CN101278194A - 用于分析物检测的协同指示系统、组分以及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用被转换成纳米尺度的“自发信号”生物传感器的抗体分子来检测样本中的分析物的方法和组合物。本发明尤其涉及那些能提供目标分析物的一步检测且无需传统测定所必要的高劳动强度步骤的方法和组合物。

Description

用于分析物检测的协同指示系统、组分以及方法

相关申请的交叉引用

本申请要求了2005年5月23日提交的美国临时申请号60/683,921和2006年3月1日提交的美国临时申请号60/778,991的优先权。

技术领域

本发明的实施方案涉及使用被转换成纳米尺度的“自发信号”生物传感器的抗体分子来检测样本中的分析物的方法和组合物，特别是那些能提供目标分析物的一步检测且无需传统测定所必要的高劳动强度步骤的方法和组合物。

背景技术

免疫测定是以抗体和抗原之间的特异性相互作用为基础的。它们通常在现代临床诊断学、药物筛选试验和医学研究中是不可缺少的。在这些免疫测定法中，酶联免疫吸附检测(ELISA)、侧流免疫测定法和蛋白印迹测定法的应用最广泛。ELISA和蛋白印迹技术需要孵育/洗涤步骤的多次循环，因此工作繁重并且容易出现操作错误。侧流免疫测定法，例如标尺测定法，通常能提供更快速的检测，但不如传统的ELISA灵敏或精确。所有这些检测方法都是使用异相的形式实施的，即它们都需要将抗体或抗原固定在固体表面上。相对而言，不必对抗体/抗原进行固定的均相测定法，可提供许多胜过异相测定的重要优点。首先且最重要的是，均相免疫测定法能以″混合与检测″的方式直接在溶液中进行检测，而不需要许多的孵育步骤或另外的信号生成部件，由此在保持测定的灵敏度和特异性的同时大大提高了测定处理量。此外，相对竞争模式而言，均相测定法优选适用于非竞争模式，因为非竞争模式敏感性通常要高几个数量级[Ohiro等人，2002，在此以引用的方式将其全部内容并入本文]。拥有可以提供均相溶液态非竞争免疫测定法的有效且通用的测定平台，在检测大批量样品时是特别重要的，因为这种模式更适合于采用现在高处理量检测应用中常用的机器人操作液体处理系统的自动化操作。然而，一个关键的技术挑战是研发一种简单、有效的指示机理来对抗原-抗体在溶液中的相互作用进行标记。

发明内容

在一些实施方案中，本发明提供了一种测知分析物的方法，包括以下步骤：提供一种生物样本；用至少一种用于检测分析物的协同指示试剂接触所述样品，其中所述指示试剂可包括亲合组分、连接组分和协同指示组分；确定系统中是否存在指示样品中存在分析物的信号；根据所述信号存在与否测知分析物，其中在不存在分析物的背景上检测不到所述信号。

在一些实施方案中，待检测的分析物可以是例如选自由蛋白质、肽、抗原、抗体、外源凝集素、结合外源凝集素的碳水化合物、疾病标示物、细胞因子、细胞因子受体、激素、激素受体、细胞粘着分子、细胞粘着分子配体、核酸、糖链、脂类、细胞、病毒、胞内细胞器、小分子、低分子量化合物等组成的组中的一种物质，或者其一部分选自上组的物质。

同样，在一些实施方案中，所述连接组分可以是蛋白L连接子，其中所述蛋白L连接子可以包括蛋白L或其片段或其衍生物。所述蛋白L连接子可以包括允许或者提高衍生物与亲和组分的化学结合的修饰。此外，所述蛋白L连接子还可以包括允许或者提高衍生物与指示组分的化学结合的修饰。所述蛋白L连接子可以包含具有SEQ ID No：7、8、9或10的全部或部分序列的多肽(分别对应SEQ ID No：2、3、4或5的核酸序列)。

在一些实施方案中，亲合组分可包括抗体或其片段或其衍生物。所述指示组分可以包括例如荧光材料、酶、酶片段、酶亚基、受体、配体、荧光蛋白、发光蛋白、非蛋白荧光体、非蛋白质化学发光化合物、荧光标记蛋白、荧光纳米晶体、荧光螯合物、光敏染料和荧光淬灭剂等等。

蛋白L连接子与指示组分的连接可以包含一个化学连接。蛋白L连接子可以被连接到指示组分，形成一个融和蛋白。蛋白L连接子与指示组分的连接可以包含一个非共价的相互作用。此外，蛋白L连接子与指示组分的连接还可以包括生物素-链霉亲和素缀合。蛋白L连接子与亲和组分的连接可以包括自组装。所述自组装可以通过氢键结合、盐桥接或者它们的组合来实现。蛋白L连接子与亲和组分的连接可以包括光致交联。

在各种实施方案中，所述分析物的检测可以在均相系统中进行。同样地，在各种实施方案中，信号可以是光信号，例如由FRET、LRET、BRET、酶片段互补、TR-FRET、发光氧通道等产生的光信号。在一些实施方案中，信号的检测不需要使用仪器。

在一些实施方案中，接触步骤可包括用至少两种协同指示试剂接触样本，其中所述协同指示试剂共同组成一个多元素协同指示系统，系统中信号的产生可以包含，在没有至少2种试剂的连接组分之间的结合的情况下，两种协同指示试剂之间的相互作用。在一些实施方案中，至少两个协同指示试剂中的每一个都可以包括一个特有的亲合组分，使得特有亲合组分各自对同一分析物的不同部分有亲合力。

本发明另外的实施方案提供了一种用于检测分析物的协同指示系统，其包括至少一个协同分子试剂，所述试剂包括亲合组分、连接组分和协同指示组分，其中所述指示组分与第二指示组分协同产生信号，且其中在不存在分析物的背景上检测不到所述信号。在一些实施方案中，所述第二指示组分与第二协同分子指示试剂相结合，而在其它的实施方案中，所述第二指示组分不与第二协同分子指示试剂相结合。在一些实施方案中，所述系统可以包括至少两种协同分子试剂，其中第一分子试剂的连接组分相对于系统中第二分子试剂的连接组分的背景没有任何亲合力。在一些实施方案中，至少两种分子试剂与分析物之间的结合或相互作用，会使得所述指示组分非常接近。

在一些实施方案中，所述连接组分可以包括蛋白L连接子，其中所述蛋白L连接子可以包括蛋白L或其片段或其衍生物。同样地，所述蛋白L连接子可以包括允许或者提高衍生物与亲和组分的化学结合的修饰。所述蛋白L连接子可以包括允许或者提高衍生物与指示组分的化学结合的修饰。所述蛋白L连接子可以包含具有SEQ ID No：7、8、9或10的全部或部分序列的多肽(分别对应SEQ ID No：2、3、4或5的核酸序列)。亲合组分可包括抗体或其片段或其衍生物。所述指示组分可以包括例如荧光材料、酶、酶片段、酶亚基、受体、配体、荧光蛋白、发光蛋白、非蛋白荧光体、非蛋白质化学发光化合物、荧光标记蛋白、荧光纳米晶体、荧光螯合物、光敏染料和荧光淬灭剂等等。蛋白L连接子与指示组分的连接可以包括例如可形成融和蛋白的化学连接，可以包含一个非共价的相互作用，生物素-链霉亲和素缀合等等。蛋白L连接子与亲和组分的连接可以包括例如自组装和光致交联等等。

在本发明的其它实施方案中，提供了用于检测分析物的生物传感器，其包括：亲合基团；协同指示物；和包括蛋白L连接子的连接组分，其中所述蛋白L连接子可以包括蛋白L或其片段或其衍生物。在一些实施方案中，所述生物传感器可以进一步包括一个或多个附加的协同指示物。亲合基团可以包括，例如抗体或其片段或其衍生物。协同指示物可以包括例如，荧光材料、酶、酶片段、酶亚基、受体、配体、荧光蛋白、发光蛋白、非蛋白荧光基团、非蛋白化学发光化合物、荧光标记蛋白、荧光纳米晶体、荧光螯合物、光敏染料和荧光淬灭剂等等。蛋白L连接子可以包括允许或者提高衍生物与指示组分的化合结合的修饰。权利要求39的生物传感器，其中蛋白L连接子可以包括允许或者提高衍生物与指示组分的化合结合的修饰。所述蛋白L连接子可以包含具有SEQ IDNo：7、8、9或10的全部或部分序列的多肽(分别对应SEQ ID No：2、3、4或5的核酸序列)。蛋白L连接子与指示组分的连接可以包括例如，可形成融合蛋白的化学连接，可以包括非共价相互作用、生物素-链霉亲和素缀合等等。蛋白L连接子与亲和组分的连接可以包括例如自组装和光致交联等等。

附图说明

图1示意性描述了制造包含自组装的非共价连接的指示物-蛋白L-抗体片段复合体的分子生物传感器的过程。

图2示意性描述了制造包含共价连接的指示物-蛋白L-抗体片段复合体的分子生物传感器的过程。

图3表示利用基于包含指示物-蛋白L-抗体片段复合体的分子生物传感器的协同指示系统的均相非竞争免疫测定。

图4表示利用基于包含与完整抗体分子结合的指示物-蛋白L的分子生物传感器的协同指示系统的均相非竞争测定。

图5表示利用基于多个分子生物传感器的协同指示系统的均相非竞争测定，每个生物传感器包含一个指示物-蛋白L-抗体片段复合体，所述指示组分参与FRET的转运。

图6表示协同指示系统，其中，分子生物传感器的指示组分是酶片段，它们互相作用并且重建酶活性，以便在有目标分析物的情况下产生可检测信号，由可检测产物的形成来例示。

图7描述了包含两个协同指示组分的分子生物传感器，其中，分析物的结合产生可检测信号，由分子内的FRET信号相互作用的改变来证明。

图8表示具有结合到第一指示组分的PpL分子、以及结合到第二指示组分的蛋白G分子的分子生物传感器。当分析物结合生物传感器时，指示组分的相互作用导致可检测信号的产生或者信号的可检测变化。

图9表示具有结合到第一指示组分的PpL分子、以及结合到第二指示组分(一个量子点)的蛋白G分子的分子生物传感器。当分析物结合生物传感器时，第一指示物同量子点的的相互作用，导致可检测信号的产生或者信号的可检测变化。

图10描述与荧光染色的目标细胞相互作用来产生可检测信号的分子生物传感器。没有染色或者不与生物传感器相互作用的细胞不产生任何可检测信号。

图11显示与荧光染色的蛋白相互作用来产生可检测信号的分子生物传感器。

图12表示具有两个在不存在分析物的情况下会淬灭彼此的信号活性的协同指示组分的分子生物传感器。分析物与指示组分之一相互作用的存在，会从生物传感器中除去该组分，使得检测信号得以恢复。

图13显示了包括本发明的协同指示系统的非竞争免疫测定的结果。目标分析物(GMCSF)的存在可以产生检测信号，由相对的荧光发射的改变示例。

图14表示在蛋白LB1结构域内的结合部位。

具体实施方式

本发明的实施方案提供了用于迅速、灵敏的单步均相非竞争免疫测定的新合成蛋白质，其能够方便地将指示物分子位点特异性地共价或者非共价地偶联到标准抗体上。这种测定模式可以在溶液中直接检测，而不需要传统免疫测定中必要的多个孵育步骤或者另外的信号生成部件，这样在保持测定灵敏度和特异性的同时大大提高了测定处理量。相应地，本发明的实施方案提供了用于比传统酶联免疫吸附测定更快且更简单的测定模式的转换成品抗体的技术。

与对抗体自身进行操作不同，本发明的实施方案提供了一种新方法，来将设计的指示物(生物分子接头)偶联到抗体的特定位点，将抗体分子转化成适用于均相非竞争形式和竞争形式的免疫测定的无试剂型自动指示分子生物传感器。一个有利的方面包含，通过生物分子接头将信号发生基团偶联到抗体上，以便在所述抗体与它们的抗原通过荧光共振能量转移(FRET)[Selvin 1995，在此以引用的方式将其全部内容并入本文]或者酶片段互补[Wehrman等，2002，Galarneau等，在此以引用的方式将以上每个的全部内容并入本文]结合后能产生可检测的信号。本测定以“混合与检测”的方式来进行，不需要多个洗涤步骤。这使得特别适应高处理量操作的简单均相测定方法得到了发展。

本发明克服的关键技术挑战，是研发一种简单、有效的指示机制，来反映溶液中抗原-抗体的相互作用。这可以通过将抗体分子转换成自动报告分子生物传感器的新方法来实现，其中借助于从大消化链球菌左旋蛋白质(PpL)免疫球蛋白(Ig)-结合域衍生的生物分子接头。这种接头能够方便地将载运分子(例如指示物基团或者治疗剂)位点特异性地共价偶联到抗体或者抗体片段上。该生物分子接头可应用于均相免疫测定的多种方法中。PpL Ig-结合域(例如B1区域)易于进行基因和化学修饰，以便与荧光指示物结合，并且可以自组装，和被免疫球蛋白(Ig)κ轻链可变区共价或者非共价地俘获。然后，这些功能化的PpL-Ig蛋白复合体应用到基于均相非竞争免疫测定的FRET(荧光共振能量转移)中。例如，当一个标有PpL-FRET供体、另一个具有PpL-FRET受体的两个抗体分子都结合目标分子时，FRET供体和受体彼此紧密地接近，引发FRET。

本发明的实施方案使用基于大消化链球菌蛋白L(PpL)域的生物分子接头。大消化链球菌PpL包含5个同源Ig-结合域(B1-B5)(Kastem等，1992，在此以引用的方式将其全部内容并入本文)。这些域尺寸小(72-76个氨基酸残基)，并且对免疫球蛋白κ轻链可变区(Vk)的亲合力强(nM范围)[De Chateau等，1993，在此以引用的方式将其全部内容并入本文]。有趣且重要地，PpL与Vk的结合不会削弱抗体的偶联亲合力[De Chateau等，1993]。野生型PpL B1域可与人、狒狒、豚鼠、小鼠、大鼠和猪IgG(K_D在nM范围)以高亲合力结合，与兔、马和山羊IgG(KD在亚μM范围)的结合亲合力较低[De Chateau等，1993]。参考附图，可以通过将基于PpL的与指示组分14相连接的连接组分12以非共价或者共价方式偶联到亲合组分16上，以构建分子生物传感器10。指示组分14可以通过例如基因融合或者化学缀合，系链到连接组分12上。在本发明的一些实施方案中，指示物缀合的PpL-B1域，通过基于PpL和抗体之间的特异性氢键和盐键的自组装步骤，非共价地与抗体或者抗体片段偶联在一起。该步骤如图1所示。本发明的其它的实施方案中，采用两步法，将指示物缀合的PpL B1域共价地连接到抗体或者抗体片段(例如Fab或者Fv)邻近抗原结合位点的部位。在第一步中，与指示物缀合的突变PpL-B1突变域通过PpL在特定位点与Ig结合的特性与抗体形成复合体。为此，两个重要的突变被引入PpL-B1域。首先，对PpL B1域的两个免疫球蛋白结合部位(已经被报告表现出相似的Ig-结合亲合力[Svensson等，2004，在此以引用的方式将其全部内容并入本文])之一突变，来实现位点特异性的生物素化。生物素化的PpL和指示物标记的链霉亲和素然后自组装成一个紧密结合的蛋白复合体。这步骤有两个重要的功能：(1)去掉PpL的两个Ig-结合部位之一，(2)将一个指示物基团连接到PpL B1域。在第二步中，引入另一个突变，用Peter Schultz’s group开发的技术将非天然的光致交联氨基酸残基(对苯甲酰-L-苯丙氨酸；Bpa)引入PpL-B1域邻近其Ig-结合位点的部位。该技术使用工程正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA对，与琥珀密码子TAG相对应，在体内将Bpa结合到埃希氏菌属大肠杆菌蛋白质内[Chin等，2002(a)，Chin等，2002(b)，Farrell等，2005，这里全部引用以上每个文献]。与指示物偶联的突变PpL-B1突变域同Ig自组装之后，该蛋白质复合体暴露于长波长的紫外光(360纳米)，使复合体通过光致交联形成共价连接结构。该两步处理法如图2所示。

在本发明中，运载分子可以通过例如蛋白A或者蛋白G等抗体-结合蛋白同抗体结合。然而，与其它例如蛋白A或者蛋白G等抗体结合蛋白相比，更优选为蛋白LB1域，有如下两个理由：1)PpL在抗原连接部位附近与抗体结合(不影响抗原结合)，当标记的抗体与目标物结合时，这可以缩短FRET对间的距离，并且增强FRET信号；2)PpL可与整体IgG、Fab和Fv段、或者库筛选的重组单链Fv结合，拓宽了高特异性和灵敏度的检测器可使用的选择范围。如图3所示，指示物-PpL分子接头与Fab段在形成非竞争均相免疫测定中结合在一起。如图4所示，也可以在形成均相免疫测定中，将指示物-PpL分子接头应用到整个Ig分子。为了预防Ig介导的蛋白寡聚化与交联，可以相对于目标物应用较高浓度的PpL-Ig复合体。一种称作时间分辨FRET(或者TR-FRET)的独特FRET技术，利用发光铕螯合物作为供体，别藻蓝素或者有机染料Cy5作为受体，这样可以在检测灵敏度上提供超过利用传统的供体/受体对的稳态FRET测量50多倍的改进[Selvin 1995，在此以引用的方式将其全部内容并入本文]。

非竞争均相免疫测定法的例子很少，但是竞争型均相免疫测定法方面的报道很多。Be douelle和其合作者[Renard等，2002，Renard等，2004，在此以引用的方式将以上每个的全部内容并入本文]报道了一种将抗体的可变区(Fv)转换制成无试剂型荧光生物传感器的方法，其中将抗原结合位点附近的一个氨基酸残基突变成半胱氨酸，然后将环境敏感的荧光基团缀合到这个半胱氨酸残基上。据报道，抗原的结合使得缀合物的荧光强度产生可测量的指示性变化。Ueda等[Ueda等，1999，Ohiro等，2002，Ueda等，2003，Komiya等，2004，Ueda等，2004，在此以引用的方式将以上每个的全部内容并入本文]报道了一种新均相夹层免疫测定法，其中，两个scFvs或者一对可变的重链(VH)和轻链(VL)片段(每个都标记有荧光蛋白、化学荧光基团或者酶片段)在溶液中有靶物存在的情况下集结到一起，产生作为FRET或者酶片段互补的结果信号。在FRET中，通过非放射性的偶极-偶极相互作用，将能量从荧光供体分子转移到受体分子。在能量转移后，当受体荧光性增加或者致敏时，供体寿命和量子产量减少。这种能量转移取决于供体和受体之间的距离和方向。VH/VL片段互补存在一个明显限制，就是在没有抗原的情况下，VH/NL间的相互作用需要足够弱。而且，由于VH/NL片段互补，结合亲合力大打折扣[Ueda等，1999，Ueda等，2003]。由于控制抗体来引入指示物基团需要对编码这些抗体/片段的基因进行修饰，因此Bedouelle等和Ueda等提出的方法都局限于重组抗体片段。因此，这些方法不能使用非重组抗体，而非重组抗体构成了免疫测定中使用的抗体的主要部分。

本发明实施方案提供了检测样品中一种分析物或者多种分析物22的方法和组合物。新方法通过接头分子将至少一种指示物分子(R)连接到亲合基团(A)的特异性位点，这样就将亲合基团转换成适于测定的自动指示的、无试剂的、分子生物传感器。

在一个优选实施方案中，生物传感器用于均相测定。在另一个实施方案中，生物传感器用于异质测定。例如，测定在异质环境中进行，一个或多个分子生物传感器可以固定在固体表面，通过将分子生物传感器与样品混合进行分析物检测，无论在信号分析之前有或没有随后的洗涤步骤。

本发明的实施方案中，信号分析包括信号检测。可检测的信号包括，例如，在背景上信号的产生、信号发射的改变、信号量级的改变、信号频率的改变、信号波长的改变、信号淬灭和信号干扰等等。可检测的信号也包括，例如，生物发光、化学发光、荧光等。本发明的实施方案可以利用的信号例如可以来自：酶促反应产物中可检测出的特性的产生或变化；位相的变化、固相的沉淀、样品颜色或者光学性质的变化等等。

被分析的样品可以是从任何生物来源获得的样品，例如，乳汁、唾液、血液、血浆、淋巴、脑脊髓液、chime、胆汁、尿、粪便、粘液、月经、汗、泪、精液、卵、任何组织、骨头、活组织检查、肿块、囊肿、食物样品、饮料、药品、溶菌产物/从任意生物/载培样品当中提取或者消耗的媒介等等。

被检测的分析物22可以是选自由蛋白质、肽、抗原、抗体、外源凝集素、结合外源凝集素的碳水化合物、疾病标示物、细胞因子、细胞因子受体、激素、激素受体、细胞粘着分子、细胞粘着分子配体、核酸、糖链、脂类、细胞、病毒、胞内细胞器、小分子、低分子量化合物等组成的组中的一种物质，或者其一部分选自上组的物质。在一些实施方案中，包含分析物的样品在混合并用分子生物传感器检测前，需要进行预处理以除去会对测定产生干扰的污染物。例如，处理选择方案包括离心、过滤、凝胶电泳、柱层析、DNA沉淀、粗蛋白沉淀等等。在其它的实施方案中，包含分析物的样品在混合并利用分子生物传感器检测之前不进行预处理。

在一些实施方案中，生物传感器和/或系统可以直接用于疾病标签的检测，例如肿瘤标签。肿瘤标签可以是与肿瘤疾病或其它肿瘤类型相关的特有差异性表达抗原。同样地，疾病标签可以是与任何疾病相关的可检测分析物。相应地，疾病标签可以是例如：蛋白质、抗体、受体或者受体配基、细胞外基质分子、片段或组分、聚糖或者其它的碳水化合物以及细胞壁片段等，这些分析物与疾病的存在相关，例如，由肿瘤生长、病毒感染、细菌或者真菌感染、寄生虫所引起疾病、自身免疫疾病和朊病毒病等。

亲合基团16可以是例如抗体、双特异抗体(diabody)、微抗体(minibody)(Presta 2003，在此以引用的方式将其全部内容并入本文)、抗体衍生的单链Fv、螺旋稳定化的Fv、Fv、Fv的一部分、F(ab’)₂、Fab、以及它们的突变体等，它们分别识别分析物中的不同位点。

指示组分14可以是荧光材料、酶、酶片段、酶亚基、受体、配体、荧光蛋白、发光蛋白、非蛋白荧光体、非蛋白质化学发光化合物、荧光标记蛋白、荧光纳米晶体、荧光螯合物、光敏染料和荧光性淬灭剂等中的任何材料。

在一个实施方案中，指示组分包含参与在分析物被检测到时产生信号的荧光共振能量转移(FRET)相互作用的荧光物质。FRET相互作用表明其可以作为可检测信号，例如包括，在背景上信号的产生，信号发射的改变，信号量级的改变，信号频率的改变，信号波长的改变，信号的淬灭等。这些可检测信号可以通过FRET对产生，例如异硫氰酸荧光素(FITC)和四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)；Alexa 488和Cy3；Cy3和Cy5；蓝色荧光蛋白(BFP)和绿色荧光蛋白(GFP)；BFP和黄色荧光蛋白(YFP)；青色荧光蛋白(CFP)和YFP；以及CFP和红色荧光蛋白(dsred)[美国专利申请号11/083,461，公开号US 2006/0068502 A1，在此以引用的方式将其全部内容并入本文]。其它的有益实施方案包括FRET协同组分的利用，例如，“LANCE”铕螯合物和别藻蓝素(APC)或Cy5荧光基团，其用于时间分辨(TR)-FRET，并且通常提供较高的测定灵敏度[Zhang等，2005，在此以引用的方式将其全部内容并入本文]。指示组分包括“传递(relay)”FRET组分，例如荧光-放射量子点(QDs)、荧光基团、荧光蛋白等[Medintz等，2003，Clamme和Deniz，2005，在此以引用的方式将以上每个的全部内容并入本文]，也是本发明的有益实施方案。包括传递FRET的实施方案如图5所示。

为了产生如图6所示的信号，本发明的实施方案可以使用蛋白质或者酶片段互补作为FRET的替代。一个酶片段通过PpL域限定到专用于被检测分析物的单克隆抗体上，另一个酶片段限定到识别同一分析物的不同抗原决定簇的第二单克隆抗体上。两个抗体与目标分析物结合起来后，酶片段在不同底物的催化转化下，重组以产生可检测信号。这种酶活性可以催化能产生生物发光的、化学发光的和荧光等可检测信号的反应。这种信号也能由于酶促反应产物的可检测特性的形成或变化而产生。酶互补系统的实施方案包括β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、荧光素酶、泛素、和鼠科动物二氢叶酸还原酶(mDHFR)(Deo 2004，在此以引用的方式将其全部内容并入本文)。在一个实施方案中，酶片段或者亚基通过长度适当的柔韧性或者刚性连接元件系链到生物传感器上。所述连接元件可以由肽、核酸、糖链、蛋白、及其复合体等组成。在另一个实施方案中，酶片段或者亚基通过化学键直接系链到生物传感器上。本发明的实施方案也利用指示组分中的荧光蛋白片段的互补，其中，当荧光蛋白片段紧密地接近彼此时，荧光信号将在它们重新组合后出现。荧光蛋白片段互补的实施方案包括分裂绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。

在第三实施方案中，指示组分包含受体或配体，其在分析物存在时参与受体-配体相互作用。分析物的检测可以通过产生可检测信号的分析物与指示物的相互作用来完成。检测信号可以以位相变化、固相沉淀、样品颜色或者光学性质改变的方式显示自身。

在本发明一个优选实施方案中，接头分子包括基于蛋白L的连接子，后者包括蛋白L或其片段或其衍生物。蛋白L可以被修改，以导入允许连接到指示组分的元素。在一个实施方案中，A20C突变在两个抗体结合部位之一处被引入到蛋白L B1区域，半胱氨酸残基就被引入到了氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。在其它实施方案中，T30C突变被引入到蛋白L B1结构域(SEQ ID No：7)。突变可以降低抗体与特异性位点的结合，同时允许对该位点通过修饰来使蛋白L可以与至少一个指示组分进行自组装。在一个优选方案中，自组装包括生物素-链霉亲和素缀合，其中，链霉亲和素分子，例如可以容易地用多个化学荧光基团标记成有效的指示物。在其它实施方案中，自组装可以包括定位的化学偶联(例如通过硫醇反应缀合)、蛋白质相互作用、弱的化学相互作用等等。

指示组分也可以通过另外的连接元件连接到蛋白L上。例如，荧光蛋白或者酶片段可以通过基因融合以共价形式连接到PpL上(图1)。PpL分子也可以直接地通过化学荧光基团被标记出来(图1)。包含适当的反应氨基酸残基(例如赖氨酸或者半胱氨酸)的肽标签可以通过基因融合与PpL融合，来提高PpL指示物标记的程度(图1)。此外，可以将具有铰链-弯曲性能的肽连接臂24(例如，许多蛋白质(包括抗体)包含绞链区)融合到PpL的N端或者C端，并且在连接臂末端引入FRET供体或者受体。与抗原目标结合，抗原可以使连接臂上的FRET标记接近或者远离与PpL另一个端点连接或者与结合部位之一结合的相对应FRET标记，并且使FRET发生改变(图7)。在一个实施方案中，附加的连接元件是融合到蛋白L C端的肽。在另一个实施方案，这种连接元件是融合到蛋白L N端的肽。在其它的实施方案中，这种连接元件可以由一端连接于蛋白L、另一端连接于指示物分子的物质组成，例如核酸、糖链、蛋白及其复合体等。

蛋白L也可以被修饰，以导入允许连接亲合基团的元件。例如，非天然氨基酸残基可以被引入到邻近其抗体(Ig)结合部位的蛋白L B1域。在一个优选实施方案中，该非天然氨基酸残基是对苯甲酰基-L-苯基丙氨酸(Bpa)。在大肠杆菌(E.coli)蛋白质表达宿主内，Bpa被用工程正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA对引入蛋白L。在一个实施方案中，蛋白L B1域的T39位点被作为突变点。在另一个实施方案中，蛋白L B1域的k41位点被作为突变点。这种突变的蛋白L可以同亲合基团发生自组装。在一个优选方案中，这种蛋白L-亲合基团复合体可以通过在长波紫外线(大约360nm)下曝光的方法形成共价连接，以形成光致交联复合体(见图2)。

蛋白L可以修饰，以允许与亲合基团和至少一个指示组分连接。

分子生物传感器具有至少一个系链到其上的协同指示组分。在一个实施方案中，分子生物传感器只有一个同其连接的协同指示组分。在有分析物存在的情况下，通过结合分析物，生物传感器紧密的靠拢，这样，第一生物传感器的第一指示物与至少一个第二生物传感器的第二指示物的相互作用就产生了可检测信号。(见图3和图4)。在一个实施方案中，第一生物传感器的第一指示物与第二生物传感器的第二指示物相互作用产生可检测信号。在另一个实施方案中，第一生物传感器的第一指示物分别与第二生物传感器的第二指示物和第三生物传感器的第三指示物相互作用，产生可检测信号。在三个指示物之间的相互作用是同时发生的。可选地，也可以包括一个“传递(relay)”相互作用，第一指示物与第二指示物相互作用，随后再与第三指示物相互作用，产生可检测信号，如图5所示[Medintz等，2003，Watrob等，2003，Galperin等，2004，在此以引用的方式将以上每个的全部内容并入本文]。在另一个实施方案中，第一生物传感器的第一指示物与三个或以上另外分别连接在不同生物传感器的指示组分相互作用，产生可检测信号。在四个或以上组分之间的这种相互作用可以同时发生，或者在指示组分之间“传递(relay)”相互作用。

在其它实施方案中，分析物可以作为协同指示物同生物传感器指示组分相互作用，来产生可检测信号。(见图10和图11)。例如，分析物可以包括荧光染料染色的细胞、荧光染料染色的蛋白质、荧光染料染色的生物材料等。

本发明的实施方案使用在协同指示物系统20中包含至少两个协同指示组分的分子生物传感器，在存在分析物的情况下，其彼此相互作用产生可检测信号。在一个实施方案中，生物传感器包含两个可以彼此淬灭的指示组分，这样，在没有分析物存在时，不会有信号被检测到。在存在分析物的情况下，分析物与生物传感器相互作用，这样，指示组分分离，信号发射恢复，就产生了可检测信号。荧光材料，例如EDANS(5-(2′氨基乙基)氨基萘-1-磺酸)、荧光素和若丹明都可以通过DABCYL(4-(4′-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸)淬灭[Vet等，1999，在此以引用的方式将其全部内容并入本文]。对非常接近荧光物质的淬灭剂的清除，可以恢复可检测信号的放射(图12)。附加的FRET淬灭物质，例如那些在美国专利11/083,461(公开号U.S.2006/0068502B1)中提到的，也适合本发明的实施方案。在另一个实施方案中，在没有分析物的情况下，两个指示组分产生基底信号。当分析物存在时，它与生物传感器相互作用，这样，两个指示物之间的相互作用由于抗体分子在绞链区的构造变化而发生改变，结果产生了表现为相对于基底放射的信号改变的可检测信号。[Lichlyter，2003，在此以引用的方式将其全部内容并入本文]。(见图8和图9)。在第三实施方案中，在没有分析物的情况下，两个指示组分互相不发生作用。当分析物被引入到样品时，其与生物传感器相互作用，两个指示组分可以很接近的靠拢，在基底信号之上产生一个可检测信号。例如，检测信号可以通过FRET对产生，例如在美国专利11/083,461(公开号U.S.2006/0068502B1)中描述的。本发明的实施方案可以使用包含三个或以上的协同指示组分的分子生物传感器，在有分析物存在的情况下，彼此相互作用产生检测信号。指示组分可以同时互相作用，或者以“传递(relay)”的方式互相作用，其中，第一指示物与第二指示物相互作用，随后与第三指示物相互作用，直到最后一次相互作用发生。在有分析物存在的情况下，生物传感器可以结合分析物，这样，检测信号从分子内的指示组分的相互作用中产生。检测信号可以包括信号淬灭、信号干扰、信号产生和信号改变等等。

在一些实施方案中，亲合基团通过蛋白L与至少一个指示组分连接，此外，亲合基团可以通过其它抗体结合蛋白(例如蛋白质A、G、H、和M)连接到至少一个另外的指示组分上(见图8和图9)。在与目标分析物结合后，指示组分可以彼此相互作用产生检测信号。这是基于这样的事实：在与抗原结合后，抗体在铰链区经历构象变化，产生检测信号[Lichlyter等，在此以引用的方式将其全部内容并入本文]。检测信号可以作为FRET相互作用来显示本身，其中，包括在背景以上信号的产生、信号发射的改变、信号量级的改变、信号频率的改变、信号波长的改变、信号的淬灭和信号干扰等等；作为产生生物发光的、化学发光的、荧光的可检测信号的酶促反应，结果使样品的光谱特性发生改变等等。或者作为位相的改变、固相沉淀、样品颜色或者光学性质的改变等等。(图8和图9)。如图9所示，当PpL接头与形成具有量子点的FRET对的指示物基团偶联在一起时，抗体分子可以被作为FRET供体或者受体的、固定在量子点[Medintz等，2003，在此以引用的方式将其全部内容并入本文]的、结合Fc的链球菌蛋白G-B1域的捕获。在结合目标物后，这种自组装、自发信号的抗体可以由于抗体在铰链区的构象变化而显示改变的FRET活性。

在一些实施方案中，利用分析物的存在来进行的信号检测，需要使用仪表，例如荧光计、光度计、阵列二级管光度计、平板读取器等。在另外的实施方案中，信号检测不需要使用仪表，并且肉眼可见。

现有技术以及本发明用到的通常与生物传感器、免疫测定技术有关的方法和材料，都在美国专利5,891,199、美国专利6,162,903、美国专利6,884,629B2和美国专利申请10/475,540(公开号US2004/0110245A1)中有描述，在此以引用的方式将以上每个的全部内容并入本文。

表1：提供了与本发明的PpL B1连接组分有关的核苷酸和氨基酸序列列表

连接组分	核苷酸序列	氨基酸序列
			PpL B1域(Y47W变异)	SEQ ID NO：1	SEQ ID NO：6
PpL B1域(Y47W和A20C变异)	SEQ ID NO：2	SEQ ID NO：7
			PpL B1域(Y47W和T30C变异)	SEQ ID NO：3	SEQ ID NO：8
PpL B1域(Y47W和T39琥珀子变异)	SEQ ID NO：4	SEQ ID NO：9
			PpL B1域(Y47W和K41琥珀子变异)	SEQ ID NO：5	SEQ ID NO：10

实施例

实施例1：为在特定位点与指示组分连接而对消化链球菌属蛋白L(PpL) 的修饰

大消化链球菌PpL B1域具有两个Igκ轻链的结合位点，它们与β折叠的两端相对应[Svensson et al.2004，此处以引证的方式将其全部内容并入本文中](图14)。为了形成所需的1∶1比例的PpL/Ig-κ复合体(如图2中所示)，定点突变和生物素/链霉亲和素(SA)介导的蛋白质组装的组合，被用于封闭与Ig-κ结合的位点1。A20C变异可通过例如美国专利号6,713,285(此处以引证的方式将其全部内容并入本文中)中所描述的定点诱变方法，使用突变引物(正向引物：5’-ATCCACACAAACTTGCGAATTCAAAGGAACATTTG-3’；反向引物：5’-TTCCTTTGAATTCGCAAGTTTGTGTGGATCCATTTGC-3’)引入到含有Y47W变异(SEQ.ID NO：1和6，由Drs.Ulf Sjobring和David Baker提供)的PpLB1域中。所述引物在位点1的中心引入单个的半胱氨酸[Svensson et al.2004]。A20C变异(SEQ.ID NO：2和7)使得位点1中心的PpL位点被特异性标记有硫醇活性的生物素分子(例如马来酰亚胺PE02-生物素(Pierce，Rockford，IL)，一种水溶性硫氢活性生物素酰化试剂)，然后与标记有链霉亲和素分子的指示物连接。可选择地，A20C变异可以用硫醇活性荧光染料(例如马来酰亚胺荧光基团衍生物)进行标记。编码PpL B1域的A20C变异的基因可以用pET21载体表达为组氨酸标签蛋白，用金属鳌和亲和色谱柱进行纯化。除了A20C变异以外，使用突变引物(正向引物：5′-ATTTGAAAAAGCATGCAGTGAAGCTTATGCAGATGCAGATAC-3′；反向引物：5′-ATAAGCTTCACTGCATGCTTTTTCAAATGTTCC-3′)的T30C变异(SEQ.ID NO：3和8)提供一种破坏与PpL结合的位点2的可选方案[Svensson etal.2004]。

实施例2：为与亲合基团的共价连接而对消化链球菌属蛋白L(PpL)的修 饰

为了能使PpL B1域共价结合到Igκ的轻链可变区，在PpL B1域与Ig结合位点的附近，一个非天然光致交联氨基酸残基(对苯甲酰基-L-苯基丙氨酸或Bpa)被引入到带有His标签的PpL B1域突变体(例1)，使用工程正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA对，与琥珀密码子TAG相对应，在体内将Bpa合成到埃希氏菌属大肠杆菌蛋白质内[Chin et al.2002(a)，Chin et al.2002(b)，Farrell et al.2005，在此以引用的方式将前述每一个的全部内容并入本文]。在PpL B1域结构内接近其两结合位点处，T39(图14A中标记为粉色)和K41(在图14B中标记为青色)就是分别将结合位点1和2突变到Bpa的位点所在。为了引入Bpa，使用了两种质粒：(1)基于p15A的质粒(pDULE)，表达正交tRNA和合成酶对(从Peter Schultz医生获得)，和(2)含琥珀变异的PpL B1域的质粒(SEQ ID NO：4，5，9，和10)。大肠杆菌用这两种质粒进行转化并在Bpa存在的培养基中培养。在与抗体一起孵育以将它们连接在一起之前，结合Bpa的PpL B1用标准蛋白纯化工艺(实施例1)进行纯化。

实施例3：连接指示组分到修饰的PpL B1分子上

带有生物素化组氨酸标签的PpL B1突变体(实施例1、实施例2)固定在Ni-NTA柱中，荧光基团标记的链霉亲和素(SA)被泵入流过所述柱中，以形成与PpL突变体的1∶1的复合体。在柱上形成的蛋白复合体然后用咪唑清洗、透析以除去可滤掉的镍离子和过剩的咪唑，并经凝胶过滤层析以进一步提纯和分析，来检查它们的分子大小分布。这种方法中，PpL B1域分子的分离管可以进行单独地标记，以制造出各种供本发明测定所用的衔接子。

实施例4：共价连接抗体到修饰的PpL B1分子上

结合Bpa的PpL B1(实施例2)与抗GMCSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)的整个单克隆抗体和/或Fab抗体在室温下孵育1小时，以获得抗体与修饰的PpLB1分子的自组装。可以使用的一个非必需步骤是将PpL/Ab复合体暴露在360nm的紫外线中进行交联。不与抗体结合的PpL B1分子可通过使用离心或标准膜超滤或者凝胶过滤工艺从标记的抗体中分离出来。在使用指示物-PpL-Ab复合体进行GMCSF(目标分析物)的免疫分析前，可使用标准ELISA法对蛋白质复合体与GMCSF的结合性能进行测定，并与未标记的抗GMCSF抗体的性能进行比较。指示物-PpL-Ab复合体的形成可进一步通过调整以下参数进行优化，例如蛋白质浓度、缓冲液离子强度、pH、结合温度。

实施例5：PpL-指示物融合蛋白的合成

荧光蛋白质(例如绿色荧光蛋白质和其变体)可通过有或没有肽连接子参与的串联基因融合连接到Ppl B1域的N端或C端(图1)。适合的肽，例如E/K卷曲螺旋(coiled coil)(Lindhout et al.2004，在此以引用的方式将其全部内容并入本文)或四半胱氨酸标签(Adarns et al.2002，在此以引用的方式将其全部内容并入本文)也被融合到PpL中，以便于位点特异性的指示物标记。标准的基于PCR的分子克隆方法可用于制备这种重组分子。

实施例6：通过铰链弯曲连接子结合到第二指示物的PpL的合成

标准的基于PCR的分子克隆方法可用于将具有铰链弯曲性质[Lichlyter et al.2003]的肽连接子引入到PpL B1变体的N端或C端(实施例1-4)上。FRET供体或受体经由基因融合或化学缀合方法引入到连接子的端部。一旦结合到抗原目标物上，所述抗原推动连接子上的FRET标记靠近或进一步远离缀合到突变的Ig结合位点之一(位点1或位点2)上的相对FRET标记，引起FRET信号的改变(图7)。

实施例7：用于检测人体粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的分子 生物传感器的制备

在大肠杆菌中生产C端融合有6个组氨酸标签、N端融合有富含赖氨酸K3(KEKIAAL)3螺旋肽标记的蛋白L B1域融合蛋白，并用金属鳌和亲和层析柱(IMAC)来纯化。采用标准的标记方法，部分PpL B1融合蛋白用异硫氰酸荧光素(FITC)进行化学标记，而另一部分的PpL B1融合蛋白用四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记。标记后，未标记的荧光基团使用10kD的截止膜，通过离心超滤从标记的PpL B1融合蛋白质中分离除掉。然后用FITC和TRITC标记的PpL B1融合蛋白分别与鼠抗GMCSF单克隆抗体3209克隆和6804克隆共同孵育(R&D Systems，Minneapolis，MN)，每种识别GMCSF抗原的一种决定簇，以形成自组装的指示物-连接臂-抗体复合体。荧光基团标记EPpL B1和抗体之间的摩尔比，优化到大于2∶1，以提高每个抗体分子接受两PpL B1分子的概率。随后，没有结合到抗体上的PpL B1分子被用10KD的截止膜通过离心超滤从标记的抗体中分离(注意：PpL远小于抗体分子)。

实施例8：以均相非竞争性试验来检测人体粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GMCSF)

在室温下，用三种含不同的浓度[0，20，50nM]GMCSF的液体样本与分子生物传感器复合体共孵育(实施例7)30分钟。之后，收集液体样本的荧光光谱，并使用标准FRET分子技术估算FRET度。随着样本中GMCSF的浓度的增加，FRET信号增强(如580nm处增强的峰值强度所示)(图13)。

实施例9：制备检测分析物用的生物样本

生物样本可从样品中获得，并在含Tris盐的冷缓释溶液中稀释，其浓度范围为50nM-1M，PH值范围为7.5-8.0。在混合物中可选择性地加入洗涤剂如Tween80或Triton X-100，最终浓度在0.1％-4％v/v之间。可选择性地4℃、1000Xg离心5分钟，以从所述混合物中清除出固体。清除过的上层清液移出并保存，用于免疫测定过程。

实施例10：在基于FRET的均相非竞争性免疫试验中的指示物-PpL-亲合基 团复合体示例

使用一对包含复合到PpL上的抗GMCSF单克隆抗体整体和/或Fab的分子生物传感器来实施GMCSF的检测，所述PpL连接在异硫氰酸荧光素(FITC)或者四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)上。在1.5mL微量离心管中，将浓度范围为0-200nM的GMSCF与含两个标记荧光基团分子的生物传感器溶液中混合。将混合物在4℃到室温的范围避光培养30分钟到1小时。在培养期后，将每个样本注入荧光分光度计的槽中，收集荧光光谱并估算FRET度。

可选择地，使用不同的FRET对在样本上完成时间分辨(TR)-FRET。例如，铕螯合物和别藻蓝素(APC)/Cy5等荧光基团可用于(TR)-FRET中，其通常具有较高的试验灵敏度(Zhang等.2005，在此以引用的方式将其全部内容并入本文)。

实施例11：在基于裂解酶的均相非竞争性免疫测定中的指示物-PpL-亲合基 团复合体示例

使用一对包含复合到PpL上的抗GMCSF单克隆抗体整体和/或Fab的分子生物传感器来实施对模拟分析物GMCSF的检测，所述PpL连接到β内酰胺酶的Δα片段上或者β内酰胺酶的Δω片段上。酶片段使用标准的PCR分子克隆方法通过与适当的肽连接子基因融合而连接到PpL上，以形成这样的重组分子。在微量离心管中，将含浓度范围为0-200nM的GMSCF的液体样本与含两个酶片段标记的生物传感器相混合。CCF2/AM荧光底物也加入到混合物中，其在DMEM中最终浓度为2μM。混合物在室温下静置30分钟到1小时。在培养期后，通过眼睛或荧光计对样本蓝色到绿色荧光发射比例的改变进行检测以确定GMCSF的存在及浓度。

实施例12：用指示物-PpL-亲合基团复合体来检测基于FRET的均相非竞争 性免疫试验中的荧光着色生物材料示例

使用FITC标记的分子生物传感器来对含混合微生物种群的液态样本中的植物病原菌茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的检测。微生物培养样本装有CC1荧光底物，其是细菌中普遍发现的一种酶，β内酰胺酶的酶底物。CC1产物能在550nm处被激发并在585nm发出红色荧光信号[Gao et al 2003，在此以引用的方式将其全部内容并入本文中]。此处可使用CC1酶底物来对微生物细胞着色。通过加载CC1的茄科雷尔氏菌(R.solanacearum)和分子生物传感器之间的结合可确定样本中病原体的存在。所述分子生物传感器含有连接到茄科雷尔氏菌(R.solanacearum)特定抗体上的FITC标记的PpL配合体。分子传感器与加载有酶底物病原体的结合会发出由FITC指示物和CCI产物之间FRET相互作用所产生的信号。

实施例13：用于检测基于FRET干扰的均相非竞争性免疫试验中的分析物的 可自组装的多组分指示物-PpL-亲合基团复合体示例

源自三个不同抗链霉亲和素单克隆抗体克隆的Fab片段，分别识别抗原上的不同的抗原决定簇。Fab片段可用于形成三个基于PpL的分子生物传感器。基于PpL的生物传感器中的指示组分可进行选择，以能够接替FRET，例如Alexa488/TMR1Cy5。复合体的制备公开在实施例1-4中。在测定抗原存在的试验中，将三个分子生物传感器用含有浓度范围为0-200nM的链霉亲和素的液体样本在室温下避光培养1小时。在培养期后，在荧光计中测量每个样本并收集荧光光谱。链霉亲和素存在时，接替FRET发生，会产生样本荧光发射光谱的改变。

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Zhang，W.X.et al.2005.Anal Biohem 343：76-83.

序列表

<110>Su，Wei Wen

<120>COOPERATIVE REPORTER SYSTEMS，COMPONENTS，AND METHODS FOR ANALYTE

DETECTION

<130>UOH.014VPC

<150>US 60/683,921

<151>2005-05-23

<150>US 60/778,991

<151>2006-03-01

<160>10

<210>1

<211>219

<212>DNA

<400>1

ATGCATCATC ATCATCATCA TGCCATGGAA GAAGTAACAA TCAAAGCTAA    50

CCTAATCTTT GCAAATGGAT CCACACAAAC TGCAGAATTC AAAGGAACAT    100

TTGAAAAAGC AACTAGTGAA GCTTATGCAT ATGCAGATAC TTTGAAGAAA    150

GACAATGGAG AATGGACTGT CGACGTTGCA GATAAAGGTT ATACTTTAAA    200

TATTAAATTT GCTGGATAG  219

<210>2

<211>219

<212>DNA

<400>2

ATGCATCATC ATCATCATCA TGCCATGGAA GAAGTAACAA TCAAAGCTAA    50

CCTAATCTTT GCAAATGGAT CCACACAAAC TTGCGAATTC AAAGGAACAT    100

TTGAAAAAGC AACTAGTGAA GCTTATGCAT ATGCAGATAC TTTGAAGAAA    150

GACAATGGAG AATGGACTGT CGACGTTGCA GATAAAGGTT ATACTTTAAA    200

TATTAAATTT GCTGGATAG  219

<210>3

<211>219

<212>DNA

<400>3

ATGCATCATC ATCATCATCA TGCCATGGAA GAAGTAACAA TCAAAGCTAA    50

CCTAATCTTT GCAAATGGAT CCACACAAAC TGCAGAATTC AAAGGAACAT    100

TTGAAAAAGC ATGCAGTGAA GCTTATGCAT ATGCAGATAC TTTGAAGAAA    150

GACAATGGAG AATGGACTGT CGACGTTGCA GATAAAGGTT ATACTTTAAA    200

TATTAAATTT GCTGGATAG  219

<210>4

<211>219

<212>DNA

<400>4

ATGCATCATC ATCATCATCA TGCCATGGAA GAAGTAACAA TCAAAGCTAA    50

CCTAATCTTT GCAAATGGAT CCACACAAAC TGCAGAATTC AAAGGAACAT    100

TTGAAAAAGC AACTAGTGAA GCTTATGCAT ATGCAGATTA GTTGAAGAAA    150

GACAATGGAG AATGGACTGT CGACGTTGCA GATAAAGGTT ATACTTTAAA    200

TATTAAATTT GCTGGATAG  219

<210>5

<211>219

<212>DNA

<400>5

ATGCATCATC ATCATCATCA TGCCATGGAA GAAGTAACAA TCAAAGCTAA    50

CCTAATCTTT GCAAATGGAT CCACACAAAC TGCAGAATTC AAAGGAACAT    100

TTGAAAAAGC AACTAGTGAA GCTTATGCAT ATGCAGATAC TTTGTAGAAA    150

GACAATGGAG AATGGACTGT CGACGTTGCA GATAAAGGTT ATACTTTAAA    200

TATTAAATTT GCTGGATAG  219

<210>6

<211>72

<212>Protein

<400>6

Met His His His His His His Ala Met Glu Glu Val Thr Ile Lys

 -8          -5             -1   1                5

Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Ala Glu Phe

         10                  15                  20

Lys Gly Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr Ala

         25                  30                  35

Asp Thr Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Trp Thr Val Asp Val Ala

         40                  45                  50

Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly

         55                  60              64

<210>7

<211>72

<212>Protein

<400>7

Met His His His His His His Ala Met Glu Glu Val Thr Ile Lys

 -8          -5              -1  1              5

Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Cys Glu Phe

         10                  15                  20

Lys Gly Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr Ala

         25                  30                  35

Asp Thr Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Trp Thr Val Asp Val Ala

         40                  45                  50

Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly

         55                  60              64

<210>8

<211>72

<212>Protein

<400>8

Met His His His His His His Ala Met Glu Glu Val Thr Ile Lys

 -8          -5              -1  1                5

Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Ala Glu Phe

         10                  15                  20

Lys Gly Thr Phe Glu Lys Ala Cys Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr Ala

         25                  30                  35

Asp Thr Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Trp Thr Val Asp Val Ala

         40                  45                  50

Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly

         55                  60              64

<210>9

<211>72

<212>Protein

<400>9

Met His  His His His His His Ala Met Glu Glu Val Thr Ile Lys

 -8           -5             -1   1                5

Ala Asn  Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Ala Glu Phe

          10                  15                  20

Lys Gly  Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr Ala

          25                  30                  35

Asp Bpa＊Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Trp Thr Val Asp Val Ala

          40                  45                  50

Asp Lys  Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly

          55                  60              64

<210>10

<211>72

<212>Protein

<400>10

Met His His His  His His His Ala Met Glu Glu Val Thr Ile Lys

 -8          -5              -1   1                5

Ala Asn Leu Ile  Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Ala Glu Phe

         10                  15                  20

Lys Gly Thr Phe  Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr Ala

         25                  30                  35

Asp Thr Leu Bpa＊Lys Asp Asn Gly Glu Trp Thr Val Asp Val Ala

         40                  45                  50

Asp Lys Gly Tyr  Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly

         55                  60               64

Claims (28)

1. 一种检测分析物的方法，包括以下步骤：

提供一个生物样本；

用至少一个协同指示试剂接触所述样本以检测所述分析物，其中，所述指示试剂包括亲合组分、连接组分和协同指示组分；

从系统中确定信号存在或不存在，其中，所述信号表明样本中存在所述分析物；

根据所述信号存在或不存在测知分析物，其中，在不存在分析物的背景上检测不到所述信号。

2. 权利要求1所述的方法，其中，待检测的分析物是选自由蛋白质、肽、抗原、抗体、外源凝集素、结合外源凝集素的碳水化合物、疾病标示物、细胞因子、细胞因子受体、激素、激素受体、细胞粘着分子、细胞粘着分子配体、核酸、糖链、脂类、细胞、病毒、胞内细胞器、小分子、低分子量化合物等组成的组中的一种物质，或者其一部分选自上组的物质。

3. 权利要求2所述的方法，其中，所述连接组分包括蛋白L连接子，其中所述蛋白L连接子包括蛋白L或其片段或其衍生物。

4. 权利要求3所述的方法，其中，所述蛋白L连接子可以包括允许或者提高衍生物与亲和组分的化学结合的修饰。

5. 权利要求3所述的方法，其中，所述蛋白L连接子可以包括允许或者提高衍生物与指示组分的化学结合的修饰。

6. 权利要求3所述的方法，其中，所述蛋白L连接子包括由SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列编码的多肽。

7. 权利要求2所述的方法，其中，所述亲合组分包括抗体或其片段或其衍生物。

8. 权利要求2所述的方法，其中，所述指示组分包括选自荧光材料、酶、酶片段、酶亚基、受体、配体、荧光蛋白、发光蛋白、非蛋白荧光体、非蛋白质化学发光化合物、荧光标记蛋白、荧光纳米晶体、荧光螯合物、光敏染料和荧光性淬灭剂组成的组中的一种组分。

9. 权利要求3所述的方法，其中，蛋白L连接子与指示组分的连接包括化学连接。

10. 权利要求3所述的方法，其中，蛋白L连接子连接到指示组分上形成融合蛋白。

11. 权利要求3所述的方法，其中，蛋白L连接子与指示组分的连接包括非共价的相互作用。

12. 权利要求3所述的方法，其中，蛋白L连接子与指示组分的连接包括生物素-链霉亲和素的结合。

13. 权利要求3所述的方法，其中，蛋白L连接子与亲合组分的连接包括自组装。

14. 权利要求13所述的方法，其中，所述自组装通过氢键合、盐桥接或者它们的组合实现。

15. 权利要求3所述的方法，其中，蛋白L连接子与亲合组分的连接包括光致交联。

16. 权利要求2所述的方法，其中，所述分析物的检测是在均相系统中进行。

17. 权利要求2所述的方法，其中，所述信号是光信号。

18. 权利要求16所述的方法，其中，所述光信号是由FRET、LRET、BRET、酶片段互补、TR-FRET、发光氧通道产生的光信号。

19. 权利要求16所述的方法，其中，所述信号的检测不需要使用仪器。

20. 权利要求1所述的方法，其中，所述接触的步骤包括用至少两种协同指示试剂接触样本，所述协同指示试剂组成一个多元素协同指示系统，在系统中，信号的产生包括在未发生所述至少两种试剂的连接组分之间的连接的情况下，两种协同指示试剂之间的交互作用。

21. 权利要求20所述的方法，其中，所述至少两种协同指示试剂中的每一种都包括一个特有的亲合组分，使得每种特有亲合组分对同一分析物的不同部位有亲合力。

22. 一种检测分析物的协同指示物系统，包括至少一个协同分子试剂，所述试剂包括亲合组分、连接组分和协同指示组分，其中，所述指示组分与第二指示组分协同产生信号，且在不存在分析物的背景上检测不到所述信号。

23. 权利要求22所述的系统，其中，所述第二指示组分与第二协同分子指示试剂结合。

24. 权利要求22所述的系统，其中，所述第二指示组分不与第二协同分子指示试剂结合。

25. 权利要求22所述的系统，包括至少两个协同分子试剂，其中，系统中第一分子试剂的连接组分对于第二分子试剂的连接组分的背景没有任何亲合力。

26. 权利要求25所述的系统，其中，所述至少两个分子试剂与分析物的结合，使所述指示组分紧密靠近。

27. 一种检测分析物的生物传感器，包括：

亲和基团；

协同指示物；和

包含蛋白L连接子的连接组分，其中所述蛋白L连接子包括蛋白L或其片段或其衍生物。

28. 权利要求27所述的生物传感器，还包括至少一个附加的协同指示物。

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