JP4885019B2 - 表面プラズモン増強蛍光センサ - Google Patents

Description

本発明は、蛍光法により試料中の特定物質を検出する蛍光センサ、特に詳細には表面プラズモン増強を利用した蛍光センサに関するものである。

従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光法が広く用いられている。この蛍光法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。また、検出対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光体で標識されて検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広くなされている。

図２は、上記の標識された物質を用いる蛍光法を実施するセンサの一例を概略図示するものである。本例の蛍光センサは一例として試料１に含まれる抗原２を検出するためのものであり、基板３には抗原２と特異的に結合する１次抗体４が塗布されている。そしてこの基板３上に設けられた試料保持部５の中において試料１が流され、次いで同様に蛍光体１０で標識されて抗原２と特異的に結合する２次抗体６が流される。その後、基板３の表面部分に向けて光源７から励起光８が照射され、また光検出器９により蛍光検出がなされる。このとき、光検出器９によって所定の蛍光が検出されたなら、上記２次抗体６と抗原２との結合、すなわち試料中における抗原２の存在を確認できることになる。

なお以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは２次抗体６であるが、この２次抗体６は抗原２と結合しなければ流されてしまって基板３上に存在し得ないものであるから、この２次抗体６の存在を確認することにより、間接的に検出対象物質である抗原２の存在が確認されることとなる。

とりわけここ数年は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化が進んでいることもあって、以上述べた蛍光法はバイオ研究には欠かせない手段となっており、さらにバイオ以外の分野においても広範に利用されている。特に可視領域では、例えばＦＩＴＣ（蛍光波長：５２５ｎｍ、量子収率：０．６）や、Ｃｙ５（蛍光波長：６８０ｎｍ、量子収率：０．３）のように、実用の目安となる０．２を超える高い量子収率を持つ蛍光色素が開発されており、蛍光法の応用分野がさらに拡大することが期待されている。

しかしながら、図２に示したような従来の蛍光センサでは、基板と試料との界面における励起光の反射／散乱光や、検出対象物質以外の不純物／浮遊物Ｍ等による散乱光がノイズとなるため、せっかく光検出器を高性能化しても蛍光検出におけるＳ／Ｎは向上しないのが実情であった。

これに対する解決法として、従来、エバネッセント波を用いる蛍光法が提案されている。この方法を実施する蛍光センサの一例を図３に概略的に示す。なおこの図３において、図２中の要素と同等の要素には同番号を付し、それらについての説明は特に必要のない限り省略する（以下、同様）。

この蛍光センサにおいては、前述の基板３に代わるものとしてプリズム（誘電体ブロック）１３が用いられ、その上には金属膜２０が形成されている。そして光源７からの励起光８が、このプリズム１３と金属膜２０との界面で全反射する条件で、プリズム１３を通して照射される。この構成においては、励起光８が上記界面で全反射するとき該界面近傍に染み出すエバネッセント波１１により２次抗体６が励起される。そして蛍光検出は、試料１に対してプリズム１３と反対側（図中では上方）に配された光検出器９によってなされる。

この蛍光センサにおいて、励起光８は図中の下方に全反射するので、上方からの蛍光を検出するに当たり、励起光検出成分が蛍光検出信号に対するバック・グラウンドとなってしまうことがない。またエバネッセント波１１は上記界面から数百ｎｍの領域にしか到達しないので、試料中の不純物／浮遊物Ｍからの散乱を殆ど無くすことができる。そのため、このエバネッセント蛍光法は、従来の蛍光法と比べて（光）ノイズを大幅に低減でき、検出対象物質を１分子単位で蛍光測定できる方法として注目されている。

なお図３に示したものは、エバネッセント蛍光法による蛍光センサの中でも、特に高感度化を図った表面プラズモン増強蛍光センサである。この表面プラズモン増強蛍光センサにおいては金属膜２０が形成されていることにより、励起光８が照射されたとき該金属膜２０中に表面プラズモンが生じ、その電界増幅作用によって蛍光が増幅されるようになる。あるシミュレーションによると、その場合の蛍光強度は１０００倍程度まで増幅されることが判っている。この種の表面プラズモン増強蛍光センサについては、例えば特許文献１や特許文献２に詳しい記載がなされている。

なお、上記の表面プラズモン増強蛍光センサにおいては、非特許文献１に示されているように、試料中の蛍光体と金属膜とが接近し過ぎていると、蛍光体内で励起されたエネルギーが蛍光を発生させる前に金属膜へ遷移してしまい、蛍光が生じないという現象（いわゆる金属消光）が起こり得る。この金属消光に対処するために上記非特許文献１には、金属膜の上にＳＡＭ（自己組織化膜）を形成し、それにより試料中の蛍光体と金属膜とを該ＳＡＭの厚さ以上離間させることが提案されている。なお図３でも、このＳＡＭに番号２１を付けて示してある。
特許第３５６２９１２号公報 特開平１０−７８３９０号公報 W.Knoll他、Analytical Chemistry（Anal.Chem.）75(2003) p.2610

上に説明した表面プラズモン増強蛍光センサは、表面プラズモンによる電界増幅作用によって蛍光が増幅され、検出対象物質の存在を示す蛍光を高Ｓ／Ｎで検出可能となっているが、金属膜の存在による新たな問題も認められる。すなわち、非常に薄く形成されるこの種の金属膜は、厚さや組成、表面粗さ等に個体差、面内のばらつきが生じやすくなっており、そのため、この個体差に起因して蛍光検出量が変動し、それが定量的な測定値の精度低下を招いている。

本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、金属膜の個体差に拘わらず、検出対象物質を精度良く定量分析することができる表面プラズモン増強蛍光センサを提供することを目的とする。

本発明による表面プラズモン増強蛍光センサは、検出対象以外の蛍光の他に、基準蛍光発生用の蛍光体が発した基準蛍光を検出するようにし、その基準蛍光に基づいて検出対象の蛍光強度を規格化するようにしたものであり、より具体的には、
所定波長λ₁の励起光を発する光源と、
前記励起光を透過させる材料から形成された誘電体ブロックと、
この誘電体ブロックの一表面に形成された金属膜と、
この金属膜の近傍位置に試料を保持する試料保持部と、
前記励起光を、前記誘電体ブロックと金属膜との界面に向けて、全反射条件を満たすように誘電体ブロックを通して入射させる入射光学系と、
前記界面に前記励起光が入射したとき、該界面から染み出すエバネッセント波に励起されて、前記試料中に含まれる物質が発した波長λ₂の蛍光を検出する測定用蛍光検出手段とを備えてなる表面プラズモン増強蛍光センサにおいて、
前記励起光によって励起される位置に配された、前記物質とは異なる蛍光体と、
前記蛍光体が発した波長λ₃（λ₃≠λ₂）の基準蛍光を検出する基準蛍光検出手段と、
この基準蛍光検出手段が検出した基準蛍光の強度に基づいて、前記測定用蛍光検出手段が検出した蛍光強度を規格化する演算手段とを備えたことを特徴とするものである。

なお上記蛍光体は、誘電体ブロックと金属膜との界面に入射する前の励起光によって励起される位置に配設されてもよいし、あるいは、この界面から出射した励起光のエバネッセント波によって励起される位置に配設されてもよい。

また、上記構成の本発明による表面プラズモン増強蛍光センサにおいては、
前記測定用蛍光検出手段および基準蛍光検出手段として共通の光検出手段が用いられた上で、
波長λ₂の蛍光を通過させる一方波長λ₃の基準蛍光は遮断する第１のフィルタと、
波長λ₂の蛍光を遮断する一方波長λ₃の基準蛍光は通過させる第２のフィルタと、
前記第１のフィルタおよび第２のフィルタのうちの一方のみを選択的に前記共通の光検出手段の前段に配置可能なフィルタ切替手段とが設けられていることが望ましい。

あるいは、前記測定用蛍光検出手段および基準蛍光検出手段として互いに別個の光検出手段が用いられた上で、
波長λ₂の蛍光は前記測定用蛍光検出手段に向けて、波長λ₃の基準蛍光は前記基準蛍光検出手段に向けて各々進行させる光学素子が設けられてもよい。

一方、波長λ₃の基準蛍光を得るためには例えば、金属膜の表面に、試料中の特定物質と結合する物質が固定され、この物質に前記蛍光体が固定されている構成を採用することができる。そのように試料中の特定物質と結合する物質としては、例えば試料中の抗原と結合する抗体が挙げられる。

あるいは、波長λ₃の基準蛍光を得る上で、前記誘電体ブロックの一部に前記蛍光体が固定されている構成も好適に採用することができる。

また、前記金属膜の表面に、疎水性材料からなる不撓性膜などの膜が形成され、この膜に前記蛍光体が固定されている構成も好適に採用することができる。

さらには、波長λ₃の基準蛍光を発する蛍光体は、例えば液体状の試料中に混合させておくようにしてもよい。

また、本発明の表面プラズモン増強蛍光センサにおいては、前記蛍光体の多光子吸収によって発光した蛍光を基準蛍光として用いてもよい。

本発明の表面プラズモン増強蛍光センサにおいては、励起光に励起された蛍光体が発した基準蛍光を検出し、この基準蛍光の強度に基づいて、測定用蛍光検出手段が検出した蛍光強度を規格化するように構成されているので、金属膜に厚さや組成、表面粗さ等の個体差・面内ばらつきが有ったとしても、規格化された蛍光強度はその個体差をキャンセルして、試料中に含まれる測定対象物質の量を高精度で示すものとなる。

このように、金属膜の個体差を許容して測定対象物質を定量的に検出できれば、誘電体ブロックおよび金属膜の部分を安価な使い捨ての形態として、家庭用の簡易分析装置などを構成することも容易となる。

また、特に金属膜の表面に疎水性材料からなる不撓性膜が形成され、この不撓性膜に前記蛍光体が固定されている場合は、試料液中の蛍光体が金属膜に対して、金属消光が起きる程度まで近接してしまうことが防止される。そこでこの場合は前述のような金属消光を招くことがなくなり、表面プラズモンによる電場増幅作用を確実に得て、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。

また、特に不撓性膜が疎水性材料から形成されていれば、試料液中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる分子が該不撓性膜の内部にまで入り込むことが無く、よってそれらの分子が励起光の励起エネルギーを奪ってしまうことが防止される。そこでこの場合は、極めて高い励起エネルギーが確保され、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。

なお、上記の「不撓性」とは、センサを普通に使用しているうちに膜厚が変わってしまうほどに変形することが無い程度の剛性を備えていることを意味するものとする。

また、本発明の表面プラズモン増強蛍光センサにおいて、基準となる蛍光体が増強場にある場合は、多光子吸収により生じたアップコンバージョン蛍光を基準蛍光として検出できるものとなる。そこでこの表面プラズモン増強蛍光センサによれば、本来の検出対象蛍光との波長差が大きい基準蛍光を検出することになり、双方の蛍光を明確に区別して精度良く検出可能となる。

以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。

図１は、本発明の第１の実施形態による表面プラズモン増強蛍光センサ（以下、単に蛍光センサという）を示す概略側面図である。図示されている通りこの蛍光センサは、例えば波長λ₁＝６３５ｎｍの励起光８を発する半導体レーザ等の光源７と、上記励起光８を透過させる材料からなり、この励起光８が上端面から入射する位置に配されたロッド状の誘電体ブロック２２と、この誘電体ブロック２２の一表面２２ａに形成された金属膜２０と、この金属膜２０の上に形成されたポリマーからなる不撓性膜３１と、不撓性膜３１に液体状試料１が接するように該試料１を保持する透明部材製の試料保持部５と、この試料保持部５内に誘電体ブロック２２を保持するチャック２３とを有している。

またこの蛍光センサは、試料保持部５の下方位置において金属膜２０と向い合う状態に配された光検出器９と、この光検出器９と試料保持部５との間に配置された集光レンズ２４と、保持部材２５に保持された第１フィルタ２６および第２フィルタ２７と、上記保持部材２５を図中左右方向に移動させるアクチュエータ２８と、光検出器９の出力を受ける演算回路２９とを備えている。

なお本実施形態では光源７が、励起光８を、誘電体ブロック２２と金属膜２０との界面に向けて、全反射条件を満たすように誘電体ブロック２２を通して入射可能に配置されている。つまりこの光源７自体が、誘電体ブロック２２に対して励起光８を上述のように入射させる入射光学系を構成している。しかしこのような構成に限らず、励起光８を上述のように入射させるレンズやミラーなどからなる入射光学系を、光源７とは別途設けても構わない。

誘電体ブロック２２は一例として、日本ゼオン株式会社製 ZEONEX（登録商標） 330Ｒ（屈折率1.50）からなるものである。一方金属膜２０は、誘電体ブロック２２の一表面２２ａ上に金をスパッタして形成されたものであり、膜厚は５０ｎｍとされている。また不撓性膜３１は、金属膜２０の上に屈折率1.59のポリスチレン系ポリマーをスピンコートして形成されたものであり、膜厚は２０ｎｍとされている。

なお、誘電体ブロック２２は上記材料の他、公知の樹脂や光学ガラスを用いて適宜形成することができる。コストの点からは、光学ガラスよりも樹脂の方がより好ましいと言える。樹脂から形成する場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネイト（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を好適に用いることができる。

この蛍光センサが検出対象としているのは、一例としてCRP抗原２（分子量11万 Da）であり、それと特異的に結合する１次抗体（モノクロナール抗体）４が上記不撓性膜３１の上に固定されている。この１次抗体４は、例えば末端をカルボキシル基化したPEGを介して、アミンカップリング法により、上記ポリマーからなる不撓性膜３１に固定される。またこの１次抗体４には、前記波長λ₁＝６７０ｎｍの励起光８により励起されてピーク波長λ₃＝７８０ｎｍの蛍光（基準蛍光）Ｆ₃を発する蛍光色素３２が固定されている。なおより具体的にこの蛍光色素３２としては、Cy7が適用されている。

蛍光検出を行う際には、試料１の中に２次抗体６が混合される。この２次抗体６としては、例えばローダミンＢ等の蛍光体１０で標識化したモノクロナール抗体（１次抗体４とはエピトープ ＜epitope;抗原決定基＞が異なる）が用いられる。蛍光体１０は、波長λ₁＝６７０ｎｍの励起光８により励起されてピーク波長λ₂＝７２０ｎｍの蛍光Ｆ₂を発するものである（Alexa700）。

上記アミンカップリング法は一例として下記（１）〜（３）のステップからなるものである。なおこれは、30μｌ（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例である。

（１）リンカー先端（末端）の-COOH基を活性化
０.１Ｍ（モル）のNHSと０.４ＭのEDCとを等体積混合した溶液を30μｌ加え、３０分間室温静置。なお、
NHS：N-hydrooxysuccinimide
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
である。
（２）1次抗体４の固定化
PBSバッファ（pH7.4）で5回洗浄後、1次抗体溶液（500μg/ｍｌ）を30μｌ加え、３０〜６０分間室温静置
（３）未反応の -COOH基をブロッキング
PBSバッフア（pH7.4）で5回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（pH8.5）を30μｌ加え、20分間室温静置。さらにPBSバッフア（pH7.4）で5回洗浄。

なお光源７としては上記半導体レーザに限らず、その他の公知の光源を適宜選択使用可能である。また光検出器９も上述のものに限らず、CCD、PD（フォトダイオード）、光電子増倍管、c-MOS等の公知のものを適宜選択使用可能である。また励起波長を変えれば、ローダミンＢ以外の色素を標識として用いることもできる。

光検出器９としては、前述したピーク波長λ₂＝７２０ｎｍの蛍光Ｆ₂も、またピーク波長λ₃＝７８０ｎｍの基準蛍光Ｆ₃も検出可能である、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）が用いられている。つまりこの光検出器９は、測定用蛍光検出手段と基準蛍光検出手段とを兼ねるものである。

保持部材２５に保持された第１フィルタ２６は、７２０±１０ｎｍの波長域の蛍光Ｆ₂を通過させる一方、７８０±１０ｎｍの波長域の基準蛍光Ｆ₃は遮断する通過特性のものである。それと反対に第２フィルタ２７は、基準蛍光Ｆ₃を通過させる一方、蛍光Ｆ₂は遮断する通過特性のものである。

以下、この蛍光センサの作用を、一例として試料１に含まれるCRP抗原２を定量分析する場合について説明する。まず試料保持部５の中において液体状の試料１が流され、次いで同様に蛍光体１０で標識されてCRP抗原２と特異的に結合する２次抗体６が流される。なお、このように試料１を流すことはしないで、試料保持部５の中に液体状の試料１を貯えた状態で蛍光検出を行ってもよいし、さらには、図１の試料保持部５は省いた上で、別の槽において誘電体ブロック２２の不撓性膜３１の部分を液体状試料１、２次抗体６に順次接触させ、その後図１に示す蛍光検出系に該誘電体ブロック２２をセットして測定を行うようにしてもよい。

蛍光検出するに当たっては、まずアクチュエータ２８が駆動されて、第２フィルタ２７が集光レンズ２４と向い合う位置に配される。次に誘電体ブロック２２に向けて光源７から波長λ₁＝６７０ｎｍの励起光８が照射されると、その励起光８の一部は誘電体ブロック２２と金属膜２０との界面に全反射条件を満たして入射し、該界面から同波長のエバネッセント波が染み出すようになる。そこで、１次抗体４に結合している蛍光色素３２がこのエバネッセント波に励起されて、ピーク波長λ₃＝７８０ｎｍ の基準蛍光Ｆ₃を発するようになる。

なお、不撓性膜３１の近傍に２次抗体６が存在していると、その標識である蛍光体１０も上記エバネッセント波に励起されてピーク波長λ₂＝７２０ｎｍの蛍光Ｆ₂を発することになるが、第２フィルタ２７が上述のように配置されていることにより、光検出器９は基準蛍光Ｆ₃のみを検出する。光検出器９からは基準蛍光Ｆ₃の強度を示す基準信号Ｐ₃が出力され、該信号Ｐ₃は演算回路２９の内部メモリに一旦記憶される。

次にアクチュエータ２８が駆動されて、第１フィルタ２６が集光レンズ２４と向い合う位置に配される。このとき、もし１次抗体４にCRP抗原２が結合していれば、さらに該抗原２に２次抗体６が結合し、その２次抗体６の標識である蛍光体１０が上記エバネッセント波によって励起されることとなる。こうして励起された蛍光体１０はピーク波長λ₂＝７２０ｎｍの蛍光Ｆ₂を発し、その蛍光Ｆ₂が光検出器９によって検出される。なお、このとき、蛍光色素３２から発せられたピーク波長λ₃＝７８０ｎｍの基準蛍光Ｆ₃は第１フィルタ２６によって遮断されるので、光検出器９によって検出されることはない。

光検出器９からは上記蛍光Ｆ₂の強度を示す信号Ｐ₂が出力され、この信号Ｐ₂も演算回路２９に入力される。演算回路２９はこの信号Ｐ₂と、先に記憶した基準信号Ｐ₃からＰ＝Ｐ₂／Ｐ₃なる演算を行い、演算後の信号Ｐを規格化蛍光強度信号として出力する。

先に述べたように、金属膜２０には厚さや組成、表面粗さ等の個体差が生じることがあり、そうであると、その個体差に応じて蛍光強度信号Ｐ₂が変動してしまう。蛍光強度信号Ｐ₂は本来、励起された蛍光体１０の量つまりは１次抗体４に結合しているCRP抗原２の量に対応した値を示すものであって、それによりCRP抗原２を定量分析することが可能となるが、金属膜２０の個体差に応じて蛍光強度信号Ｐ₂が変動すると、定量分析の精度が損なわれてしまう。しかし本実施形態では、Ｐ＝Ｐ₂／Ｐ₃なる規格化演算を行っているので、その結果得られた規格化蛍光強度信号Ｐは金属膜２０の個体差をキャンセルして、CRP抗原２の量を正確に示すものとなり得る。

上述のように、金属膜２０の個体差をある程度許容して高精度で定量分析できれば、誘電体ブロック２２および金属膜２０の部分を安価な使い捨ての形態として、家庭用の簡易分析装置などを構成することも容易となる。

なお上記エバネッセント波は、誘電体ブロック２２と金属膜２０との界面から数百ｎｍ程度の領域にしか到達しない。そこで、試料１中の不純物／浮遊物からの散乱を略皆無とすることができる。それに加えてこの蛍光センサにおいて、誘電体ブロック２２中の不純物等で散乱した光（これは通常の伝搬光である）は金属膜２０で遮断され、光検出器９に到達することがない。以上によりこの蛍光センサにおいては、光ノイズを殆ど皆無までに低減することができ、極めて高Ｓ／Ｎの蛍光検出が可能となる。

さらに本実施形態の蛍光センサにおいては、金属膜２０の上に膜厚が２０ｎｍの不撓性膜３１が設けられているので、試料１中の蛍光体１０が金属膜２０に対して、金属消光が起きる程度まで近接してしまうことが防止される。そこでこの蛍光センサによれば、上述のような金属消光を招くことがなくなり、表面プラズモンによる電場増幅作用を確実に得て、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。

そして上記不撓性膜３１は疎水性材料であるポリスチレン系ポリマーから形成されているので、液体状の試料１中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる分子が該不撓性膜３１の内部に入り込むことが無く、よってそれらの分子が励起光８の励起エネルギーを奪ってしまうことが防止される。そこでこの蛍光センサによれば、極めて高い励起エネルギーが確保され、極めて高い感度で蛍光を検出可能となる。

なお、この蛍光センサにおいて、CRP抗原２と結合しないで不撓性膜３１の表面から離れている２次抗体６は、そこまでエバネッセント波が届かないので蛍光を発することがない。そこで、試料１中でそのような２次抗体６が浮遊していても測定上問題が無いので、測定毎に洗浄つまりＢ／Ｆ分離（バウンド／フリー分離）を行う必要もない。

次に図４を参照して、本発明の第２の実施形態について説明する。本実施形態の蛍光センサは図１に示したものと比べると、基準信号Ｐ₃を発する蛍光体が配設された位置が異なるものである。すなわち本実施形態においては、誘電体ブロック２２の金属膜２０が固定される表面２２ａに近い部分が、蛍光体４０から形成されている。

この構成においては、蛍光体４０が波長λ₁の励起光８により励起されて、波長λ₃の基準蛍光Ｆ₃を発する。この基準蛍光Ｆ₃は、金属膜２０および不撓性膜３１を透過して光検出器９によって検出され、第１実施形態におけるのと同様の規格化に利用される。なお、上述のように誘電体ブロック２２の一部に形成される蛍光体４０は、例えば２色成型等の方法によって形成することができる。

次に図５を参照して、本発明の第３の実施形態について説明する。本実施形態の蛍光センサは図１に示したものと比べると、基準信号Ｐ₃を発する蛍光体が配設された位置が異なるものである。すなわち本実施形態においては、金属膜２０の上に形成された不撓性膜３１ａ自体が蛍光体から形成されている。

この構成においては、波長λ₁の励起光８が誘電体ブロック２２と金属膜２０との界面に向けて照射されると、該界面から同波長のエバネッセント波が染み出すようになる。そこで、蛍光体からなる不撓性膜３１ａがこのエバネッセント波によりに励起されて、波長λ₃の基準蛍光Ｆ₃を発する。この基準蛍光Ｆ₃は光検出器９によって検出され、第１実施形態におけるのと同様の規格化に利用される。

本実施形態においては、第１の実施形態と同様に例えば励起光波長λ₁を６７０ｎｍとし、２次抗体６をローダミンＢ等で標識化してそこからピーク波長λ₂＝７２０ｎｍの蛍光Ｆ₂を発生させる一方、不撓性膜３１ａからピーク波長λ₃＝７８０ｎｍの基準蛍光Ｆ₃を発生させることができる。

次に図６を参照して、本発明の第４の実施形態について説明する。本実施形態の蛍光センサは図１に示したものと比べると、光源７に出力可変回路４１が接続されて、該光源７の出力がＥ１，Ｅ２の２通りに変えられるようになっている点が基本的に異なる。また光源７としては、波長λ₁＝７８５ｎｍの励起光８を発するものが用いられている。一方、１次抗体４を標識化する蛍光体３２には、例えばFITC が適用されている。

この蛍光センサにおいて、規格化データを得るに当たっては、光源７の励起光出力がＥ１よりも高いＥ２に設定される。それにより蛍光体３２が２光子吸収を起こし、波長７８５／２＝３９３ｎｍの励起光で励起された場合と同様に励起されて、波長λ₃＝５２０ｎｍの基準蛍光Ｆ₃を発する。一方、通常の蛍光検出に際しては光源７の励起光出力がＥ１に設定される。この低い出力Ｅ1に設定されたとき、２次抗体６に結合している蛍光色素（IRDye800CW）１０は波長λ₁＝７８５ｎｍの励起光８で励起されて、ピーク波長λ₂＝７９０ｎｍの蛍光Ｆ₂を発する。このように波長λ₂とλ₃の値が大きく離れていれば、第１フィルタ２６および第２フィルタ２７として通過特性がさほど急峻ではないものを適用しても、蛍光Ｆ₂と基準蛍光λ₃とを明確に区別して検出可能となる。

このように２光子励起によって基準蛍光Ｆ₃を発生させる場合の規格化蛍光強度信号Ｐは、例えば蛍光Ｆ₂、基準蛍光Ｆ₃の強度を示す信号をそれぞれＰ₂、Ｐ₃とすると、Ｐ＝Ｐ₂／（Ｐ₃）^0.25として求められる。

なお、２光子吸収を起こす必要がある蛍光体３２は、１次抗体４に固定されて金属膜２０と非常に近い位置に存在すると、金属消光のために蛍光を発しない可能性もある。そこで不撓性膜３１は、この蛍光体３２を金属膜２０から十分に離間させるために、１０〜２０ｎｍ程度の厚さを有するSiO₂やポリマーなどの膜とすることが望ましい。

また、以上説明した構成とは逆に、２次抗体６に結合させる蛍光色素１０としてFITCを適用する一方、１次抗体４を標識化する蛍光体３２としてIRDye800CWを適用すれば、表面プラズモンによる電場増幅作用が２次抗体６の位置で非常に大きくなることを利用して、励起光出力Ｅ１、Ｅ２の切り替えをしなくても、蛍光色素１０のみで２光子励起が起きるようにすることができる。すなわち上記電場増幅作用について詳しく説明すると、一例として金属膜２０として厚さ５０ｎｍの金膜を用い、その表面に厚さ１ｎｍのＳＡＭ（自己組織化膜）を形成した場合、金属膜表面から大略３５ｎｍ以上離れた位置から２次抗体６が存在するようになるが、本発明者のシミュレーションによると、表面プラズモンにより増幅される電場はその２次抗体６が存在する位置近辺で最大となる。

次に図７を参照して、本発明の第５の実施形態について説明する。本実施形態の蛍光センサは図１に示したものと比べると、試料保持部５の下方に配設された蛍光検出系が異なるものである。すなわち本実施形態においては、試料保持部５の下方に回折格子５０が配置されるとともに、その側方に集光レンズ５３を介して２つの光検出器５１，５２が設けられている。

回折格子５０は、波長λ₂の蛍光Ｆ₂と波長λ₃の基準蛍光Ｆ₃とを互いに異なる回折角で反射回折させる。そして、それにより互いに異なる方向に進行する蛍光Ｆ₂と基準蛍光Ｆ₃はそれぞれ集光レンズ５３で集光された上で、蛍光Ｆ₂の波長域に感度を有する光検出器（測定用蛍光検出手段）５１と、基準蛍光Ｆ₃の波長域に感度を有する光検出器（基準蛍光検出手段）５２とによって受光される。このような構成においては、蛍光Ｆ₂の検出と基準蛍光Ｆ₃の検出とを同時に行うことができるので、蛍光検出の作業能率を高める上で有利である。

なおこのような蛍光検出系は、基準蛍光Ｆ₃を発生させる構成として図４〜６に示したような構成を用いる場合にも、同様に適用可能である。

なお、以上説明した各実施形態においては、基準蛍光Ｆ₃を発生させる蛍光体が装置の一部に固定されているが、そのような蛍光体は固定する他に、液体状試料の中に混合させて使用することも可能である。

本発明の第１実施形態による表面プラズモン増強蛍光センサを示す概略側面図 従来の蛍光センサの一例を示す概略側面図 従来の蛍光センサの別の例を示す概略側面図 本発明の第２実施形態による表面プラズモン増強蛍光センサを示す概略側面図 本発明の第３実施形態による表面プラズモン増強蛍光センサを示す概略側面図 本発明の第４実施形態による表面プラズモン増強蛍光センサを示す概略側面図 本発明の第５実施形態による表面プラズモン増強蛍光センサを示す概略側面図

符号の説明

１ 試料
２ 抗原
４ １次抗体
６ ２次抗体
７ 光源
８ 励起光
９ 光検出器
１０ 蛍光体
２０ 金属膜
２２ 誘電体ブロック
２４ 集光レンズ
２６ 第１フィルタ
２７ 第２フィルタ
２８ アクチュエータ
２９ 演算回路
３１、３１ａ 不撓性膜
３２ 蛍光色素
４０ 蛍光体
４１ 光源の出力可変回路
５０ 回折格子
５１ 光検出器（測定用蛍光検出手段）
５２ 光検出器（基準蛍光検出手段）
５３ 集光レンズ

Claims (4)

1. 所定波長λ₁の励起光を発する光源と、
   前記励起光を透過させる材料から形成された誘電体ブロックと、
   この誘電体ブロックの一表面に形成された金属膜と、
   この金属膜の近傍位置に試料を保持する試料保持部と、
   前記励起光を、前記誘電体ブロックと金属膜との界面に向けて、全反射条件を満たすように誘電体ブロックを通して入射させる入射光学系と、
   前記界面に前記励起光が入射したとき、該界面から染み出すエバネッセント波に励起されて、前記試料中に含まれる物質が発した波長λ₂の蛍光を検出する測定用蛍光検出手段とを備えてなる表面プラズモン増強蛍光センサにおいて、
   前記励起光によって励起される位置に配された、前記物質とは異なる蛍光体と、
   前記蛍光体が発した波長λ₃（λ₃≠λ₂）の基準蛍光を検出する基準蛍光検出手段と、
   この基準蛍光検出手段が検出した基準蛍光の強度に基づいて、前記測定用蛍光検出手段が検出した蛍光強度を規格化する演算手段とを備え
   前記金属膜の表面に疎水性材料からなる不撓性膜が形成され、この膜の上に前記蛍光体が固定されていることを特徴とする表面プラズモン増強蛍光センサ。
2. 前記測定用蛍光検出手段および基準蛍光検出手段として共通の光検出手段が用いられた上で、
   波長λ₂の蛍光を通過させる一方波長λ₃の基準蛍光は遮断する第１のフィルタと、
   波長λ₂の蛍光を遮断する一方波長λ₃の基準蛍光は通過させる第２のフィルタと、
   前記第１のフィルタおよび第２のフィルタのうちの一方のみを選択的に前記共通の光検出手段の前段に配置可能なフィルタ切替手段とが設けられたことを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン増強蛍光センサ。
3. 前記測定用蛍光検出手段および基準蛍光検出手段として互いに別個の光検出手段が用いられた上で、
   波長λ₂の蛍光は前記測定用蛍光検出手段に向けて、波長λ₃の基準蛍光は前記基準蛍光検出手段に向けて各々進行させる光学素子が設けられたことを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン増強蛍光センサ。
4. 前記蛍光体が多光子吸収によって発光した蛍光を基準蛍光として用いる構成を有することを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の表面プラズモン増強蛍光センサ。

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