用于构建用于西妥昔单抗的发蓝绿色光的LUMABS传感器，其发射比率变化相对不大(DR约为60％)(参见：Van Rosmalen等，Anal.Chem.，2018，90，3592)。由于中间位肽中半胱氨酸残基的存在排除了使用半胱氨酸-马来酰亚胺化学方法引入Cy3染料，因此，我们取而代之是经由张力促进的叠氮-炔基点击化学(SPAAC)引入了非经典氨基酸对叠氮苯丙氨酸(pAzF)以实现与DBCO功能化荧光团的位点-特异性缀合。为了并入pAzF，将TAG琥珀终止密码子引入到SBiT2的C末端之后(CTX-NB-LUMABS-2；SEQ ID NO：26)或N末端之前(CTX-NB-LUMABS-1；SEQ ID NO：25)。对于pAzF与正交tRNA合成酶/tRNA对的共表达可成功地将pAzF在所需位置处引入到西妥昔单抗传感器变体。CTX-NB-LUMABS-1在不存在西妥昔单抗的情况下显示出明亮的Cy3发射，并且在抗体结合时发射比率显著降低(图6)。动态范围达到233±12％，代表与蓝绿色CTX-LUMABS传感器(Van Rosmalen等，Anal.Chem.2018，90，3592)相比提高了4倍，同时发现通过拟合滴定数据获得的总Kd为34.7±3.7nM是相似的(图6)。在CTX-NB-LUMABS-2的SBiT2的C末端引入Cy3大大降低了无抗体状态下的BRET效率(图6)，这与针对HIV-NB-LUMABS-2获得的结果一致。我们还构建了一种传感器变体(CTX-NB-LUMABS-3)，其包含具有较弱亲和力的环状的西妥昔单抗中间位(SEQ IDNO：24)。用CTX-NB-LUMABS-3进行的滴定实验显示Kd为189±16nM，使该传感器能够可靠地测量西妥昔单抗的高浓度(图6)。与CTX-NB-LUMABS-1相比，CTX-NB-LUMABS-3对西妥昔单抗的较低亲和力还导致更快的响应。这些结果表明，可以重新配置NB-LUMABS传感器模式以检测对二硫键约束的环肽进行识别的抗体，从而产生两种西妥昔单抗传感器，其联合响应方案涵盖了临床相关的西妥昔单抗浓度范围(25nM-2.3μM)。
这些结果进一步表明，为示例性抗HIV1-p17抗体开发的框架可用于轻松开发用于其他抗体的传感器。
表2.各种靶向治疗性抗体的NB-LUMABS变体的特性。
| 传感器名称 | SBiT1 | SBiT2 | 荧光团位置 | DR | K<sub>d,app</sub>(nM) |
| TRAS-NB-LUMABS-1 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝2.5μM | 在SBiT2之前 | 37％ | 74.0±9.4 |
| TRAS-NB-LUMABS-2 | K<sub>d</sub>＝2.5μM | K<sub>d</sub>＝0.18μM | 在SBiT2之前 | 0％ | - |
| TRAS-NB-LUMABS-3 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝190μM | 在SBiT2之前 | 36％ | 85.7±6.3 |
| CTX-NB-LUMABS-1 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝2.5μM | 在SBiT2之前 | 233％ | 34.7±3.7 |
| CTX-NB-LUMABS-2 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝2.5μM | 在SBiT2之后 | 110％ | 20.7±3.4 |
| CTX-NB-LUMABS-3 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝2.5μM | 在SBiT2之前 | 88％ | 189±16 |
实验
克隆和诱变
编码NB-LUMABS-1(SEQ ID NO：6)的合成DNA序列是从GenScript(Piscataway，USA)订购的。使用特定引物通过定点诱变从NB-LUMABS-1构建了NB-LUMABS-2(SEQ ID NO：7)、NB-LUMABS-3(SEQ ID NO：10)、NB-LUMABS-4(SEQ ID NO：9)、NB-LUMABS-5(SEQ ID NO：10)、NB-LUMABS-6(SEQ ID NO：11)和NB-LUMABS-7(SEQ ID NO：12)(表3)。根据制造商的说明，使用QuickChange定点诱变试剂盒(安捷伦科技)来引入目标突变(matations ofinterest)。
为了构建TRAS-NB-LUMABS-1(SEQ ID NO：13)、TRAS-NB-LUMABS-2(SEQ ID NO：14)和TRAS-NB-LUMABS-3(SEQ ID NO：15)，使用KpnI和SpeI经由酶切连接(restriction-ligation)法将编码包括曲妥珠单抗模拟表位(QLGPYELWELSH)的半柔性接头的基因克隆到编码NB-LUMABS-1，NB-LUMABS-5或NB-LUMABS-7的pET28a质粒中。通过Sanger测序(StarSEQGmbH)确认了所有克隆和诱变结果。
为了构建CTX-NB-LUMABS-1(SEQ ID NO：25)、CTX-NB-LUMABS-2(SEQ ID NO：26)和CTX-NB-LUMABS-3(SEQ ID NO：27)，利用KpnI-HF和SpeI-HF限制酶来消化编码CTX-LUMABS的pET28a(+)质粒，该质粒是根据Van Rosmalen等公开的方法制备的(Anal.Chem.2018，90，3592)。然后通过利用KpnI-HF和SpeI-HF的酶切连接法将包括西妥昔单抗中间位的接头(即具有中间位CVFDLGTRRLRC(SEQ ID NO：23)的CTX-NB-LUMABS-1和CTX-NB-LUMABS-2，以及具有中间位CQFDLSTRRLKC(SEQ ID NO：24)的CTX-NB-LUMABS-3)克隆到编码NB-LUMABS-1(SEQID NO：6)的pET28a(+)质粒中。去掉半胱氨酸残基，并利用特异性引物通过定点诱变将TAG密码子引入所需位置(表3)。通过Sanger测序(StarSEQ GmbH)确认了所有克隆和诱变结果。
表3.NB-LUMABS变体的构建
| 传感器名称 | SBiT1-LBiT相互作用 | SBiT2-LBiT相互作用 | Cys/TAG位置 |
| NB-LUMABS-1 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝2.5μM | Cys在SBiT2之前 |
| NB-LUMABS-2 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝2.5μM | Cys在SBiT2之后 |
| NB-LUMABS-3 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝2.5μM | Cys在SBiT2之前和之后 |
| NB-LUMABS-4 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝0.18μM | Cys在SBiT2之前 |
| NB-LUMABS-5 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝190μM | Cys在SBiT2之前 |
| NB-LUMABS-6 | K<sub>d</sub>＝2.5μM | K<sub>d</sub>＝2.5μM | Cys在SBiT2之前 |
| NB-LUMABS-7 | K<sub>d</sub>＝2.5μM | K<sub>d</sub>＝0.18μM | Cys在SBiT2之前 |
| TRAS-NB-LUMABS-1 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝2.5μM | Cys在SBiT2之前 |
| TRAS-NB-LUMABS-2 | K<sub>d</sub>＝2.5μM | K<sub>d</sub>＝0.18μM | Cys在SBiT2之前 |
| TRAS-NB-LUMABS-3 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝190μM | Cys在SBiT2之前 |
| CTX-NB-LUMABS-1 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝2.5μM | TAG在SBiT2之前 |
| CTX-NB-LUMABS-2 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝2.5μM | TAG在SBiT2之后 |
| CTX-NB-LUMABS-3 | K<sub>d</sub>＝190μM | K<sub>d</sub>＝2.5μM | TAG在SBiT2之前 |
蛋白质的表达和纯化
使用标准规程来表达和纯化蛋白质。简而言之，将合适的pET28a质粒转化到E.coliBL21(DE3)中。将细胞于37℃在含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养。使用0.1mMIPTG在20℃过夜在OD600为0.6时诱导蛋白质表达。收获细胞并使用Bugbuster试剂(Novagen)进行裂解。使用Ni-NTA亲和色谱法来纯化传感器蛋白，然后按照制造商的说明进行Strep-Tactin纯化。利用消光系数(由蛋白质序列计算)通过在280nm处测量吸光度来确定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE确认蛋白质纯度。纯化的蛋白质在使用前储存于-80℃。
为了并入对叠氮苯丙氨酸(pAzF)，将编码CTX-NB-LUMABS的pET28a质粒与编码tRNA/tRNA合成酶对的pEVOL载体一起共转化到E.coli BL21(DE3)中。pEVOL载体是来自Peter Schultz的赠品(Addgene质粒#31186)。细胞在含有30μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的2YT培养基(每升16g蛋白胨、5gNaCl、10g酵母提取物)中培养。在存在1mM pAzF(Bachem，F-3075.0001)的情况下，使用0.1mM IPTG和0.2％阿拉伯糖诱导蛋白质表达。传感器蛋白如上所述进行纯化。
从GenScript订购了编码初始pG-NB-LUMABS的pET28a质粒，其无表位序列。另外，还从GenScript订购了两个pUC57载体，其编码半柔性接头中的两个表位序列(SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24)。使用KpnI和SpeI限制酶进行酶切连接克隆，将这些表位序列克隆到pET28a+载体中，并使用T4连接酶进行连接。通过被转化到E.coli NovaBlue细菌(Novagen)中并随后进行培养来进行扩增载体。使用QIAprep离心微量制备试剂盒(spin miniprepkit)(Qiagen)提取载体。通过Sanger测序(StarSeq，德国)确认了具有表位的半柔性接头的正确并入(incorporation)。将新获得的pET28a+载体(包括表位)与编码tRNA/tRNA合成酶的pEVOL载体(其用于将对苯甲酰基苯丙氨酸(pBPA)并入到蛋白G中)一起转化到来自Novagen的E.coli BL21(DE3)细菌中。该pEVOL-pBpF载体是来自Peter Schultz的赠品(Addgene质粒#31190)。将细菌在加入30μg/mL卡那霉素和氯霉素后的LB培养基中培养。通过0.1M IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)和0.2％阿拉伯糖在OD为0.6时诱导蛋白质的表达，同时添加非天然氨基酸pBPA(Bachem，F-2800.0001)(1mM)。在18℃过夜表达后，将培养物以10000xg离心10分钟。使用BugBuster(20mL/L)和Benzonase(20μL/L)在室温下将细胞裂解20分钟。将裂解的细菌在4℃以16000xg离心45分钟。利用镍亲和力和Strep-Tactin柱色谱法进行上清液的纯化。利用SDS-PAGE凝胶和Q-ToF-MS确认传感器蛋白的纯度。
蛋白质的荧光团标记
在室温下，用50mM Tris-HCl(pH 7.4)中的1mM三羧基乙基膦(TCEP)来还原经纯化的NB-LUMABS蛋白20min。然后将溶于水的磺酸基花青3马来酰亚胺(Lumiprobe)(10mg/ml)以30倍摩尔过量的量添加到蛋白质溶液中，并在室温下温育1小时，然后在4℃下温育过夜。通过使用PD10脱盐柱来去除未反应的染料，并使用10kDa的Amicon离心过滤器来浓缩缀合物。通过测量280nm和553nm处的吸光度并假设蛋白质和染料的消光系数分别为39,420M- 1cm-1和162,000M-1cm-1来确定染料与蛋白质的比率。通过Q-ToF LC-MS来确认Cy3标记的NB-LUMABS蛋白。
在室温下，将DBCO-磺酸基-Cy3(Jena Bioscience，CLK-A140-1)以40倍摩尔过量的量与CTX-NB-LUMABS缀合过夜。使用10kDa的Amicon离心过滤器去除多余的染料。通过测量在280nm和563nm处的吸光度并使用消光系数(由蛋白质序列计算)来确定染料与蛋白质的比率。通过Q-TOF-MS来分析反应产物。
对50mM TRIS pH 7中的纯的pG-NB-LUMABS(50μM，800μL)鼓入氩气。加入10μL100mM TCEP(三羧基乙基膦)(终浓度为1mM)，并在室温下用氩气冲洗20分钟。将来自Lumiprobe的磺酸基-Cy3-马来酰亚胺(1mg)溶于100μL的MilliQ水中。将染料添加到蛋白质溶液中(染料15倍过量的量)，并用氩气冲洗。将其在室温下放置1小时，并在4℃下放置过夜。使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)除去未反应的染料。用3kDa Amicon Ultra 0.5mL离心过滤器浓缩已标记的蛋白。利用NanoDrop(UV-VIS)、在280nm和548nm处的吸收来测量染料与蛋白质的比率。
pG-NB-LUMABS的光致缀合
使用Promed UVL-30UV光源(4×9瓦)进行光致缀合反应。使用2μM抗体(HyTest)和PBS缓冲液(pH 7.4)中的8μM pG-NB-LUMABS来测试光致缀合效率。将混合物在UV光(365nm)下放置在冰上30、60或90分钟。然后将样品进行SDS-PAGE凝胶电泳以确定光致缀合效率。
使用尺寸排阻色谱法(SEC)成功去除了过量的非缀合传感器蛋白。生物发光光谱显示，pG-NB-LUMABS蛋白与其抗体缀合后，Cy3发射大大降低，这与预期的肽表位与抗原结合位点的结合破坏了LBit-Sbit2的相互作用相一致。表位肽的添加确实导致BRET比率增大，通过显示出传感器由于竞争性结合而在低BRET状态和高BRET状态之间可逆切换的能力，证明了传感器构思的可行性(图8B)。
传感器的表征
抗HIV1-p17抗体获自Zeptometrix(克隆32/1.24.89)。曲妥珠单抗(Herceptin，Roche)和西妥昔单抗(Erbitux，Merck)是通过荷兰埃因霍温的凯瑟琳娜医院药房获得的。使用1pM的传感器浓度，在PerkinElmer平板白色96孔Optiplate中在100μL PBS(pH 7.4，1mg/ml BSA)中进行NB-LUMABS的抗体滴定。使用100pM的传感器进行曲妥珠单抗和西妥昔单抗滴定。将传感器和抗体温育2小时后，以最终稀释1000倍添加NanoGlo底物。
使用2nM的传感器浓度将抗CRP169结合肽滴定到缀合抗体的pG-NB-LUMABS。将传感器和肽温育45分钟后，以最终稀释500倍添加NanoGlo底物。
在Tecan Spark 10M读板器上记录在398nm至653nm之间的发光光谱，步长为15nm，带宽为25nm，积分时间为1000ms。将滴定度拟合至等式1以获得表观Kd值。
P1是发射比率(ER)变化最大值，P2是不存在分析物时的发射比率。动态范围(DR)的计算公式为：
使用数码相机记录信号
向白色96孔板中加入200μL PBS缓冲液(pH 7.4，1mg/ml BSA)，其中含有100pMCTX-NB-LUMABS、不同浓度的西妥昔单抗和1μL NanoGlo底物。将板放置在黑暗房间的聚苯乙烯泡沫塑料盒中以排除周围的光线。为了进行血浆测量，样品以具有5nM传感器的200μL未稀释血浆来制备。照片是使用SONY DSC-RX100数码相机通过盒子上的孔拍摄的，曝光时间为10-30s，F值为1.8，ISO值为1600-6400。通过使用ImageJ来分析图像以计算蓝色和红色通道中平均强度之间的比率值。
序列表
<110> 艾恩德霍芬技术大学
<120> 用于检测和定量溶液中的生物分子或配体的生物发光生物传感器
<130> 77659PC
<150> US62/635053
<151> 2018-02-26
<160> 27
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 深海虾（Oplophorus gracilirostris）
<220>
<223> SBiT K(d) 为 190 µM
<400> 1
Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 深海虾（Oplophorus gracilirostris）
<220>
<223> SBiT K(d) 为 2.5 µM
<400> 2
Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 深海虾（Oplophorus gracilirostris）
<220>
<223> SBiT K(d) 为 0.18 µM
<400> 3
Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Ile Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV1-p17 抗体结合表位
<400> 4
Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗结合模拟表位
<400> 5
Gln Leu Gly Pro Tyr Glu Leu Trp Glu Leu Ser His
1 5 10
<210> 6
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NB-LUMABS-1
<400> 6
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg
225 230 235 240
Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys
355 360 365
Ile Arg Leu Arg Pro Thr Ser Gly Gly Ser Cys Gly Gly Ser Val Thr
370 375 380
Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp
385 390 395 400
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
<210> 7
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NB-LUMABS-2
<400> 7
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg
225 230 235 240
Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys
355 360 365
Ile Arg Leu Arg Pro Thr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Val Thr Gly
370 375 380
Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser Gly Gly Ser Cys Gly Gly Ser Trp
385 390 395 400
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
<210> 8
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NB-LUMABS-3
<400> 8
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg
225 230 235 240
Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys
355 360 365
Ile Arg Leu Arg Pro Thr Ser Gly Gly Ser Cys Gly Gly Ser Val Thr
370 375 380
Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser Gly Gly Ser Cys Gly Gly Ser
385 390 395 400
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
<210> 9
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NB-LUMABS-4
<400> 9
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg
225 230 235 240
Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys
355 360 365
Ile Arg Leu Arg Pro Thr Ser Gly Gly Ser Cys Gly Gly Ser Val Thr
370 375 380
Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Ile Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp
385 390 395 400
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
<210> 10
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NB-LUMABS-5
<400> 10
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg
225 230 235 240
Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys
355 360 365
Ile Arg Leu Arg Pro Thr Ser Gly Gly Ser Cys Gly Gly Ser Val Thr
370 375 380
Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp
385 390 395 400
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
<210> 11
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NB-LUMABS-6
<400> 11
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg
225 230 235 240
Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys
355 360 365
Ile Arg Leu Arg Pro Thr Ser Gly Gly Ser Cys Gly Gly Ser Val Thr
370 375 380
Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp
385 390 395 400
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
<210> 12
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NB-LUMABS-7
<400> 12
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg
225 230 235 240
Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys
355 360 365
Ile Arg Leu Arg Pro Thr Ser Gly Gly Ser Cys Gly Gly Ser Val Thr
370 375 380
Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Ile Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp
385 390 395 400
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
<210> 13
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAS-NB-LUMABS-1
<400> 13
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Gln Leu Gly Pro Tyr Glu Leu Trp Glu Leu Ser
225 230 235 240
His Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Leu Gly Pro Tyr Glu Leu
355 360 365
Trp Glu Leu Ser His Thr Ser Gly Gly Ser Cys Gly Gly Ser Val Thr
370 375 380
Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp
385 390 395 400
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
<210> 14
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAS-NB-LUMABS-2
<400> 14
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Gln Leu Gly Pro Tyr Glu Leu Trp Glu Leu Ser
225 230 235 240
His Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Leu Gly Pro Tyr Glu Leu
355 360 365
Trp Glu Leu Ser His Thr Ser Gly Gly Ser Cys Gly Gly Ser Val Thr
370 375 380
Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Ile Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp
385 390 395 400
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
<210> 15
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAS-NB-LUMABS-3
<400> 15
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Gln Leu Gly Pro Tyr Glu Leu Trp Glu Leu Ser
225 230 235 240
His Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Leu Gly Pro Tyr Glu Leu
355 360 365
Trp Glu Leu Ser His Thr Ser Gly Gly Ser Cys Gly Gly Ser Val Thr
370 375 380
Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp
385 390 395 400
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
<210> 16
<211> 56
<212> PRT
<213> 链球菌属
<220>
<223> 蛋白质 G
<220>
<221> 结合型
<222> 24
<223> 光交联剂 对苯甲酰苯丙氨酸 (BPA)
<400> 16
Met Thr Phe Lys Leu Ile Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Ile
1 5 10 15
Thr Ile Glu Ala Val Asp Ala Xaa Glu Ala Glu Lys Ile Phe Lys Gln
20 25 30
Tyr Ala Asn Asp Tyr Gly Ile Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala
35 40 45
Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
50 55
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CRP169结合表位
<400> 17
Val Gly Ala Glu Ala Ser Ile Ile Leu Gly Gln Glu Gln Asp Ser Phe
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CRP36结合表位
<400> 18
Tyr Ser Phe Thr Val Gly Gly Ser Glu Ile Leu Phe Glu Val Pro Glu
1 5 10 15
Val
<210> 19
<211> 158
<212> PRT
<213> 深海虾（Oplophorus gracilirostris）
<220>
<223> LBiT
<400> 19
Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr Ala Ala
1 5 10 15
Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Leu
20 25 30
Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Arg Ser
35 40 45
Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu
50 55 60
Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe Lys Val
65 70 75 80
Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro Tyr Gly
85 90 95
Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr Phe Gly
100 105 110
Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val
115 120 125
Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile
130 135 140
Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
145 150 155
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半柔性接头
<400> 20
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
35 40 45
Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
85 90 95
Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
115 120
<210> 21
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pG-NB-LUMABS-17
<220>
<221> 结合型
<222> 254
<223> 光交联剂 对苯甲酰苯丙氨酸(BPA)
<400> 21
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Thr Phe Lys Leu Ile Ile Asn Gly Lys
225 230 235 240
Thr Leu Lys Gly Glu Ile Thr Ile Glu Ala Val Asp Ala Xaa Glu Ala
245 250 255
Glu Lys Ile Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Tyr Gly Ile Asp Gly Glu
260 265 270
Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Gly Thr
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
305 310 315 320
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
325 330 335
Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
355 360 365
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
370 375 380
Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ala Glu Ala Ser Ile Ile
405 410 415
Leu Gly Gln Glu Gln Asp Ser Phe Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Cys
420 425 430
Thr Ser Gly Gly Ser Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
450 455 460
<210> 22
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pG-NB-LUMABS-11
<220>
<221> 结合型
<222> 254
<223> 光交联剂 对苯甲酰苯丙氨酸(BPA)
<400> 22
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Thr Phe Lys Leu Ile Ile Asn Gly Lys
225 230 235 240
Thr Leu Lys Gly Glu Ile Thr Ile Glu Ala Val Asp Ala Xaa Glu Ala
245 250 255
Glu Lys Ile Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Tyr Gly Ile Asp Gly Glu
260 265 270
Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Gly Thr
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
305 310 315 320
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
325 330 335
Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
355 360 365
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
370 375 380
Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Ser Phe Thr Val Gly Gly Ser
405 410 415
Glu Ile Leu Phe Glu Val Pro Glu Val Gly Gly Ser Gly Gly Ser Cys
420 425 430
Thr Ser Gly Gly Ser Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
450 455 460
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗结合中间位 单价 K(d) 为 61 nM
<400> 23
Cys Val Phe Asp Leu Gly Thr Arg Arg Leu Arg Cys
1 5 10
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔单抗结合中间位 单价 K(d) 为 270 nM
<400> 24
Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys
1 5 10
<210> 25
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTX-NB-LUMABS-1
<220>
<221> 结合型
<222> 379
<223> 光交联剂 对叠氮-L-苯丙氨酸 (pAzF)
<400> 25
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Cys Val Phe Asp Leu Gly Thr Arg Arg Leu Arg
225 230 235 240
Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Cys Val Phe Asp Leu Gly Thr
355 360 365
Arg Arg Leu Arg Cys Thr Ser Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Ser Val Thr
370 375 380
Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp
385 390 395 400
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
<210> 26
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTX-NB-LUMABS-2
<220>
<221> 结合型
<222> 396
<223> 光交联剂 对叠氮-L-苯丙氨酸 (pAzF)
<400> 26
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Cys Val Phe Asp Leu Gly Thr Arg Arg Leu Arg
225 230 235 240
Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Cys Val Phe Asp Leu Gly Thr
355 360 365
Arg Arg Leu Arg Cys Thr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Val Thr Gly
370 375 380
Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Ser Trp
385 390 395 400
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
<210> 27
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTX-NB-LUMABS-3
<220>
<221> 结合型
<222> 379
<223> 光交联剂 对叠氮-L-苯丙氨酸 (pAzF)
<400> 27
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
20 25 30
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val
100 105 110
Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro
115 120 125
Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe
130 135 140
Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr
165 170 175
Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile
180 185 190
Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg
195 200 205
Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Thr Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys
225 230 235 240
Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
275 280 285
Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
325 330 335
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr
355 360 365
Arg Arg Leu Lys Cys Thr Ser Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Ser Val Thr
370 375 380
Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Lys Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Trp
385 390 395 400
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
405
Claims (15)
1.一种生物传感器，其包括具有第一端和第二端的接头，其中：
-所述接头的第一端经由第一结合域与第一荧光素酶结构域的一个末端融合；和
-所述接头的第二端经由第二结合域与第二荧光素酶结构域融合，
其中，所述生物传感器可选地包含第三荧光素酶结构域，所述第三荧光素酶结构域经由间隔基与所述第一荧光素酶结构域的另一个末端融合，
其中，所述结合域被配置为结合至生物分子，
其中，所述生物传感器以两种构象存在，其中所述第二荧光素酶结构域或第三荧光素酶结构域与所述第一荧光素酶结构域结合以形成互补的荧光素酶，并且其中荧光团与所述第二荧光素酶结构域或第三荧光素酶结构域中的一个相邻地缀合，从而仅在所述两种构象中的一种中导致所述萤光素酶与所述荧光团之间有效的生物发光共振能量转移(BRET)。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其中，所述第三荧光素酶结构域经由间隔基与所述第一荧光素酶结构域的另一个末端融合。
3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述第一荧光素酶结构域是大的荧光素酶结构域，优选为大的分裂荧光素酶片段，并且其中，所述第二荧光素酶结构域和第三荧光素酶结构域是小的荧光素酶结构域，优选为小的分裂荧光素酶片段。
4.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其中，所述接头是半柔性接头。
5.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其中，所述生物分子包括抗体、抗原、蛋白质或适配体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的生物传感器，其中，所述第一结合域被配置为与所述生物分子形成缀合系统，并且其中，所述第二结合域被配置为结合至所述生物分子的配体结合位点。
7.根据权利要求6所述的生物传感器，其中，所述生物分子的配体结合位点包括抗体的抗原结合位点。
8.根据权利要求6或7所述的生物传感器，其中，所述生物分子共价结合至所述生物传感器的第一结合域。
9.一种体外生物分子检测方法，包括以下步骤：
-使样品与权利要求1至5中任一项所述的生物传感器接触；
-确定在样品存在的情况下的所述生物传感器的发光的变化；以及
-确定在样品存在的情况下的所述发光变化，以定量和/或定性生物分子的存在或不存在。
10.根据权利要求9所述的体外生物分子检测方法，其中，在不存在生物分子的情况下，所述生物传感器处于无生物分子的状态，其中至少一些所述第一荧光素酶结构域与所述第二荧光素酶结构域互补。
11.根据权利要求9或10所述的体外生物分子检测方法，其中，所述生物传感器的结合域与所述生物分子之间的结合改变了在所述生物传感器的无生物分子的状态与所述生物传感器的与生物分子结合的状态之间的平衡，使得所述荧光素酶与荧光团之间的BRET发生了变化。
12.一种体外配体检测方法，包括以下步骤：
-使样品与权利要求6至8中任一项所述的生物传感器接触；
-确定在样品存在的情况下所述生物传感器的发光变化；以及
-确定在样品存在的情况下的所述发光变化，以定量和/或定性配体的存在或不存在。
13.根据权利要求12所述的体外配体检测方法，其中，在不存在配体的情况下，所述生物分子结合至所述第二结合域，从而破坏所述第二荧光素酶结构域与所述第一荧光素酶结构域的相互作用。
14.根据权利要求12或13所述的体外配体检测方法，其中在存在配体的情况下，所述生物传感器处于与配体结合状态，从而允许至少一些所述第一荧光素酶结构域与所述第二荧光素酶结构域互补。
15.包含权利要求1至8中任一项所述的生物传感器的部件套件，其中，所述生物传感器包含经由半柔性接头与第二荧光素酶结构域融合的第一荧光素酶结构域，所述半柔性接头包含在所述接头的端部处的两个结合域，并且其中，所述部件套件进一步包含第三荧光素酶结构域。
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