CN102449485B - 利用fret生物传感器检测配体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用FRET(荧光共振能量转移)现象的生物传感器来检测配体的方法,更具体地,本发明涉及一种通过在某条件下测量FRET生物传感器以检测配体的简单方法,其中所述条件是下特定临界温度下通过一种现象来确定的,其中生物传感器的配体结合蛋白在温度高于特定临界温度下显示出可逆的解折叠且解折叠的改变程度取决于配体的浓度。本发明的方法可广泛采用不同种类的使用配体结合蛋白的FRET生物传感器。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用应用FRET现象的生物传感器来检测配体的方法,更具体地,本发明涉及一种比现有方法更有效地检测配体(特别是糖)并测量所述配体浓度的方法,所述方法使用这样一种现象,当温度高于特定临界温度时,生物传感器中的配体结合蛋白显示出可逆的解折叠,且解折叠变化程度取决于配体的浓度。
背景技术
2002年,斯坦福大学的Frommer首次开发出用于测量麦芽糖的FRET生物传感器(Fehr et al.,PNAS.,99:9846-9851,2002)。从此,相继地开发出用于测量核糖(Lager et al.,FEBS Lett.,553:85,2003)、葡萄糖(Fehr et al.,J.Biol.Chem.,278:19127-19133,2003)或蔗糖(Ha et al.,Appl.Environ.Microbiol.,73:7408,2007)的其它相似类型的传感器。
然而,以前开发的生物传感器显示出非常低的检测能力,因此需要开发可用作更准确的测量工具的高灵敏传感器(Fehr et al.Current Opinion in PlantBiology,7:345,2004)。在为了满足这种需求的尝试中,本发明人以前报道过,可以通过优化生物传感器的蛋白域之间的接头肽来增强用于测量麦芽糖的FRET生物传感器的检测能力(韩国授权专利No.10-0739529(2007年7月29日)和美国专利No.7432353(2008年10月7日))。此外,Miyawaki(RIKENInstitute)通过荧光蛋白的环状排列极大地增强了用于测量钙的FRET生物传感器″Cameleon″的检测能力(Nagai et al.,PNAS.,101:10554,2004),且Frommer通过将荧光蛋白框内融合到QBP(谷氨酰胺结合蛋白)中,增强了FRET生物传感器的检测能力(Deuschle et al.,Protein Sci.,14:2304,2006)。
然而,通过基因操作来增强FRET传感器需要反复试验,耗时且已达到技术极限。因此,需要一种更有效且更容易的增强FRET生物传感器的方法。
同时,由于蛋白质的三维结构已被阐明,因此对通过改变温度来观察蛋白质结构的可逆变化和热稳定性维持的研究,以及对蛋白质折叠过程预测的研究已经引起研究者的极大注意。大肠杆菌(E.coli)周质-结合蛋白(PBPs)已经成为观察这种蛋白质结构的热动力学变化的良好模型。根据使用示差扫描热量计(DSC)来观察依赖于温度的阿拉伯糖结合蛋白(ARBP)的结构变化的报道,没有阿位伯糖时,可逆解折叠发生在53.5℃;当存在1mM阿拉伯糖时,可逆解折叠发生在59℃(Fukuda et al.,J.Biol.Chem.,258:13193.1983)。此外,有报道称,对于葡萄糖/半乳糖结合蛋白(GGBP),根据葡萄糖存在或不存在,其解折叠温度从50℃上升到63℃(Piszczek et al.,Biochem.J.,381:97,2004),而对于麦芽糖结合蛋白(MBP),在存在麦芽糖时,其折叠温度依赖于pH值增加8-15℃(Novokhatny et al.,Protein Sci.,6:141,1997)。
因此,本发明人对现有的FRET生物传感器测量配体浓度以及检测配体的能力进行了大量的努力,并且结果是,发现当由融合蛋白质构成的生物传感器在发生可逆折叠的特定临界温度下与配体接触时,生物传感器检测配体及测量配体浓度的能力显著增强,从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测配体以及测量所述配体浓度的新方法,所述方法增强了现有FRET生物传感器检测配体及测量所述配体浓度的能力。
为了实现上述目的,本发提供了一种利用FRET生物传感器检测配体的方法,所述生物传感器包括含有荧光供体和荧光受体的信号域和含有使荧光供体和荧光受体相连接的配体结合蛋白的感应域,所述方法包括在临界温度范围内使FRET生物传感器接触含有配体的样品,其中在所述临界温度范围内发生可逆解折叠且由配体与配体结合蛋白的结合所产生的FRET比率变化最大。
本发明还提供了一种利用FRET生物传感器来测量配体浓度的方法,所述生物传感器包括含有荧光供体和荧光受体的信号域,以及含有连接荧光供体和荧光受体的配体结合蛋白的感应域,所述方法包括以下步骤:
(a)在临界温度范围下,使FRET生物传感器接触含有配体的样品,其中在所述临界温度范围内发生可逆解折叠且由配体与配体结合蛋白的结合所产生的FRET比率变化最大,和
(b)测量荧光供体和荧光受体的光发射强度的比率变化以测量配体的浓度。
通过以下详细说明及所附权利要求书,本发明的其它特征和实施方式将更加显见。
附图说明
图1是示意图,示出在室温(25℃)和临界温度下,存在或不存在配体时,FRET生物传感器的结构变化、FRET效率的变化以及得到的荧光蛋白质的发射强度差异。
图2是一组图表,示出根据温度,麦芽糖FRET生物传感器的比率和Δ比 率的变化。
图3是一组图表,示出根据温度,葡萄糖FRET生物传感器的比率和Δ比 率的变化。
图4是一组图表,示出根据温度,阿洛糖FRET生物传感器的比率和Δ比 率的变化。
图5是一组图表,示出根据温度,阿拉伯糖FRET生物传感器的比率和Δ比率的变化。
图6是麦芽糖FRET生物传感器的一组滴定曲线,测量于25℃和Δ比值最大的临界温度54℃时的不同麦芽糖浓度,以及图6中的插图示出测量于25℃和54℃的麦芽糖FRET生物传感器的荧光光谱。
图7是葡萄糖FRET生物传感器的一组滴定曲线,测量于25℃和Δ比值最大的临界温度50℃时的不同葡萄糖浓度,以及图7中的插图示出测量于25℃和50℃的葡萄糖FRET生物传感器的荧光光谱。
图8是阿洛糖FRET生物传感器的一组滴定曲线,测量于25℃和Δ比值最大的临界温度49℃时的不同阿洛糖浓度,以及图8中的插图示出测量于25℃和49℃的阿洛糖FRET生物传感器的荧光光谱。
图9是阿拉伯糖FRET生物传感器的一组滴定曲线,测量于25℃和Δ比值最大的临界温度49℃时的不同阿拉伯糖浓度,以及图9中的插图示出测量于25℃和49℃的阿拉伯糖FRET生物传感器的荧光光谱。
图10是一组示出麦芽糖FRET生物传感器对不同种类的糖的特异性图表。
图11是一组示出葡萄糖FRET生物传感器对不同种类的糖的特异性图表。
图12是一组示出阿洛糖FRET生物传感器对不同种类的糖的特异性图表。
图13是一组示出阿拉伯糖FRET生物传感器对不同种类的糖的特异性图表。
具体实施方式
除非另外定义,否则本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员的常规性理解相同的含义。通常,本发明和后面描述的实验方法中所使用的专门名称是本领域公知和常用的。
用于详细描述本发明的主要术语的定义如下:
本发明使用的术语“FRET”(荧光共振能量转移)是指在具有不同发射波长的两个荧光团间的非辐射能量转移,其中处于激发态的荧光供体的激发能转移到荧光受体,从而观察到荧光受体发射或荧光供体淬灭(Lakowicz,J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy,2nd ed.,New York:Plenum Press,1999)。
本发明使用的术语“荧光供体”是指在FRET现象中作为供体的荧光团,而术语“荧光受体”是指在FRET现象中作为受体的荧光团。
本发明使用的术语“配体结合蛋白”是指通过结合配体而经历构象变化的蛋白质聚集物,并且该术语旨在包括大肠杆菌周质结合蛋白(PBP)(de Wolf etal.,Pharmacol Rev.,52:207,2000)。
本发明使用的术语“配体”是指与配体结合蛋白结合以使配体结合蛋白产生构象变化的分子,并且其可以是糖、氨基酸、蛋白质、脂质、有机酸、金属或金属离子、氧化物、氢氧化物或其缀合物、无机离子、胺或聚胺、以及维生素中任一种,但不限于此。
本发明使用的术语“样品”是指被怀疑含有目的配体且将被分析的组合物。所述配体可以从细胞、水、油、空气、食品、废弃物以及动物和植物器官及组织中的一或多种来收集,但不限于此。在此,动物和植物包括人。
本发明使用的术语“临界温度”是指这样的温度范围,其中FRET生物传感器中的配体结合蛋白的解折叠依赖于配体的存在与否来控制,从而增强FRET生物传感器的检测和测量能力,换而言之,所述“临界温度”是由配体与配体结合蛋白结合后产生的FRET比率变化最大时的温度范围。如本发明实施例3和4所论述,以PBP构成的FRET生物传感器为例,49-54℃的温度范围是感应器的检测和测量能力增强的“临界温度”。
一方面,本发明涉及一种使用FRET生物传感器来检测配体的方法,所述生物传感器包括含有荧光供体和荧光受体的信号域和含有使荧光供体和荧光受体相连接的配体结合蛋白的感应域,所述方法包括在临界温度范围内使FRET生物传感器接触含有配体的样品,其中在所述临界温度范围内发生可逆解折叠且由配体与配体结合蛋白的结合产生的FRET比率变化最大。
样品中配体的检测是通过使用荧光分析系统测量来自荧光供体和荧光受体的光发射而完成的,且可用于本发明的荧光分析系统的实例包括滤光片式和单色式荧光分光光度计。如果样品中含有配体,那么荧光供体和荧光受体的发射变化被感应到,从而检测配体。
另一方面,本发明涉及一种利用FRET生物传感器来测量配体浓度的方法,所述生物传感器包括含有荧光供体和荧光受体的信号域,和含有连接荧光供体和荧光受体的配体结合蛋白的感应域,所述方法包括以下步骤:
(a)在临界温度范围下,使FRET生物传感器接触含有配体的样品,其中在所述临界温度范围内发生可逆解折叠且由配体与配体结合蛋白的结合所产生的FRET比率变化最大,和
(b)测量荧光供体和荧光受体发射强度的比率变化以测量配体的浓度。
用荧光分析系统或类似系统来测量荧光供体和荧光受体的发射,如果配体浓度发生变化,那么荧光供体和荧光受体的发射就会发生变化。因此,本发明可用于测量配体浓度的变化。
在本发明中,构成FRET生物传感器的融合蛋白包括含有荧光供体和荧光受体的信号域,以及含有配体结合蛋白的感应域,其中荧光供体和荧光受体可融合到配体结合蛋白的两端。这种情况下,荧光供体或荧光受体可使用至少一个接头与配体结合蛋白融合。
优选地,配体结合蛋白可以是任一种大肠杆菌PBPs,如用于本发明实施例的MBP(麦芽糖结合蛋白)、ALBP(阿洛糖结合蛋白)、ARBP(阿拉伯糖结合蛋白)以及GGBP(半乳糖/葡萄糖结合蛋白)。然而,显然任何配体结合蛋白都可用于本发明的方法和传感器,只要结合配体能使其经历构象变化。
此外,对于包括在生物传感器的信号域中的荧光供体和荧光受体,可使用任何材料,只要荧光供体的发射光谱和荧光受体的吸引光谱可以彼此重叠以产生FRET或淬灭。可用于本发明的荧光供体的实例包括具有不同波长的荧光蛋白、荧光染料、生物发光蛋白和量子点。可用于本发明的荧光受体的实例包括与那些荧光供体波长不同的荧光蛋白、荧光染料和量子点。或者,荧光受体可由降低荧光供体的荧光强度的淬灭剂或金纳米粒子构成。在它们中,有鉴于FRET生物传感器中使用的荧光供体和荧光受体的消光系数、量子效率、光稳定性和便利性,优选使用荧光蛋白ECFP(加强型青色荧光蛋白)和EYFP(加强型黄色荧光蛋白)。
根据本发明的检测和测量配体浓度的方法采用“FRET”,荧光的光学性质,其原理如图1所示。通常,由于荧光供体的发射波长与荧光受体的吸收光谱重叠而命名FRET,且FRET的发生没有光子出现且FRET产生自荧光供体和荧光受体之间的远程双极子的相互作用。FRET的能量转移效率的变化取决于荧光供体的发射光谱和荧光受体的吸收光谱彼此重叠的范围、荧光供体的量子效率、荧光供体和荧光受体转移双极子的相对取向、以及荧光供体和荧光受体之间的距离。因此,FRET的能量转移效率的变化取决于荧光供体和荧光受体间的距离及其相对取向,且根据福斯特(Forster’s)方程式表示如下:
[方程式1]
E=R0 6/(R6+R0 6)
其中E表示FRET效率,R表示荧光供体和荧光受体间的距离且通常为2-9mm,取决于荧光团的种类。同样,方程式1中的R0表示FRET的效率为50%时,荧光供体和荧光受体间的距离,且通常被称为“福斯特距离”或“福斯特半径”。R0由以下方程式所示:
[方程式2]
R0=0.211[k2n-4QDJ(λ)]1/6(单位为)
其中,k2是取向因子,通常计算为2/3,且取值范围从0到4,取决于荧光供体的发射和荧光受体的吸收的相对取向。N是介质的折射指数且对25℃的水而言通常是~1.334,QD是荧光供体的量子效率。J(λ)是荧光供体的发射光谱和荧光受体的吸收光谱间的重叠程度并以单位M-1cm-1nm4表示(Lakowicz,J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy,2nd ed.,New York:Plenum Press,1999;Patterson et al.,Anal.Biochem.284:438,2000;Patterson et al.,J.of Cell Sci.114:837,2001)。
利用上述FRET原理,本发明人之前通过将分别作为荧光供体和荧光受体的荧光蛋白ECFP*加强型青色荧光蛋白)和EYFP(加强型黄色荧光蛋白)融合到配体结合蛋白PBP的两端,制造了FRET生物传感器,并发现所制造的FRET生物传感器可以用于定量检测能结合到配体结合蛋白的配体:阿洛糖、阿拉伯糖、核糖或麦芽糖(韩国授权专利No.10-0739529(2007年7月29日)和美国专利No.7432353(2008年10月7日)。
上述FRET生物传感器,ECFP-PBP-EYFP,由表示为大融合蛋白的多肽构成。当考虑到PBPs的大小约为3×4×6.5nm(Spurlino et al.,J.Biol.Chem.,266:5202,1991)时,ECFP和EYFP间的距离约为5-6nm,在此距离可以发生FRET。因此,当ECFP于436nm激发时,ECFP的激发发射能被转移到EYFP,并因此可以同时观察到ECFP和EYFP的发射(参见图1)。当糖结合到FRET生物传感器的配体结合蛋白时,融合在PBP两端的ECFP和EYFP的距离和相对取向将改变,导致两荧光蛋白间的FRET效率的差异,并因此两荧光蛋白的发射比率将改变。因此,可以通过测量两荧光蛋白的发射变化来感应配体,并因此可以定量地测量糖浓度,因为两荧光蛋白的发射比率的变化与糖浓度成正比。
另外,根据方程式2,ECFP和EYFP的R0值约为5nm(Patterson et al.,Anal.Biochem.,284:438,2000),并因此假设当ECFP和EYFP间的距离约为5-6nm时,两荧光蛋白的距离或相对取向的微小变化可以引起FRET效率的显著差异。因此,本发明人预测,如果可以使依赖于配体结合蛋白的配体存在与否的FRET效率差异最大化,则生物传感器的检测能力将极大增强。因此,本发明人开展了使生物传感器检测能力最大化的研究,结果发现随着温度上升,大肠杆菌PBPs显示出可逆的解折叠,且这种解折叠现象在更高的温度下、存在配体的条件下被观察到。基于这些研究结果,提供本发明的方法来检测配体及测量配体浓度,该方法检测配体的能力比使用现有FRET原理的现有技术方法更强。
具体地,在本发明的一个实施例中,根据温度来分析FRET生物传感器的荧光性,且结果发现在温度为45-65℃的条件下,生物传感器的荧光性依赖于配体的存在或缺失而极大地改变。更具体地,发现传感器的检测能力(Δ比值)在49℃-54℃的温度范围内增强,其中该温度范围被认为是“临界温度”范围(图2-5)。此外,本领域的技术人员可以理解本发明披露的临界温度可以依赖于配体结合蛋白的稳定性和反应液的组成而改变。换而言之,包括源自嗜冷或嗜热微生物的配体结合蛋白或其通过改进底物特异性而获得的配体结合蛋白的生物传感器也可在高于或低于本发明的临界温度范围(49℃-54℃)下具有增强的检测配体的能力。尤其,对本领域的技术人员来说,显然临界温度的控制可依赖于存在或缺失影响蛋白质构象刚性的底物,例如,酸、碱、还原剂、变性剂(离液剂)、稳定剂、表面活性剂、乳化剂或洗涤剂。
在本发明的其它实施例中,发现在临界温度下,FRET生物传感器的检测能力比其在25℃高约2.5-12倍(图6-9)且各生物传感器对底物的特异性比美国专利No.US 7,432,353中披露的更强(图12和13)。
具体实施方式
以下,将参考实施例进一步详细描述本发明。对具有本领域普通知识的人员来说,显然这些实施例仅仅用作说明的目的并不能理解为对本发范围的限制。也就是说,以下步骤将描述为说明性的且不限制本发明的范围。
实施例1:FRET生物传感器的制备
1-1:用于制备FRET生物传感器用融合蛋白的表达载体的构建
首先,为了提供含有以下式I表示的蛋白质的生物传感器,按以下方式构建表达载体。
[式1]
其中,PBP是配体结合蛋白,选自:ALBP、ARBP、MBP和GGBP;L1和L2是由两个氨基酸组成的接头肽,L1和L2分别连接FP1的C-末端与PBP N-末端,以及连接PBP的C-末端与FP2的N-末端;且FP1和FP2分别由ECFP和EYFP构成,是FRET的荧光供体和荧光受体。
用于本发明的能定量测量阿洛糖、阿拉拍糖和麦芽糖的FRET生物传感器与本申请人名义下的韩国授权专利No.10-0739529和美国专利No.US7,432,353披露的传感器相同。
按以下方式构建用于定量测量麦芽糖的麦芽糖传感器-表达载体CMY-BII。
SEQ ID NO:1:5′-gatcggatccatggtgagcaagggcgag-3′
SEQ ID NO:2:5′-gatcaagcttgtacagctcgtccatgc-3′
SEQ ID NO:3:5′-gatcatatggtgagcaagggcgag-3′
SEQ ID NO:4:5′-tttaccttcttcgattttcattcgcgacttgtacagctcgtccatgcc-3′
SEQ ID NO:5:5′-atgaaaatcgaagaaggtaaac-3′
SEQ ID NO:6:5′-gatcggatcccgagctcgaattagtctg-3′
首先,用pEYFP-N1载体(Clontech,Palo Alto,CA)作为模板通过PCR扩增EYFP基因,引物为分别含有BamHI和HindIII限制性序列的SEQ ID NO:1和2。扩增的EYFP基因用BamHI和HindIII限制性酶进行酶切,然后插入到表达载体pET-21a(Novagen,Madison,WI)的限制性酶识别位点,从而构建载体pEYFP-III,其中可以于EYFP的C-末端表达6×His-tag。用pECFP载体(Clontech,Palo Alto,CA)作为模板通过PCR扩增ECFP基因,引物为含有NdeI限制性序列的SEQ ID NO:3以及制备为与MBP的N-末端核苷酸序列重叠的SEQ IDNO:4。同样,使用pMALc2x(NEB,Beverly,MA,USA)作为模板通过PCR扩增MBP基因,引物为SEQ ID NO:5和含BamHI限制性序列的SEQ ID NO:6。所扩增的ECFP和MBP基因均可以使用制备为彼此重叠的引物,通过重叠延伸PCR进行扩增。因此,将ECFP和MBP基因以同样量加入到反应液中,然后用引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6进行PCR,从而可获得形式为ECFP-MBP的合成基因。所扩增的合成基因用NdeI和BamHI限制性酶进行酶切并克隆到MBP-EYFP的表达载体pEYFP-III的限制性酶识别位点上,从而构建表达载体pECMY-BII。如上所述而构建的用于测量麦芽糖的FRET生物传感器命名为“CMY-BII”。
此外,为了构建用于测量阿洛糖的生物传感器-表达载体CalsBY-QV,用引物SEQ ID NO:3和7通过PCR扩增ECFP基因,以及用提取自E.coliMG1655的染色体DNA作为模板,并以SEQ ID NO:8和9作为引物通过PCR扩增ALBP基因。
SEQ ID NO:7:5′-gacagcatattcggcggccattacttgcttgtacagctcgtccatgc-3′
SEQ ID NO:8:5′-atggccgccgaatatgctgt-3′
SEQ ID NO:9:5′-cgcggatcccgattgagtgaccaggatt-3′
所扩增的ECFP和ALBP基因用引物SEQ ID NO:3和9通过PCR扩增,从而获得合成基因ECFP-ALBP。将ECFP-ALBP基因插入到pECMY-BII表达载体,用NdeI和BamHI限制性酶切位点将其中的ECFP-MBP基因切除,从而得到用于测量阿洛糖的生物传感器-pECalsBY-QV载体。
同样,为了构建用于测量阿位伯糖的生物传感器-表达载体CaraFY-PR,用引物SEQ ID NO:3和10通过PCR扩增ECFP基因,并用提取自E.coli MG1655的染色体DNA作为模板,以SEQ ID NO:11和12作为引物通过PCR扩增ARBP基因。
SEQ ID NO:10:5′-ccgagcttcaggttctccatcctaggcttgtacagctcgtccatgc-3′
SEQ ID NO:11:5′-atggagaacctgaagctcg-3′
SEQ ID NO:12:5′-cgcggatcccgacttaccgcctaaacctt-3′
所扩增的ECFP和ARBP基因用引物SEQ ID NO:3和12通过PCR进行扩增,从而获得合成基因ECFP-ARBP。将ECFP-ARBP基因插入到pECMY-BII表达载体的ECFP-MBP基因位置,从而构建pECaraFY-PR载体。
另外,按以下方式构建本发明用于测量葡萄糖的生物传感器-表达载体CmglBY-SS。
SEQ ID NO:13:5′-caccaatgcgagtatcagccatcgaagacttgtacagctcgtccatgcc-3′
SEQ ID NO:14:5′-atggctgatactcgcattggtg-3′
SEQ ID NO:15:5′-cgcggatcccgatttcttgctgaattcagc-3′
首先,使用pECFP载体作为模板并使用制备成与GGBP的N-末端核苷酸序列重叠的正向引物SEQ ID NO:3以及反向引物SEQ ID NO:13,通过PCR扩增ECFP基因。同样,使用提取自E.coli MG1655的染色体DNA作为模板,和正向引物SEQ ID NO:14以及含有BamHI限制性序列的反向引物SEQ IDNO:15,通过PCR扩增GGBP基因。将所扩增的ECFP和GGBP基因加入到反应液中,然后用引物SEQ ID NO:3和15通过PCR扩增,从而获得合成基因ECFP-GGBP。所扩增的合成基因ECFP-GGBP用NdeI和BamHI限制性酶进行酶切并插入到pECMYB-II载体,用载体的NdeI和BamHI限制性酶切位点从该载体切除ECFP-MBP基因,从而构建pECmglBY-SS载体。按上述构建的用于测量葡萄糖的FRET生物传感器命名为“CmglBY-SS”。
1-2:FRET生物传感器的制备和纯化
将分别转化实施例1-1中构建的pECalsBY-QV、pECaraFY-PR、pECMY-BII和pECmglBY-SS载体的大肠杆菌细胞接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl)中并于37℃振荡培养12小时。
将培养的大肠杆菌细胞以1%的浓度接种到1L含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中,并于37℃培养约2小时。当O.D.600nm的吸光度达到0.5时,向其中加入浓度为0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷),然后于25℃孵化细胞24小时,从而诱导蛋白质在细胞内的表达。
完成培养后,使用离心机(Supra22K,Hanil,Korea)以6000rpm的速度回收培养的细菌菌株并重悬于20Mm的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中,然后用超声波仪破坏细胞膜。以15000rpm的速度再次离心裂解后的细菌菌株,并去除沉淀。上清液通过0.2-μm的过滤器进行过滤,并在后续的纯化工艺中纯化滤液。
用连接于FRET生物传感器的C-末端的6×His-tag,通过连接FPLC(快速高效液相色谱)的亲和色谱柱HisTrapTM HP(GE Healthcare,Uppsala,Sweden),然后通过阴离子交换色谱柱HiTrapTM Q HP(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)来进行蛋白质的纯化。将纯化的FRET传感器于含20%甘油的PBS缓冲液(pH7.4)中浓缩直到浓度为10mg/ml并贮存于-70℃下备用。
实施例2:FRET生物传感器的荧光分析
在0.5ml PBS缓冲液(pH 7.4)中将各生物传感器的蛋白质浓度控制同为0.5μM的条件下,用荧光分析系统Cary Eclipse(Varian Inc.,Mulgrave,Australia)测量FRET生物传感器的荧光性。从450nm到600nm扫描于436nm处激发的发射光谱。另外,对于FRET效率的指数,将FRET比率定义为:FRET测得的ECFP在480nm处的发射强度与EYFP在530nm处的发射强度之比,如以下公式3所示:
[公式3]
比率=(530nm/480nm)
其中
比率:EYFP与ECFP之间发射强度之比;
530nm:FRET测量的FYFP发射强度;
480nm:于436nm处激发时所测量的ECFP发射强度。
另外,限定FRET生物传感器检测能力的Δ比率根据以下公式4确定:
[公式4]
Δ比率=比率最大-比率最小
其中
Δ比率:存在和没有配体时,比率的最大差异;
比率最大:存在配体时测量的比率;
比率最小:没有配体时测量的比率。
使用Sigmaplot 10.0(Systat软件公司,美国)的4-参数希尔方程,基于配体浓度从1nM上升到10mM时所测量的比率变化以S型曲线(Sigmoidal curves)表示FRET生物传感器的滴度曲线。同样,Kd是各传感器的配体的电离常数,Kd定义为Δ比率在S型曲线中的值为1/2时的配体浓度。同样,可以用传感器定量测量的配体浓度范围定义为Δ比值为10%~90%饱和的范围内的配体浓度。
实施例3:FRET生物传感器根据温度的荧光分析
就根据温度变化的各FRET生物传感器的荧光性分析而言,在0.5ml PBS缓冲液(pH 7.4)中将各FRET生物传感器浓度控制为0.5μM,在没有配体或存在1mM配体的情况下测量FRET比率。为了防止过量稀释传感器,加入到0.5ml各FRET生物传感器中的配体体积限度为5μl,相当于总体积的1/100。在10~65℃范围内以5℃的间隔来测量温度变化且在比率变化强烈的45~60℃范围内以1℃的间隔进行测量。所有供试组均在加盖的荧光小玻璃管中测试以防止水分蒸发,其中,小玻璃管被放置在装有温度控制器的帕尔帖装置中,在这种状态下,当达到目标温度3分钟以后测量荧光度。
结果,如图2到5所示,实施例1-2中纯化的FRET生物传感器的临界温度范围为:麦芽糖传感器为54℃(图2),葡萄糖传感器为50℃(图3),以及阿洛糖和阿拉伯糖传感器为49℃(图4和5),它们彼此之间有轻微的差异,所述临界温度范围是根据存在或没有配体时,FRET比率变化最大的温度范围。当临界温度±1℃时,FRET比率变化不显著则表明稳定的结果。
同样,分析各FRET生物传感器在临界温度范围内对配体的滴度曲线。结果见于图6到9,麦芽糖传感器的Δ比值为1.22(图6)、葡萄糖传感器的Δ比值为1.6(图7)、阿洛糖传感器的Δ比值为-0.62(图8)、阿拉伯糖传感器的Δ比值为0.72(图9)。
当将如上述而测量的各FRET生物传感器的Δ比值与之前在25℃的测量值相比较时,本发明测量的Δ比值为:麦芽糖传感器增加了7倍(图6)、葡萄糖传感器增加了12倍(图7)、阿洛糖传感器增加了3倍(图8)、以及阿拉伯糖传感器增加了2.5倍(图9)。此结果直接说明了在本发明披露的临界温度下,可以显著改善不同种类的FRET生物传感器的检测能力。
以上结果总结于下面的表1中。
[表1]FRET生物传感器的特征分析结果
同时,可用各生物传感器测量的配体的浓度范围显示为生理学上显著的。例如,血液葡萄糖浓度为70-200mg/dl,相当于400-1100μM。因此,当葡萄糖传感器用于检测血液的葡萄糖浓度时,加入的血液量要相当于传感器总体积的1/100,因此在4-11μM的浓度范围内。上述浓度范围也可以被最精确地测量,因为葡萄糖传感器的Kd值为9.2±0.5μM。
实施例4:FRET生物传感器对配体的特异性分析
用包括单糖、多糖和糖醇等19种糖来进行FRET生物传感器对不同配体的特异性分析。
为了测量传感器的特异性,将各纯化的FERT生物传感器以0.5μM的浓度加入到0.5ml的PBS缓冲液(pH 7.4)中,使得各配体的浓度达到100μM、1mM、10mM等。在围绕着小玻璃管的帕尔帖(peltier)装置达到实施例3中确定的各临界温度3分钟之后测量荧光。
结果可见于图10和12,用于测量麦芽糖和阿洛糖的FRET传感器不与其它糖特异性结合。同样,与在本申请人名义下的美国专利No.7432353披露的测量结果(于25℃)相比较,阿洛糖生物传感器对高浓度核糖所显示出的特异性降低。
同样,用于测量阿拉伯糖和葡萄糖的FRET生物传感器对半乳糖具有很高的亲和力,与以前的研究结果相似(Vyas et al.,J.Biol.Chem.266,5226-5237,1991;Fehr et al.,J.Biol.Chem.278,19127-19133,2003)。特别地,发现除了半乳糖,葡萄糖传感器还对许多高浓度糖的亲和力都较低(图11)。然而,由于血液中除了葡萄糖外的其他糖都是以痕量存在,相信即使用葡萄糖传感器来测量血液葡萄糖,由其他糖引起的误差也是无关紧要的。另外,由于最近才报道GGBP对半乳糖的亲和力显著降低(Sakaguchi-Mikami et al.,Biotechnol.Lett.30:1453-1460,2008),因此可进一步改善用于测量葡萄糖的FRET生物传感器的特异性。
工业运用
如上所述,根据本发明的方法是这样一种技术,其基于当温度高于特定的临界温度时,生物传感器中的配体结合蛋白显示出可逆的解折叠,且解折叠的变化程度取决于配体的浓度这种现象。此外,本发明涉及一种用于在临界温度测量FRET生物传感器的荧光的方法,所述方法可明显地增强所述生物传感器的检测能力,且可以广泛地用于多种使用配体结合蛋白和荧光蛋白的FRET生物传感器。
尽管参考具体特征来详细描述本发明,但是显然对本领域的技术人员来说这种描述仅仅是优选的实施方式而并不限制本发明。因此,本发明的实质性范围由所附权利要求书及其等同范围来限定。
Claims (13)
1.一种利用FRET生物传感器检测配体的方法,所述FRET生物传感器包括信号域以及感应域,所述信号域包括荧光供体和荧光受体,所述感应域含有使荧光供体和荧光受体相连接的配体结合蛋白,所述方法包括在临界温度范围内,使FRET生物传感器接触含有配体的样品,其中在所述临界温度范围内所述配体结合蛋白发生可逆解折叠且由配体与配体结合蛋白的结合所产生的FRET比率变化最大。
2.一种利用FRET生物传感器测量配体浓度的方法,所述FRET生物传感器包括信号域以及感应域,所述信号域包括荧光供体和荧光受体,所述感应域含有使荧光供体和荧光受体相连接的配体结合蛋白感应域,所述方法包括以下步骤:
(a)在临界温度范围下,使FRET生物传感器接触含有配体的样品,其中在所述临界温度范围内发生可逆解折叠且由配体与配体结合蛋白的结合所产生的FRET比率变化最大,和
(b)测量荧光供体和荧光受体发射强度的比率变化以测量配体的浓度。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中加入酸、碱、还原剂、变性剂、稳定剂、表面活性剂、乳化剂和洗涤剂中至少之一以改变临界温度,然后在改变的临界温度下使生物传感器接触配体。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中FRET生物传感器包括源自嗜冷或嗜热微生物的周质结合蛋白PBP或通过改进其底物特异性而获得的PBP来作为配体结合蛋白以改变临界温度,并使所述配体结合蛋白在所述改变的临界温度下接触配体。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中配体选自糖、氨基酸、蛋白质、脂质、有机酸、金属、氧化物、氢氧化物或其缀合物、无机离子、胺或聚胺、以及维生素。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中荧光供体选自荧光蛋白、荧光染料、生物发光蛋白和量子点;并且荧光受体选自波长与所述荧光供体不同的荧光蛋白、荧光染料和量子点。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其中荧光供体选自荧光蛋白、荧光染料、生物发光蛋白和量子点;并且荧光受体包括降低荧光供体的荧光强度的淬灭剂。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述淬灭剂包括金纳米粒子。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其中使用至少一个接头将荧光供体或荧光受体融合到配体结合蛋白。
10.根据权利要求1或2所述的方法,其中如果配体结合蛋白是周质结合蛋白PBP,则临界温度范围是49-54℃。
11.根据权利要求1或2所述的方法,其中如果配体结合蛋白是麦芽糖结合蛋白MBP,则临界温度是54℃。
12.根据权利要求1或2所述的方法,其中如果配体结合蛋白是半乳糖/葡萄糖结合蛋白GGBP,则临界温度是50℃。
13.根据权利要求1或2所述的方法,其中如果配体结合蛋白是阿洛糖结合蛋白ALBP或阿拉伯糖结合蛋白ARBP,则临界温度是49℃。
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