JP2015203650A - 生体分子の濃度測定装置及び生体分子の濃度測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】簡便に生体分子を定量することができる生体分子の濃度測定装置を提供する。
【解決手段】第１の蛍光部位及び第２の蛍光部位を有し任意の生体分子に結合する標識分子を含む試料に励起光を照射する光照射部と、前記標識分子からの発光を検出する検出部と、前記試料中の前記検出部によって検出された発光点の数を数える計数部と、前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数と、前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数と、に基づき前記試料に含まれる前記任意の生体分子の濃度を算出する濃度算出部と、を有する生体分子の濃度測定装置を提供する。
【選択図】図１

Description

本技術は、生体分子の濃度測定装置及び生体分子の濃度測定方法に関する。より詳しくは、発光点の数に基づき濃度を測定する技術に関する。

生体由来の試料に含まれる物質の検出及び定量には、各種方法が用いられている。特に、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）は、抗原抗体反応を利用することにより、比較的高感度に測定対象の定量を行うことができるため、試料に含まれる抗原又は抗体の定量に好適に用いられている。しかし、ＥＬＩＳＡ法では、複数の試薬や洗浄工程を必要とするため、その作業は煩雑である。

このような作業性の問題に対して、例えば、特許文献１には、「標的物質を含む被験試料液に下記競合物質を混合した混合液を、下記競合的捕捉物質、下記判定物質の順に接触させる免疫反応工程と、前記競合的捕捉物質及び前記判定物質のうちの少なくとも一方に前記競合物質が備える酵素の基質を接触させて反応物を得る酵素反応工程と、前記反応物の量を測定して前記標的物質の量を算出する算出工程と、を有することを特徴とする標的物質の測定方法」が開示されている。当該測定方法では、競合物質を利用することにより、競合物質が競合的捕捉物質に捕捉された量を直接的乃至間接的に測定することで、競合する標的物質の定量を行っている。

特開２００８−３２４９４号公報

上記特許文献１に記載されている測定方法によって、生体分子の濃度の測定において、作業性を向上させることができる。しかし、上記特許文献１に記載の方法でも、競合的捕捉物質及び判定物質の各々の物質を含む複数の試薬を用意して、順に混合する工程が必須である。このため、より簡便に試料中の生体分子の濃度を測定する方法が求められている。

そこで、本開示は、簡便に生体分子を定量することができる、生体分子の濃度測定装置等を提供することを主な目的とする。

上記課題解決のため、本開示は第１の蛍光部位及び第２の蛍光部位を有し任意の生体分子に結合する標識分子を含む試料に励起光を照射する光照射部と、前記標識分子からの発光を検出する検出部と、前記試料中の前記検出部によって検出された発光点の数を数える計数部と、前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数と、前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数と、に基づき前記試料に含まれる前記任意の生体分子の濃度を算出する濃度算出部と、を有する生体分子の濃度測定装置を提供する。
前記励起光を照射された前記標識分子は、前記任意の生体分子と結合していない場合には前記第１の蛍光部位から第１の蛍光を発し、前記任意の生体分子と結合している場合には前記第２の蛍光部位から第２の蛍光を発するもの、又は前記任意の生体分子と結合していない場合には前記第２の蛍光部位から第２の蛍光を発し、前記任意の生体分子と結合している場合には前記第１の蛍光部位から第１の蛍光を発するもの、であってもよい。
前記濃度算出部は前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数と前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数の和に対する前記任意の生体分子と結合している場合に蛍光を発する蛍光部位に由来する発光点の数の割合に基づき前記濃度を算出してもよい。
前記計数部は、任意の大きさの同一領域における前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数及び前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数を数えることができる。
前記生体分子の濃度測定装置では、前記任意の生体分子と結合した前記標識分子へ前記励起光が照射されると、前記第１の蛍光部位から前記第２の蛍光部位、又は前記第２の蛍光部位から前記第１の蛍光部位へ励起エネルギーが与えられてもよい。
また、前記任意の生体分子と結合していない前記標識分子へ前記励起光が照射されると、前記第１の蛍光部位から前記第２の蛍光部位、又は前記第２の蛍光部位から前記第１の蛍光部位へ励起エネルギーが与えられてもよい。
また、前記励起光をエバネッセント光とすることもできる。
さらに、前記試料は基板上に保持されていてもよい。

本開示はまた、第１の蛍光部位及び第２の蛍光部位を有し任意の生体分子に結合する標識分子を含む試料に励起光を照射する光照射工程と、前記標識分子からの発光を検出する検出工程と、前記試料中の前記検出工程によって検出された発光点の数を数える計数工程と、前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数と、前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数と、に基づき前記試料に含まれる前記任意の生体分子の濃度を算出する濃度算出工程と、を有する生体分子の濃度測定方法を提供する。
前記濃度測定方法は、前記光照射工程の前に前記試料を基板上に保持させて濃縮する濃縮工程を有していてもよい。

本開示により、簡便に生体分子を定量することができる生体分子の濃度測定装置等が提供される。なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。

本開示の第１実施形態に係る生体分子の濃度測定装置の構成の概要を示す模式図である。 標識分子の構造を示す模式図である。 本開示に係る生体分子の濃度測定方法の概要を示すフローチャートである。 Ａ及びＢは、標識分子における発光する蛍光部位の切り替えを説明するための模式図である。 計数工程の概要を示す模式図である。 本開示の第２実施形態に係る生体分子の濃度測定装置の構成の概要を示す模式図である。 本開示の第３実施形態に係る生体分子の濃度測定装置の構成の概要を示す模式図である。

以下、本開示を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本開示の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本開示の範囲が狭く解釈されることはない。

１．第１実施形態に係る生体分子の濃度測定装置
先ず、本開示の第１実施形態に係る生体分子の濃度測定装置について説明する。図１は、本実施形態の生体分子の濃度測定装置（以下、単に濃度測定装置とも称する。）の構成の概要を示す模式図である。図１に示すように、濃度測定装置Ｄ１は、少なくとも、試料に励起光Ｌ１１を照射する光照射部１ａと、標識分子Ｍからの発光Ｌ２１を検出する検出部２ａと、検出部２ｂによって検出された発光点の数を数える計数部３と、試料に含まれる任意の生体分子の濃度を算出する濃度算出部４と、を有する。濃度測定装置Ｄ１の各構成について順に説明する。

＜光照射部＞
光照射部１ａは、濃度測定装置Ｄ１において、標識分子Ｍを含む試料に励起光Ｌ１１を照射するための構成である。図２に標識分子Ｍの構造を模式的に示す。標識分子Ｍとは、第１の蛍光部位Ｆ１及び第２の蛍光部位Ｆ２を有するものである。また、任意の生体分子に結合するために、標識分子Ｍは、任意の生体分子との結合部位Ｂを有する。結合部位Ｂは、結合対象とする生体分子Ｔを１つ結合でき、複数結合させることはできない構造を有する。標識分子Ｍの詳細は、後述する。

光照射部１ａは、標識分子Ｍに所定の波長の励起光Ｌ１１を照射できれば、その構成は特に限定されず、公知の構成の中から適宜採用することができる。例えば、光照射部１ａには、励起光Ｌ１１を出射する光源１１や集光レンズ１２、絞り１３等を備えることができる。また、光照射部１ａは、走査しながら試料に対して励起光Ｌ１１を照射できるように構成されていてもよい。

光源１１としては、例えば、レーザー光源、ＬＥＤ光源、水銀ランプ、タングステンランプ等の中から、標識分子Ｍの構成等に合わせて適切な光源１１を選択することができる。また、励起光Ｌ１１を所定の波長域の光とするために、試料と光源１１との間に励起フィルタを設けることもできる（図１において、励起フィルタは不図示）。

＜検出部＞
検出部２ａは、濃度測定装置Ｄ１において、試料中の標識分子Ｍからの発光Ｌ２１を検出するための構成である。検出部２ａについても、標識分子Ｍからの発光を検出できれば、その構成は特に限定されず、公知の構成の中から適宜採用することができる。例えば、検出部２ａには、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子、ＰＭＴ（光電子倍増管）、フォトダイオード等を検出器２１として備えることができる。また、検出部２ａには、対物レンズ２２等の構成が備えられていてもよい。

標識分子Ｍは、上述したように複数の蛍光部位Ｆ１，Ｆ２を有しているものである。これらの蛍光部位Ｆ１，Ｆ２から発せられる第１の蛍光と第２の蛍光については、励起波長及び発光波長に関して、各々、波長域が異なることが好ましい。また、検出部２ａは、第１の蛍光部位Ｆ１と第２の蛍光部位Ｆ２の、いずれの蛍光部位からの発光についても検出する。

検出部２ａは、上記の特徴を有する標識分子Ｍからの発光を検出する場合には、第１の蛍光と第２の蛍光とを、区別して検出できるように構成されていることが好ましい。例えば、標識分子Ｍと検出器２１との間に、蛍光フィルタ２３を設けることにより、所望の波長域の光のみを検出器２１側へ透過させることができる。この場合、透過可能な波長域が互いに異なる複数の蛍光フィルタ２３を設けることで、第１の蛍光の検出と、第２の蛍光の検出と、を、蛍光フィルタ２３の切り替えにより行うことができる。

＜計数部及び濃度算出部＞
計数部３は、濃度測定装置Ｄ１において、検出部２ａによって検出された試料中の発光点の数を数えるための構成である。また、濃度算出部４は、第１の蛍光部位Ｆ１に由来する発光点の数と、第２の蛍光部位Ｆ２に由来する発光点の数と、に基づいて、試料に含まれる任意の生体分子の濃度を算出するための構成である。これらの計数部３及び濃度算出部４については、上記の機能を有するように構成されていれば、その構成は特に限定されず、公知の構成の中から適宜採用することができる。例えば、計数部３及び濃度算出部４は、各々、ＣＰＵ、メモリ及びハードディスクなどを備える汎用のコンピュータによって構成することができる。また、計数部３と濃度算出部４とを、１台の汎用コンピュータから構成してもよい。

上述した構成の他、濃度測定装置Ｄ１には、後述する試料中の標識分子Ｍの濃度等を入力するための入力部や、試料中の任意の生体分子の濃度等を表示するための表示部、試料における標識分子Ｍの濃度や測定された任意の生体分子の濃度等を記憶しておくための記憶部等が備えられていてもよい。

２．第１実施形態に係る濃度測定装置による生体分子の濃度の測定
次に、本開示に係る生体分子の濃度測定方法について説明する。即ち、上述した第１実施形態に係る濃度測定装置Ｄ１の動作について説明する。図３は、本開示に係る濃度測定方法の概要を示すフローチャートである。図３に示すように、濃度測定方法は、光照射工程Ｓ１、検出工程Ｓ２、計数工程Ｓ３及び濃度算出工程Ｓ４の各工程を有する。

＜光照射工程＞
光照射工程Ｓ１は、光照射部１ａによって、標識分子Ｍを含む試料に励起光Ｌ１１を照射する工程である。本工程Ｓ１では、上述した第１の蛍光部位Ｆ１又は第２の蛍光部位Ｆ２のいずれかに採用された蛍光物質の励起波長域に相当する波長域の光を照射する。励起光Ｌ１１の波長域については、後述する、標識分子Ｍにおける発光部位の切り替えにおいて適切な波長となるように適宜設定することができる。

光照射工程Ｓ１において、試料は励起光Ｌ１１を照射可能であれば、どのような容器に収容されていてもよいが、例えば、試料を基板Ｐ上に保持することもできる（図１、再度参照）。試料を基板Ｐ上に保持する場合、基板Ｐは標識分子Ｍとの親和性を有するように構成されていることが好ましい。基板Ｐが標識分子Ｍとの親和性を有することにより、標識分子Ｍを基板Ｐに吸着させ、標識分子Ｍのブラウン運動を抑えて、後述する計数工程Ｓ３において、発光点の数をより精度高く数えることができる。

例えば、基板Ｐの表面に、標識分子Ｍとの親和性を高めるために、標識分子Ｍとの親和性が高い素材が積層されていてもよい。あるいは、基板Ｐの表面に標識分子Ｍを接近させるために、遠心処理を行ってもよい。また、基板Ｐの表面に、標識分子Ｍと親和性の高い物質が塗布されていてもよい。さらに、基板Ｐは、自家蛍光の少ない材質で構成されていることが好ましい。

試料とは、濃度の測定対象となる生体分子が含まれていればよく、その組成は、特に限定されない。また、濃度の測定対象となる生体分子には、生体内で合成、代謝又は蓄積される分子全般が含まれる。例えば、生体分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、ペプチド、タンパク質、脂質−タンパク質複合体等、が挙げられる。また、これらの生体分子を含む試料は、例えば、液状又はゲル状の生体試料であってもよい。生体試料としては、例えば、全血、血漿、血清、脳脊髄液、唾液、涙液、精液、滑液、胸水等が挙げられる。

試料に含まれる生体分子の濃度が低い場合には、本開示に係る生体分子の濃度測定方法は、光照射工程Ｓ１の前に試料を基板上に保持させて濃縮する濃縮工程を有していてもよい。試料を濃縮することによって、生体分子と結合した標識分子Ｍに由来する発光の検出率を高めることができる。

また、本工程Ｓ１の時点で、試料には標識分子Ｍが添加されている。試料中の標識分子Ｍの濃度は、既知であることが好ましい。標識分子Ｍの濃度については、例えば、予め所定の濃度に調製された標識分子Ｍの溶解液を用意して、試料への添加量と試料の容量から、試料中の標識分子Ｍの濃度を算出することもできる。

＜検出工程＞
検出工程Ｓ２は、光照射工程Ｓ１によって励起光Ｌ１１を照射された標識分子Ｍからの発光Ｌ２１を、上述した検出部２ａによって検出する工程である。上述したように、標識分子Ｍは、第１の蛍光部位Ｆ１と第２の蛍光部位Ｆ２の、２つの蛍光部位を有している。また、標識分子Ｍは、生体分子と結合している場合と結合していない場合とで、発光する蛍光部位が切り替わるように構成されていることが好ましい。

例えば、標識分子Ｍは、任意の生体分子と結合していない場合には第１の蛍光部位Ｆ１から第１の蛍光を発し、任意の生体分子と結合している場合には第２の蛍光部位Ｆ２から第２の蛍光を発するものが好ましい。また、標識分子Ｍは、任意の生体分子と結合していない場合には第２の蛍光部位Ｆ２から第２の蛍光を発し、任意の生体分子と結合している場合には第１の蛍光部位Ｆ１から第１の蛍光を発するものとすることもできる。標識分子Ｍが、このような構成を有することにより、標識分子Ｍに由来する発光を検出することで、その標識分子Ｍが、結合対象である生体分子と結合しているか否か判定することが容易となる。

図４Ａ及び図４Ｂに、標識分子Ｍの発光部位の切り替えについて、例を示す。また、図４Ａ及び図４Ｂに示すような、発光部位の切り替えは、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer、ＦＲＥＴ）の原理を利用して行うこともできる。

図４Ａに示す標識分子Ｍ１では、生体分子Ｔと結合していない標識分子Ｍ１へ励起光が照射されると、励起光Ｌ１１の波長域は、第１の蛍光部位の励起光に相当する波長域であるため、第１の蛍光部位Ｆ１から第１の蛍光Ｌ２１１が発せられる。一方、結合領域Ｂに生体分子Ｔが結合すると、標識分子Ｍ１の立体構造が変化して、第１の蛍光部位Ｆ１と第２の蛍光部位Ｆ２が近接する。そして、生体分子Ｔと結合した標識分子Ｍ１へ励起光Ｌ１１が照射されると、励起光Ｌ１１を照射された第１の蛍光部位Ｆ１から第２の蛍光部位Ｆ２へ励起エネルギーが与えられる。この結果、第２の蛍光部位Ｆ２から第２の蛍光Ｌ２１２が発せられる。

結合領域Ｂと生体分子Ｔとの結合による標識分子Ｍの立体構造の変化は、第１の蛍光部位Ｆ１と第２の蛍光部位Ｆ２が近接する場合には限定されない。例えば、図４Ｂに示す標識分子Ｍ２は、結合部位Ｂに生体分子Ｔが結合していない場合、第１の蛍光部位Ｆ１と第２の蛍光部位Ｆ２は、近接している。そのため、生体分子Ｔと結合していない標識分子Ｍ２へ励起光Ｌ１１が照射されると、第２の蛍光部位Ｆ２から第１の蛍光部位Ｆ１への励起エネルギーが与えられる。この結果、第１の蛍光部位Ｆ１から第１の蛍光Ｌ２１１が発せられる。一方、結合領域Ｂに生体分子Ｔが結合すると、標識分子Ｍ２の立体構造が変化して、第１の蛍光部位Ｆ１と第２の蛍光部位Ｆ２が解離する。そして、励起光Ｌ１１を照射された第２の蛍光部位Ｆ２からは、第２の蛍光Ｌ２１２が発せられる。

上述した標識分子Ｍにおいて、生体分子Ｔと結合していない状態における発光部位は、第１の蛍光部位Ｆ１に限定されるものではない。同様に、生体分子Ｔと結合した状態における発光部位についても、第２の蛍光部位Ｆ２に限定されるものではない。即ち、生体分子Ｔと結合した標識分子Ｍへ励起光Ｌ１１が照射されると、標識分子Ｍにおいては、第２の蛍光部位Ｆ２から第１の蛍光部位Ｆ１へ励起エネルギーが与えられて、発光部位が、第２の蛍光部位Ｆ２から第１の蛍光部位Ｆ１へ切り替えられてもよい。また、同様に、標識分子Ｍにおいては、生体分子Ｔと結合していない標識分子Ｍへ励起光Ｌ１１が照射されると、第２の蛍光部位Ｆ２から第１の蛍光部位Ｆ１へ励起エネルギーが与えられて、発光部位が切り替えられてもよい。

このようなＦＲＥＴの原理を利用した標識分子Ｍにおける蛍光物質の組み合わせの例としては、ＣＦＰ（励起波長：４５２ｎｍ、発光波長：５０５ｎｍ）とＹＦＰ（励起波長：５１４ｎｍ、発光波長：５２７ｎｍ）、ＢＦＰ（励起波長：３８０ｎｍ、発光波長：４４０ｎｍ）とＣＦＰ（励起波長：４５２ｎｍ、発光波長：５０５ｎｍ）、ＧＦＰ（励起波長：４８８ｎｍ、発光波長：５０９ｎｍ）とＹＦＰ（励起波長：５１４ｎｍ、発光波長：５２７ｎｍ）等が挙げられる。

上述した蛍光タンパク質以外にも、発光タンパク質と蛍光タンパク質の組み合わせであるBioluminescence resonance energy transfer（ＢＲＥＴ）を用いることや、励起波長と蛍光波長の異なる２種類の蛍光分子等を組み合わせること、励起波長と蛍光波長の異なる２種類のＱｄｏｔ（登録商標）を使用すること、先述の光学特性を持つ分子を組み合わせること（蛍光タンパク質と蛍光分子、蛍光分子とＱｄｏｔ（登録商標）、蛍光タンパク質とＱｄｏｔ（登録商標））等が挙げられる。

また、標識分子Ｍの結合部位Ｂについては、任意の生体分子Ｔに特異的に結合する構造を有する、抗体やアプタマー等の構成を採用することができる。

＜計数工程＞
計数工程Ｓ３は、計数部３によって、検出部２ａにおいて検出された試料中の発光点の数を数える工程である。計数部３は、検出部２ａにおいて検出された光の強度の分布から、予め定めた基準を超えている点を、標識分子Ｍから発せられた蛍光Ｌ２１に由来する発光点として扱い、その数を数えることができる。例えば、図５に示すように、計数部３は、検出部２ａの蛍光フィルタ２３を切り替えて検出された光の強度の分布について、第１の蛍光部位Ｆ１から発せられた第１の蛍光Ｌ２１１に由来する点Ｓ１（図５Ａ）の数を数える。同様に、計数部３は、第２の蛍光部位Ｆ２から発せられた第２の蛍光Ｌ２１２に由来する点Ｓ２（図５Ｂ）の数を数える。

また、計数部３は、任意の大きさの同一領域（領域Ｒ）における第１の蛍光部位Ｆ１に由来する発光点Ｓ１の数及び第２の蛍光部位Ｆ２に由来する発光点Ｓ２の数を数えることが好ましい。同じ領域Ｒにおいて各々の発光点Ｓ１，Ｓ２の数を数えることにより、後述する濃度算出工程Ｓ４において、より精度高く濃度を算出することができる。

＜濃度算出工程＞
濃度算出工程Ｓ４は、第１の蛍光部位Ｆ１に由来する発光点の数Ｓ１と、第２の蛍光部位Ｆ２に由来する発光点Ｓ２の数と、に基づき試料に含まれる任意の生体分子Ｔの濃度を算出する工程である。上述したように、標識分子Ｍは、結合対象である生体分子Ｔとの結合の有無によって、発光する蛍光部位を切り替えることができる性質を有する。このため、第１の蛍光部位Ｆ１に由来する発光点Ｓ１の数と、第２の蛍光部位Ｆ２に由来する発光点Ｓ２の数のうち、いずれか一方は、試料中の生体分子Ｔと結合していない標識分子Ｍの数に相当し、他方は、生体分子Ｔと結合した標識分子Ｍの数に相当する。このため、濃度算出部４は、第１の蛍光部位Ｆ１に由来する発光点Ｓ１の数と、第２の蛍光部位Ｆ２に由来する発光点Ｓ２の数と、の和に対する、任意の生体分子Ｔと結合している場合に蛍光を発する蛍光部位に由来する発光点の数の割合に基づき、試料中の生体分子の濃度を算出することができる。

本工程Ｓ４について、標識分子Ｍが、生体分子Ｔと結合していない状態では、第１の蛍光部位Ｆ１から第１の蛍光Ｌ２１１が発せられ、生体分子Ｔと結合した状態では、第２の蛍光部位Ｆ２から第２の蛍光Ｌ２１２が発せられる構成を有している場合を例に説明する（図４Ａ、標識分子Ｍ１、再度参照）。このような標識分子Ｍ１では、第２の蛍光部位Ｆ２に由来する発光点Ｓ２の数は、生体分子Ｔと結合した標識分子Ｍ１の数に相当する。従って、計数工程Ｓ３で、複数の試料について第２の蛍光部位Ｆ２に由来する発光点Ｓ２の数を数えている場合には、濃度算出部４は、一つの試料を基準として、発光点Ｓ２の数に応じて、複数の試料における生体分子Ｔの濃度を相対的に定量することもできる。

さらに、下記に示す、第１の蛍光部位Ｆ１に由来する発光点Ｓ１の数と、第２の蛍光部位Ｆ２に由来する発光点Ｓ２の数の和に対する、第２の蛍光部位Ｆ２に由来する発光点Ｓ２の数の割合は、試料中の生体分子Ｔの濃度を反映したものである。

試料中の標識分子Ｍの濃度は、予め試料へ添加する際に所望の濃度に調製することができる。このため、試料中の標識分子Ｍの濃度と、上記割合とに基づいて、試料中の生体分子Ｔの濃度を算出することができる。

また、同じ領域Ｒから２種類の発光点Ｓ１，Ｓ２を数える場合、同一体積に含まれる、生体分子Ｔと結合していない標識分子Ｍの数と、生体分子Ｔと結合した標識分子Ｍの数と、を容易に数えることができる。従って、上記割合をより正確に求めることができる。

上述した本実施形態に係る濃度測定装置による生体分子の濃度測定方法では、標識分子のみを用いて、試料中の生体分子の濃度を算出することができる。このため、複数の試薬を用いる必要がない。また、呈色反応も不要であるため、従来の濃度の算出方法に比べて、短時間で簡便に行うことができる。

また、上記濃度測定方法では、生体分子と結合した標識分子と、生体分子と結合していない標識分子と、を発光波長に基づいて区別できるため、従来のＥＬＩＳＡ法等で必要な試料の洗浄工程が不要である。このため、生体分子の濃度の測定をより簡便に行うことができる。

従来のＥＬＩＳＡ法などでは、標準品を用いて希釈系列を作製して、検量線を求める工程が必要であった。しかし、上記濃度測定方法では、生体分子と結合した標識分子に由来する発光点の割合と、試料中の標識分子の濃度に基づき、試料中の生体分子の濃度を算出することができる。このため、より簡便に生体分子の濃度を測定することができる。

３．本開示の第２実施形態に係る濃度測定装置
図６は、本開示の第２実施形態に係る濃度測定装置Ｄ２の構成の概要を示す模式図である。濃度測定装置Ｄ２の光照射部１ｂは、励起光Ｌ１２として、エバネッセント光を試料に照射するための構成を有する。なお、第１実施形態に係る濃度測定装置Ｄ１と同一の構成については同一の符号を付し、その説明は省略する。

光照射部１ｂは、エバネッセント光を試料中の標識分子Ｍに照射できるように構成されていればよく、その構成は公知の顕微鏡等の構成から適宜採用できる。例えば、濃度測定装置Ｄ２において、光照射部１ｂにミラー１４が設けられていてもよい。

ミラー１４は、光源１１から出射された励起光Ｌ１１を、基板Ｐの試料接触面Ｐ１において全反射させる角度に備えられている。励起光Ｌ１１を試料接触面Ｐ１において全反射させることにより、標識分子Ｍを含む試料に照射される励起光Ｌ１２をエバネッセント光とすることができる。エバネッセント光は、試料の限定された領域にのみ照射されるため、検出部２ａは、発光Ｌ２２を背景光の少ない状態で検出することができる。

第２実施形態に係る濃度測定装置においては、励起光としてエバネッセント光を利用することができる。このため、より高解像度に標識分子に由来する発光を検出することができ、発光点の計数をより精度高く行うことができる。従って、濃度測定装置における濃度の測定の精度をより高めることができる。

また、エバネッセント光を用いる場合は、上述した基板Ｐにおいては、エバネッセント光の到達が基板Ｐ近傍に限定されるため、基板Ｐの面積を決定すれば、体積を算出することができるため、単位体積当たりの分子数を算出することも可能である。この他、第２実施形態に係る濃度測定装置における効果は、上述した第１実施形態に係る濃度測定装置と同様である。

４．本開示の第３実施形態に係る濃度測定装置
図７は、本開示の第３実施形態に係る濃度測定装置Ｄ３の構成の概要を示す模式図である。濃度測定装置Ｄ３の検出部２ｃには、発光Ｌ２１の光子を受光する２つの受光器２７ａ，２７ｂを有する。この他、検出部２ｃは、２つの受光器２７ａ，２７ｂへ導光するための構成として、ダイクロイックミラー２４、バンドパスフィルタ２５及びハーフミラー２６を有する。ハーフミラー２６は、透過率と反射率が各々５０％のものである。また、２つの受光器２７ａ，２７ｂは、ハーフミラー２６から同じ距離に設置されている。さらに、濃度測定装置Ｄ３には、必要に応じて、偏光ビームスプリッタ２８等が設けられていてもよい。

濃度測定装置Ｄ３において、光照射部１ｃには、光源１１ｃとして、励起光Ｌ１１を試料へパルス照射するためのレーザー光源が備えられている。この他、第１実施形態に係る濃度測定装置Ｄ１と同一の構成については同一の符号を付し、その説明は省略する。

本実施形態の濃度測定装置Ｄ３では、励起光Ｌ１１によって標識分子Ｍから発せられた発光Ｌ２１について、ダイクロイックミラー２４とバンドパスフィルタ２５によって励起光Ｌ１１を除いて、ハーフミラー２６へ導光する。発光Ｌ２１に含まれる光子が、標識分子Ｍの蛍光部位Ｆ１，Ｆ２のうち、一つの蛍光部位に由来していれば、単一光子であるため、ハーフミラー２６において分離することができない。このため、２台の受光器２７ａ，２７ｂのうち、いずれか一方が光子を検出する。

一方、発光Ｌ２１に含まれる光子が、例えば、複数の標識分子Ｍの各々の蛍光部位に由来していれば、単一光子ではないため、２つの受光器２７ａ，２７ｂの両方で光子が検出される。また、励起光Ｌ１１はパルス照射されているため、単一光子ではない場合、２台の受光器２７ａ，２７ｂは、同じタイミングで光子を検出することができる。このため、２台の受光器２７ａ，２７ｂにおいて、同時に光子を検出するか、又は交互に検出するかによって、発光Ｌ１２が一つの標識分子Ｍに由来するものであるか否か判定することができる。

本開示に係る濃度測定方法においては、発光点の数に基づき生体分子の濃度を測定している。このため、試料に含まれる標識分子の濃度によっては、複数の標識分子Ｍが近接して、２つの標識分子Ｍに由来する発光Ｌ２１を一つの発光点として検出するおそれがある。上述したように、本実施形態の濃度測定装置では、２台の受光器によって、発光点が一つの標識分子Ｍに由来するものであるか否か判定することができる。そこで、計数部が数える発光点について、予め単一光子に由来する発光点のみに限定することができる。この結果、発光点の数をより正確に数えることができ、濃度の測定をより精度高く行うことができる。

なお、上記に記載された効果はあくまで例示であって、限定されるものではなく、また他の効果があってもよい。

本開示は、以下のような構成もとることができる。
（１）第１の蛍光部位及び第２の蛍光部位を有し任意の生体分子に結合する標識分子を含む試料に励起光を照射する光照射部と、前記標識分子からの発光を検出する検出部と、前記試料中の前記検出部によって検出された発光点の数を数える計数部と、前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数と、前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数と、に基づき前記試料に含まれる前記任意の生体分子の濃度を算出する濃度算出部と、を有する生体分子の濃度測定装置。
（２）前記励起光を照射された前記標識分子は、前記任意の生体分子と結合していない場合には前記第１の蛍光部位から第１の蛍光を発し、前記任意の生体分子と結合している場合には前記第２の蛍光部位から第２の蛍光を発するもの、又は前記任意の生体分子と結合していない場合には前記第２の蛍光部位から第２の蛍光を発し、前記任意の生体分子と結合している場合には前記第１の蛍光部位から第１の蛍光を発するもの、である上記（１）に記載の生体分子の濃度測定装置。
（３）前記濃度算出部は前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数と前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数の和に対する前記任意の生体分子と結合している場合に蛍光を発する蛍光部位に由来する発光点の数の割合に基づき前記濃度を算出する上記（２）に記載の生体分子の濃度測定装置。
（４）前記計数部は任意の大きさの同一領域における前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数及び前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数を数える上記（２）又は（３）に記載の生体分子の濃度測定装置。
（５）前記任意の生体分子と結合した前記標識分子へ前記励起光が照射されると、前記第１の蛍光部位から前記第２の蛍光部位、又は前記第２の蛍光部位から前記第１の蛍光部位へ励起エネルギーが与えられる上記（１）〜（４）のいずれかに記載の生体分子の濃度測定装置。
（６）前記任意の生体分子と結合していない前記標識分子へ前記励起光が照射されると、前記第１の蛍光部位から前記第２の蛍光部位、又は前記第２の蛍光部位から前記第１の蛍光部位へ励起エネルギーが与えられる上記（１）〜（４）のいずれかに記載の生体分子の濃度測定装置。
（７）前記励起光がエバネッセント光である上記（１）〜（６）のいずれかに記載の生体分子の濃度測定装置。
（８）前記試料は基板上に保持されている上記（１）〜（７）いずれかに記載の生体分子の濃度測定装置。
（９）第１の蛍光部位及び第２の蛍光部位を有し任意の生体分子に結合する標識分子を含む試料に励起光を照射する光照射工程と、前記標識分子からの発光を検出する検出工程と、前記試料中の前記検出工程によって検出された発光点の数を数える計数工程と、前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数と、前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数と、に基づき前記試料に含まれる前記任意の生体分子の濃度を算出する濃度算出工程と、を有する生体分子の濃度測定方法。
（１０）前記光照射工程の前に前記試料を基板上に保持させて濃縮する濃縮工程を有する上記（９）に記載の生体分子の濃度測定方法。

Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３：生体分子の濃度測定装置（濃度測定装置）
Ｂ：結合部位
Ｆ１：第１の蛍光部位
Ｆ２：第２の蛍光部位
Ｌ１１，Ｌ１２：励起光
Ｌ２１，Ｌ２１１，Ｌ２１２，Ｌ２２：発光
Ｍ，Ｍ１，Ｍ２：標識分子
Ｒ：領域
Ｐ：基板
Ｐ１：試料接触面
Ｓ１，Ｓ２：発光点
Ｔ：生体分子
１ａ，１ｂ，１ｃ：光照射部
１１，１１ｃ：光源
１２：集光レンズ
１３：絞り
１４：ミラー
２ａ，２ｃ：検出部
２１：検出器
２２：対物レンズ
２３：蛍光フィルタ
２４：ダイクロイックミラー
２５：バンドパスフィルタ
２６：ハーフミラー
２７ａ，２７ｂ：受光器
２８：偏光ビームスプリッタ
３：計数部
４：濃度算出部

Claims (10)

1. 第１の蛍光部位及び第２の蛍光部位を有し任意の生体分子に結合する標識分子を含む試料に励起光を照射する光照射部と、
   前記標識分子からの発光を検出する検出部と、
   前記試料中の前記検出部によって検出された発光点の数を数える計数部と、
   前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数と、前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数と、に基づき前記試料に含まれる前記任意の生体分子の濃度を算出する濃度算出部と、
   を有する生体分子の濃度測定装置。
2. 前記励起光を照射された前記標識分子は、前記任意の生体分子と結合していない場合には前記第１の蛍光部位から第１の蛍光を発し、前記任意の生体分子と結合している場合には前記第２の蛍光部位から第２の蛍光を発するもの、又は前記任意の生体分子と結合していない場合には前記第２の蛍光部位から第２の蛍光を発し、前記任意の生体分子と結合している場合には前記第１の蛍光部位から第１の蛍光を発するもの、である
   請求項１に記載の生体分子の濃度測定装置。
3. 前記濃度算出部は前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数と前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数の和に対する前記任意の生体分子と結合している場合に蛍光を発する蛍光部位に由来する発光点の数の割合に基づき前記濃度を算出する
   請求項２に記載の生体分子の濃度測定装置。
4. 前記計数部は任意の大きさの同一領域における前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数及び前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数を数える
   請求項３に記載の生体分子の濃度測定装置。
5. 前記任意の生体分子と結合した前記標識分子へ前記励起光が照射されると、前記第１の蛍光部位から前記第２の蛍光部位、又は前記第２の蛍光部位から前記第１の蛍光部位へ励起エネルギーが与えられる
   請求項１に記載の生体分子の濃度測定装置。
6. 前記任意の生体分子と結合していない前記標識分子へ前記励起光が照射されると、前記第１の蛍光部位から前記第２の蛍光部位、又は前記第２の蛍光部位から前記第１の蛍光部位へ励起エネルギーが与えられる
   請求項１に記載の生体分子の濃度測定装置。
7. 前記励起光がエバネッセント光である
   請求項１に記載の生体分子の濃度測定装置。
8. 前記試料は基板上に保持されている
   請求項１に記載の生体分子の濃度測定装置。
9. 第１の蛍光部位及び第２の蛍光部位を有し任意の生体分子に結合する標識分子を含む試料に励起光を照射する光照射工程と、
   前記標識分子からの発光を検出する検出工程と、
   前記試料中の前記検出工程によって検出された発光点の数を数える計数工程と、
   前記第１の蛍光部位に由来する発光点の数と、前記第２の蛍光部位に由来する発光点の数と、に基づき前記試料に含まれる前記任意の生体分子の濃度を算出する濃度算出工程と、
   を有する生体分子の濃度測定方法。
10. 前記光照射工程の前に前記試料を基板上に保持させて濃縮する濃縮工程を有する
    請求項９に記載の生体分子の濃度測定方法。
    

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