JP5733151B2 - 計測を行う方法及び計測装置 - Google Patents

Description

本発明は、表面プラズモン励起蛍光分光法により計測を行う方法及び表面プラズモン励起蛍光分光法により計測を行う計測装置に関する。

誘電体媒体の内部を進行する励起光が金属膜と誘電体媒体との界面に全反射条件を満たして入射する場合は、界面からエバネッセント波がもれだし、金属膜の表面のプラズモンとエバネッセント波とが干渉する。界面への励起光の入射角が共鳴角に設定されプラズモンとエバネッセント波とが共鳴する場合にエバネッセント波の電場は著しく増強される。表面プラズモン励起蛍光分光法（ＳＰＦＳ）による計測においては、この増強された電場が用いられる。

ＳＰＦＳによる計測においては、金属膜の表面に抗原捕捉膜が形成され、抗原捕捉膜に抗原が捕捉され、捕捉された抗原に蛍光標識が付加される。増強された電場が蛍光標識を励起し、蛍光標識から蛍光が放射される。蛍光量が測定され、抗原の有無、抗原の濃度等が求められる。

特許文献１及び２の発明は、ＳＰＦＳによる計測の精度の向上を目的とする。特許文献１及び２の発明においては、散乱光量を用いて蛍光量が規格化される。

特開２００９−２１６５３２号公報 特開２００９−２４４０１８号公報

しかし、エバネッセント波の強度は、センサーチップ及び計測装置のばらつき及び経時変化により変化する。また、蛍光量の測定の精度は、計測装置のばらつき及び経時変化により変化する。このため、抗原の捕捉量が同じ場合でも、蛍光量の測定結果が異なる場合がある。このことは、センサーチップ及び計測装置のばらつき及び経時変化により、計測の精度及び感度が低下することを意味する。

本発明は、この問題を解決するためになされる。本発明の目的は、計測の精度及び感度を向上することである。

本発明の第１から第８までの局面は、表面プラズモン励起蛍光分光法により計測を行う方法に向けられる。

本発明の第１の局面においては、計測用のセンサーチップ、抗原を含む試料液、既知の濃度の蛍光標識を含む蛍光標識液及び蛍光量測定用の液体が準備される。センサーチップは、誘電体媒体、導電体膜、抗原捕捉膜及び流路形成物を備える。誘電体媒体は、入射面、反射面及び出射面を備える。励起光が入射面に入射し反射面に反射され出射面から出射するように入射面、反射面及び出射面が配置される。導電体膜は、第１の主面及び第２の主面を備える。反射面は第１の主面に密着し、抗原捕捉膜は第２の主面に定着する。流路形成物には流路が形成される。抗原捕捉膜は流路の内部に露出する。

計測用のセンサーチップの流路に試料液が満たされ、計測用のセンサーチップの抗原捕捉膜に抗原が捕捉させられる。

また、抗原が計測用のセンサーチップの抗原捕捉膜に捕捉させられた後に計測用のセンサーチップの流路に蛍光標識液が満たされる。

計測用のセンサーチップの流路に蛍光標識液が満たされた状態において、計測用のセンサーチップの入射面に励起光が入射させられ、計測用のセンサーチップの反射面に共鳴角で励起光が入射させられる。計測用のセンサーチップの流路に満たされる蛍光標識液に含まれる蛍光標識がエバネッセント波で励起される。蛍光標識液に含まれる蛍光標識から放射され計測用のセンサーチップから出射する蛍光の強度である基準蛍光量が測定される。

基準蛍光量が測定された後に計測用のセンサーチップの抗原捕捉膜に捕捉された抗原に蛍光標識が付加される。

蛍光標識が付加された後に計測用のセンサーチップの流路に蛍光量測定用の液体が満たされる。

計測用のセンサーチップの流路に蛍光量測定用の液体が満たされた状態において、計測用のセンサーチップの入射面に励起光が入射させられ、計測用のセンサーチップの反射面に共鳴角で励起光が入射させられる。計測用のセンサーチップの抗原捕捉膜に捕捉された抗原に付加された蛍光標識がエバネッセント波で励起される。計測用のセンサーチップから出射する蛍光量が測定される。

基準蛍光量を用いて蛍光量が規格化され、規格化された蛍光量が求められる。

本発明の第２の局面は、本発明の第１の局面にさらなる事項を付加する。本発明の第２の局面においては、抗原が捕捉された後に、蛍光標識液が満たされ、基準蛍光量が測定される。

本発明の第３の局面は、本発明の第１又は第２の局面にさらなる事項を付加する。本発明の第３の局面においては、規格化された蛍光量と試料液に含まれる抗原の濃度との対応を示す検量線が準備される。規格化された蛍光量に対応する試料液に含まれる抗原の濃度が検量線において求められる。

本発明の第４の局面は、本発明の第１から第３までのいずれかの局面にさらなる事項を付加する。本発明の第４の局面においては、上述の蛍光標識液が第１の蛍光標識液であり、上述の既知の濃度が第１の既知の濃度であり、上述の基準蛍光量が第１の基準蛍光量である。

事前評価用のセンサーチップ及び第２の既知の濃度の蛍光標識を含む第２の蛍光標識液が準備される。

事前評価用のセンサーチップの流路に第２の蛍光標識液が満たされる。

事前評価用のセンサーチップの流路に第２の蛍光標識液が満たされた状態において、事前評価用のセンサーチップの入射面に励起光が入射させられ、事前評価用のセンサーチップの反射面に共鳴角で励起光を入射させられる。事前評価用のセンサーチップの流路に満たされた第２の蛍光標識液に含まれる蛍光標識がエバネッセント波で励起される。事前評価用のセンサーチップから出射する第２の基準蛍光量が測定される。

規格化された蛍光量が求められる場合は、第１の基準蛍光量を第２の基準蛍光量で除した商を因子として含む補正係数が求められる。蛍光量が補正係数で除される。

本発明の第５の局面は、本発明の第４の局面にさらなる事項を付加する。本発明の第５の局面においては、２個以上の事前評価用のセンサーチップが準備される。２個以上の事前評価用のセンサーチップの各々に対して第２の蛍光標識液が満たされ第２の基準蛍光量が測定される。２個以上の事前評価用のセンサーチップについての第２の基準蛍光量の代表値が求められる。第１の基準蛍光量を代表値で除した商を因子として含む補正係数が求められる。

本発明の第６の局面は、本発明の第４又は第５の局面にさらなる事項を付加する。本発明の第６の局面においては、第１の基準蛍光量に含まれるノイズ成分及び第２の基準蛍光量に含まれるノイズ成分が測定される。第１の基準蛍光量から第１の基準蛍光量に含まれるノイズ成分を減ずる補正が行われ、第１の基準蛍光量の補正値が求められる。第２の基準蛍光量から第２の基準蛍光量に含まれるノイズ成分を減ずる補正が行われ、第２の基準蛍光量の補正値が求められる。第１の基準蛍光量の補正値を第２の基準蛍光量の補正値で除した商を因子として含む補正係数が求められる。

本発明の第７の局面は、本発明の第４から第６までのいずれかの局面にさらなる事項を付加する。本発明の第７の局面においては、第１の既知の濃度と同じ第２の既知の濃度の蛍光標識を含む第２の蛍光標識液が準備される。

本発明の第８の局面は、本発明の第１から第７までのいずれかの局面にさらなる事項を付加する。本発明の第８の局面においては、抗原と特異的に結合する抗体を含まない蛍光標識液が準備される。基準蛍光量が測定された後に、蛍光標識液に抗体が注入される。蛍光標識及び抗体の複合体である蛍光標識抗体が形成される。計測用のセンサーチップの抗原捕捉膜に捕捉された抗原に蛍光標識抗体が結合させられ、計測用のセンサーチップの抗原捕捉膜に捕捉された抗原に蛍光標識が付加される。

本発明の第９の局面は、表面プラズモン励起蛍光分光法により計測を行う計測装置に向けられる。

本発明の第９の局面においては、センサーチップ、送液機構、照射機構、測定機構及びコントローラーが設けられる。

センサーチップは、誘電体媒体、導電体膜、抗原捕捉膜及び流路形成物を備える。誘電体媒体は、入射面、反射面及び出射面を備える。励起光が入射面に入射し反射面に反射され出射面から出射するように入射面、反射面及び出射面が配置される。導電体膜は、第１の主面及び第２の主面を備える。反射面は第１の主面に密着し、抗原捕捉膜は第２の主面に定着する。流路形成物には流路が形成される。抗原捕捉膜は流路の内部に露出する。

送液機構は、抗原を含む試料液、既知の濃度の蛍光標識を含む蛍光標識液及び蛍光量測定用の液体を流路に満たす。

照射機構は、誘電体媒体に励起光を照射する。

測定機構は、センサーチップから出射する光量を測定する。

コントローラーは、送液機構、照射機構及び測定機構を制御する。コントローラーは、１次免疫反応進行部、蛍光標識液充填部、基準蛍光量測定部、液体充填部、蛍光量測定部及び演算部を備える。

１次免疫反応進行部は、送液機構を制御し、試料液を流路に満たさせ、抗原捕捉膜に抗原を捕捉させる。

蛍光標識液充填部は、送液機構を制御し、蛍光標識液を流路に満たさせる。

基準蛍光量測定部は、照射機構を制御し、抗原が抗原捕捉膜に捕捉されるとともに流路に蛍光標識液が満たされた状態であって抗原捕捉膜に捕捉された抗原に蛍光標識が付加される前に、入射面に励起光を入射させ、反射面に共鳴角で励起光を入射させる。流路に満たされた蛍光標識液に含まれる蛍光標識がエバネッセント波で励起される。基準蛍光量測定部は、測定機構を制御し、蛍光標識液に含まれる蛍光標識から放射されセンサーチップから出射する蛍光の強度である基準蛍光量を測定する。

液体充填部は、送液機構を制御し、抗原捕捉膜に捕捉された抗原に蛍光標識が付加された後に流路に蛍光量測定用の液体を満たさせる。

蛍光量測定部は、流路に蛍光量測定用の液体が満たされた状態において、照射機構を制御し、入射面に励起光を入射させ、反射面に共鳴角で励起光を入射させる。抗原捕捉膜に捕捉された抗原に付加された蛍光標識がエバネッセント波で励起される。蛍光量測定部は、測定機構を制御し、センサーチップから出射する蛍光量を測定させる。演算部は、基準蛍光量及び蛍光量を測定機構から取得し、基準蛍光量を用いて蛍光量を規格化し、規格化された蛍光量を求める。

本発明の第１及び第９の局面によれば、センサーチップの個体差の影響が抑制され、計測の精度及び感度が向上する。

本発明の第２の局面によれば、抗原捕捉膜に抗原が捕捉された後に基準蛍光量及び蛍光量の両方が測定される。抗原捕捉膜への抗原の捕捉による共鳴角の変化が規格化に与える影響が抑制される。

本発明の第３の局面によれば、正確な抗原の濃度が求められる。

本発明の第４の局面によれば、第２の基準蛍光量が測定された時からの経時変化の影響が抑制され、計測の精度が向上する。

本発明の第５の局面によれば、事前評価用のセンサーチップの個体差の影響が抑制され、計測の精度が向上する。

本発明の第６の局面によれば、ノイズ成分の影響が抑制され、計測の精度が向上する。

本発明の第７の局面によれば、第１の基準蛍光量及び第２の基準蛍光量を直接的に対比可能になり、規格化の処理が簡略化される。

本発明の第８の局面によれば、基準蛍光量が測定される場合に抗原捕捉膜に捕捉された抗原に蛍光標識が付加されておらず、正確な基準蛍光量が測定され、計測の精度が向上する。

これらの及びこれら以外の本発明の目的、特徴、局面及び利点は、添付図面とともに考慮されたときに下記の本発明の詳細な説明によってより明白となる。

計測装置の模式図である。 センサーチップの斜視図である。 センサーチップの横断面図である。 センサーチップの縦断面図である。 センサーチップの抗原捕捉膜の近傍の断面図である。 センサーチップの抗原捕捉膜の近傍の断面図である。 センサーチップの抗原捕捉膜の近傍の断面図である。 センサーチップの抗原捕捉膜の近傍の断面図である。 センサーチップの抗原捕捉膜の近傍の断面図である。 センサーチップの抗原捕捉膜の近傍の断面図である。 コントローラーのブロック図である。 計測の流れを示すフローチャートである。 計測の流れを示すフローチャートである。 計測の流れを示すフローチャートである。 検量線を用いた抗原の濃度の演算を説明するグラフである。 ロットごとの検量線の補正を示すグラフである。 ロットごとの検量線及び個々のセンサーチップの正確な検量線を示すグラフである。 検量線の作成の流れを示すフローチャートである。 基準蛍光量から自家蛍光量を減ずる補正の流れを示すフローチャートである。

（概略）
この望ましい実施形態は、表面プラズモン励起蛍光分光法（ＳＰＦＳ）により計測を行う方法及びＳＰＦＳにより計測を行う計測装置に関する。

図１の模式図は、計測装置を示す。図２から図４までの模式図は、センサーチップを示す。図２から図４までは、それぞれ、斜視図、横断面図及び縦断面図である。

図１に示すように、計測装置１０００は、本体１０２０、センサーチップ１０２２及び試薬チップ１０２４を備える。本体１０２０は、照射機構１０４０、測定機構１０４２、送液機構１０４４及びコントローラー１０４６を備える。

照射機構１０４０は、レーザーダイオード１０６０、直線偏光板１０６２、ミラー１０６４及びミラー駆動機構１０６６を備える。

測定機構１０４２は、光電子増倍管１０８０、バンドパスフィルター１０８２、バンドパスフィルター駆動機構１０８４及びフォトダイオード１０８６を備える。

これらの構成物以外の構成物が計測装置１０００に付加されてもよい。これらの構成物の一部が計測装置１０００から省略されてもよい。

図２から図４までに示すように、センサーチップ１０２２は、プリズム１１００、金膜１１０２、抗原捕捉膜（図２には図示されていない。）１１０４及び流路形成物１１０６を備える。流路形成物１１０６は、流路形成シート１１２０及び流路形成蓋１１２２を備える。プリズム１１００は、入射面１１４０、反射面１１４２及び出射面１１４４を備える。流路形成物１１０６には、流路１１６０が形成される。

図５から図１０までの模式図は、センサーチップの抗原捕捉膜の近傍の断面を示す。

計測が行われる場合は、図５に示すように、計測される抗原１１８０を含む試料液１２００が流路１１６０に満たされ、抗原捕捉膜１１０４に抗原１１８０が捕捉される。抗原捕捉膜１１０４への抗原１１８０の捕捉は、試料液１２００に含まれる抗原１１８０と抗原捕捉膜１１０４に固定された抗体１３２０とを結合させる１次免疫反応（抗原−抗体反応）により行われる。

抗原１１８０が捕捉された後に、図６に示すように、蛍光標識１２２０を含むが抗原１１８０と特異的に結合する抗体を含まない蛍光標識液１２４０が流路１１６０に満たされる。蛍光標識液１２４０が流路１１６０に満たされている状態において、基準蛍光量Ｓ１が測定される。

基準蛍光量Ｓ１が測定された後に、図７に示すように、抗原１１８０と特異的に結合する抗体１２４２が蛍光標識液１２４０に注入される。これにより、図８に示すように、蛍光標識１２２０及び抗体１２４２が結合し、蛍光標識１２２０及び抗体１２４２の複合体である蛍光標識抗体１２６０が形成される。蛍光標識抗体１２６０は、図９に示すように、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０に結合する。これにより、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０に蛍光標識１２２０が付加される。抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０への蛍光標識１２２０の付加は、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０と蛍光標識液１２４０に含まれる抗体１２４２とを結合させる２次免疫反応により行われる。

蛍光標識１２２０が付加された後に、図１０に示すように、バッファー液１２８０が流路１１６０に満たされる。バッファー液１２８０が流路１１６０に満たされた状態において、蛍光量Ｓ２が測定される。

基準蛍光量Ｓ１が測定される場合及び蛍光量Ｓ２が測定される場合は、図６及び図１０に示すように、励起光ＥＬがプリズム１１００に照射される。励起光ＥＬは、図３に示すように、入射面１１４０に入射し、反射面１１４２に反射され、出射面１１４４から出射する。励起光ＥＬが全反射条件を満たして反射面１１４２に入射する場合は、図６及び図１０に示すように、プリズム１１００と金膜１１０２との界面から金膜１１０２の側へエバネッセント波ＥＷがもれだす。エバネッセント波ＥＷと金膜１１０２の表面のプラズモンとは共鳴し、エバネッセント波ＥＷの電場が増強される。基準蛍光量Ｓ１が測定される場合及び蛍光量Ｓ２が測定される場合は、望ましくは励起光ＥＬが同じ条件でプリズム１１００に照射される。

基準蛍光量Ｓ１が測定される場合は、図６に示すように、流路１１６０に満たされる蛍光標識液１２４０に含まれる蛍光標識１２２０がエバネッセント波ＥＷで励起される。このとき、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０には蛍光標識１２２０がまだ付加されていない。基準蛍光量Ｓ１は、主に、流路１１６０に満たされる蛍光標識液１２４０に含まれエバネッセント波ＥＷで励起された蛍光標識１２２０から放射される蛍光ＦＬ１の強度である。基準蛍光量Ｓ１は、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０の量に依存せず、蛍光標識液１２４０に含まれる蛍光標識１２２０の濃度が既知である場合は、エバネッセント波ＥＷの強度の指標になる。

蛍光量Ｓ２が測定される場合は、図１０に示すように、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０に付加された蛍光標識１２２０がエバネッセント波ＥＷで励起される。蛍光量Ｓ２は、主に、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０に付加されエバネッセント波ＥＷで励起された蛍光標識１２２０から放射される蛍光ＦＬ２の強度である。蛍光量Ｓ２は、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０の量の指標になるが、エバネッセント波ＥＷの強度にも依存する。

蛍光量Ｓ２のエバネッセント波ＥＷの強度への依存性を解消するため、基準蛍光量Ｓ１を用いて蛍光量Ｓ２が規格化される。これにより、センサーチップ１０２２の個体差の影響が抑制され、計測の精度及び感度が向上する。「規格化」とは、基準蛍光量Ｓ１に対する蛍光量Ｓ２の相対的な関係を特定することをいう。

（センサーチップ）
図２から図４までに示すように、反射面１１４２は金膜１１０２の一方の主面１３００に密着させられ、抗原捕捉膜１１０４は金膜１１０２の他方の主面１３０２に定着させられる。流路形成物１１０６は、金膜１１０２及び抗原捕捉膜１１０４が形成されたプリズム１１００に接合される。

センサーチップ１０２２は、「検査チップ」「分析チップ」「バイオチップ」「試料セル」等とも呼ばれる。センサーチップ１０２２は、望ましくは各辺の長さが数ｍｍから数ｃｍまでの範囲内にある構造物であるが、より小型の又はより大型の構造物であってもよい。

（プリズム）
図２から図４までに示すように、プリズム１１００は、台形柱体である。プリズム１１００は、望ましくは等脚台形柱体である。プリズム１１００の一方の傾斜側面は入射面１１４０になる。プリズム１１００の幅広の平行側面は反射面１１４２になる。プリズム１１００の他方の傾斜側面は出射面１１４４になる。

励起光ＥＬが入射面１１４０へ入射し全反射条件を満たして反射面１１４２に入射し反射面１１４２に反射され出射面１１４４から出射するように入射面１１４０、反射面１１４２及び出射面１１４４が配置される。

プリズム１１００の形状は、励起光ＥＬを共鳴角で反射面１１４２に入射させることができるように決められる。この条件が満たされる限り、プリズム１１００が台形柱体以外でもよく、プリズム１１００が「プリズム」とは呼びがたい形状物に置きかえられてもよい。例えば、プリズム１１００が半円柱体であってもよく、プリズム１１００が板に置きかえられてもよい。

プリズム１１００は、励起光ＥＬに対して透明な誘電体からなる誘電体媒体である。プリズム１１００の材質は、樹脂、ガラス等である。プリズム１１００の材質が樹脂である場合は、プリズム１１００は、望ましくは射出成型により作製される。

（金膜）
金膜１１０２は、薄膜である。金膜１１０２の膜厚は、望ましくは１００ｎｍ以下であり、さらに望ましくは４０〜５０ｎｍである。ただし、金膜１１０２の膜厚がこの範囲外であってもよい。

金膜１１０２が表面プラズモン共鳴を発生させる他の種類の導電体からなる導電体膜に置きかえられてもよい。例えば、金膜１１０２が銀、銅、アルミニウム等の金属又はこれらの金属を含む合金からなる導電体膜に置きかえられてもよい。

金膜１１０２は、スパッタリング、蒸着、メッキ等により形成される。

（抗原捕捉膜）
図５に示すように、抗原捕捉膜１１０４には計測される抗原１１８０と結合する抗体１３２０が固定される。試料液１２００が抗原捕捉膜１１０４に接触した場合は、試料液１２００に含まれる抗原１１８０が抗原捕捉膜１１０４に固定された抗体１３２０と結合し、試料液１２００に含まれる抗原１１８０が抗原捕捉膜１１０４に捕捉される。

図３及び図４に示すように、抗原捕捉膜１１０４は、流路１１６０の内部に露出する。試料液１２００、蛍光標識液１２４０、バッファー液１２８０等の液体が流路１１６０に満たされた場合は、流路１１６０に満たされた液体が抗原捕捉膜１１０４に接触し、エバネッセント波が生じる空間が液体で埋められる。

抗原捕捉膜１１０４は、非流動体からなる。したがって、液体が抗原捕捉膜１１０４に接触しても、抗原捕捉膜１１０４は移動しない。

抗原捕捉膜１１０４は、ラバー製のアプリケーターによりパターニングされ、金膜１１０２の他方の主面１３０２の一部にのみ定着する。抗原捕捉膜１１０４が他の方法によりパターニングされてもよい。抗原捕捉膜１１０４の平面形状は、円形、多角形等である。抗原捕捉膜１１０４の径は、望ましくは数ｍｍである。抗原捕捉膜１１０４の厚さは、望ましくは１００ｎｍ以下であり、さらに望ましくは６０ｎｍ以下である。

抗原捕捉膜１１０４が形成される場合は、金膜１１０２の他方の主面１３０２に自己組織化（ＳＡＭ）膜が形成され、自己組織化膜上に固相支持体層が形成され、固相支持体層に抗体１３２０が固定される。

自己組織化膜が形成される場合は、自己組織化膜を構成する物質が溶解又は分散させられた液体に金膜１１０２が形成されたプリズム１１００が浸漬される。例えば、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール等のアルカンチオール誘導体のエタノール溶液に金膜１１０２が形成されたプリズム１１００が浸漬される。

固相支持体層が形成される場合は、固相支持体層を構成する物質が溶解又は分散させられた液体に金膜１１０２が形成されたプリズム１１００が浸漬される。例えば、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）が溶解させられたバッファー液に金膜１１０２が形成されたプリズム１１００が浸漬される。バッファー液は、例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）及び塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の水溶液である。

（流路形成物）
図４に示すように、流路１１６０は、一方の開口１３４０から流路形成物１１０６の内部を経由して他方の開口１３４２へ至る。流路１１６０の一部は、金膜１１０２及び抗原捕捉膜１１０４が形成されたプリズム１１００に接合される面に露出する。

流路形成シート１１２０には反応室１３６０が形成される。流路形成蓋１１２２には経路１３６２及び１３６４が形成される。反応室１３６０並びに経路１３６２及び１３６４により流路１１６０が構成される。

反応室１３６０は、流路形成シート１１２０の両主面を貫通する孔である。一方の経路１３６２は、一方の開口１３４０から反応室１３６０の一端へ至る孔である。他方の経路１３６４は、反応室１３６０の他端から他方の開口１３４２へ至る孔である。

流路形成シート１１２０は、ポリエチレンテレフタラート等からなる基材の両主面にアクリル系粘着剤等の粘着剤からなる層が形成された両面粘着シートであり、金膜１１０２及び抗原捕捉膜１１０４が形成されたプリズム１１００と流路形成蓋１１２２とを接合する。

流路形成蓋１１２２は、表面プラズモン励起蛍光（蛍光ＦＬ１及びＦＬ２）に対して透明な材質からなる。流路形成蓋１１２２は、例えば、樹脂、ガラス等からなる。流路形成蓋１１２２が樹脂である場合は、流路形成蓋１１２２は、望ましくは射出成型により作製される。

流路形成シート１１２０及び流路形成蓋１１２２が一体物であってもよい。

（送液機構）
図１に示すように、送液機構１０４４は、液体をセンサーチップ１０２２へ供給し、液体をセンサーチップ１０２２から回収する。液体がセンサーチップ１０２２へ供給される場合は、一方の開口１３４０へ液体が供給され、流路１１６０が液体で満たされ、液体が抗原捕捉膜１１０４に接触する。液体が計測用のセンサーチップ１０２２から回収される場合は、一方の開口１３４０から液体が回収され、流路１１６０が空又は空に近い状態になる。

送液機構１０４４は、例えば、ポンプにより送液元から液体を吸引し、送液元から送液先へポンプを搬送し、ポンプにより送液先へ液体を吐出する。送液元から送液先へ至る配管に液体が流されてもよい。

（レーザーダイオード）
図１に示すように、レーザーダイオード１０６０は励起光ＥＬを放射する。

レーザーダイオード１０６０が他の形式の光源に置きかえられてもよい。例えば、レーザーダイオード１０６０が発光ダイオード、水銀灯、レーザーダイオード以外のレーザー等に置きかえられてもよい。

光源から放射される光が平行光線でない場合は、レンズ、ミラー、スリット等により光が平行光線へ変換される。光が直線偏光でない場合は、直線偏光板等により光が直線偏光へ変換される。光が単色光でない場合は、回折格子等により光が単色光へ変換される。

（直線偏光板）
図１に示すように、直線偏光板１０６２は、励起光ＥＬの光路上に配置され、レーザーダイオード１０６０から放射された励起光ＥＬを直線偏光へ変換する。励起光ＥＬの偏光方向は、励起光ＥＬがプリズム１１００の反射面１１４２に対してｐ偏光になるように選択される。これにより、エバネッセント波ＥＷのもれだしが増加し、表面プラズモン励起蛍光の光量が増加し、計測の精度及び感度が向上する。

（ミラー及びミラー駆動機構）
図１に示すように、ミラー１０６４は、励起光ＥＬの光路上に配置され、直線偏光板１０６２を通過した励起光ＥＬを反射する。ミラー１０６４により反射された励起光ＥＬは、プリズム１１００に照射される。プリズム１１００に照射された光は、図３に示すように、入射面１１４０へ入射し、反射面１１４２に反射され、出射面１１４４から出射する。反射面１１４２への励起光ＥＬの入射角θは、全反射条件θｃ≦θを満たす（θｃ：臨界角）。

ミラー駆動機構１０６６は、モーター、圧電アクチュエーター、電磁モーター等の駆動力源を備え、ミラー１０６４を回転させ、ミラー１０６４の姿勢を調整する。また、ミラー駆動機構１０６６は、リニアステッピングモーター等の駆動力源を備え、レーザーダイオード１０６０の光軸方向にミラー１０６４を移動させ、ミラー１０６４の位置を調整する。これにより、反射面１１４２における励起光ＥＬの入射位置を抗原捕捉膜１１０４が定着する領域の裏側に維持したまま反射面１１４２への励起光ＥＬの入射角θを調整できる。

照射機構１０４０又はセンサーチップ１０２２の位置又は姿勢を調整することにより入射角θが調整されてもよい。

（光電子増倍管）
図１に示すように、光電子増倍管１０８０は、センサーチップ１０２２から出射する蛍光ＦＬ１及びＦＬ２の光路上に配置され、基準蛍光量Ｓ１及び蛍光量Ｓ２を測定する。光電子増倍管１０８０が他の形式の光量センサーに置きかえられてもよい。例えば、光電子増倍管１０８０が電荷結合素子（ＣＣＤ）センサー等に置きかえられてもよい。

（バンドパスフィルター）
図１に示すように、バンドパスフィルター１０８２は蛍光ＦＬ１及びＦＬ２の光路上に配置される。バンドパスフィルター１０８２は、通過域に含まれる波長の光を透過し、阻止域に含まれる波長の光を減衰させる。通過域は蛍光ＦＬ１及びＦＬ２の波長を含むように選択され、阻止域は励起光ＥＬの波長を含むように選択される。

散乱された励起光ＥＬはバンドパスフィルター１０８２により減衰し、散乱された励起光ＥＬ（以下では「散乱光」という。）のごく一部が光電子増倍管１０８０に到達するが、蛍光ＦＬ１及びＦＬ２はバンドパスフィルター１０８２を透過し、蛍光ＦＬ１及びＦＬ２の大部分が光電子増倍管１０８０に到達する。これにより、相対的に小さい基準蛍光量Ｓ１及び蛍光量Ｓ２が測定される場合に散乱光の影響が抑制され、計測の精度が向上する。バンドパスフィルター１０８２がローパスフィルターに置きかえられてもよい。

（バンドパスフィルター駆動機構）
図１に示すように、バンドパスフィルター駆動機構１０８４は、バンドパスフィルター１０８２が蛍光ＦＬ１及びＦＬ２の光路上に配置された状態とバンドパスフィルター１０８２が蛍光ＦＬ１及びＦＬ２の光路上に配置されない状態とを切り替える。

（フォトダイオード）
図１に示すように、フォトダイオード１０８６は、プリズム１１００と金膜１１０２との界面において反射された励起光ＥＬ（以下では「反射光」という）の光路上に配置され反射光量を測定する。フォトダイオード１０８６が他の形式の光量センサーに置きかえられてもよい。例えば、フォトダイオード１０８６がフォトトランジスター、フォトレジスター等に置きかえられてもよい。

（コントローラー）
コントローラー１０４６は、制御プログラムを実行する組み込みコンピューターである。１個の組み込みコンピューターがコントローラー１０４６の機能を担ってもよいし、２個以上の組み込みコンピューターが分担してコントローラー１０４６の機能を担ってもよい。ソフトウエアを伴わないハードウエアがコントローラー１０４６の全部又は一部の機能を担ってもよい。ハードウエアは、例えば、オペアンプ、コンパレーター等の電子回路であるが、リンク機構等の機械的な機構がハードウエアに含まれてもよい。コントローラー１０４６による処理の全部又は一部が、手作業により実行されてもよく、計測装置１０００の外部において実行されてもよい。

図１１のブロック図は、コントローラーを示す。コントローラー１０４６は、照射機構１０４０、測定機構１０４２及び送液機構１０４４を制御する。

図１１に示すように、コントローラー１０４６は、試料液準備部１４００、１次免疫反応進行部１４０２、試料液排出部１４０４、第１の流路洗浄部１４０６、第１のバッファー液充填部１４０８、共鳴角検出部１４１０、自家蛍光量測定部１４１２、バッファー液排出部１４１４、蛍光標識液充填部１４１６、基準蛍光量測定部１４１８、２次免疫反応進行部１４２０、蛍光標識液排出部１４２２、第２の流路洗浄部１４２４、第２のバッファー液充填部１４２６、蛍光量測定部１４２８及び演算部１４３０を備える。これらのブロックによる制御、演算等の具体的内容は、計測の流れの欄において説明される。

（計測の流れ）
図１２から図１４までのフローチャートは、計測の流れを示す。

（本体、計測用のセンサーチップ及び試薬チップの準備）
図１２から図１４までに示すように、計測が行われる場合は、本体１０２０が準備され（ステップＳ１０１）、計測用のセンサーチップ１０２２が準備され（ステップＳ１０２）、試薬チップ１０２４が準備される（ステップＳ１０３）。

コントローラー１０４６には、検量線及び検量線の作成時に測定された基準蛍光量Ｓ０が記憶されている。検量線及び基準蛍光量Ｓ０は、典型的には、センサーチップ１０２２の製造事業者によりンサーチップ１０２２の製造ロットごとに作成され、センサーチップ１０２２の使用者に提供される。検量線及び基準蛍光量Ｓ０がセンサーチップ１０２２の製造事業者以外により準備されてもよい。例えば、検量線及び基準蛍光量Ｓ０がセンサーチップ１０２２の使用者により準備されてもよい。検量線及び基準蛍光量Ｓ０が製造ロット以外の単位ごとに準備されてもよい。例えば、検量線及び基準蛍光量Ｓ０がセンサーチップ１０２２の品種ごとに準備されてもよい。検量線及び基準蛍光量Ｓ０は、光学ディスク、メモリーカード等の記録媒体に記録された状態で提供されてもよいし、ネットワーク等の電気通信回線を経由して提供されてもよいし、バーコード等の図形に担持された状態で提供されてもよい。検量線及び基準蛍光量Ｓ０は、センサーチップ１０２２の使用者により本体１０２０に記憶させられる。検量線及び基準蛍光量Ｓ０が電気通信回線を経由して提供される場合は、計測装置１０００が電気通信回線を経由して直接的に検量線及び基準蛍光量Ｓ０を取得してもよい。

試薬チップ１０２４には、検体、蛍光標識液、バッファー液、希釈液、洗浄液等の計測に必要な液体が収容される。検体は、典型的には、血液等の人間からの採取物であるが、人間以外の生物からの採取物であってもよく、非生物からの採取物であってもよい。血液は、血漿、血清及び全血のいずれでもよい。バッファー液は、抗体１３２０、抗原１１８０及び蛍光標識抗体１２６０を失活させないｐＨを維持する緩衝能を持つ。抗体１３２０、抗原１１８０及び蛍光標識抗体１２６０を失活させず蛍光量Ｓ２の測定を阻害しない限り、バッファー液に代えて緩衝能を持たない蛍光量測定用の液体が用いられてもよい。

（計測用のセンサーチップ及び試薬チップの取り付け）
本体１０２０、計測用のセンサーチップ１０２２及び試薬チップ１０２４が準備された後に、計測用のセンサーチップ１０２２及び試薬チップ１０２４が本体１０２０に取り付けられる（ステップＳ１０４）。

（試料液の準備）
計測用のセンサーチップ１０２２及び試薬チップ１０２４が取り付けられた後に、試料液１２００が準備される（ステップＳ１０５）。試料液１２００が準備される場合は、送液機構１０４４が試料液準備部１４００により制御され、送液機構１０４４により検体及び希釈液があらかじめ決められた希釈率で混合される。検体がそのまま試料液１２００とされてもよい。試料液１２００の調製が手作業で行われてもよい。試料液１２００の調製が手作業で行われる場合は、当該手作業は計測装置１０００の内部で行われてもよいし外部で行われてもよい。

（１次免疫反応の進行）
試料液１２００が準備された後に、１次免疫反応が進行させられる（ステップＳ１０６）。１次免疫反応が進行させられる場合は、送液機構１０４４が１次免疫反応進行部１４０２により制御され、送液機構１０４４により試料液１２００が計測用のセンサーチップ１０２２へ供給され試料液１２００が流路１１６０に満たされる。これにより、試料液１２００が抗原捕捉膜１１０４に接触し、試料液１２００に含まれる抗原１１８０が抗原捕捉膜１１０４に固定された抗体１３２０に結合し、試料液１２００に含まれる抗原１１８０が抗原捕捉膜１１０４に捕捉される。抗原捕捉膜１１０４への抗原１１８０の捕捉が完了するまで試料液１２００が流路１１６０に満たされた状態が維持される。試料液１２００は、試料液１２００が抗原捕捉膜１１０４に十分に接触する程度に流路１１６０に満たされればよい。すなわち、主に反応室１３６０が試料液１２００で満たされればよく、流路１１６０の全体が試料液１２００で満たされることは必ずしも必要がない。

（試料液の排出）
抗原１１８０の捕捉が完了した後に、試料液１２００が流路１１６０から排出される（ステップＳ１０７）。試料液１２００が排出される場合は、送液機構１０４４が試料液排出部１４０４により制御され、送液機構１０４４により計測用のセンサーチップ１０２２から試料液１２００が回収され、流路１１６０が空になる。

（流路の洗浄）
試料液１２００が排出された後に、流路１１６０が洗浄される（ステップＳ１０８）。流路１１６０が洗浄される場合は、送液機構１０４４が第１の流路洗浄部１４０６により制御され、送液機構１０４４により洗浄液が計測用のセンサーチップ１０２２へ供給され、送液機構１０４４により洗浄液が計測用のセンサーチップ１０２２から回収される。これにより、未反応の抗原１１８０、不要物等が流路１１６０から除去される。未反応の抗原１１８０、不要物の残存が無視できるほど少ない場合は、流路１１６０の洗浄が省略されてもよい。

（バッファー液の充填）
流路１１６０が洗浄された後に、流路１１６０がバッファー液で満たされる（ステップＳ１０９）。流路１１６０がバッファー液で満たされる場合は、送液機構１０４４が第１のバッファー液充填部１４０８により制御され、送液機構１０４４によりバッファー液が計測用のセンサーチップ１０２２へ供給される。バッファー液は、エバネッセント波ＥＷがもれだす空間を埋める程度に流路１１６０に満たされればよい。

（共鳴角の検出）
流路１１６０がバッファー液で満たされた状態において、共鳴角が検出される（ステップＳ１１０）。共鳴角が検出される場合は、照射機構１０４０が共鳴角検出部１４１０により制御され、照射機構１０４０によりプリズム１１００に励起光ＥＬが照射される。励起光ＥＬは、入射面１１４０に入射し、全反射条件を満たして反射面１１４２に入射し、反射面１１４２に反射され、反射光になって出射面１１４４から出射する。このとき、ミラー駆動機構１０６６により予想される共鳴角の付近において入射角θが走査される。入射角θが走査されている間に、共鳴角検出部１４１０により測定機構１０４２が制御され、反射光量がフォトダイオード１０８６により測定される。共鳴角検出部１４１０は、入射角θ及び反射光量を取得し、反射光量が極小になる入射角θを特定する。反射光量が極小になる入射角θ又はその補正値は、電場増強度が極大になる共鳴角であるとみなされる。反射光量が極小になる入射角θと電場増強度が極大になる入射角θとのずれを無視できない場合は、反射光量が極小になる入射角θに微小角を加算又は減算する補正が行われる。これ以外の方法により共鳴角が検出されてもよい。例えば、散乱光量が極大になる入射角θから共鳴角が検出されてもよい。大部分の場合は計測ごとに共鳴角が検出されるが、計測ごとの共鳴角の変動を無視できる場合は、バッファー液の供給及び共鳴角の検出が省略され、固定された共鳴角で反射面１１４２に励起光ＥＬが入射させられてもよい。

（自家蛍光量の測定）
共鳴角が検出された後に、流路１１６０がバッファー液で満たされた状態において、自家蛍光量Ｓ１ａが測定される（ステップＳ１１１）。自家蛍光量Ｓ１ａが測定される場合は、照射機構１０４０が自家蛍光量測定部１４１２により制御され、照射機構１０４０によりプリズム１１００に励起光ＥＬが照射される。このとき、入射角θは共鳴角に設定される。励起光ＥＬは、入射面１１４０に入射し、共鳴角で反射面１１４２に入射し、反射面１１４２に反射され、出射面１１４４から出射する。励起光ＥＬが照射されている間に、測定機構１０４２が自家蛍光量測定部１４１２により制御され、計測用のセンサーチップ１０２２から出射する自家蛍光量Ｓ１ａが光電子増倍管１０８０により測定される。計測用のセンサーチップ１０２２から出射する蛍光は、主に、プリズム１１００により放射される自家蛍光である。演算部１４３０は、光電子増倍管１０８０から自家蛍光量Ｓ１ａを取得する。後述する自家蛍光量Ｓ１ａを減ずる補正が省略される場合は、自家蛍光量Ｓ１ａの測定が省略されてもよい。

（バッファー液の排出）
自家蛍光量Ｓ１ａが測定された後に、バッファー液が流路１１６０から排出される（ステップＳ１１２）。バッファー液が排出される場合は、送液機構１０４４がバッファー液排出部１４１４により制御され、送液機構１０４４によりバッファー液が計測用のセンサーチップ１０２２から回収される。

（蛍光標識液の充填）
バッファー液が回収された後に、流路１１６０が蛍光標識液１２４０で満たされる（ステップＳ１１３）。流路１１６０が蛍光標識液１２４０で満たされる場合は、送液機構１０４４が蛍光標識液充填部１４１６により制御され、送液機構１０４４により蛍光標識液１２４０が計測用のセンサーチップ１０２２に供給される。

（基準蛍光量の測定）
流路１１６０に蛍光標識液１２４０が満たされた状態において、基準蛍光量Ｓ１が測定される（ステップＳ１１４）。基準蛍光量Ｓ１が測定される場合は、照射機構１０４０が基準蛍光量測定部１４１８に制御され、照射機構１０４０によりプリズム１１００に励起光ＥＬが照射される。励起光ＥＬは、入射面１１４０に入射し、共鳴角で反射面１１４２に入射し、反射面１１４２に反射され、出射面１１４４から出射する。励起光ＥＬが照射されている間に、測定機構１０４２が基準蛍光量測定部１４１８により制御され、計測用のセンサーチップ１０２２から出射する基準蛍光量Ｓ１が光電子増倍管１０８０により測定される。演算部１４３０は、光電子増倍管１０８０から基準蛍光量Ｓ１を取得する。

（２次免疫反応の進行）
基準蛍光量Ｓ１が測定された後に、２次免疫反応が進行させられる（ステップＳ１１５）。２次免疫反応が進行させられる場合は、送液機構１０４４が２次免疫反応進行部１４２０により制御され、送液機構１０４４により抗体１２４２が蛍光標識液１２４０に注入される。抗体１２４２は、計測される抗原１１８０と特異的に結合する。注入された抗体１２４２と蛍光標識液１２４０に含まれる蛍光標識１２２０とは結合し、抗体１２４２と蛍光標識１２２０との複合体である蛍光標識抗体１２６０が形成される。蛍光標識抗体１２６０は、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０に結合する。これにより、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０に蛍光標識１２２０が付加される。付加される蛍光標識１２２０の数は、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０の数に比例する。

基準蛍光量Ｓ１が測定された後に蛍光標識液１２４０に抗体１２４２が注入される場合は、基準蛍光量Ｓ１が測定されるときに抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０に蛍光標識１２２０が付加されていない。このため、正確な基準蛍光量Ｓ１が測定され、計測の精度が向上する。

基準蛍光量Ｓ１が測定された後に代えて基準蛍光量Ｓ１が測定される前に抗体１２４２が蛍光標識液１２４０に注入されてもよい。計測される抗原１１８０と特異的に結合する抗体１２４２を含まない蛍光標識液１２４０に代えて蛍光標識抗体１２６０が既に形成された蛍光標識液１２４０で流路１１６０が満たされてもよい。これらの場合は、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０に蛍光標識１２２０が付加される前に基準蛍光量Ｓ１が測定され、基準蛍光量Ｓ１が測定された後には抗体１２４２は注入されない。抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０に蛍光標識１２２０が付加されるまでには多くの場合は数分の時間を要するので、抗体１２４２が蛍光標識液１２４０に注入されてから、又は、蛍光標識抗体１２６０が既に形成された蛍光標識液１２４０で流路１１６０が満たされてから、数十秒以内に基準蛍光量Ｓ１の測定が完了した場合には、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０に蛍光標識１２２０が付加される前に基準蛍光量Ｓ１の測定が完了する。

試料液１２００に含まれる抗原１１８０の濃度が高い場合は、抗原捕捉膜１１０４に捕捉される抗原１１８０の量も多いため、２次免疫反応が進行すると抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０に多くの蛍光標識１２２０が付加される。したがって、試料液１２００に含まれる抗原１１８０の濃度が高い場合に２次免疫反応が十分に進行した後に基準蛍光量Ｓ１が測定されたときは、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０に捕捉された蛍光標識１２２０から放射される蛍光量が大きくなり、基準蛍光量Ｓ１が正確に測定されない。

（蛍光標識液の排出）
蛍光標識１２２０の付加が完了した後に、蛍光標識液１２４０が流路１１６０から排出される（ステップＳ１１６）。蛍光標識液１２４０が排出される場合は、送液機構１０４４が蛍光標識液排出部１４２２により制御され、送液機構１０４４により蛍光標識液１２４０が計測用のセンサーチップ１０２２から回収される。

（流路の洗浄）
蛍光標識液１２４０が排出された後に、流路１１６０が洗浄される（ステップＳ１１７）。流路１１６０が洗浄される場合は、送液機構１０４４が第２の流路洗浄部１４２４により制御され、洗浄液が計測用のセンサーチップ１０２２へ供給され、洗浄液が計測用のセンサーチップ１０２２から回収される。これにより、未反応の蛍光標識抗体１２６０等が流路１１６０から除去される。未反応の蛍光標識抗体１２６０等の残存が無視できるほど少ない場合は、流路１１６０の洗浄が省略されてもよい。

（バッファー液の充填）
流路１１６０が洗浄された後に、流路１１６０がバッファー液１２８０で満たされる（ステップＳ１１８）。流路１１６０がバッファー液１２８０で満たされる場合は、送液機構１０４４が第２のバッファー液充填部１４２６により制御され、送液機構１０４４によりバッファー液１２８０が計測用のセンサーチップ１０２２へ供給される。バッファー液は、エバネッセント波ＥＷがもれだす空間を埋める程度に流路１１６０に満たされればよい。

（蛍光量の測定）
流路１１６０がバッファー液１２８０に満たされた状態において、蛍光量Ｓ２が測定される（ステップＳ１１９）。蛍光量Ｓ２が測定される場合は、照射機構１０４０が蛍光量測定部１４２８により制御され、照射機構１０４０によりプリズム１１００に励起光ＥＬが照射される。励起光ＥＬは、入射面１１４０に入射し、共鳴角で反射面１１４２に入射し、反射面１１４２に反射され、出射面１１４４から出射する。励起光ＥＬが照射されている間に、測定機構１０４２が蛍光量測定部１４２８により制御され、計測用のセンサーチップ１０２２から出射する蛍光量Ｓ２が光電子増倍管１０８０により測定される。演算部１４３０は、光電子増倍管１０８０から蛍光量Ｓ２を取得する。

（規格化された蛍光量の演算）
蛍光量Ｓ２が測定された後に、規格化された蛍光量Ｓ３が求められる（ステップＳ１２０）。規格化された蛍光量Ｓ３が求められる場合は、基準蛍光量Ｓ１を基準蛍光量Ｓ０で除した商Ｓ１／Ｓ０を因子として含む補正係数Ｋ＝Ｓ１／Ｓ０が求められる。蛍光量Ｓ２が補正係数Ｋで除され、規格化された蛍光量Ｓ３＝Ｓ２／Ｋが求められる。これにより、検量線が作成された時からの経時変化の影響が抑制され、計測の精度が向上する。

計測時に準備された蛍光標識液１２４０に含まれる蛍光標識１２２０の濃度Ｍ１と検量線作成時に準備された蛍光標識液１２４０に含まれる蛍光標識１２２０の濃度Ｍ０とが同じ（Ｍ１＝Ｍ０）場合は、基準蛍光量Ｓ１と蛍光量Ｓ０とを直接的に対比可能になる。このため、基準蛍光量Ｓ１を基準蛍光量Ｓ０で除した商Ｓ１／Ｓ０がそのまま補正係数Ｋになり、規格化の処理が簡略化される。ただし、濃度Ｍ１と濃度Ｍ０とが異なる（Ｍ１≠Ｍ０）場合も規格化は可能である。この場合は、補正係数Ｋ＝（Ｓ１／Ｍ１）／（Ｓ０／Ｍ０）が用いられる。

（抗原の濃度の演算）
規格化された蛍光量Ｓ３が求められた後に、抗原１１８０の濃度Ｄ１が求められる（ステップＳ１２１）。

図１５のグラフは、検量線を用いた抗原の濃度の演算を説明する。図１５に示される検量線は、蛍光量（縦軸）と試料液に含まれる抗原の濃度（横軸）との対応を示す。図１５には、コントローラー１０４６に実際に記憶されている規格化された蛍光量と試料液１２００に含まれる抗原１１８０の濃度との対応を示す製造ロットごとの検量線ＬＡ及び蛍光量と試料液１２００に含まれる抗原１１８０の濃度との正確な対応を示す検量線ＬＢが描かれている。図１５に示すように、演算部１４３０は、検量線ＬＡを参照し、規格化された蛍光量Ｓ３に対応する抗原１１８０の濃度Ｄ１を検量線ＬＡにおいて求める。これにより、検量線ＬＢにおいて蛍光量Ｓ２に対応する抗原１１８０の濃度が求められた場合に近い正確な抗原１１８０の濃度Ｄ１が求められる。

（基準蛍光量の測定のタイミング）
蛍光標識液１２４０の充填（ステップＳ１１３）及び基準蛍光量Ｓ１の測定（ステップＳ１１４）は、望ましくは１次免疫反応の進行（ステップＳ１０６）の後に実行される。これにより、抗原捕捉膜１１０４に抗原１１８０が捕捉された後に基準蛍光量Ｓ１及び蛍光量Ｓ２の両方が測定され、抗原捕捉膜１１０４への抗原１１８０の捕捉による共鳴角の変化の影響が抑制される。ただし、計測の精度がやや低下することが許される場合又は共鳴角の検出が２回以上行われることが許される場合は、蛍光標識液１２４０の充填及び基準蛍光量Ｓ１の測定が１次免疫反応の進行の前に実行されてもよい。

（測定される蛍光量を左右する因子）
測定される蛍光量は、反射面１１４２に入射する励起光ＥＬの光量、電場増強度、抗原捕捉膜１１０４に捕捉された抗原１１８０の量及び測定機構１０４２の感度等に依存する。

反射面１１４２に入射する励起光ＥＬの光量は、レーザーダイオード１０６０が放射する光の光量、レーザーダイオード１０６０が放射する光においてｐ偏光成分が占める比率、プリズム１１００の透過率、プリズム１１００のｐ偏光成分の維持率等に依存する。

電場増強度は、金膜１１０２の膜厚、金膜１１０２の屈折率、プリズム１１００の屈折率、抗原捕捉膜１１０４の膜厚、抗原捕捉膜１１０４の屈折率、反射面１１４２への励起光ＥＬの入射角θ等に依存する。

抗原捕捉膜１１０４に捕捉される抗原１１８０の量は、抗原捕捉膜１１０４に固定されている抗体１３２０の密度、抗原捕捉膜１１０４において抗体１３２０が固定されている範囲の面積、１次免疫反応を進行させる時間、抗原捕捉膜１１０４に固定された抗体１３２０の活性度、蛍光標識１２２０による標識率、蛍光標識１２２０の活性度、試料液１２００に含まれる抗原１１８０の濃度等に依存する。

測定機構１０４２の感度は、集光レンズの透過率、バンドバスフィルター１０８２の透過率、光電子増倍管１０８０の感度等に依存する。

このように、測定される蛍光量は、試料液１２００に含まれる抗原１１８０の濃度以外の多数の因子に依存し、本体１０２０、センサーチップ１０２２及び蛍光標識液１２４０の個体差及び経時変化に左右される。

（ロットごとの検量線の補正）
図１６のグラフは、ロットごとの検量線の補正を示す。図１７のグラフは、ロットごとの検量線及び個々のセンサーチップの正確な検量線を示す。

図１６に示すように、ロットごとの検量線ＬＣが提供される場合は、提供された検量線ＬＣに対して本体１０２０、センサーチップ１０２２及び試薬チップ１０２４の経時変化を考慮した補正が行われ、補正された検量線ＬＤが用いられる。

しかし、図１７に示すように、個々のセンサーチップ１０２２の正確な検量線ＬＥ及びＬＦは、ロットごとの検量線ＬＤと必ずしも同じではなく、一方のセンサーチップ１０２２の検量線ＬＥと他方のセンサーチップ１０２２の検量線ＬＦとは必ずしも同じではないこのため、補正された検量線ＬＤが用いられても、センサーチップ１０２２の個体差の影響により計測の精度が低下する。

しかし、基準蛍光量Ｓ１を用いて蛍光量Ｓ２が規格され、センサーチップ１０２２ごとに補正が行われた場合は、多数の因子の影響を個別に考慮しなくても、多数の因子の影響がまとめて抑制され、センサーチップ１０２２の個体差の影響が抑制される。これにより、計測の精度及び感度が向上し、検出下限の抗原１１８０の濃度が低くなる。

（検量線の作成）
図１８のフローチャートは、検量線の作成の流れを示す。

図１８に示すように、検量線が作成される場合は、２個以上の検量線作成用のセンサーチップ１０２２が準備され（ステップＳ１５１）、蛍光標識液１２４０が準備される（ステップＳ１５２）。準備される検量線作成用のセンサーチップ１０２２の数が１個であってもよい。この場合は、後述する基準蛍光量Ｓ０の代表値Ｓ０’の演算（ステップＳ１５９）が省略される。検量線作成用のセンサーチップ１０２２は、基準蛍光量Ｓ０の事前評価用のセンサーチップ１０２２を兼ねる。検量線作成用のセンサーチップ１０２２と基準蛍光量Ｓ０の事前評価用のセンサーチップ１０２２とが別個であってもよい。検量線作成用のセンサーチップ１０２２及び計測用のセンサーチップ１０２２は、同じ製造ロットのセンサーチップ１０２２から選択される。検量線及び基準蛍光量Ｓ０が製造ロット以外の単位ごとに準備される場合は、検量線及び基準蛍光量Ｓ０が準備される単位となるセンサーチップ１０２２の集団から検量線作成用のセンサーチップ１０２２及び計測用のセンサーチップ１０２２が選択される。望ましくは、基準蛍光量Ｓ０が測定される場合に使用される蛍光標識液１２４０に含まれる蛍光標識１２２０の濃度Ｍ０は、基準蛍光量Ｓ１が測定される場合に使用される蛍光標識１２２０に含まれる蛍光標識１２２０の濃度Ｍ１と同じ既知の濃度である。

検量線作成用のセンサーチップ１０２２及び蛍光標識液１２４０が準備された後に、計測時と同じように、流路１１６０がバッファー液で満たされ（ステップＳ１５３）、共鳴角が検出され（ステップＳ１５４）、自家蛍光量Ｓ０ａが測定され（ステップＳ１５５）、バッファー液が排出される（ステップＳ１５６）。また、流路１１６０が蛍光標識液１２４０で満たされ（ステップＳ１５７）、基準蛍光量Ｓ０が測定される（ステップＳ１５８）。ステップＳ１５３からステップＳ１５８までは、２個以上の検量線作成用のセンサーチップ１０２２の各々に対して実行される。

基準蛍光量Ｓ０が測定された後に、２個以上の検量線作成用のセンサーチップ１０２２についての基準蛍光量Ｓ０の代表値Ｓ０’が求められる（ステップＳ１５９）。代表値Ｓ０’は、２個以上の検量線作成用のセンサーチップ１０２２についての基準蛍光量Ｓ０を統計的に処理することにより求められる。代表値Ｓ０’は、平均値、中間値、最頻値等である。

基準蛍光量Ｓ０の代表値Ｓ０’が求められた場合は、基準蛍光量Ｓ１を基準蛍光量Ｓ０の代表値Ｓ０’で除した商Ｓ１／Ｓ０’を因子として含む補正係数Ｋ＝Ｓ１／Ｓ０’が計測時に用いられる。これにより、検量線作成用のセンサーチップ１０２２の個体差の影響が抑制され、計測の精度が向上する。

基準蛍光量Ｓ０の測定とは別に、又は、基準蛍光量Ｓ０の測定結果を一部に利用して、検量線が作成される（ステップＳ１６０）。

（自家蛍光量を減じる補正）
図１９のフローチャートは、望ましくは行われる、自家蛍光量を減ずる補正の流れを示す。

自家蛍光量を減ずる補正が行われる場合は、計測時の基準蛍光量Ｓ１から計測時の自家蛍光量Ｓ１ａを減ずる補正が行われ、基準蛍光量Ｓ１の補正値Ｓ１−Ｓ１ａが求められる（ステップＳ１８１）。また、検量線作成時の基準蛍光量Ｓ０から検量線作成時の自家蛍光量Ｓ０ａを減ずる補正が行われ、基準蛍光量Ｓ０の補正値Ｓ０−Ｓ０ａが求められる（ステップＳ１８２）。自家蛍光量を減ずる補正が行われた場合は、基準蛍光量Ｓ１の補正値Ｓ１−Ｓ１ａを基準蛍光量Ｓ０の補正値Ｓ０−Ｓ０ａで除した商（Ｓ１−Ｓ１ａ）／（Ｓ０−Ｓ０ａ）を因子として含む補正係数Ｋ＝（Ｓ１−Ｓ１ａ）／（Ｓ０−Ｓ０ａ）が求められる。

これにより、プリズム１１００が放射する自家蛍光の影響が抑制され、計測の精度が向上する。

一般的にいって、計測時の基準蛍光量Ｓ１及び検量線作成時の基準蛍光量Ｓ０は、蛍光標識液１２４０に含まれエバネッセント波ＥＷで励起される蛍光標識１２２０から放射される蛍光量とそれ以外のノイズ成分の蛍光量との和である。前者の蛍光量は、エバネッセント波ＥＷにより励起されることにより生じ、表面プラズモン共鳴による電場増強度を反映する。後者の蛍光量は、エバネッセント波ＥＷ以外により励起されることにより生じ、表面プラズモン共鳴による電場増強度を反映しない。ノイズ成分の蛍光の代表は、プリズム１１００が放射する自家蛍光である。このため、望ましくは、基準蛍光量から自家蛍光量を減ずる補正が行われる。ただし、自家蛍光量に代えて又は自家蛍光量に加えて自家蛍光量以外のノイズ成分の蛍光量を基準蛍光量から減ずる補正が行われてもよい。例えば、金膜１１０２を透過する励起光ＥＬによって励起される界面から離れた位置を浮遊する蛍光標識１２２０から放射される蛍光量を基準蛍光量から減ずる補正が行われてもよい。

この発明は詳細に説明されたが、上記の説明は、すべての局面において例示であり、この発明は上記の説明に限定されない。例示されない無数の変形例が、この発明の範囲から外れることなく想定されうる。

１０２２ センサーチップ
１０４０ 照射機構
１０４２ 測定機構
１０４４ 送液機構
１０４６ コントローラー
１１００ プリズム
１１０２ 金膜
１１０４ 抗原捕捉膜
１１０６ 流路形成物
１１６０ 流路
１１８０ 抗原
１２００ 試料液
１２２０ 蛍光標識
１２４０ 蛍光標識液
１２４２ 抗体
１２６０ 蛍光標識抗体
１２８０ バッファー液
ＥＬ 励起光
ＥＷ エバネッセント波

Claims (9)

1. 表面プラズモン励起蛍光分光法により計測を行う方法であって、
   (a) 誘電体媒体、導電体膜、抗原捕捉膜及び流路形成物を備え、前記誘電体媒体が入射面、反射面及び出射面を備え、励起光が前記入射面に入射し前記反射面に反射され前記出射面から出射するように前記入射面、前記反射面及び前記出射面が配置され、前記導電体膜が第１の主面及び第２の主面を備え、前記反射面が前記第１の主面に密着し、前記抗原捕捉膜が前記第２の主面に定着し、前記流路形成物に流路が形成され、前記抗原捕捉膜が前記流路の内部に露出するセンサーチップから選択された計測用のセンサーチップを準備する工程と、
   (b) 抗原を含む試料液、既知の濃度の蛍光標識を含む蛍光標識液及び蛍光量測定用の液体を準備する工程と、
   (c) 前記計測用のセンサーチップの前記流路に前記試料液を満たし、前記計測用のセンサーチップの前記抗原捕捉膜に前記抗原を捕捉させる工程と、
   (d) 前記工程(c)の後に前記計測用のセンサーチップの前記流路に前記蛍光標識液を満たす工程と、
   (e) 前記計測用のセンサーチップの前記流路に前記蛍光標識液が満たされた状態において、前記計測用のセンサーチップの前記入射面に励起光を入射させ、前記計測用のセンサーチップの前記反射面に共鳴角で励起光を入射させ、前記計測用のセンサーチップの前記流路に満たされる前記蛍光標識液に含まれる前記蛍光標識をエバネッセント波で励起し、前記蛍光標識液に含まれる前記蛍光標識から放射され前記計測用のセンサーチップから出射する蛍光の強度である基準蛍光量を測定する工程と、
   (f) 前記基準蛍光量が測定された後に前記計測用のセンサーチップの前記抗原捕捉膜に捕捉された前記抗原に前記蛍光標識を付加する工程と、
   (g) 前記蛍光標識が付加された後に前記計測用のセンサーチップの前記流路に前記蛍光量測定用の液体を満たす工程と、
   (h) 前記計測用のセンサーチップの前記流路に前記蛍光量測定用の液体が満たされた状態において、前記計測用のセンサーチップの前記入射面に励起光を入射させ、前記計測用のセンサーチップの前記反射面に共鳴角で励起光を入射させ、前記計測用のセンサーチップの前記抗原捕捉膜に捕捉された前記抗原に付加された前記蛍光標識をエバネッセント波で励起し、前記計測用のセンサーチップから出射する蛍光量を測定する工程と、
   (i) 前記基準蛍光量を用いて前記蛍光量を規格化し、規格化された蛍光量を求める工程と、
   を備える計測を行う方法。
2. 請求項１の計測を行う方法において、
   前記工程(d)及び前記工程(e)が前記工程(c)の後に実行される
   計測を行う方法。
3. 請求項１又は請求項２の計測を行う方法において、
   (j) 前記規格化された蛍光量と前記試料液に含まれる前記抗原の濃度との対応を示す検量線を準備する工程と、
   (k) 前記規格化された蛍光量に対応する前記試料液に含まれる前記抗原の濃度を前記検量線において求める工程と、
   をさらに備える計測を行う方法。
4. 請求項１から請求項３までのいずれかの計測を行う方法において、
   前記蛍光標識液が第１の蛍光標識液であり、
   前記既知の濃度が第１の既知の濃度であり、
   前記基準蛍光量が第１の基準蛍光量であり、
   前記計測を行う方法は、
   (l) 前記センサーチップから選択された事前評価用のセンサーチップを準備する工程と、
   (m) 第２の既知の濃度の前記蛍光標識を含む第２の蛍光標識液を準備する工程と、
   (n) 前記事前評価用のセンサーチップの前記流路に前記第２の蛍光標識液を満たす工程と、
   (o) 前記事前評価用のセンサーチップの前記流路に前記第２の蛍光標識液が満たされた状態において、前記事前評価用のセンサーチップの前記入射面に励起光を入射させ、前記事前評価用のセンサーチップの前記反射面に共鳴角で励起光を入射させ、前記事前評価用のセンサーチップの前記流路に満たされた前記第２の蛍光標識液に含まれる前記蛍光標識をエバネッセント波で励起し、前記事前評価用のセンサーチップから出射する第２の基準蛍光量を測定する工程と、
   をさらに備え、
   工程(i)は、前記第１の基準蛍光量を前記第２の基準蛍光量で除した商を因子として含む補正係数を求め、前記蛍光量を前記補正係数で除し、前記規格化された蛍光量を求める
   計測を行う方法。
5. 請求項４の計測を行う方法において、
   工程(l)は、２個以上の前記事前評価用のセンサーチップを準備し、
   工程(n)及び工程(o)が２個以上の前記事前評価用のセンサーチップの各々に対して実行され、
   前記計測を行う方法は、
   (p) ２個以上の前記事前評価用のセンサーチップについての前記第２の基準蛍光量の代表値を求める工程、
   をさらに備え、
   工程(i)は、
   前記第１の基準蛍光量を前記代表値で除した商を因子として含む前記補正係数を求める
   計測を行う方法。
6. 請求項４又は請求項５の計測を行う方法において、
   (q) 前記第１の基準蛍光量に含まれるノイズ成分を測定する工程と、
   (r) 前記第２の基準蛍光量に含まれるノイズ成分を測定する工程と、
   (s) 前記第１の基準蛍光量から前記第１の基準蛍光量に含まれるノイズ成分を減ずる補正を行い、前記第１の基準蛍光量の補正値を求める工程と、
   (t) 前記第２の基準蛍光量から前記第２の基準蛍光量に含まれるノイズ成分を減ずる補正を行い、前記第２の基準蛍光量の補正値を求める工程と、
   をさらに備え、
   工程(i)は、
   前記第１の基準蛍光量の補正値を前記第２の基準蛍光量の補正値で除した商を因子として含む前記補正係数を求める
   計測を行う方法。
7. 請求項４から請求項６までのいずれかの計測を行う方法において、
   工程(m)は、前記第１の既知の濃度と同じ前記第２の既知の濃度の前記蛍光標識を含む前記第２の蛍光標識液を準備する
   計測を行う方法。
8. 請求項１から請求項７までのいずれかの計測を行う方法において、
   工程(b)は、前記抗原と特異的に結合する抗体を含まない前記蛍光標識液を準備し、
   工程(f)は、前記基準蛍光量が測定された後に、前記蛍光標識液に前記抗体を注入し、前記蛍光標識及び前記抗体の複合体である蛍光標識抗体を形成し、前記計測用のセンサーチップの前記抗原捕捉膜に捕捉された前記抗原に前記蛍光標識抗体を結合させ、前記計測用のセンサーチップの前記抗原捕捉膜に捕捉された前記抗原に前記蛍光標識を付加する
   計測を行う方法。
9. 表面プラズモン励起蛍光分光法により計測を行う計測装置であって、
   誘電体媒体、導電体膜、抗原捕捉膜及び流路形成物を備え、前記誘電体媒体が入射面、反射面及び出射面を備え、励起光が前記入射面に入射し前記反射面に反射され前記出射面から出射するように前記入射面、前記反射面及び前記出射面が配置され、前記導電体膜が第１の主面及び第２の主面を備え、前記反射面が前記第１の主面に密着し、前記抗原捕捉膜が前記第２の主面に定着し、前記流路形成物に流路が形成され、前記抗原捕捉膜が前記流路の内部に露出するセンサーチップと、
   抗原を含む試料液、既知の濃度の蛍光標識を含む蛍光標識液及び蛍光量測定用の液体を前記流路に満たす送液機構と、
   前記誘電体媒体に励起光を照射する照射機構と、
   前記センサーチップから出射する光量を測定する測定機構と、
   前記照射機構、前記測定機構及び前記送液機構を制御するコントローラーと、
   を備え、
   前記コントローラーは、
   前記送液機構を制御し、前記試料液を前記流路に満たさせ、前記抗原捕捉膜に前記抗原を捕捉させる１次免疫反応進行部と、
   前記送液機構を制御し、前記蛍光標識液を前記流路に満たさせる蛍光標識液充填部と、
   前記照射機構を制御し、前記抗原が前記抗原捕捉膜に捕捉されるとともに前記流路に前記蛍光標識液が満たされた状態であって前記抗原捕捉膜に捕捉された前記抗原に前記蛍光標識が付加される前に、前記入射面に励起光を入射させ、前記反射面に共鳴角で励起光を入射させ、前記流路に満たされた前記蛍光標識液に含まれる前記蛍光標識をエバネッセント波で励起させ、前記測定機構を制御し、前記蛍光標識液に含まれる前記蛍光標識から放射され前記センサーチップから出射する蛍光の強度である基準蛍光量を測定させる基準蛍光量測定部と、
   前記送液機構を制御し、前記抗原捕捉膜に捕捉された前記抗原に前記蛍光標識が付加された後に前記流路に前記蛍光量測定用の液体を満たさせる液体充填部と、
   前記流路に前記蛍光量測定用の液体が満たされた状態において、前記照射機構を制御し、前記入射面に励起光を入射させ、前記反射面に共鳴角で励起光を入射させ、前記抗原捕捉膜に捕捉された前記抗原に付加された前記蛍光標識をエバネッセント波で励起させ、前記測定機構を制御し、前記センサーチップから出射する蛍光量を測定させる蛍光量測定部と、
   前記基準蛍光量及び前記蛍光量を前記測定機構から取得し、前記基準蛍光量を用いて前記蛍光量を規格化し、規格化された蛍光量を求める演算部と、
   を備える計測装置。

Images