JP5710595B2 - Fretバイオセンサーを利用したリガンドの検出方法 - Google Patents
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Description
(a)可逆的なアンフォールディングが起こり、リガンドが前記リガンド結合蛋白質に結合することによるFRET比の変化が最も大きい温度区間である臨界温度で、前記FRETバイオセンサーを、リガンドを含有する試料と接触させる工程、及び
(b)前記蛍光供与体と蛍光受容体の発光量比の変化を測定してリガンドの濃度を測定する工程。
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からより一層明白になる。
本発明の詳細な説明などにおいて使用される主な用語の定義は、下記の通りである。
(a)可逆的なアンフォールディングが起こり、リガンドが前記リガンド結合蛋白質に結合することによるFRET比の変化が最も大きい温度区間である臨界温度で、前記FRETバイオセンサーをリガンドを含有する試料と接触させる工程、及び
(b)前記蛍光供与体と蛍光受容体の発光量比の変化を測定してリガンドの濃度を測定する工程。
E=R0 6/(R6+R06) (1)
前記式(1)において、EはFRET効率を示し、Rは蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離であり、蛍光物質により差はあるが通常2〜9nm以内で定義される。また、R0はFRET効率が50%になる蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離であり、一般にForster distanceまたはForster radiusと呼ばれる。R0は次の式に表現される。
R0=0.211[k2n−4QDJ(λ)]1/6 (inÅ) (2)
前記式(2)において、k2は方向係数(orientation factor)であり、通常2/3で計算し、蛍光供与体発光と蛍光受容体吸光の相対方向により0〜4の範囲の値を有する。nは、媒質の屈折率であり、通常25℃の水は〜1.334であり、QDは、蛍光供与体の量子効率である。J(λ)は、蛍光供与体の発光と蛍光受容体の吸光スペクトラム上の重複(overlap)程度であり、M−1cm−1nm4の単位値を有する(Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999、Patterson et al., Anal. Biochem. 284:438, 2000、 Patterson et al., J. of Cell Sci. 114:837, 2001)。
本発明の他の実施形態では、FRETバイオセンサーの検出能力が、25℃で測定した場合より臨界温度において最小2.5倍から最大12倍程度増加することを確認し(図6〜図9)、各センサーの基質に対する特異性も、米国登録特許US7432353号で提示した結果より向上することを確認することができた(図12、図13)。
《実施例1:FRETバイオセンサーの製造》
1−1:FRETバイオセンサーのための融合蛋白質製造のための発現ベクターの構築
まず次の式(I)で表される蛋白質を含有するバイオセンサーを提供するために次のように発現ベクターを構築した:
まず、マルトースを定量的に測定するためのマルトースバイオセンサーであるCMY−BIIの発現ベクターは次の方法によって構築した。
配列番号2:5'−gatcaagcttgtacagctcgtccatgc−3'
配列番号3:5'−gatcatatggtgagcaagggcgag−3'
配列番号4:5'−tttaccttcttcgattttcattcgcgacttgtacagctcgtccatgcc−3'
配列番号5:5'−atgaaaatcgaagaaggtaaac−3'
配列番号6:5'−gatcggatcccgagctcgaattagtctg−3'
配列番号7:5'−gacagcatattcggcggccattacttgcttgtacagctcgtccatgc−3'
配列番号8:5'−atggccgccgaatatgctgt−3'
配列番号9:5'−cgcggatcccgattgagtgaccaggatt−3'
配列番号10:5'−ccgagcttcaggttctccatcctaggcttgtacagctcgtccatgc−3'
配列番号11:5'−atggagaacctgaagctcg−3'
配列番号12:5'−cgcggatcccgacttaccgcctaaacctt−3'
また、本発明で用いられたグルコース測定用バイオセンサーであるCmglBY−SSの発現ベクターは下の方法で構築した。
配列番号13:5'−caccaatgcgagtatcagccatcgaagacttgtacagctcgtccatgcc−3'
配列番号14:5'−atggctgatactcgcattggtg−3'
配列番号15:5'−cgcggatcccgatttcttgctgaattcagc−3'
実施例1−1で構築したpECalsBY−QV、pECaraFY−PR、pECMY−BII及びpECmglBY−SSが、各々JM109(DE3)に形質転換された大腸菌を50μg/mLのアンピシリンが添加されたLB培地(1%bacto−trypton、0.5%yeast extract、1%NaCl)に接種して、37℃で12時間震盪培養した。
FRETバイオセンサーの蛍光は、各センサー蛋白質を0.5mLのPBS緩衝液(pH7.4)に0.5μMの濃度で同一に調節した条件で、蛍光分析システムのCary Eclipse(Varian Inc.,Mulgrave,Australia)を用いて測定し、436nmで励起させて発生する発光スペクトラムを450nmから600nmまでスキャンして確認した。また、FRET効率を示す指標としては、480nmでのECFP発光とFRETによって発生するEYFPの530nmでの発光量(emission intensity)の比を下記の式(3)に代入した値であるFRET ratioと定義した。
[数3]
ratio=(530nm/480nm) (3)
ratio:EYFPとECFPの発光量比
530nm:FRETによって測定されるEYFPの発光量
480nm:励起光を436nmにした時測定されるECFPの発光量
また、FRETバイオセンサーの検出能力を定義する△ratioは下記の式(4)により決めた。
[数4]
△ratio=ratiomax−ratiomin (4)
△ratio:リガンドの有無によるratioの最大差
ratiomax:リガンドが存在する条件で測定されるratioの比
ratiomin:リガンドがない条件で測定されるratioの比
温度変化によるFRETバイオセンサーの蛍光分析は、各センサーを0.5mLのPBS緩衝液(pH7.4)に0.5μMの濃度に調節して、リガンドがない条件と飽和濃度の1mMのリガンドが添加された条件でのFRET ratioを測定して、比較分析した。FRETバイオセンサー0.5mLに添加するリガンドの体積は、センサーの過度な希釈を防止するために全体積の1/100に該当する5μLに制限した。温度変化は、10〜65℃区間まで5℃間隔で測定し、ratioの変化が著しい区間である45〜60℃間では1℃間隔で温度を変化させながら測定した。全ての実験群は水分蒸発を防止するために栓が閉じられた蛍光キューベット(cuvette)に入っている状態で実験を行い、キューベットは温度調節装置が連結したペルチエ素子(peltier device)に位置させた状態で目標温度に到達してから3分経過後、蛍光を測定した。
前記結果は下記の表1にまとめられた。
FRETバイオセンサーの多様なリガンドに対する特異性分析は、19種の単糖類と多糖類、及び糖アルコール等種々の糖類を対象に測定した。
測定方法は、精製されたFRETバイオセンサーを0.5mLのPBS緩衝液(pH7.4)に0.5μMの濃度に調節して、各リガンドの濃度を100μMと1mM、10mM等になるよう添加して、キューベットを囲むペルチエ素子が前記実施例3で求めた臨界温度に到達した時から3分経過後に蛍光を測定した。
その結果、図10及び12に示したように、マルトースとアロース測定用FRETバイオセンサーは、他の種類の糖とは特異的な結合をしないと確認された。また、25℃で測定した、本発明出願人によって先出願された米国登録特許US7432353号の結果と比較して見ると、アロースFRETバイオセンサーは、高濃度のリボースに対する特異性が減少することが確認できた。
Claims (6)
- 蛍光供与体及び蛍光受容体を含む信号発生部と前記蛍光供与体及び蛍光受容体を連結するリガンド結合蛋白質を含む感知部を含むFRETバイオセンサーを利用したリガンドの検出方法であって、可逆的なアンフォールディングが起こり、リガンドの前記リガンド結合蛋白質への結合に伴うFRET比の変化が最も大きい温度区間である臨界温度でリガンドを含有する試料と接触させ、前記リガンド結合蛋白質が、pMALc2xを鋳型として生成したMBP、大腸菌MG1655から抽出した染色体を鋳型として生成したGGBP、ALBP及びARBPからなる群より選択される大腸菌由来のリガンド結合蛋白質であり、そして前記臨界温度が、MBPの場合は54℃、GGBPの場合は50℃、ALBP及びARBPの場合は49℃であることを特徴とするリガンドの検出方法。
- 次の工程を含む、蛍光供与体及び蛍光受容体を含む信号発生部と前記蛍光供与体及び蛍光受容体を連結するリガンド結合蛋白質を含む感知部を含むFRETバイオセンサーを利用したリガンド濃度の測定方法であって:
(a)可逆的なアンフォールディングが起こり、リガンドの前記リガンド結合蛋白質への結合に伴うFRET比の変化が最も大きい温度区間である臨界温度で、前記FRETバイオセンサーをリガンドを含有する試料と接触させる工程、及び
(b)前記蛍光供与体と蛍光受容体の発光量比の変化を測定して、リガンドの濃度を測定する工程;
ここで、前記リガンド結合蛋白質が、pMALc2xを鋳型として生成したMBP、大腸菌MG1655から抽出した染色体を鋳型として生成したGGBP、ALBP及びARBPからなる群より選択される大腸菌由来のリガンド結合蛋白質であり、そして前記臨界温度が、MBPの場合は54℃、GGBPの場合は50℃、ALBP及びARBPの場合は49℃であるリガンド濃度の測定方法。 - 前記リガンドは、糖、アミノ酸、蛋白質、脂質、有機酸、金属または金属イオン、酸化物、水酸化物またはそのコンジュゲート、無機イオン、アミンまたはポリアミン及びビタミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記蛍光供与体は、蛍光蛋白質、蛍光顔料、生体発光蛋白質及び量子ドットからなる群から選択され、前記蛍光受容体は、前記蛍光供与体と波長が異なる蛍光蛋白質、蛍光顔料及び量子ドットからなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛍光供与体は、蛍光蛋白質、蛍光顔料、生体発光蛋白質及び量子ドットからなる群から選択され、前記蛍光受容体は、前記蛍光供与体の蛍光強度を減少させる消光剤または金ナノ粒子であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛍光供与体または蛍光受容体は、一つ以上のリンカーを介して、前記リガンド結合蛋白質に連結することを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
載の方法。
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