WO2017082069A1 - 反応方法 - Google Patents

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WO2017082069A1
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pipette tip
tip
pipette
temperature
reaction
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野田　哲也
正貴 松尾
洋一 青木
Original Assignee
コニカミノルタ株式会社
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Publication date
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    • G01N35/1009—Characterised by arrangements for controlling the aspiration or dispense of liquids
    • G01N35/1011—Control of the position or alignment of the transfer device
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/021—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids
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    • B01L3/0237—Details of electronic control, e.g. relating to user interface
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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    • G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
    • G01N1/14—Suction devices, e.g. pumps; Ejector devices

Definitions

  • the present invention relates to a reaction method including a reaction step in which two or more substances are reacted using a pipette tip attached to a pipette nozzle for inhaling or discharging a liquid.
  • excitation light is irradiated to a prism on which a metal thin film is formed so as to be totally reflected by the metal thin film, and the excitation light is totally reflected by the metal thin film.
  • a second capture body for example, a secondary antibody
  • a first capture body for example, a primary antibody
  • a pipette tip is used for supplying and removing a specimen and a labeling solution.
  • the pipette tips are integrally formed by injection molding or the like, the lengths are different from each other. Therefore, a method for supplying and removing a specimen and a labeling solution in consideration of the fact that pipette tips have different lengths is known (see, for example, Patent Document 2).
  • the tip position of a resin pipette tip attached to a pipette nozzle is detected by a photosensor. Then, based on the information on the tip position of the pipette tip, the position of the pipette nozzle is adjusted to supply and remove the liquid with high accuracy.
  • the reaction for capturing a small amount of a substance to be detected by the capturing body as described above varies greatly depending on the reaction temperature. For this reason, the apparatus manages the reaction part in the apparatus at a constant temperature optimum for the reaction in relation to the installation environment temperature of the apparatus.
  • the pipette tip supplied to the apparatus is placed in a temperature environment different from the reaction part in the apparatus, such as room temperature, unless it is previously installed in the apparatus. For this reason, when the pipette tip is supplied to the apparatus at the time of measurement, the total length of the pipette tip changes depending on the environmental temperature at the time of supply and removal.
  • an object of the present invention is to accurately control the tip height of the pipette tip with respect to the reaction field, even when the pipette tip is affected by temperature, and appropriately react two or more substances in the reaction field. It is to provide a reaction method that can be performed.
  • a reaction method includes a pipette tip attached to a pipette nozzle for sucking or discharging a liquid, and supplying the liquid to the reaction field and the reaction.
  • a reaction method comprising a reaction step of reacting two or more substances by removing a liquid from a field a plurality of times, wherein the tip height of the pipette tip is detected before the reaction step, and the pipette tip
  • the first step of setting the reference height of the pipette nozzle based on the tip height of the pipette, and the fluctuation of the tip height of the pipette tip due to the temperature of the pipette tip changing during the reaction step A second step of correcting the height of the pipette nozzle from the reference height so as to cancel.
  • the height of the tip of the pipette tip can be accurately controlled even if the pipette tip expands and contracts due to the temperature of the pipette tip changing.
  • the amount of liquid in the reaction field can be controlled with high accuracy.
  • the presence or amount of a substance to be detected can be detected with high accuracy.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining a first step of the reaction method according to the first embodiment.
  • 2A and 2B are diagrams for explaining the second step of the reaction method according to Embodiment 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the temperature of the pipette tip and the elapsed time of the reaction process.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the configuration of the SPFS apparatus.
  • 5A to 5C are diagrams showing the configuration of the detection chip.
  • FIG. 6 is a schematic cross-sectional view of another form of the detection chip.
  • FIG. 7 is a flowchart showing the operation of the SPFS apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 8 is a flowchart showing the content of the step of detecting the tip height of the pipette tip.
  • FIG. 9 is a diagram showing a configuration around the pipette tip of the SPFS device.
  • 10A is a side view for explaining the arrangement of the second temperature measuring means
  • FIG. 10B is a sectional view
  • FIG. 10C explains the arrangement of the second temperature measuring means and the arrangement of the temperature control mechanism.
  • FIG. 10D is a cross-sectional view.
  • a reaction method uses a pipette tip attached to a pipette nozzle for sucking or discharging a liquid to supply a liquid to the reaction field and remove the liquid from the reaction field. It includes a reaction step that is performed a plurality of times to react two or more substances.
  • FIG. 1 is a diagram showing a step (first step) of detecting the tip height of the pipette tip A.
  • FIG. 2 is a diagram showing a step (second step) for setting the reference height of the pipette nozzle B.
  • 2A is a diagram for explaining a case where the temperature when the pipette tip A is attached to the pipette nozzle B is lower than the temperature when the reaction step is performed
  • FIG. 2B is the case where the pipette tip A is attached to the pipette nozzle B It is a figure for demonstrating the case where the temperature when performing is higher than the temperature when performing a reaction process.
  • the reaction method according to Embodiment 1 is a method that is performed without measuring the temperature of the pipette tip A.
  • the reaction method includes a first step for setting the reference height of the pipette nozzle B before the reaction step, and a second step for correcting the height of the pipette nozzle B from the reference height in the middle of the reaction step.
  • the “reaction step” means a step including an operation of supplying a liquid to the reaction field and an operation of removing the liquid from the reaction field. Two or more substances are supplied by supplying a specimen to the reaction field. And the step of removing the specimen after reacting, the step of supplying the cleaning liquid to the reaction field and removing the cleaning liquid from the reaction field.
  • liquid includes a specimen, a washing solution, a buffer solution, and the like.
  • first temperature the temperature of the pipette tip in the first step of attaching the pipette tip A to the pipette nozzle B, and the pipette tip in the reaction step of reacting two or more substances.
  • second temperature the temperature of the pipette tip
  • the first temperature may be higher than the second temperature or lower than the second temperature.
  • the case where the first temperature is lower than the second temperature is, for example, the case where the apparatus is installed in a temperature environment of 20 ° C.
  • room temperature and the temperature of the part where the reaction process of this apparatus is performed may be controlled at 37 ° C. .
  • the pipette tip A stored in a temperature environment of 20 ° C. (normal temperature) is installed on the apparatus by opening a hatch (not shown) of the apparatus.
  • the elapsed time after the pipette tip A is installed in the apparatus is short. Therefore, the temperature of the pipette tip A has not increased so much, for example, it is still about 20 ° C., and the temperature of the pipette tip A is influenced by the temperature inside the pipette tip A around the passage of a predetermined time thereafter. In response, the temperature rises gradually. Then, the temperature of the pipette tip A in the reaction step may be equal to or higher than the temperature in the first step (about 20 ° C.) and may rise to a maximum of 37 ° C.
  • the internal temperature at which the reaction process is performed is maintained at 37 ° C.
  • the device and the pipette tip A are installed in a temperature environment lower than the internal temperature, and an example in which the pipette tip A having an initial temperature lower than the internal temperature is brought into the device is described.
  • the outside air flows into the device, and at the time when the pipette tip A is installed (the first step thereafter), the temperature inside the chamber around the pipette nozzle B is temporarily changed to the outside temperature. It may have changed in the approaching direction.
  • the space for mounting the pipette tip A to the pipette nozzle B and the space for performing the reaction step are separate spaces in the apparatus, and only the space for performing the reaction is managed at 37 ° C. This corresponds to the case where the space to be mounted is not temperature-controlled (for example, a temperature close to the outside air temperature where the apparatus is installed).
  • the tip height of the pipette tip A is detected before the reaction step, and the reference height of the pipette nozzle B is set based on the tip height of the pipette tip A.
  • the method for detecting the tip height of the pipette tip A is not particularly limited. Examples of the method for detecting the tip height of the pipette tip A include a method using the air pressure in the pipette tip A. Gas was sucked or discharged from the tip of the pipette tip A by changing the distance between the tip of the pipette tip A and a reference portion (in this embodiment, a reaction field) C which is the reference height of the tip of the pipette tip A.
  • the reference height (h2) of the pipette nozzle A is set.
  • the detected tip height of the pipette tip A is corrected to a height (for example, 100 ⁇ m) h1 when the liquid is removed from the reaction field.
  • the height of the pipette nozzle B after the correction is the reference height (h2) of the pipette nozzle B.
  • the height of the pipette nozzle B is set so as to cancel the fluctuation of the tip position of the pipette tip A due to the temperature change of the pipette tip A during the reaction step.
  • the height is corrected from the reference height.
  • the tip height of the pipette tip A varies so as to approach the reaction field with the elapsed time after the first step.
  • the tip height of the pipette tip A varies from h1 to h1 '. This is because the internal temperature around the pipette tip A is higher than the temperature at the time when the pipette tip A is installed in the apparatus, so that the temperature of the pipette tip A gradually increases depending on the internal temperature. This is because the total length of A becomes longer.
  • the height of the pipette nozzle B is corrected from the reference height h2 to h2 'so as to cancel the fluctuation of the tip height of the pipette tip A. That is, the height of the pipette nozzle B is corrected to be higher than the reaction field so that the tip of the pipette tip A with respect to the reaction field has a predetermined height (h1).
  • the total length of the pipette tip A gradually depends on the internal temperature.
  • the temperature decreases as the temperature decreases.
  • the pipette tip A varies from the tip height h1 to h1 '.
  • the height of the pipette nozzle B is corrected from the reference height h2 to h2 'so as to cancel the fluctuation of the tip height of the pipette tip A. That is, the height of the pipette nozzle B is corrected to be lower than the reaction field so that the tip of the pipette tip A with respect to the reaction field has a predetermined height (h1).
  • the time for correcting the height of the pipette nozzle B from the reference height is immediately before supplying the liquid to the reaction field, or after supplying the liquid to the reaction field and before removing the liquid from the reaction field (particularly , Immediately before removal).
  • the height of the pipette nozzle B from the reference height at such time, the positional relationship between the reaction field and the tip of the pipette tip A can be accurately controlled.
  • the amount of liquid remaining in the reaction field can be controlled with high accuracy.
  • the height of the pipette nozzle B is preferably corrected according to the elapsed time of the reaction process.
  • the pipette tip A is affected by the internal temperature around the pipette tip A during the reaction process.
  • the tip height of the pipette nozzle B gradually changes according to the elapsed time of the reaction process. Therefore, by correcting the height of the pipette nozzle B according to the elapsed time of the reaction process, the fluctuation of the tip of the pipette tip A can be easily and quickly canceled without measuring the total length of the pipette tip A. . Further, since a special device is not required, it can be performed at low cost and in a small space.
  • the height of the pipette nozzle B varies with time in the length between the tip of the pipette tip A and the fitting portion of the pipette nozzle B, the linear expansion coefficient of the pipette tip A, and the temperature of the pipette tip A. And it is preferable to correct based on the elapsed time of the reaction step.
  • the height of the pipette nozzle B is preferably corrected based on the maximum amount of change in the temperature of the pipette tip A in the reaction step in addition to the elements described above.
  • the length from the tip of the pipette tip A to the fitting portion with the pipette nozzle B is measured in advance by an arbitrary measuring device.
  • the linear expansion coefficient of the pipette tip A is determined for each material of the pipette tip A.
  • the pipette tip A is preferably made of resin from the viewpoint that it can be easily and inexpensively manufactured.
  • the coefficient of linear expansion of pipette tip A when using polypropylene is about 5.8 ⁇ 10 ⁇ 5 to 12 ⁇ 10 ⁇ 5 / ° C.
  • the coefficient of linear expansion of pipette tip A when using polystyrene is 6 It is about 0.0 ⁇ 10 ⁇ 5 to 8.0 ⁇ 10 ⁇ 5 / ° C.
  • the linear expansion coefficient of the pipette tip A when using polyethylene is about 11 ⁇ 10 ⁇ 5 to 15 ⁇ 10 ⁇ 5 / ° C.
  • the linear expansion coefficient of the pipette tip A when using low density polyethylene is 16 ⁇ 10 ⁇ 5 to 20 ⁇ 10 ⁇ 5 / ° C.
  • the linear expansion coefficient of the pipette tip A when using a fluororesin is about 10 ⁇ 10 ⁇ 5 to 12 ⁇ 10 ⁇ 5 / ° C.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the temperature of the pipette tip A and the elapsed time of the reaction process after the first process.
  • the horizontal axis in FIG. 3 is the elapsed time in the reaction step after the first step, and the vertical axis is the temperature (° C.) of the pipette tip A.
  • the temperature of the pipette tip A when the pipette tip A is attached to the pipette nozzle B is in the range of 10 to 30 degrees.
  • the internal temperature of the space in which the reaction process is performed was 37 ° C.
  • the maximum temperature reached by the pipette tip A in the space was 35 ° C.
  • F10 shown in FIG. 3 is a function indicating the relationship between the elapsed time and the temperature of the pipette tip A when the temperature of the pipette tip A when the pipette tip A is attached to the pipette nozzle B is 10 ° C.
  • F20 is a function indicating the relationship between the elapsed time and the temperature of the pipette tip A when the temperature of the pipette tip A is 20 ° C.
  • the relationship between the elapsed time of the reaction process and the temperature of the pipette tip A differs depending on the temperature of the pipette tip A when the pipette tip A is mounted on the pipette nozzle B.
  • the relationship between the elapsed time and the temperature of the pipette tip A is obtained in advance. If the temperature of the pipette tip A is not measured, it is unclear which temperature is within the range of 10 to 30 ° C. in the first step. In this case, after detecting the tip height of the pipette tip A, the temperature range that can be taken by the pipette tip A after t1 seconds after the start of the reaction step is the range of “A” shown in FIG. The temperature range that the pipette tip A can take after t2 seconds is within the range of “B” shown in FIG.
  • the maximum value of the temperature change amount of the pipette tip A after t1 seconds is “C” shown in FIG. 3, and can be represented by F10 (t1) ⁇ F10 (t0).
  • the minimum value of the change amount of the temperature of the pipette tip A after t1 seconds is “D” shown in FIG. 3, and can be represented by F30 (t1) ⁇ F30 (t0).
  • the amount of change in the temperature of the pipette tip A is such that the lower the temperature of the pipette tip A at the first step (or immediately after the start of the reaction), the greater the temperature difference from the maximum temperature reached.
  • the amount of change in the temperature of the pipette tip A after t seconds increases.
  • time change function of the temperature of the pipette tip A is the temperature (initial temperature) in the first step of the pipette tip A, and the warehouse for performing the reaction step. Depends on the internal temperature.
  • assumed cases will be described.
  • the rate of change of the pipette tip A at the changed temperature difference is known from the changed temperature difference and the linear expansion coefficient of the pipette tip A.
  • the fluctuation amount of the tip of the pipette tip A can be estimated.
  • the correction amount of the pipette nozzle B is estimated based on the fluctuation.
  • the length between the tip of the pipette tip A and the fitting portion of the pipette nozzle B, the linear expansion coefficient of the pipette tip A, the temperature variation of the pipette tip A, and the progress of the reaction process By estimating the correction amount of the height of the pipette nozzle B based on the time, the height of the pipette nozzle B when a predetermined time elapses in the reaction process without measuring the temperature of the pipette tip A is accurate. It can be positioned well.
  • the slope (change rate) of the time change function of the temperature of the pipette tip A becomes smaller with the elapsed time. If the internal temperature of the space in which the reaction process is performed is constant while the reaction process is performed, the slope (change rate) of the time change function of the temperature of the pipette tip A decreases with the elapsed time.
  • assumed cases will be described.
  • the temperature of the pipette tip A may be estimated by measuring the internal temperature when the pipette tip A is attached to the pipette nozzle B by the first temperature measuring means. In this case, if the ambient environment temperature in the first step is known (for example, 20 ° C.), it can be estimated that the temperature is close to the initial temperature of the pipette tip A immediately after being input. And the maximum amount of change in the temperature of the pipette tip A after t1 seconds can be expressed as F20 (t1) -F20 (t0).
  • the maximum change amount of the temperature of the pipette tip A is F10 (t1) -F10 (t0), and the minimum change amount is F30 (t1) -F30 (t0).
  • the correction amount is calculated as F30 (t1) ⁇ F30 (t0) or more and F10 (t1) ⁇ F10 (t0) or less, and the height of the pipette nozzle B can be corrected. From the viewpoint of avoiding the collision of the tip of the pipette tip, it is more desirable to correct the height of the pipette nozzle B with the maximum correction amount calculated from the maximum change amount F10 (t1) ⁇ F10 (t0).
  • the height (correction amount) of the pipette nozzle B after correcting the height of the pipette nozzle B from the reference height can be estimated and corrected.
  • this maximum temperature change is corrected, the reaction field and the tip position of the pipette tip A are separated from each other, but at least the tip of the pipette tip A can be prevented from colliding with the reaction field.
  • the reference height of the pipette nozzle B is set based on the tip height of the pipette tip A, and the fluctuation of the tip height of the pipette tip A is canceled out. Since the height of the pipette nozzle B is corrected from the reference height, the positional relationship (distance) between the reaction field and the tip of the pipette tip A can be accurately controlled. Thereby, since the reaction process can be controlled with high accuracy, a result can be obtained quantitatively with high sensitivity.
  • the reaction method according to the second embodiment is different from the reaction method according to the first embodiment in that the temperature of the pipette tip A is measured.
  • the reaction method according to Embodiment 2 corrects the height of the pipette nozzle B from the reference height during the first step of setting the reference height of the pipette nozzle B before the reaction step and during the reaction step.
  • a second step In the first step, the temperature of the pipette tip A is further measured by the second temperature measuring means.
  • the temperature of the pipette tip A is preferably measured after the pipette tip A is attached to the pipette nozzle B and immediately before the transition to the reaction step, more preferably the first step. It is almost the same time.
  • the temperature of the pipette tip A is further measured by the second temperature measuring means, and the tip height of the pipette tip A measured by the second temperature measuring means in the first step is detected.
  • the height of the pipette nozzle B is corrected from the quasi-height.
  • the temperature of the pipette tip A may be constantly measured.
  • the length between the tip of the pipette tip A and the fitting portion of the pipette nozzle B, the linear expansion coefficient of the pipette tip A, and the pipette when the tip height of the pipette tip A is detected It is preferable to correct the height of the pipette nozzle B from the reference height based on the difference between the temperature of the tip A (first temperature) and the temperature of the pipette tip A (second temperature) in the reaction process. In this case, since the fluctuation of the height of the pipette tip A can be accurately grasped by measuring the temperature of the pipette tip A, the pipette nozzle A can be accurately controlled.
  • the pipette tip A is made of polypropylene, and the linear expansion coefficient of the pipette tip A is 10 ⁇ 10 ⁇ 5 / ° C.
  • the length from the tip of the pipette tip A to the fitting portion with the pipette nozzle B is 70 mm.
  • the pipette tip A is attached to the pipette nozzle B, and the temperature when the tip height of the pipette tip A is detected is set to 10 ° C. In the reaction space, the temperature of the pipette tip A rises to 35 ° C. That is, it is assumed that the temperature of the pipette tip B has changed from 10 ° C. to 35 ° C.
  • the pipette tip A extends 175 ⁇ m.
  • the distance between the reaction field and the tip of the pipette tip A 100 ⁇ m or less in order to reduce the amount of liquid in the reaction field.
  • the tip of the pipette tip A comes into contact with the reaction field.
  • the reference height of the pipette nozzle B is corrected by an amount corresponding to the extension of the pipette tip A. In this case, it is moved upward by 175 ⁇ m.
  • the temperature of the pipette tip A may be controlled by a temperature control mechanism.
  • the temperature of the pipette tip A can be maintained constant, and the temperature of the liquid after suction can be maintained, so that the reaction can be performed with higher accuracy.
  • pump suction and discharge are repeated a plurality of times and the reaction solution is reciprocated a plurality of times between the reaction field and the pipette tip, it is more effective to maintain the temperature in the pipette tip.
  • preliminary temperature control can be performed in the pipette, which is effective.
  • the temperature of the pipette tip A is measured twice in the first step and the second step by the second temperature measuring means, and the correction amount is calculated based on the temperature difference.
  • Such a case is effective when, for example, an error occurs in the temperature measurement of the pipette tip A due to the influence of the temperature control (heater) of the pipette tip A arranged nearby. Also, at the time of the first step, the temperature of the pipette tip A is turned off and the temperature of the pipette tip A is measured. In the subsequent reaction step, the temperature control of the pipette tip A is turned on and the reaction is performed at a stable temperature.
  • SPFS equipment As an example of an apparatus for performing the reaction method according to Embodiments 1 and 2 described above, a surface plasmon excitation enhanced fluorescence analyzer (SPFS apparatus) for detecting the presence or amount of a target substance contained in a specimen ).
  • SPFS apparatus surface plasmon excitation enhanced fluorescence analyzer
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon excitation enhanced fluorescence analyzer (SPFS apparatus) 100 capable of performing the reaction method according to the first embodiment.
  • SPFS apparatus surface plasmon excitation enhanced fluorescence analyzer
  • the SPFS device 100 includes a liquid feeding unit 110 including a pipette 111 and a pipette moving unit 112, a transport unit 120 including a tip holder 121, a position information acquisition unit 130, and a light irradiation unit 140. And a light detection unit 150 and a control unit 160.
  • the SPFS device 100 is used with the detection chip 10 mounted on the chip holder 121. Therefore, the detection chip 10 will be described first, and then each component of the SPFS device 100 will be described.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a configuration of the detection chip 10.
  • 5A is a plan view of the detection chip 10
  • FIG. 5B is a cross-sectional view taken along line AA shown in FIG. 5A
  • FIG. 5C is a cross-sectional view taken along line BB shown in FIG. 5A.
  • FIG. 6 is a schematic cross-sectional view showing another form of the detection chip 10.
  • the detection chip 10 includes a prism 20 including an incident surface 21, a film formation surface 22 and an output surface 23, a metal film 30, a flow path including a reaction region 41 and a reagent storage region 42. And a lid 40.
  • the metal film 30 and the flow path lid 40 are disposed on the film formation surface 22 of the prism 20.
  • the prism 20, the metal film 30, and the channel lid 40 form a channel 60 through which liquid flows.
  • the flow path 60 is disposed directly or via the metal film 30 on the film formation surface 22 of the prism 20.
  • the detection chip 10 may be a reusable chip or a disposable chip. In the present embodiment, the detection chip 10 is a disposable chip.
  • liquid flowing in the flow path 60 examples include a specimen (for example, blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, semen, etc.) containing a substance to be detected, and a capturing body labeled with a fluorescent substance. Labeling solution, washing solution, etc. are included.
  • the prism 20 is made of an insulator that is transparent to the excitation light ⁇ .
  • the incident surface 21 of the prism 20 causes the excitation light ⁇ from the light irradiation unit 140 to enter the prism 20.
  • a metal film 30 is disposed on the film formation surface 22.
  • the excitation light ⁇ incident on the inside of the prism 20 is applied to the metal film 30 where the substance to be detected is captured.
  • the excitation light ⁇ is reflected on the back surface of the metal film 30 to become reflected light ⁇ . More specifically, the excitation light ⁇ is reflected at the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30 to become reflected light ⁇ .
  • the emission surface 23 emits the reflected light ⁇ to the outside of the prism 20.
  • the shape of the prism 20 is not particularly limited.
  • the prism 20 is a pillar having a trapezoidal bottom surface.
  • the surface corresponding to one base of the trapezoid is the film formation surface 22, the surface corresponding to one leg is the incident surface 21, and the surface corresponding to the other leg is the emission surface 23.
  • the trapezoid serving as the bottom surface is preferably an isosceles trapezoid. Thereby, the entrance surface 21 and the exit surface 23 are symmetric, and the S wave component of the excitation light ⁇ is less likely to stay in the prism 20.
  • the incident surface 21 is formed so that the excitation light ⁇ does not return to the light irradiation unit 140.
  • the light source of the excitation light ⁇ is a laser diode (hereinafter also referred to as “LD”)
  • LD laser diode
  • the angle of the incident surface 21 is set so that the excitation light ⁇ does not enter the incident surface 21 perpendicularly in the scanning range centered on the enhancement angle.
  • the “enhancement angle” means scattered light having the same wavelength as the excitation light ⁇ emitted above the detection chip 10 when the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 is scanned (hereinafter referred to as “plasmon scattered light”). This means the angle of incidence when the amount of ⁇ is maximized.
  • the angle between the incident surface 21 and the film formation surface 22 and the angle formed between the film formation surface 22 and the emission surface 23 are both about 80 °.
  • the enhancement angle is generally determined by the design of the detection chip 10.
  • the design factors are the refractive index of the prism 20, the refractive index of the metal film 30, the film thickness of the metal film 30, the extinction coefficient of the metal film 30, the wavelength of the excitation light ⁇ , and the like.
  • the enhancement angle is shifted by the substance to be detected trapped on the metal film 30, but the amount is less than several degrees.
  • the prism 20 has a considerable amount of birefringence.
  • the material of the prism 20 include insulating resin and glass.
  • the material of the prism 20 is preferably a resin having a refractive index of 1.4 to 1.6 and a small birefringence.
  • the metal film 30 is disposed so as to be exposed to at least a part of the flow path 60 on the film formation surface 22 of the prism 20.
  • the metal film 30 causes an interaction (SPR) between the photon of the excitation light ⁇ incident on the film formation surface 22 under total reflection conditions and the free electrons in the metal film 30, and is locally on the surface of the metal film 30.
  • SPR interaction
  • In-situ light commonly referred to as “evanescent light” or “near-field light” can be generated.
  • the material of the metal film 30 is not particularly limited as long as it is a metal capable of generating SPR.
  • Examples of the material of the metal film 30 include gold, silver, copper, aluminum, and alloys thereof.
  • the metal film 30 is a gold thin film.
  • the method for forming the metal film 30 is not particularly limited. Examples of the method for forming the metal film 30 include sputtering, vapor deposition, and plating.
  • the thickness of the metal film 30 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 70 nm.
  • a capturing body for capturing a substance to be detected is fixed on the surface of the metal film 30.
  • the substance to be detected can be selectively detected.
  • the capturing body is uniformly fixed to a predetermined region on the metal film 30.
  • the region where the capturing body is fixed serves as a reaction field where a primary reaction and a secondary reaction described later occur.
  • the capturing body fixed to the metal film 30 is exposed in the flow path 60.
  • the type of capturing body is not particularly limited as long as it can capture the substance to be detected.
  • the capturing body is an antibody or a fragment thereof that can specifically bind to the substance to be detected.
  • the channel lid 40 is disposed on the film formation surface 22.
  • the flow path lid 40 has the reaction region 41 and the reagent storage region 42.
  • the reaction region 41 is a region for performing a primary reaction and a secondary reaction described later.
  • the reagent storage area 42 is an area in which a labeling solution used for the secondary reaction, a cleaning solution used for cleaning after each reaction, and the like are stored.
  • a channel groove 43 to be the channel 60 is formed on the back surface of the reaction region 41 in the channel lid 40.
  • a first through hole 44 serving as the injection portion 70 and a second through hole 45 serving as the storage portion 80 are opened on the front surface and the back surface of the reaction region 41, respectively.
  • Both ends of the flow channel 43 are connected to the first through hole 44 and the second through hole 45, respectively.
  • a recess 46 opened on the surface is formed in the reagent storage area 42.
  • the number of the recessed parts 46 is not specifically limited. In the present embodiment, the number of recesses 46 is two.
  • a labeling solution used for the secondary reaction, a cleaning solution, and the like are stored in the recess 46.
  • the channel groove 43, the first through hole 44, and the second through hole 45 become the channel 60, the injection unit 70, and the storage unit 80, respectively, by stacking the prism 20, the metal film 30, and the channel lid 40 in this order. .
  • the channel lid 40 is preferably made of a material that is transparent to the fluorescence ⁇ emitted from the metal film 30 and the plasmon scattered light ⁇ .
  • An example of the material of the flow path lid 40 includes a resin.
  • the flow path cover 40 may be formed of an opaque material as long as the portion from which the fluorescent ⁇ and the plasmon scattered light ⁇ are extracted is transparent to the fluorescent ⁇ and the plasmon scattered light ⁇ .
  • the channel lid 40 is bonded to the prism 20 or the metal film 30 by, for example, adhesion using a double-sided tape or an adhesive, laser welding, ultrasonic welding, or pressure bonding using a clamp member.
  • the detection chip 10 ′ may have a well 60 ′ instead of the flow path 60.
  • liquid is injected or removed from the opening of the well 60 ′.
  • the reaction field may be formed in such a manner that the capture body is fixed in advance to the bottom of the well or the wall surface of the well, and may react with the substance to be detected in the solution.
  • a liquid-liquid reaction may be performed in the solution in the well.
  • the excitation light ⁇ enters the prism 20 at the incident surface 21.
  • the excitation light ⁇ that has entered the prism 20 is applied to the metal film 30 at a total reflection angle (an angle at which SPR occurs).
  • a total reflection angle an angle at which SPR occurs.
  • This localized field light excites a fluorescent substance that labels the substance to be detected present on the metal film 30 and emits fluorescence ⁇ .
  • the SPFS device 100 detects the presence or amount of the substance to be detected by measuring the amount of fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent substance.
  • the SPFS device 100 includes the liquid feeding unit 110, the transport unit 120, the position information acquisition unit 130, the light irradiation unit 140, the light detection unit 150, and the control unit 160.
  • the detection chip 10 can be held by the chip holder 121 of the transport unit 120.
  • the liquid feeding unit 110 includes a liquid feeding pump 111, a pipette nozzle 116, a pipette nozzle driving mechanism 112, and a liquid feeding pump driving mechanism 113.
  • the liquid feeding unit 110 injects a specimen into the flow path 60 of the detection chip 10 held by the chip holder 121, or a liquid such as a labeling solution or a cleaning liquid stored in the reagent storage region 42 of the detection chip 10 in the reaction region. 41 in the channel 60. Further, the liquid feeding unit 110 also discharges the liquid from the flow path 60 and stirs the liquid in the flow path 60.
  • the liquid feeding unit 110 is used in a state where the pipette tip 170 is attached to the pipette nozzle 116. It should be noted that the pipette tip 170 is preferably replaceable from the viewpoint of preventing contamination of impurities.
  • the liquid feed pump 111 sucks the liquid when supplying the liquid to the flow path 60 or removing the liquid from the flow path 60.
  • the liquid feed pump 111 includes a syringe 114, a plunger 115 that can reciprocate within the syringe 114, and a syringe 114, and a pipette nozzle 116 is connected to the syringe 114. Further, the liquid feed pump 111 can quantitatively suck and discharge the liquid by the reciprocating motion of the plunger 115. Thereby, the liquid feed pump 111 can supply the liquid to the flow path 60 or remove the liquid from the flow path 60. Further, the liquid feed pump 111 can agitate the liquid in the flow path 60 by repeatedly sucking and discharging the liquid.
  • the pipette nozzle drive mechanism 112 moves the pipette nozzle 116 in order to supply the liquid into the flow path 60 via the injection section 70 and to remove the liquid from the flow path 60 via the injection section 70.
  • the pipette nozzle drive mechanism 112 moves the pipette nozzle 116 in order to correct the height of the pipette nozzle 116 described above from the reference height.
  • the pipette nozzle driving mechanism 112 freely moves the pipette nozzle 116 in the axial direction (for example, the vertical direction) of the pipette nozzle 116.
  • the pipette nozzle drive mechanism 112 includes, for example, a solenoid actuator and a stepping motor.
  • the liquid feed pump drive mechanism 113 moves the plunger 115 to suck the external liquid into the pipette tip 170 or discharge the liquid inside the pipette tip 170 to the outside.
  • the liquid feed pump drive mechanism 113 includes a device for reciprocating the plunger 115 such as a stepping motor.
  • the stepping motor is preferable from the viewpoint of managing the remaining liquid amount of the detection chip 10 because it can manage the liquid feeding amount and the liquid feeding speed of the liquid feeding pump 111.
  • the liquid feeding section 110 sucks various liquids from the recess 46 and supplies them to the flow path 60 of the detection chip 10.
  • the reciprocating operation of the plunger 115 with respect to the syringe 114 is repeated, thereby liquid inside the flow channel 60 in the detection chip 10.
  • Reciprocates, and the liquid in the flow path 60 is agitated.
  • the liquid in the channel 60 is again sucked by the liquid feed pump 111 and discharged to a waste liquid tank or the like not shown.
  • reaction with various liquids, washing, and the like can be performed, and a detection target substance labeled with a fluorescent substance can be arranged in the reaction field in the flow path 60.
  • the height of the pipette nozzle 116 is corrected from the reference height so as to cancel the fluctuation in the tip height of the pipette tip 170.
  • the transport unit 120 transports the detection chip 10 to the mounting position, the detection position, or the liquid feeding position, and holds the detection chip 10.
  • the “mounting position” is a position where the pipette tip 170 is mounted on the pipette nozzle 116.
  • the “detection position” is a position where the light irradiation unit 140 irradiates the detection chip 10 with the excitation light ⁇ , and the light detection unit 150 detects the fluorescence ⁇ or the plasmon scattered light ⁇ generated accordingly.
  • the “liquid feeding position” is a position where the liquid feeding unit 110 injects liquid into the flow channel 60 of the detection chip 10 or removes the liquid in the flow channel 60 of the detection chip 10.
  • the transport unit 120 includes a chip holder 121 and a transport stage 122. The “mounting position” and the “detection position” may be the same position.
  • the chip holder 121 is fixed to the transfer stage 122 and holds the detection chip 10 in a detachable manner.
  • the shape of the chip holder 121 is not particularly limited as long as it can hold the detection chip 10 and does not interfere with the optical paths of the excitation light ⁇ , fluorescence ⁇ , and plasmon scattered light ⁇ .
  • the shape of the chip holder 121 is configured so that the detection chip 10 can be held with the flow path lid 40 interposed therebetween.
  • the transfer stage 122 moves the chip holder 121 in one direction and in the opposite direction (left and right direction on the paper surface of FIG. 1).
  • the transport stage 122 also has a shape that does not interfere with the optical paths of the excitation light ⁇ , fluorescence ⁇ , and plasmon scattered light ⁇ .
  • the transfer stage 122 is driven by, for example, a stepping motor.
  • the position information acquisition unit 130 acquires the tip height of the pipette tip 170.
  • the position information acquisition unit 130 is not particularly limited as long as information about the tip height of the pipette tip 170 can be acquired.
  • the position information acquisition unit 130 includes an air pressure sensor 131.
  • the air pressure sensor 131 is connected between the pipette nozzle 116 and the syringe 114.
  • the type of the air pressure sensor 131 is not particularly limited as long as the air pressure (pressure) in the pipette tip 170 can be measured. Examples of the type of the air pressure sensor 131 include a mechanical sensor using a Bourdon tube, an electronic sensor using a semiconductor, and the like.
  • the tip height of the pipette tip 170 is such that the distance between the tip of the pipette tip 170 and the reference portion 180 is changed so that the gas is sucked or discharged from the tip of the pipette tip 170. It is acquired by measuring a change in air pressure with the air pressure sensor 131.
  • the reference unit 180 may be solid or liquid, and is not particularly limited as long as the height is specified with high accuracy. Examples of the solid reference portion 180 include the flow channel lid 40 and the seal 50 in the detection chip 10, the prism 20 (the bottom surface of the flow channel 60), and the like.
  • Examples of the reference unit 180 in the SPFS apparatus 100 include a transfer stage 122, a chip holder 121, an arrangement surface (a portion located below the pipette nozzle 116) on which the transfer stage 122 is arranged in the transfer unit 120. Also good.
  • Examples of the liquid reference portion 180 include the liquid level stored in the recess 46 in the detection chip 10, the liquid level in the flow channel 60, and the like.
  • the position of the reaction field is desirably used as the reference unit 180 more directly.
  • the prism 20 the bottom surface of the channel 60
  • the reference portion 180 is used.
  • the suction or discharge of gas at the tip of the pipette tip 170 may be performed continuously or intermittently.
  • the air pressure sensor 131 is changed while the distance between the tip position of the pipette tip 170 and the reference portion 180 is changed while discharging the gas from the tip of the pipette tip 170 using the liquid feed pump 111.
  • the threshold value is greater than or equal to the threshold value, the tip position of the pipette tip 170 is detected assuming that the tip of the pipette tip 170 is close to the reference portion 180. It is preferable to appropriately adjust the threshold used for the determination according to the reference unit 180.
  • the threshold value can be increased as compared with the case where the reference part 180 is liquid.
  • the sensor for detecting the tip height of the pipette tip 170 in the first step is not only a pneumatic sensor but also a contact pressure sensor, load cell, non-contact image sensor, etc., as long as the tip height can be accurately detected.
  • Various sensors can be used.
  • the first step since the liquid is not yet sucked into the pipette tip 170, there is no concern that the apparatus is contaminated, and not only a non-contact type but also a contact type sensor can be used.
  • the light irradiation unit 140 irradiates the excitation light ⁇ toward the incident surface 21 of the detection chip 10 held by the chip holder 121. At the time of measuring the fluorescence ⁇ or the plasmon scattered light ⁇ , the light irradiation unit 140 emits only the P wave toward the incident surface 21 so that the incident angle with respect to the metal film 30 is an angle that causes SPR. .
  • the “excitation light” is light that directly or indirectly excites the fluorescent material.
  • the excitation light ⁇ is light that generates localized field light on the surface of the metal film 30 that excites the fluorescent material when the metal film 30 is irradiated through the prism 20 at an angle at which SPR occurs.
  • the light irradiation unit 140 includes a light source unit 141, an angle adjustment mechanism 142, and a light source control unit 143.
  • the light source unit 141 emits the collimated excitation light ⁇ having a constant wavelength and light amount so that the shape of the irradiation spot on the back surface of the metal film 30 is substantially circular.
  • the light source unit 141 includes, for example, a light source of excitation light ⁇ , a beam shaping optical system, an APC mechanism, and a temperature adjustment mechanism (all not shown).
  • the type of the light source is not particularly limited, and is, for example, a laser diode (LD).
  • Other examples of light sources include light emitting diodes, mercury lamps, and other laser light sources.
  • the light emitted from the light source is not a beam, the light emitted from the light source is converted into a beam by a lens, a mirror, a slit, or the like.
  • the light emitted from the light source is not monochromatic light, the light emitted from the light source is converted into monochromatic light by a diffraction grating or the like.
  • the light emitted from the light source is not linearly polarized light, the light emitted from the light source is converted into linearly polarized light by a polarizer or the like.
  • the beam shaping optical system includes, for example, a collimator, a band pass filter, a linear polarization filter, a half-wave plate, a slit, and a zoom means.
  • the beam shaping optical system may include all of these or a part thereof.
  • the collimator collimates the excitation light ⁇ emitted from the light source.
  • the band-pass filter turns the excitation light ⁇ emitted from the light source into narrowband light having only the center wavelength. This is because the excitation light ⁇ from the light source has a slight wavelength distribution width.
  • the linear polarization filter turns the excitation light ⁇ emitted from the light source into completely linearly polarized light.
  • the half-wave plate adjusts the polarization direction of the excitation light ⁇ so that the P-wave component is incident on the metal film 30.
  • the slit and zoom means adjust the beam diameter, contour shape, and the like of the excitation light ⁇ so that the shape of the irradiation spot on the back surface of the metal film 30 is a circle of a predetermined size.
  • the APC mechanism controls the light source so that the output of the light source is constant. More specifically, the APC mechanism detects the amount of light branched from the excitation light ⁇ with a photodiode (not shown) or the like.
  • the APC mechanism controls the input energy by a regression circuit, thereby controlling the output of the light source to be constant.
  • the angle adjustment mechanism 142 adjusts the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (the interface between the prism 20 and the metal film 30 (film formation surface 22)). In order to irradiate the excitation light ⁇ at a predetermined incident angle toward a predetermined position of the metal film 30 via the prism 20, the angle adjustment mechanism 142 relatively places the optical axis of the excitation light ⁇ and the chip holder 121. Rotate.
  • the angle adjustment mechanism 142 rotates the light source unit 141 around an axis (axis perpendicular to the paper surface of FIG. 4) orthogonal to the optical axis of the excitation light ⁇ .
  • the position of the rotation axis is set so that the position of the irradiation spot on the metal film 30 hardly changes even when the incident angle is scanned.
  • the angle at which the amount of plasmon scattered light ⁇ is maximum is the enhancement angle.
  • High intensity fluorescence ⁇ can be measured by setting the incident angle of the excitation light ⁇ to the enhancement angle or an angle in the vicinity thereof.
  • the basic incident condition of the excitation light ⁇ is determined by the material and shape of the prism 20 of the detection chip 10, the film thickness of the metal film 30, the refractive index of the liquid in the flow channel 60, etc. The optimum incident condition varies slightly depending on the type and amount of the light and the shape error of the prism 20. For this reason, it is preferable to obtain an optimal enhancement angle for each measurement.
  • the light source control unit 143 controls various devices included in the light source unit 141 to control the emission of the excitation light ⁇ from the light source unit 141.
  • the light source control unit 143 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.
  • the light detection unit 150 detects the amount of fluorescence ⁇ emitted from the vicinity of the surface of the metal film 30 on the flow path 60 side when the light irradiation unit 140 irradiates the metal film 30 of the detection chip 10 with the excitation light ⁇ . To do. Further, as necessary, the light detection unit 150 also detects plasmon scattered light ⁇ generated by irradiation of the excitation light ⁇ to the metal film 30.
  • the light detection unit 150 includes a light receiving unit 151, a position switching mechanism 152, and a sensor control unit 153.
  • the light receiving unit 151 is disposed in the normal direction to the surface of the metal film 30 of the detection chip 10.
  • the light receiving unit 151 includes a first lens 154, an optical filter 155, a second lens 156, and a light receiving sensor 157.
  • the first lens 154 is, for example, a condensing lens, and condenses light emitted from the metal film 30.
  • the second lens 156 is an imaging lens, for example, and forms an image of the light collected by the first lens 154 on the light receiving surface of the light receiving sensor 157.
  • the optical path between the first lens 154 and the second lens 156 is substantially parallel.
  • the optical filter 155 is disposed between the first lens 154 and the second lens 156.
  • the optical filter 155 guides only the fluorescence component to the light receiving sensor 157 and removes the excitation light component (plasmon scattered light ⁇ ) in order to detect the fluorescence ⁇ with a high S / N ratio.
  • Examples of the optical filter 155 include an excitation light reflection filter, a short wavelength cut filter, and a band pass filter.
  • the optical filter 155 is, for example, a filter including a multilayer film that reflects a predetermined light component, or a color glass filter that absorbs a predetermined light component.
  • the light receiving sensor 157 detects fluorescence ⁇ and plasmon scattered light ⁇ .
  • the light receiving sensor 157 has a high sensitivity capable of detecting weak fluorescence ⁇ from a very small amount of a substance to be detected.
  • the light receiving sensor 157 is, for example, a photomultiplier tube (PMT), an avalanche photodiode (APD), a silicon photodiode (SiPD), or the like.
  • the position switching mechanism 152 switches the position of the optical filter 155 on or off the optical path in the light receiving unit 151. Specifically, when the light receiving sensor 157 detects the fluorescence ⁇ , the optical filter 155 is disposed on the optical path of the light receiving unit 151, and when the light receiving sensor 157 detects the plasmon scattered light ⁇ , the optical filter 155 is placed on the light receiving unit 151. Placed outside the optical path.
  • the sensor control unit 153 controls detection of an output value of the light receiving sensor 157, management of sensitivity of the light receiving sensor 157 based on the detected output value, change of sensitivity of the light receiving sensor 157 for obtaining an appropriate output value, and the like.
  • the sensor control unit 153 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.
  • the controller 160 controls the liquid feed pump drive mechanism 113, the transport stage 122, the angle adjustment mechanism 142, the light source controller 143, the position switching mechanism 152, and the sensor controller 153.
  • the control unit 160 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device. Note that the length between the tip of the pipette tip 170 and the fitting portion of the pipette nozzle 116, the linear expansion coefficient of the pipette tip 170, the maximum change in the temperature of the pipette tip 170 in the reaction process, and the pipette The change with time of the temperature of the chip 170 is stored in the storage device in advance.
  • control unit 160 sets the reference height of the pipette nozzle 116 based on the tip height of the pipette tip 170 in the first step. Further, the control unit 160 obtains a correction amount for correcting the height of the pipette nozzle 116 in the second process from the reference height.
  • FIG. 7 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the SPFS apparatus 100.
  • FIG. 8 is a flowchart showing the contents of the step of detecting the tip height of the pipette tip 170 (step S120 in FIG. 7).
  • the primary antibody is immobilized on the metal film 30 as a capturing body.
  • a secondary antibody labeled with a fluorescent substance is used as a capturing body used for fluorescent labeling.
  • the reference portion 180 is the bottom surface (metal film 30) of the flow path 60.
  • step S110 preparation for measurement is performed (step S110). Specifically, the detection chip 10 is prepared, and the detection chip 10 is installed in the chip holder 121 at the set position of the detection chip 10. Further, the pipette tip 170 is attached to the tip of the pipette nozzle 116 at the attachment position.
  • the tip height of the pipette tip 170 is detected (step S120).
  • the first pressure in the pipette tip 170 is measured (step S121).
  • the control unit 160 drives the pipette nozzle drive mechanism 112 to move the tip of the pipette tip 170 directly above the bottom surface (reference unit) of the flow channel 60.
  • the controller 160 drives the liquid feed pump drive mechanism 113 to advance the plunger 115 relative to the syringe 114, and continuously pipes air out from the tip of the pipette tip 170, while pipetting with the air pressure sensor 131.
  • a first pressure in the chip 170 is measured.
  • the control unit 160 drives the pipette nozzle drive mechanism 112 so that the tip of the pipette tip 170 is positioned closer to the bottom surface (reference unit 180) side of the flow channel 60 than the step of measuring the first pressure (step S121). Move to. Then, the controller 160 drives the liquid feed pump drive mechanism 113 to advance the plunger 115 relative to the syringe 114, and continuously pipes air out from the tip of the pipette tip 170, while pipetting with the air pressure sensor 131. A second pressure in the chip 170 is measured.
  • step S123 the difference between the first pressure and the second pressure is obtained (step S123). Specifically, the control unit 160 obtains a difference between the first pressure and the second pressure by subtracting the second pressure (first pressure) from the first pressure (second pressure). At this time, the pipette nozzle driving mechanism 112 is driven until the difference between the first pressure and the second pressure becomes a predetermined threshold or more, and the tip of the pipette tip 170 is moved to the bottom surface (reference portion 180) side of the flow channel 60. The process of measuring the second pressure in the pipette tip 170 by the air pressure sensor 131 is repeated.
  • the controller 160 determines that the tip of the pipette tip 170 is close to the reference portion 180 due to the difference between the first pressure and the second pressure, and the tip height of the pipette tip 170 relative to the reference portion 180 is increased. Detect. That is, the control unit 160 detects the tip height of the pipette tip 170 with respect to the reference unit 180 when the air pressure sensor 131 detects the air pressure.
  • step S 120 air is continuously or intermittently ejected from the tip of the pipette tip 170 and the tip of the pipette tip 170 is brought close to the reference portion 180.
  • the air pressure in the pipette tip 170 may be measured by the air pressure sensor 131. In this case, the air pressure before moving the pipette tip 170 becomes the first pressure.
  • the air pressure in the pipette tip 170 measured by the air pressure sensor 131 while the tip of the pipette tip 170 is brought close to the reference portion 180 becomes the second pressure. Even in this case, the tip height of the pipette tip 170 can be detected with high accuracy.
  • the reference height of the pipette nozzle 116 is set (step S130). Specifically, the control unit 160 drives the pipette nozzle drive mechanism 112 to determine the liquid from the flow path 60 based on the height (position) of the pipette nozzle 116 when the tip of the pipette tip 170 is detected in step S120. The pipette nozzle 116 is moved so that the tip of the pipette tip 170 is removed from the bottom surface of the flow path 60 at a predetermined height. Then, the control unit sets the height of the pipette nozzle 116 when the tip of the pipette tip 170 has a predetermined height (for example, 100 ⁇ m) to the reference height of the pipette nozzle 116.
  • a predetermined height for example, 100 ⁇ m
  • the measurement liquid is injected into the detection chip 10 (step S140).
  • the control unit 160 operates the transport stage 122, the pipette nozzle drive mechanism 112, and the liquid feed pump drive mechanism 113 to detect the detection chip from the well in which the measurement liquid is stored via the pipette chip 170.
  • the measurement liquid is injected into the ten flow paths 60.
  • correction of the pipette nozzle reference height is not particularly required.
  • the plunger 115 is reciprocated with the position of the tip of the pipette chip 170 fixed, and the pipette chip 170 By repeatedly sucking and discharging the measurement liquid (washing liquid), the measurement liquid may be reciprocated in the flow path 60 to wash away the stored reagent.
  • the measurement liquid used for washing is removed by suction with the pipette tip 170, and a new measurement liquid is injected into the flow channel 60 of the detection chip 10 again.
  • the incident angle of the excitation light ⁇ is determined (step S150).
  • the controller 160 operates the transfer stage 122 to move the detection chip 10 to the detection position.
  • the controller 160 drives the sensor controller 153 to detect the plasmon scattered light ⁇ by the light receiving sensor 157 while driving the angle adjusting mechanism 142 to scan the incident angle of the excitation light ⁇ .
  • the angle at which the amount of plasmon scattered light ⁇ is maximized is defined as the incident angle (enhancement angle) of the excitation light ⁇ .
  • the measurement liquid is removed from the flow path 60 by sucking the measurement liquid into the pipette tip 170.
  • the control unit 160 obtains the correction amount of the height of the pipette nozzle 116 from the reference height so as to cancel the fluctuation of the tip height of the pipette tip 170 by any of the means described above. Then, the control unit 160 moves the height of the pipette nozzle 116 to the corrected reference height via the pipette nozzle drive mechanism 112. The controller 160 operates the liquid feed pump drive mechanism 113 to suck and remove the measurement liquid in the flow path 60 into the pipette tip 170.
  • the detection target substance in the specimen is reacted with the primary antibody (primary reaction; step S170).
  • the control unit 160 operates the transfer stage 122, the pipette nozzle drive mechanism 112, and the liquid feed pump drive mechanism 113, and passes through the pipette tip 170 from the well in which the primary reaction solution (sample or sample diluent) is stored. Then, the primary reaction liquid is injected into the flow path 60 of the detection chip 10 and the plunger 115 is reciprocated to reciprocate for a predetermined time. When a substance to be detected exists in the sample, at least a part of the substance to be detected binds to the primary antibody. After the primary reaction, the primary reaction solution is sucked into the pipette tip 170 to remove the specimen from the flow path 60.
  • the types of the specimen and the substance to be detected are not particularly limited.
  • the specimen include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, semen, and diluted solutions thereof.
  • substances to be detected include nucleic acids (such as DNA and RNA), proteins (such as polypeptides and oligopeptides), amino acids, carbohydrates, lipids, and modified molecules thereof.
  • the metal film 30 is cleaned with a cleaning solution such as a buffer (step S180).
  • the control unit 160 operates the transport stage 122, the pipette nozzle drive mechanism 112, and the liquid feed pump drive mechanism 113, and from the well in which the cleaning liquid is stored, into the flow path 60 of the detection chip 10 via the pipette chip 170.
  • the cleaning liquid is injected into the plunger and the plunger 115 is reciprocated to reciprocate for a predetermined time.
  • the cleaning liquid containing the primary reaction liquid remaining from the flow path 60 is removed.
  • the control unit 160 uses one of the above-described means to cancel the fluctuation of the tip height of the pipette tip 170.
  • a correction amount from the reference height of the nozzle 116 is obtained.
  • the control unit 160 moves the height of the pipette nozzle 116 to the corrected reference height via the pipette nozzle drive mechanism 112.
  • the controller 160 moves the height of the pipette nozzle 116 to the corrected reference height via the pipette nozzle drive mechanism 112, and passes the cleaning liquid containing the primary reaction liquid remaining at the corrected position through the flow path. Remove from within 60.
  • the substance to be detected captured on the metal film 30 is labeled with a fluorescent substance (secondary reaction; step S190).
  • the control unit 160 operates the transport stage 122, the pipette nozzle drive mechanism 112, and the liquid feed pump drive mechanism 113 to change the pipette tip from the well in which the secondary reaction liquid (labeled antibody liquid) is stored.
  • the secondary reaction liquid is injected into the flow path 60 of the detection chip 10 through 170, and the plunger 115 is reciprocated to reciprocate for a predetermined time.
  • the detection target substance captured on the metal film 30 is labeled with a fluorescent substance by an antigen-antibody reaction. After this secondary reaction, the secondary reaction solution is sucked into the pipette tip 170 to remove the specimen from the flow path 60.
  • the metal film 30 is cleaned with a cleaning solution such as a buffer solution (step S200).
  • the control unit 160 operates the transport stage 122, the pipette nozzle drive mechanism 112, and the liquid feed pump drive mechanism 113, and from the well in which the cleaning liquid is stored, into the flow path 60 of the detection chip 10 via the pipette chip 170.
  • the cleaning liquid is injected into the plunger and the plunger 115 is reciprocated to reciprocate for a predetermined time.
  • the cleaning liquid containing the secondary reaction liquid remaining from the flow path 60 is removed.
  • the control unit 160 uses the above-described means of the present invention to perform pipetting.
  • the amount of correction of the height of the pipette nozzle 116 from the reference height is determined so as to cancel the fluctuation in the tip height of the tip 170.
  • the control unit 160 moves the height of the pipette nozzle 116 to the corrected reference height via the pipette nozzle drive mechanism 112.
  • the control unit 160 moves the height of the pipette nozzle 116 to the corrected reference height via the pipette nozzle drive mechanism 112, and passes the cleaning liquid containing the secondary reaction liquid remaining at the corrected position to the flow path.
  • step S170 the order of the primary reaction (step S170) and the secondary reaction (step S190) is not limited to this.
  • a liquid containing these complexes may be provided on the metal film 30 after the substance to be detected is bound to the secondary antibody.
  • the specimen and the labeling solution may be provided on the metal film 30 at the same time.
  • a substance to be detected is detected (step S210).
  • the control unit 160 operates the transfer stage 122 to move the detection chip 10 to the detection position.
  • the sensor control unit 153 is driven to drive the metal film 30 (while the light source control unit 143 is driven to irradiate the excitation light ⁇ at a predetermined position of the metal film 30 with the incident angle (enhancement angle) determined in step S120.
  • the light receiving sensor 157 is controlled so as to detect the intensity of the fluorescence ⁇ emitted from the surface of the metal film 30 and the vicinity thereof.
  • the control unit 160 may measure the blank value after determining the incident angle (step S150) (before the primary reaction S180). In this case, the excitation light ⁇ is irradiated onto the metal film 30 at an enhancement angle, and the detection value of the light receiving sensor 157 is set as a blank value. In the step of detecting the substance to be detected (step S210), the amount of fluorescence ⁇ indicating the amount of the substance to be detected in the sample is calculated by subtracting the blank value from the detected value of fluorescence ⁇ .
  • the step of correcting the height of the pipette nozzle 116 from the reference height may not be performed in all cases where the liquid is removed from the flow path 60.
  • the correction of the height of the pipette nozzle 160 from the reference height includes the measurement liquid discharging step (step S160), the cleaning step after the primary reaction (step S180), and the cleaning step after the secondary reaction (step).
  • the operation may be performed during the operation of removing the liquid from the flow path 60.
  • what is necessary is just to perform in the discharge process (process S160) of a measurement liquid, and the washing
  • the step of correcting the height of the pipette nozzle 116 from the reference height is performed because the measurement liquid remains in the flow channel 60 and the sample in the primary reaction This is to prevent the liquid from being diluted. Further, in the cleaning step after the primary reaction (step S180), the step of correcting the height of the pipette nozzle 116 from the reference height is performed because the primary reaction solution remains in the flow channel 60 excessively. This is to prevent the primary reaction from continuing thereafter. In the cleaning step after the secondary reaction (step S200), the step of correcting the height of the pipette nozzle 116 from the reference height is performed because the fluorescent substance floating in the labeling solution remains in the flow channel 60. This is because the fluorescent substance that has reacted with the substance to be detected cannot be distinguished from each other, resulting in noise.
  • the correction from the reference height in this step can be omitted.
  • the measurement liquid discharging step (step S160) has a relatively short elapsed time after setting the reference height in the first step, and the temperature change of the pipette tip 170 is relatively small. Correction from the reference height can be omitted.
  • the washing step after the secondary reaction since the elapsed time after detecting the tip height of the pipette tip 170 is long, the amount of change in the length of the pipette tip 170 is the largest. The effect of correction is large and most important.
  • the SPFS device may further include first temperature measuring means 190 for measuring the temperature of the mounting space.
  • the first temperature measuring means 190 is not particularly limited as long as it can measure the internal temperature around the pipette tip 170 attached.
  • the first temperature measuring means 190 is a temperature sensor or the like. Since the estimated value of the difference between the maximum temperature and the minimum temperature of the pipette tip 170 in the reaction process can be estimated with higher accuracy by the first temperature measuring means 190, the height of the pipette nozzle 116 can be accurately corrected from the reference height.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing a configuration around a pipette tip of a surface plasmon excitation enhanced fluorescence analyzer (SPFS apparatus) which is an example of an apparatus for carrying out the reaction method according to the second embodiment.
  • 10A is a side view for explaining the arrangement of the second temperature measuring means 192
  • FIG. 10B is a cross-sectional view
  • FIG. 10C is the arrangement of the second temperature measuring means 192 and the arrangement of the temperature adjustment mechanism 194.
  • FIG. 10D is a cross-sectional view.
  • the SPFS apparatus capable of performing the reaction method according to Embodiment 2 has a second temperature measuring means 192.
  • the second temperature measuring means 192 measures the temperature of the pipette tip 170.
  • the second temperature measuring means 192 is not particularly limited as long as it can exhibit the above function. Examples of the second temperature measuring means 192 include a thermocouple, a thermomobile, a bolometer, and the like. In particular, since the temperature of the pipette tip 170 can be measured in a short time without contact and is inexpensive, the second temperature measuring means 192 is preferably a cir mobile.
  • the SPFS device may have a temperature adjustment mechanism 194 that adjusts the temperature of the pipette tip 170.
  • the temperature control mechanism 194 is not particularly limited as long as it can exhibit the above-described function.
  • the temperature control mechanism 194 is, for example, a temperature control block.
  • the temperature adjustment mechanism 194 has the second temperature measuring means 192 at a height excluding a portion where the tip of the pipette tip 170 enters the detection chip 10 ′ or the well 60. It is arranged in the excluded position.
  • the controller 160 attaches the pipette tip 170 to the pipette nozzle 116, performs the first step, and then activates the temperature adjustment mechanism 194 in order to adjust the temperature of the pipette tip 170 until the reaction step ends.
  • the reaction method according to the present invention can measure, for example, a substance to be detected with high reliability. Therefore, the reaction method according to the present invention is also expected to contribute to the development, spread and development of a very simple quantitative immunoassay system.

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Abstract

反応方法は、ピペットノズルに装着された、液体を吸引または排出するためのピペットチップを用いて、反応場に液体の供給および反応場からの液体の除去を複数回行うことで２以上の物質を反応させる反応工程を含む反応方法であって、反応工程の前に、ピペットチップの先端高さを検出し、ピペットチップの先端高さに基づいて、ピペットノズルの基準高さを設定する第１工程と、反応工程の途中に、ピペットチップの温度が変化することによるピペットチップの先端高さの変動を打ち消すように、ピペットノズルの高さを基準高さから補正する第２工程とを有する。

Description

反応方法
　本発明は、ピペットノズルに装着された、液体を吸入または排出するためのピペットチップを用いて、２以上の物質を反応させる反応工程を含む反応方法に関する。
　臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法および装置が求められている。被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている（例えば、特許文献１参照）。
　特許文献１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分析法は、金属薄膜が形成されたプリズムに対して金属薄膜で全反射するように励起光を照射し、金属薄膜で励起光が全反射されることにより金属薄膜の表面に生じるプラズモン散乱光を測定する工程と、測定されたプラズモン散乱光の強度が最大となる入射角（増強角）を励起光の金属薄膜に対する入射角に決定する工程と、被検出物質に特異的に結合できる第１捕捉体（例えば１次抗体）が固定された金属薄膜上に、被検出物質および蛍光物質で標識された第２捕捉体（例えば２次抗体）を提供する反応工程と、決定した増強角で励起光を照射し、金属薄膜上の被検出物質を標識した蛍光物質から放出された蛍光の蛍光強度を測定する検出工程と、を含む。
　特許文献１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分析法では、金属薄膜上に被検出物質を含む液状の検体を提供すると、第１捕捉体に被検出物質が結合する。次いで、被検出物質が結合した金属薄膜上に蛍光物質で標識された第２捕捉体を含む標識液を提供すると、被検出物質が蛍光物質で標識される。この状態で金属薄膜に励起光を照射すると、被検出物質を標識する蛍光物質は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）により増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。
　このように、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出するためには、検体や標識液を精度よく供給および除去する必要がある。一般的に、検体や標識液の供給および除去には、ピペットチップが使用される。また、ピペットチップは、射出成型などで一体形成されるため、それぞれ長さが異なる。そこで、ピペットチップの長さがそれぞれ異なることを考慮して検体や標識液を供給および除去する方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。
　特許文献２に記載の液体を供給および除去する方法では、ピペットノズルに装着された樹脂製のピペットチップの先端位置をフォトセンサで検出している。そして、ピペットチップの先端位置の情報に基づいて、ピペットノズルの位置を調整して、液体を精度よく供給および除去している。
国際公開第２０１１／１５２０６４号 特開２００６－２７５８２０号公報
　前述したような微量の被検出物質を捕捉体などに捕捉させるための反応は、反応温度により大きく反応性が異なる。このため、装置は、装置の設置環境温度に関わらす、装置内の反応部を反応に最適な一定温度に管理している。これに対して、装置に供給されるピペットチップは、あらかじめ装置内に設置されている場合を除いて、室温など装置内の反応部とは異なる温度環境下に置かれている。このため、測定時にピペットチップを装置に供給した際、ピペットチップの全長は、供給時および除去時の環境温度によって変化してしまう。
　特許文献２に記載の液体を送液する方法では、供給時および除去時の環境温度を考慮していないため、経時的にピペットチップの先端高さが変化してしまい、精度よく液体を供給および除去できない場合があった。特に、反応工程を厳密に制御したい場合には、ピペットチップの先端高さを精度よく制御できないため、液体を除去した後の残液量を精度よく管理できず、また、ピペットチップの先端が流路の底面に接触してしまうという問題があった。
　そこで、本発明の目的は、ピペットチップが温度の影響を受けた場合であっても、反応場に対するピペットチップの先端高さを精度よく制御して、反応場において２以上の物質を適切に反応させることができる反応方法を提供することである。
　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る反応方法は、ピペットノズルに装着された、液体を吸引または排出するためのピペットチップを用いて、反応場に液体の供給および前記反応場からの液体の除去を複数回行うことで２以上の物質を反応させる反応工程を含む反応方法であって、前記反応工程の前に、前記ピペットチップの先端高さを検出し、前記ピペットチップの先端高さに基づいて、前記ピペットノズルの基準高さを設定する第１工程と、前記反応工程の途中に、前記ピペットチップの温度が変化することによる前記ピペットチップの先端高さの変動を打ち消すように、前記ピペットノズルの高さを前記基準高さから補正する第２工程とを有する。
　本発明によれば、ピペットチップの温度が変化することによりピペットチップが伸縮しても、ピペットチップの先端高さを精度よく制御することができる。これにより、反応場において液体の量を高精度に制御することができる。たとえば、本発明によれば、被検出物質の存在または量を高い精度で検出することができる。
図１は、実施の形態１に係る反応方法の第１工程を説明するための図である。 図２Ａ、Ｂは、実施の形態１に係る反応方法の第２工程を説明するための図である。 図３は、ピペットチップの温度および反応工程の経過時間との関係を示すグラフである。 図４は、ＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。 図５Ａ～Ｃは、検出チップの構成を示す図である。 図６は、検出チップの他の形態の断面模式図である。 図７は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の動作を示すフローチャートである。 図８は、ピペットチップの先端高さを検出する工程の内容を示すフローチャートである。 図９は、ＳＰＦＳ装置のピペットチップ周りの構成を示す図である。 図１０Ａは、第２温度測定手段の配置を説明するための側面図であり、図１０Ｂは、断面図であり、図１０Ｃは、第２温度測定手段の配置および温調機構の配置を説明するための側面図であり、図１０Ｄは、断面図である。
　以下、本発明の一実施の形態について、添付した図面を参照して詳細に説明する。本発明の一実施の形態に係る反応方法は、ピペットノズルに装着された、液体を吸引または排出するためのピペットチップを用いて、反応場への液体の供給および反応場からの液体の除去を複数回行い、２以上の物質を反応させる反応工程を含む。
　［実施の形態１］
　図１および図２は、本発明の実施の形態１に係る反応方法を説明するための図である。図１は、ピペットチップＡの先端高さを検出する工程（第１工程）を示す図である。図２は、ピペットノズルＢの基準高さを設定する工程（第２工程）を示す図である。図２Ａは、ピペットチップＡをピペットノズルＢに装着するときの温度が反応工程を行うときの温度より低い場合について説明するための図であり、図２Ｂは、ピペットチップＡをピペットノズルＢに装着するときの温度が反応工程を行うときの温度より高い場合について説明するための図である。
　実施の形態１に係る反応方法は、ピペットチップＡの温度を測定することなく行う方法である。反応方法は、反応工程の前に、ピペットノズルＢの基準高さを設定する第１工程と、反応工程の途中に、ピペットノズルＢの高さを基準高さから補正する第２工程とを有する。ここで、「反応工程」とは、反応場に液体を供給する動作と、反応場から液体を除去する動作とを含む工程を意味しており、反応場に検体を供給して２以上の物質を反応させた後に検体を除去する工程、反応場に洗浄液を供給して反応場から洗浄液を除去する工程などを含む。ここで、「液体」には、検体、洗浄液、緩衝液などが含まれる。本実施の形態に係る反応方法は、ピペットノズルＢにピペットチップＡを装着する第１工程でのピペットチップの温度（第１温度）と、２以上の物質を反応させる反応工程でのピペットチップの温度（第２温度）とが異なる場合に適用される。なお、第１温度は、第２温度より高くてもよいし、第２温度より低くてもよい。ここでは、第１温度が第２温度より低い場合について説明する。第１温度が第２温度より低い場合とは、例えば、装置が２０℃（常温）の温度環境に設置され、この装置の反応工程を行う部分の温度は３７℃に管理されている場合がある。この装置に対して、２０℃（常温）の温度環境で保存されたピペットチップＡを装置のハッチ（図示せず）を開けて架設する場合がある。
　ピペットチップＡをピペットノズルＢに装着し、ピペットチップＡの先端高さを検出する工程（第１工程）では、ピペットチップＡを装置内に架設してからの経過時間が短い。よって、ピペットチップＡの温度はあまり上昇しておらず、例えばまだ約２０℃であり、その後、所定の時間が経過することで、ピペットチップＡの温度はピペットチップＡ周辺の庫内温度の影響を受けて徐々に温度が上昇する。そして、反応工程でのピペットチップＡの温度は、第１工程における温度（約２０℃）以上であって、最大３７℃にまで上昇する場合がある。
　ここでは、ピペットチップＡの温度が変化する例として、反応工程を行う庫内温度が３７℃に保持されている。また、装置およびピペットチップＡは、庫内温度より低い温度環境に設置されており、庫内温度より低い初期温度のピペットチップＡが装置内に持ち込まれる例を記載した。このとき、装置のハッチを開閉することで、外気が装置内に流れ込み、ピペットチップＡ設置時点（その後の第１工程時点）では、ピペットノズルＢ周辺の庫内温度が、一時的に外気温に近づく方向に変化している場合もある。
　また、別の例としては、ピペットチップＡをピペットノズルＢに装着する空間と、反応工程を行う空間が装置内で別空間になっており、反応を行う空間のみ３７℃で管理されており、装着する空間は温度管理されていない（例えば、ほぼ装置を設置している外気温に近い温度な）場合も相当する。
　図２に示されるように、第１工程では、反応工程の前に、ピペットチップＡの先端高さを検出し、ピペットチップＡの先端高さに基づいて、ピペットノズルＢの基準高さを設定する。ピペットチップＡの先端高さを検出する方法は、特に限定されない。ピペットチップＡの先端高さを検出する方法の例には、ピペットチップＡ内の空気圧を利用する方法が含まれる。ピペットチップＡの先端と、ピペットチップＡの先端の基準の高さとなる基準部（本実施の形態では、反応場）Ｃとの間隔を変えて、ピペットチップＡの先端から気体を吸引または排出したときのピペットチップＡ内の空気圧の変化を測定する方法がある。より具体的には、まず、ピペットチップＡの先端と基準部（反応場）Ｃとを離した状態で、ピペットチップＡの先端から気体を吸引または排出したときのピペットチップＡ内の第１圧力を測定する。そして、第１圧力の測定時よりもピペットチップＡの先端と基準部Ｃとを近づけた状態で、ピペットチップＡの先端から気体を吸引または排出したときのピペットチップＡ内の第２圧力を測定する。最後に、第１圧力と第２圧力との差に基づいて、基準部に対するピペットチップＡの先端高さを検出する。
　次いで、ピペットチップＡの先端高さに基づいて、ピペットノズルＡの基準高さ（ｈ２）を設定する。図２Ａの左図に示されるように、本実施の形態では、検出したピペットチップＡの先端高さを、反応場から液体を除去するときの高さ（例えば１００μｍ）ｈ１に補正する。そして、補正した後のピペットノズルＢの高さがピペットノズルＢの基準高さ（ｈ２）である。
　図２Ａの右図に示されるように、第２工程では、反応工程の途中に、ピペットチップＡの温度が変化することによるピペットチップＡの先端位置の変動を打ち消すように、ピペットノズルＢの高さを基準高さから補正する。
　第１工程後の経過時間に伴い、ピペットチップＡの先端高さは、反応場に近づくように変動する。本実施の形態では、ピペットチップＡは、先端高さがｈ１からｈ１’に変動する。これは、ピペットチップＡ周辺の庫内温度が、ピペットチップＡを装置内に設置した時点の温度よりも高いため、ピペットチップＡの温度が庫内温度に依存して徐々に上昇し、ピペットチップＡの全長が長くなることによる。このまま反応工程を進めた場合、ピペットチップＡの先端が反応場に接触してしまい、反応場から適切に液体を除去できなくなってしまう。
　そこで、ピペットチップＡの先端高さの変動を打ち消すように、ピペットノズルＢの高さを基準高さｈ２からｈ２’に補正する。すなわち、反応場に対するピペットチップＡの先端が所定の高さ（ｈ１）となるように、ピペットノズルＢの高さを反応場に対して高くなるように補正する。
　なお、ピペットチップＡ周辺の庫内温度が、ピペットチップＡを装置内に設置した時点の温度よりも低い場合には、ピペットチップＡの全長は、庫内温度に依存して徐々にピペットチップＡの温度が低下することによって短くなる。この場合、図２Ｂに示されるように、ピペットチップＡは、先端高さｈ１からｈ１’に変動する。このまま反応工程を進めた場合、反応場に対してピペットチップＡの先端が高くなりすぎてしまい、反応場から液体を除去した場合に、反応場に規定量以上の液体が残留してしまう。よって、次の液体を反応場に供給すると、反応場に残留した液体により、新たに供給した液体が希釈されてしまい、精度よく反応させることができない。そこで、ピペットチップＡの先端高さの変動を打ち消すように、ピペットノズルＢの高さを基準高さｈ２からｈ２’に補正する。すなわち、反応場に対するピペットチップＡの先端が所定の高さ（ｈ１）となるように、ピペットノズルＢの高さを反応場に対して低くなるように補正する。
　なお、ピペットノズルＢの高さを基準高さから補正する時期は、反応場に液体を供給する直前、あるいは、反応場に液体を供給した後、反応場からこの液体を除去する前まで（特に、除去する直前）に行うことが好ましい。このような時期にピペットノズルＢの高さを基準高さから補正することにより、反応場およびピペットチップＡの先端の位置関係を精度よく制御することができる。反応場に液体を供給する直前に補正することにより、ピペットチップＡの全長が伸びた際、ピペットチップＡの先端が反応場に接触することや、接触により先端が曲がってしまうことを防止できる。また、ピペットノズルＢの高さを反応場から液体を除去する直前に補正することにより、反応場内に残留する液体の量を精度よく制御することができる。
　なお、ピペットノズルＢの高さは、反応工程の経過時間に応じて補正することが好ましい。ピペットチップＡは、反応工程中においてピペットチップＡ周辺の庫内温度の影響を受ける。そして、ピペットノズルＢの先端高さは、反応工程の経過時間に応じて徐々に変動する。よって、ピペットノズルＢの高さを反応工程の経過時間に応じて補正することで、ピペットチップＡの全長を測定することなく、簡単にかつ迅速にピペットチップＡの先端の変動を打ち消すことができる。また、特別な装置を必要としないため、安価で、かつ少ないスペースで行うことができる。
　また、ピペットノズルＢの高さは、ピペットチップＡにおける先端とピペットノズルＢとの嵌合部との間の長さと、ピペットチップＡの線膨張係数と、ピペットチップＡの温度の経時的な変動と、反応工程の経過時間と、に基づいて補正させることが好ましい。ピペットノズルＢの高さは、前述した要素に加え、反応工程おける、ピペットチップＡの温度の最大変化量に基づいて補正させることが好ましい。
　例えば、ピペットチップＡにおける先端からピペットノズルＢとの嵌合部までの長さは、任意の測定装置で予め測定される。
　ピペットチップＡの線膨張係数は、ピペットチップＡの材料毎に決まる。ピペットチップＡは、容易にかつ安価に製造できる観点から、樹脂製であることが好ましい。ポリプロピレンを用いた場合のピペットチップＡの線膨張係数は、５．８×１０－５～１２×１０－５／℃程度であり、ポリスチレンを用いた場合のピペットチップＡの線膨張係数は、６．０×１０－５～８．０×１０－５／℃程度である。また、ポリエチレンを用いた場合のピペットチップＡの線膨張係数は、１１×１０－５～１５×１０－５／℃程度であり、低密度ポリエチレンを用いた場合のピペットチップＡの線膨張係数は、１６×１０－５～２０×１０－５／℃程度である。さらに、フッ素樹脂を用いた場合のピペットチップＡの線膨張係数は、１０×１０－５～１２×１０－５／℃程度である。
　次いで、ピペットチップＡの温度の継時的な変動について、図３を参照しながら詳細に説明する。図３は、ピペットチップＡの温度および第１工程後の反応工程の経過時間との関係を示すグラフである。図３の横軸は、第１工程後の反応工程における経過時間であり、縦軸は、ピペットチップＡの温度（℃）である。この説明では、ピペットチップＡをピペットノズルＢに装着するときのピペットチップＡの温度は１０～３０度の範囲内である。さらに、反応工程を行う空間の庫内温度を３７℃とし、当該空間内におけるピペットチップＡの最大到達温度を３５℃とした。また、図３に示されるＦ１０は、ピペットチップＡをピペットノズルＢに装着するときのピペットチップＡの温度が１０℃の場合における経過時間とピペットチップＡの温度との関係を示す関数であり、Ｆ２０は、ピペットチップＡをピペットノズルＢに装着するときのピペットチップＡの温度が２０℃の場合における経過時間とピペットチップＡの温度との関係を示す関数であり、Ｆ３０は、ピペットチップＡをピペットノズルＢに装着するときのピペットチップＡの温度が３０℃の場合における経過時間とピペットチップＡの温度との関係を示す関数である。
　図３に示されるように、反応工程の経過時間およびピペットチップＡの温度の関係は、ピペットチップＡをピペットノズルＢに装着するときのピペットチップＡの温度によって異なるため、反応空間における反応工程の経過時間およびピペットチップＡの温度の関係を求めておく。ピペットチップＡの温度を測定しない場合、第１工程におけるピペットチップＡの温度は、１０～３０℃の範囲内のいずれの温度であるか不明となる。この場合、ピペットチップＡの先端高さを検出した後であって、反応工程の開始後、ｔ１秒後におけるピペットチップＡの温度の取りうる温度範囲は、図３に示される「Ａ」の範囲内であり、ｔ２秒後におけるピペットチップＡの温度の取りうる温度範囲は、図３に示される「Ｂ」の範囲内となる。
　また、ｔ１秒後におけるピペットチップＡの温度の変化量の最大値は、図３に示される「Ｃ」であり、Ｆ１０（ｔ１）－Ｆ１０（ｔ０）で表すことができる。また、ｔ１秒後におけるピペットチップＡの温度の変化量の最小値は、図３に示される「Ｄ」であり、Ｆ３０（ｔ１）－Ｆ３０（ｔ０）で表すことができる。図３に示されるように、ピペットチップＡの温度の変化量は、第１工程時点（あるいは反応開始直後）のピペットチップＡの温度が低いほど、最大到達温度との温度差が大きくなるため、ｔ秒後におけるピペットチップＡの温度の変化量が大きくなる。図３に示される例では、ピペットチップＡの最大温度変化量は、３５℃－１０℃＝２５℃である。
　ピペットチップＡの温度の経時的な変動（以下、「ピペットチップＡの温度の時間変化関数」ともいう）は、ピペットチップＡの第１工程における温度（初期温度）と、反応工程を実施する庫内温度とに依存する。以下に、想定されるケースについて説明する。
　（ケース１）
　ピペットチップＡの第１工程での温度（初期温度）が既知の場合には、ピペットチップＡの温度の時間変化関数によりｔ秒後のピペットチップＡの温度が推定できるため、ピペットノズルＢの高さを基準高さから補正した後のピペットノズルＢの高さ（補正量）を精度よく決めることができる。
　（ケース２）
　ピペットチップＡの第１工程での温度（初期温度）が未知の場合には、ピペットチップＡの第１工程での温度（初期温度）が最低の１０℃と最大の３０℃の時の時間変化関数Ｆ１０とＦ３０を用いて、ｔ秒後のピペットチップＡの温度を、Ｆ１０（ｔ）～Ｆ３０（ｔ）の間と推定することで、ピペットノズルＢの高さを基準高さから補正した後のピペットノズルＢの高さ（補正量）を概算することができる。
　（ケース３）
　さらに、ピペットチップＡの温度の経時的な変動自体が不明な場合には、反応時間によるピペットチップＡの先端の変動が不明であるため、ピペットチップＡの第１工程での温度（初期温度）と最大到達温度を３５℃とから算出されるピペットチップＡの最大温度変化量の範囲内とでピペットノズルＢの高さを基準高さから補正する。この最大温度変化量を考慮して補正した場合、反応場とピペットチップＡの先端位置とが離れてしまうが、少なくともピペットチップＡの先端が反応場に衝突することを防止できる。
　具体的には、前述したピペットチップの温度の経時的な変動と、反応工程の経過時間とから、ピペットノズルを基準高さから補正するときにおける、ピペットチップＡの温度が第１工程の直後から変動した温度差がわかる。次いで、当該変動した温度差と、ピペットチップＡの線膨張係数とから当該変動した温度差におけるピペットチップＡの変化率がわかる。次いで、当該変化率と、ピペットチップＡにおける先端とピペットノズルＢとの嵌合部との間の長さとから、ピペットチップＡの先端の変動量が推定できる。そして、当該変動に基づいてピペットノズルＢの補正量を推定する。このように、ピペットチップＡにおける先端とピペットノズルＢとの嵌合部との間の長さと、ピペットチップＡの線膨張係数と、ピペットチップＡの温度の経時的な変動と、反応工程の経過時間とに基づいてピペットノズルＢの高さの補正量を推定することで、ピペットチップＡの温度を測定することなく、反応工程において所定の時間が経過したときのピペットノズルＢの高さを精度よく位置決めすることができる。
　また、図３に示されるように、ピペットチップＡの温度の時間変化関数は、その傾き（変化率）が経過時間とともに、小さくなることが好ましい。反応工程を行う空間の庫内温度が反応工程を行っている間一定であれば、ピペットチップＡの温度の時間変化関数は、その傾き（変化率）が経過時間とともに、小さくなる。以下に、想定されるケースについて説明する。
　（ケース１）
　ピペットチップＡをピペットノズルＢに装着したときの庫内温度を、第１温度測定手段により測定することで、ピペットチップＡの温度を推定してもよい。この場合、第１工程での周辺環境温度がわかれば（例えば、２０℃）、その温度がほぼ投入された直後のピペットチップＡの初期温度に近いと推定できるため、温度の時間変化関数としてＦ２０を選択し、ｔ１秒後のピペットチップＡの温度の最大変化量は、Ｆ２０（ｔ１）－Ｆ２０（ｔ０）で表せることができる。これは、第１工程でのピペットチップＡの温度が未知の場合における、ｔ１秒後のピペットチップＡの温度の最大変化量（Ｆ１０（ｔ１）－Ｆ１０（ｔ０））より小さいため、精度よくピペットノズルＢの高さを補正できる。
　（ケース２）
　ピペットチップＡの第１工程での温度（初期温度）が未知の場合には、ピペットチップＡの第１工程での温度（初期温度）が最低の１０℃と最大の３０℃の時の時間変化関数Ｆ１０とＦ３０を用いて、ｔ秒後のピペットチップＡの温度を、Ｆ１０（ｔ）～Ｆ３０（ｔ）の間の温度と推定することで、ピペットノズルＢの高さを基準高さから補正した後のピペットノズルＢの高さ（補正量）を概算することができる。このとき、ピペットチップＡの温度の最大変化量は、Ｆ１０（ｔ１）－Ｆ１０（ｔ０）、最小変化量は、Ｆ３０（ｔ１）－Ｆ３０（ｔ０）であるため、ピペットチップＡの温度変化量をＦ３０（ｔ１）－Ｆ３０（ｔ０）以上、Ｆ１０（ｔ１）－Ｆ１０（ｔ０）以下として、補正量を算出し、ピペットノズルＢの高さを補正できる。ピペットチップ先端の衝突を回避する観点から、最大変化量Ｆ１０（ｔ１）－Ｆ１０（ｔ０）から算出される最大補正量にて、ピペットノズルＢの高さを補正するのがより望ましい。
　（ケース３）
　反応時間によるピペットチップＡの先端の変動が不明な場合、ピペットチップＡの第１工程での温度（初期温度）と最大到達温度である３５℃とから算出されるピペットチップＡの最大温度変化量の範囲内でピペットノズルＢの高さを基準高さから補正する。さらに初期温度も不明な場合は、想定されるピペットチップＡの第１工程での最低温度（例えば１０℃）と、最大到達温度である３５℃との差が最大温度変化量となる。この最大温度変化量を用いて、ピペットノズルＢの高さを基準高さから補正した後のピペットノズルＢの高さ（補正量）を概算し、補正することができる。この最大温度変化量で補正した場合には、反応場とピペットチップＡの先端位置とが離れてしまうが、少なくともピペットチップＡの先端が反応場に衝突することを防止できる。
　（効果）
　以上のように、実施の形態１に係る反応方法では、ピペットチップＡの先端高さに基づいてピペットノズルＢの基準高さを設定し、ピペットチップＡの先端高さの変動を打ち消すように、ピペットノズルＢの高さを基準高さから補正しているため、反応場とピペットチップＡの先端との位置関係（距離）を精度よく制御できる。これにより、反応工程を精度よく制御することができるため、高感度に、かつ定量的に結果を得ることができる。
　［実施の形態２］
　実施の形態２に係る反応方法は、ピペットチップＡの温度を測定している点において実施の形態１に係る反応方法と異なる。実施の形態２に係る反応方法は、反応工程の前に、ピペットノズルＢの基準高さを設定する第１工程と、反応工程の途中に、ピペットノズルＢの高さを基準高さから補正する第２工程とを有する。また、第１工程では、第２温度測定手段によってピペットチップＡの温度をさらに測定する。第１工程において、ピペットチップＡの温度を測定する時期は、ピペットノズルＢにピペットチップＡを装着した後であって、反応工程に移行する直前までに行うことが好ましく、より好ましくは第１工程とほぼ同じ時期である。
　第２工程では、第２温度測定手段によってピペットチップＡの温度をさらに測定するとともに、第１工程において第２温度測定手段によって測定された、ピペットチップＡの先端高さを検出したときのピペットチップＡの温度と、反応工程における第２温度測定手段によって測定されたピペットチップＡの温度との差に応じて、ピペットノズルＢの高さを準高さから補正する。第２工程では、ピペットチップＡの温度を常時測定してもよい。
　また、第２工程では、ピペットチップＡにおける先端とピペットノズルＢとの嵌合部との間の長さと、ピペットチップＡの線膨張係数と、ピペットチップＡの先端高さを検出したときのピペットチップＡの温度（第１温度）と、反応工程におけるピペットチップＡの温度（第２温度）との差とに基づいて、ピペットノズルＢの高さを基準高さから補正することが好ましい。この場合、ピペットチップＡの温度を測定することにより正確にピペットチップＡの高さの変動を把握することができるため、ピペットノズルＡを精度よく制御することができる。
　具体的には、ピペットチップＡはポリプロピレン製とし、ピペットチップＡの線膨張係数は１０×１０－５／℃とする。また、ピペットチップＡの先端からピペットノズルＢとの嵌合部までの長さを７０ｍｍとする。また、ピペットチップＡをピペットノズルＢに取り付け、ピペットチップＡの先端高さを検出した時の温度を１０℃とする。そして、反応空間内において、ピペットチップＡの温度が３５℃まで上昇するとする。すなわち、ピペットチップＢの温度は、１０℃から３５℃まで変化したとする。この場合、ピペットチップＡは、１７５μｍ伸びる。例えば、反応場から液体を除去する動作において、反応場における液体の液量を少なくするため、反応場とピペットチップＡの先端との距離を１００μｍ以下に制御したい場合がある。このように、反応場とピペットチップＡの先端との距離を高精度に制御したい場合、ピペットチップＡの先端が反応場に接触してしまう。このため、ピペットチップＡが伸びた分だけ、ピペットノズルＢの基準高さを補正する。この場合では、１７５μｍ上方に移動させる。
　（効果）
　以上のように、実施の形態２に係る反応方法では、ピペットチップＡの温度を測定するため、実施の形態１に係る反応方法と比較して、さらに精度よく、ピペットノズルＡの高さを基準高さから補正することができる。これにより、反応場とピペットチップＡの先端との位置関係（距離）をさらに精度よく制御できる。また、反応工程を精度よく制御することができるため、さらに高感度に、かつ定量的に結果を得ることができる。
　なお、実施の形態１および実施の形態２においてピペットチップＡは、温調機構により温度が制御されていてもよい。この場合、ピペットチップＡの温度を一定に維持することができるとともに、吸引後の液体の温度も維持することができるため、さらに、精度よく反応を行うことができる。特に、ポンプ吸排を複数回繰り返し、反応液が反応場とピペットチップ内を複数回往復送液される場合には、ピペットチップ内での温度に維持により効果的である。また、反応空間において、反応場および液体の貯留部が離れているときや、液体貯留部が温調されていない場合には、ピペット内で予備温調することができ有効である。
　なお、実施の形態２では、第２温度測定手段によってピペットチップＡの温度を第１工程と、第２工程との２回測定し、その温度差により補正量を算出しているが、ピペットチップＡの温度の測定を第１工程のみとし、得られた第１工程でのピペットチップＡの温度（初期温度）（例えば３０℃）と、その温度での時間変化関数としてＦ３０とを用いることで、ｔ１秒後のピペットチップＡの温度の最大変化量は、Ｆ３０（ｔ１）－Ｆ３０（ｔ０）で表せることができる。これは、第１工程でのピペットチップＡの温度が未知の場合における、ｔ１秒後のピペットチップＡの温度の最大変化量（Ｆ１０（ｔ１）－Ｆ１０（ｔ０））より小さいため、精度よくピペットノズルＢの高さを補正できる。実施の形態２の第２工程でもピペットチップＡの温度を測定する場合と比較して、補正精度は下がるが、何らかの理由で、第２工程でピペットチップＡの温度が正確に測定できない場合に有効な手段である。このような場合として、例えば、近くに配置されたピペットチップＡの温調（ヒーター）の影響により、ピペットチップＡの温度測定に誤差が出る際などに有効である。また、第１工程時点では、ピペットチップＡの温調をＯＦＦにして、ピペットチップＡの温度を測定し、その後の反応工程ではピペットチップＡの温調をＯＮにして安定した温度で反応させる場合に利用できる。
　［ＳＰＦＳ装置］
　次いで、前述した実施の形態１、２に係る反応方法を実施するための装置の一例として、検体に含まれる被検出物質の存在または量を検出するための表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）について説明する。
　（ＳＰＦＳ装置の構成１）
　図４は、実施の形態１に係る反応方法を行うことができる表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。
　図４に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、ピペット１１１およびピペット移動部１１２を含む送液部１１０と、チップホルダー１２１を含む搬送部１２０と、位置情報取得部１３０と、光照射部１４０と、光検出部１５０と、制御部１６０とを有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１２１に検出チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、検出チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成部材について説明する。
　（検出チップの構成）
　図５は、検出チップ１０の構成を示す図である。図５Ａは、検出チップ１０の平面図であり、図５Ｂは、図５Ａに示されるＡ－Ａ線の断面図であり、図５Ｃは、図５Ａに示されるＢ－Ｂ線の断面図である。図６は、検出チップ１０の他の形態を示す断面模式図である。
　図５Ａ～Ｃに示されるように、検出チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を含むプリズム２０と、金属膜３０と、反応領域４１および試薬貯留領域４２を含む流路蓋４０とを有する。金属膜３０および流路蓋４０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。プリズム２０、金属膜３０および流路蓋４０により、液体が流れる流路６０が形成される。流路６０は、プリズム２０の成膜面２２上に直接または金属膜３０を介して配置されている。検出チップ１０は、再利用可能なチップであってもよいし、使い捨てのチップであってもよい。本実施の形態では、検出チップ１０は、使い捨てのチップである。また、流路６０を流れる液体の例には、被検出物質を含む検体（例えば、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液など）や、蛍光物質で標識された捕捉体を含む標識液、洗浄液などが含まれる。
　プリズム２０は、励起光αに対して透明な絶縁体からなる。プリズム２０の入射面２１は、光照射部１４０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。本実施の形態では、プリズム２０の内部に入射した励起光αは、被検出物質が捕捉される金属膜３０に照射される。励起光αは、金属膜３０の裏面で反射して反射光βとなる。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射して反射光βとなる。出射面２３は、反射光βをプリズム２０の外部に出射させる。
　プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、底面が台形の柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。
　入射面２１は、励起光αが光照射部１４０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。ここで「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、検出チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）γの光量が最大となるときの入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３とのなす角度は、いずれも約８０°である。
　なお、検出チップ１０の設計により、増強角が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に捕捉された被検出物質によって増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
　一方で、プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、絶縁性の樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１．４～１．６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
　金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上の流路６０の少なくとも一部に露出するように配置されている。金属膜３０により、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（ＳＰＲ）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。
　金属膜３０の材料は、ＳＰＲを生じさせることができる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０～７０ｎｍの範囲内であることが好ましい。
　また、特に図示しないが、金属膜３０の表面には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定されている。金属膜３０に捕捉体を固定することで、被検出物質を選択的に検出することができる。本実施の形態では、金属膜３０上の所定の領域に、捕捉体が均一に固定されている。捕捉体が固定されている領域は、後述する１次反応および２次反応が起こる反応場となる。金属膜３０に固定されている捕捉体は、流路６０内に露出している。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体は、被検出物質に特異的に結合可能な抗体またはその断片である。
　流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されている。前述したように、流路蓋４０は、反応領域４１および試薬貯留領域４２を有する。反応領域４１は、後述する１次反応や２次反応を行うための領域である。また、試薬貯留領域４２は、２次反応に使用する標識液や、各反応後の洗浄に使用される洗浄液などが貯留される領域である。流路蓋４０における反応領域４１の裏面には、流路６０となる流路溝４３が形成されている。また、反応領域４１の表面と裏面とには、注入部７０となる第１貫通孔４４と、貯留部８０となる第２貫通孔４５とがそれぞれ開口している。流路溝４３の両端は、第１貫通孔４４および第２貫通孔４５にそれぞれ接続されている。試薬貯留領域４２には、表面に開口した凹部４６が形成されている。凹部４６の数は、特に限定されない。本実施の形態では、凹部４６の数は、２個である。凹部４６には、２次反応に使用する標識液や、洗浄液などが貯留されている。流路溝４３、第１貫通孔４４および第２貫通孔４５は、プリズム２０、金属膜３０および流路蓋４０をこの順に積層することでそれぞれ流路６０、注入部７０および貯留部８０となる。
　流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される蛍光δおよびプラズモン散乱光γに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。流路蓋４０は、蛍光δおよびプラズモン散乱光γを外部に取り出す部分が蛍光δおよびプラズモン散乱光γに対して透明であれば、他の部分は不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などによりプリズム２０または金属膜３０に接合されている。
　なお、図６に示されるように、検出チップ１０’は、流路６０に代えてウェル６０’を有していてもよい。この検出チップ１０’では、ウェル６０’の開口から液体を注入したり、除去したりする。このとき、反応場は、ウェルの底部やウェルの壁面に予め捕捉体が固定される形で形成され、溶液中の被検出物質と反応する場合でもよく、また、そのような捕捉体は固定されておらず、ウェル内の溶液中で液－液反応する場合でも良い。
　図４に示されるように、励起光αは、入射面２１でプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（ＳＰＲが生じる角度）で照射される。このように金属膜３０に対して励起光αをＳＰＲが生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光δが放出される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光δの光量を測定することで、被検出物質の存在または量を検出する。
（ＳＰＦＳ装置の構成）
　次に、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００の各構成部材について説明する。前述したように、ＳＰＦＳ装置１００は、送液部１１０、搬送部１２０、位置情報取得部１３０、光照射部１４０、光検出部１５０および制御部１６０を有する。検出チップ１０は、搬送部１２０のチップホルダー１２１に保持されうる。
　送液部１１０は、送液ポンプ１１１、ピペットノズル１１６、ピペットノズル駆動機構１１２および送液ポンプ駆動機構１１３を有する。送液部１１０は、チップホルダー１２１に保持された検出チップ１０の流路６０内に検体を注入したり、検出チップ１０の試薬貯留領域４２に貯留された標識液や洗浄液などの液体を反応領域４１の流路６０内に移動させたりする。また、送液部１１０は、流路６０から液体を排出したり、流路６０内の液体を攪拌したりもする。送液部１１０は、ピペットノズル１１６にピペットチップ１７０を装着した状態で使用される。なお、不純物の混入などを防止する観点から、ピペットチップ１７０は、交換可能であることが好ましい。
　送液ポンプ１１１は、流路６０に液体を供給したり、流路６０から液体を除去したりする際に液体を吸引する。送液ポンプ１１１は、シリンジ１１４と、シリンジ１１４内を往復動作可能なプランジャー１１５と、シリンジ１１４からなり、シリンジ１１４にはピペットノズル１１６が接続されている。また、送液ポンプ１１１は、プランジャー１１５の往復運動によって、液体の吸引および排出を定量的に行うことができる。これにより送液ポンプ１１１は、流路６０に液体を供給したり、流路６０から液体を除去したりできる。また、送液ポンプ１１１は、液体の吸引および排出を繰り返すことで、流路６０内の液体を攪拌できる。
　ピペットノズル駆動機構１１２は、注入部７０を介した流路６０内への液体の供給、注入部７０を介した流路６０内からの液体の除去のために、ピペットノズル１１６を移動させる。また、ピペットノズル駆動機構１１２は、前述のピペットノズル１１６の高さを基準高さから補正するために、ピペットノズル１１６を移動させる。ピペットノズル駆動機構１１２は、例えば、ピペットノズル１１６をピペットノズル１１６の軸方向（例えば垂直方向）に自在に動かす。ピペットノズル駆動機構１１２は、例えば、ソレノイドアクチュエーターおよびステッピングモーターを含む。
　送液ポンプ駆動機構１１３は、プランジャー１１５を移動させて、外部の液体をピペットチップ１７０内に吸入させたり、ピペットチップ１７０内の液体を外部に排出させたりする。送液ポンプ駆動機構１１３は、ステッピングモーターなどのプランジャー１１５を往復運動させるための装置を含む。ステッピングモーターは、送液ポンプ１１１の送液量や送液速度を管理できるため、検出チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。
　前述したように、送液部１１０は、凹部４６より各種液体を吸引し、検出チップ１０の流路６０内に供給する。このとき、ピペットチップ１７０の先端が流路６０内において流路６０の底面と近接した状態で、シリンジ１１４に対するプランジャー１１５の往復動作を繰り返すことで、検出チップ１０中の流路６０内を液体が往復し、流路６０内の液体が攪拌される。これにより、液体の濃度の均一化や、流路６０内における反応（例えば、１次反応および２次反応）の促進などを実現することができる。
　流路６０内の液体は、再び送液ポンプ１１１で吸引され、図外の廃液タンクなどに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応や洗浄などを実施し、流路６０内の反応場に、蛍光物質で標識された被検出物質を配置することができる。なお、流路６０内から液体を除去するときには、前述したように、ピペットチップ１７０の先端高さの変動を打ち消すように、ピペットノズル１１６の高さを基準高さから補正する。
　搬送部１２０は、検出チップ１０を装着位置、検出位置または送液位置に搬送するとともに、検出チップ１０を保持する。ここで「装着位置」とは、ピペットノズル１１６にピペットチップ１７０を装着する位置である。また、「検出位置」とは、光照射部１４０が検出チップ１０に励起光αを照射し、それに伴い発生する蛍光δまたはプラズモン散乱光γを光検出部１５０が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液部１１０が検出チップ１０の流路６０内に液体を注入するか、または検出チップ１０の流路６０内の液体を除去する位置である。搬送部１２０は、チップホルダー１２１および搬送ステージ１２２を含む。「装着位置」と「検出位置」とは、同じ位置であってもよい。
　チップホルダー１２１は、搬送ステージ１２２に固定されており、検出チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１２１の形状は、検出チップ１０を保持することが可能であり、かつ励起光α、蛍光δおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げなければ特に限定されない。本実施の形態では、チップホルダー１２１の形状は、流路蓋４０を挟み込んで検出チップ１０を保持できるように構成されている。
　搬送ステージ１２２は、チップホルダー１２１を一方向およびその逆方向（図１の紙面における左右方向）に移動させる。搬送ステージ１２２も、励起光α、蛍光δおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１２２は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
　位置情報取得部１３０は、ピペットチップ１７０の先端高さを取得する。位置情報取得部１３０は、ピペットチップ１７０の先端高さに関する情報を取得できれば特に限定されない。本実施の形態では、位置情報取得部１３０には、空気圧センサー１３１が含まれる。空気圧センサー１３１は、ピペットノズル１１６とシリンジ１１４との間に接続されている。空気圧センサー１３１の種類は、ピペットチップ１７０内の空気圧（圧力）を測定することができれば特に限定されない。空気圧センサー１３１の種類の例には、ブルドン管を用いた機械式のセンサーや、半導体などを用いた電子式のセンサーなどが含まれる。
　本実施の形態では、ピペットチップ１７０の先端高さは、ピペットチップ１７０の先端と基準部１８０との間隔を変えて、ピペットチップ１７０の先端から気体を吸引または排出したときのピペットチップ１７０内の空気圧の変化を空気圧センサー１３１により測定することで取得される。基準部１８０は、固体であってもよいし、液体であってもよく、その高さが高精度に特定されていれば特に限定されない。固体の基準部１８０の例には、検出チップ１０における流路蓋４０やシール５０、プリズム２０（流路６０の底面）などが含まれる。また、ＳＰＦＳ装置１００における基準部１８０の例には、搬送ステージ１２２や、チップホルダー１２１、搬送部１２０において搬送ステージ１２２を配置する配置面（ピペットノズル１１６の下方に位置する部分）などであってもよい。また、液体の基準部１８０の例には、検出チップ１０における凹部４６に貯留されている液体の液面、流路６０内の液体の液面などが含まれる。反応場とピペットチップ１７０の先端位置とを高精度に管理するためには、より直接的に反応場の位置を基準部１８０とすることが望ましく、例えば、プリズム２０（流路６０の底面）を基準部１８０とすることがより望ましい。
　ピペットチップ１７０の先端高さを検出する動作において、ピペットチップ１７０の先端における気体の吸引または排出は、連続的に行われてもよいし、間欠的に行われてもよい。例えば、気体を排出する場合では、送液ポンプ１１１を用いてピペットチップ１７０の先端より気体を排出させながら、ピペットチップ１７０の先端位置と上記基準部１８０との距離を変化させつつ、空気圧センサー１３１の出力を検出し、出力値が閾値以上に大きくなった時、ピペットチップ１７０の先端が基準部１８０に近接したとして、ピペットチップ１７０の先端位置を検出する。判定に用いる閾値は、基準部１８０に応じて適宜調整することが好ましい。基準部１８０が固体の場合には、基準部１８０が液体の場合と比較して閾値を高圧にすることができる。なお、第１工程にてピペットチップ１７０の先端高さを検出するセンサーは、空気圧センサーだけでなく、接触式の圧力センサー、ロードセル、非接触の画像センサーなど、先端高さを精度よく検出さえできれば、さまざまなセンサーを使用できる。第１工程では、まだピペットチップ１７０には液が吸引されていないため、装置が汚染されるなどの心配もなく、非接触式だけでなく接触式のセンサーも使用できる。
　光照射部１４０は、チップホルダー１２１に保持された検出チップ１０の入射面２１に向かって励起光αを照射する。蛍光δまたはプラズモン散乱光γの測定時には、光照射部１４０は、金属膜３０に対する入射角がＳＰＲを生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０にＳＰＲが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。光照射部１４０は、光源ユニット１４１、角度調整機構１４２および光源制御部１４３を含む。
　光源ユニット１４１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１４１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。
　光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
　ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
　角度調整機構１４２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１４２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１２１とを相対的に回転させる。
　たとえば、角度調整機構１４２は、光源ユニット１４１を励起光αの光軸と直交する軸（図４の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化できる。
　前述したように、金属膜３０に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光γの光量が最大となる角度が増強角である。励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光δを測定することが可能となる。検出チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路６０内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路６０内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。
　光源制御部１４３は、光源ユニット１４１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１４１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部１４３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
　光検出部１５０は、光照射部１４０が検出チップ１０の金属膜３０に励起光αを照射したときに、金属膜３０の流路６０側の面の近傍から放出される蛍光δの光量を検出する。また、必要に応じて、光検出部１５０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光γも検出する。光検出部１５０は、受光ユニット１５１、位置切り替え機構１５２およびセンサー制御部１５３を含む。
　受光ユニット１５１は、検出チップ１０の金属膜３０の表面に対する法線方向に配置される。受光ユニット１５１は、第１レンズ１５４、光学フィルター１５５、第２レンズ１５６および受光センサー１５７を含む。
　第１レンズ１５４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１５６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１５４で集光された光を受光センサー１５７の受光面に結像させる。第１レンズ１５４および第２レンズ１５６の間の光路は、略平行になっている。
　光学フィルター１５５は、第１レンズ１５４および第２レンズ１５６の間に配置されている。光学フィルター１５５は、蛍光成分のみを受光センサー１５７に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光δを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。光学フィルター１５５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１５５は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
　受光センサー１５７は、蛍光δおよびプラズモン散乱光γを検出する。受光センサー１５７は、微量の被検出物質からの微弱な蛍光δを検出することが可能な高い感度を有する。受光センサー１５７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、シリコンフォトダイオード（ＳｉＰＤ）などである。
　位置切り替え機構１５２は、光学フィルター１５５の位置を、受光ユニット１５１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１５７が蛍光δを検出する時には、光学フィルター１５５を受光ユニット１５１の光路上に配置し、受光センサー１５７がプラズモン散乱光γを検出する時には、光学フィルター１５５を受光ユニット１５１の光路外に配置する。
　センサー制御部１５３は、受光センサー１５７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１５７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１５７の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１５３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
　制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１１３、搬送ステージ１２２、角度調整機構１４２、光源制御部１４３、位置切り替え機構１５２、およびセンサー制御部１５３を制御する。制御部１６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。なお、前述したピペットチップ１７０における先端とピペットノズル１１６との嵌合部との間の長さと、ピペットチップ１７０の線膨張係数と、反応工程おける、ピペットチップ１７０の温度の最大変化量と、ピペットチップ１７０の温度の経時的な変動とは、予め記憶装置に記憶されている。また、制御部１６０は、第１工程におけるピペットチップ１７０の先端高さに基づいて、ピペットノズル１１６の基準高さを設定する。また、制御部１６０は、第２工程におけるピペットノズル１１６の高さを基準高さから補正する補正量を求める。
　（ＳＰＦＳ装置の検出動作）
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の被検出物質の検出動作について説明する。図７は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。図８は、ピペットチップ１７０の先端高さを検出する工程（図７における工程Ｓ１２０）の内容を示すフローチャートである。この例では、捕捉体として１次抗体が金属膜３０上に固定化されている。また、蛍光標識に使用する捕捉体として、蛍光物質で標識された２次抗体を使用している。さらに、基準部１８０は、流路６０の底面（金属膜３０）とした。
　まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、検出チップ１０を準備して、検出チップ１０のセット位置においてチップホルダー１２１に検出チップ１０を設置する。また、装着位置において、ピペットノズル１１６の先端部にピペットチップ１７０を装着する。
　次いで、ピペットチップ１７０の先端高さを検出する（工程Ｓ１２０）。まず、ピペットチップ１７０内の第１圧力を測定する（工程Ｓ１２１）。具体的には、制御部１６０は、ピペットノズル駆動機構１１２を駆動して、ピペットチップ１７０の先端を流路６０の底面（基準部）の直上に移動させる。そして、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１１３を駆動して、プランジャー１１５をシリンジ１１４に対して進行させて、ピペットチップ１７０の先端から空気を連続してはき出しながら、空気圧センサー１３１によってピペットチップ１７０内の第１圧力を測定する。
　次いで、ピペットチップ１７０内の第２圧力を測定する（工程Ｓ１２２）。具体的には、制御部１６０は、ピペットノズル駆動機構１１２を駆動して、第１圧力を測定した工程（工程Ｓ１２１）よりもピペットチップ１７０の先端を流路６０の底面（基準部１８０）側に移動させる。そして、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１１３を駆動して、プランジャー１１５をシリンジ１１４に対して進行させて、ピペットチップ１７０の先端から空気を連続してはき出しながら、空気圧センサー１３１によってピペットチップ１７０内の第２圧力を測定する。
　次いで、第１圧力と第２圧力との差を求める（工程Ｓ１２３）。具体的には、制御部１６０は、第１圧力（第２圧力）から第２圧力（第１圧力）を差し引くことで第１圧力と第２圧力との差を求める。このとき、第１圧力と第２圧力との差が所定の閾値以上になるまで、ピペットノズル駆動機構１１２を駆動して、ピペットチップ１７０の先端を流路６０の底面（基準部１８０）側に移動させ、空気圧センサー１３１によってピペットチップ１７０内の第２圧力を測定する工程を繰り返す。そして、制御部１６０は、第１圧力と第２圧力との差が生じたことにより、ピペットチップ１７０の先端が基準部１８０に近接したと判定して、基準部１８０に対するピペットチップ１７０の先端高さを検出する。すなわち、制御部１６０は、空気圧センサー１３１が空気圧を検出することで、基準部１８０に対するピペットチップ１７０の先端高さを検出する。
　なお、ピペットチップ１７０の先端高さを検出する工程（工程Ｓ１２０）では、ピペットチップ１７０の先端から空気を連続してまたは間欠的にはき出しながら、かつピペットチップ１７０の先端を基準部１８０に近づけながら空気圧センサー１３１によりピペットチップ１７０内の空気圧を測定してもよい。この場合、ピペットチップ１７０を移動する前の空気圧が第１圧力となる。また、ピペットチップ１７０の先端を基準部１８０に近づけながら空気圧センサー１３１により測定したピペットチップ１７０内の空気圧が第２圧力となる。この場合であってもピペットチップ１７０の先端高さを高精度に検出できる。
　次いで、ピペットノズル１１６の基準高さを設定する（工程Ｓ１３０）。具体的には、制御部１６０は、ピペットノズル駆動機構１１２を駆動して、工程Ｓ１２０でピペットチップ１７０の先端を検出したときにおけるピペットノズル１１６の高さ（位置）から、流路６０内から液体を除去するときの、ピペットチップ１７０の先端が流路６０の底面から所定の高さとなるように、ピペットノズル１１６を移動する。そして、制御部は、ピペットチップ１７０の先端が所定の高さ（例えば１００μｍ）のときのピペットノズル１１６の高さをピペットノズル１１６の基準高さに設定する。
　次に、検出チップ１０に測定液を注入する（工程Ｓ１４０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１２２、ピペットノズル駆動機構１１２、送液ポンプ駆動機構１１３を操作して、測定液が貯留されているウェルから、ピペットチップ１７０を介して、検出チップ１０の流路６０内に測定液を注入する。この工程では、ピペットノズルの基準高さを設定した直後なので、ピペットノズル基準高さの補正は特に不要である。このとき、検出チップの金属膜３０上の反応場が保存試薬により保護されている場合には、ピペットチップ１７０の先端の位置を固定した状態で、プランジャー１１５を往復動作させ、ピペットチップ１７０で測定液（洗浄液）の吸入および排出を繰り返すことで、流路６０内で測定液を往復させ、保存試薬を洗浄除去してもよい。この場合は、洗浄に用いた測定液をピペットチップ１７０にて吸引除去し、新しい測定液を再度検出チップ１０の流路６０内に注入する。
　次いで、励起光αの入射角を決定する（工程Ｓ１５０）。制御部１６０は、搬送ステージ１２２を操作して、検出チップ１０を検出位置に移動させる。そして、制御部１６０は、角度調整機構１４２を駆動して励起光αの入射角を走査しながら、センサー制御部１５３を駆動して受光センサー１５７によりプラズモン散乱光γを検出する。そして、プラズモン散乱光γの光量が最大となる角度を励起光αの入射角（増強角）とする。次いで、ピペットチップ１７０内に測定液を吸入することで流路６０内から測定液を除去する。
　次に、流路６０内より測定液を吸引除去する（工程Ｓ１６０）。この際、制御部１６０は、前述したいずれかの手段により、ピペットチップ１７０の先端高さの変動を打ち消すように、ピペットノズル１１６の高さを基準高さからの補正量を求める。そして、制御部１６０は、ピペットノズル駆動機構１１２を介して、ピペットノズル１１６の高さを補正後の基準高さに移動させる。制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１１３を操作して、流路６０内の測定液をピペットチップ１７０内に吸引除去する。ピペットノズル基準高さを補正し、ピペットチップ１７０の先端位置を高精度に管理することで、流路６０内の測定液の残液量を低減し、かつ一定量に管理することが可能となり、次の１次反応工程において、残液により検体が希釈されてしまう割合を低減かつ一定の希釈率に管理することができる。
　次いで、検体中の被検出物質と１次抗体とを反応させる（１次反応；工程Ｓ１７０）。制御部１６０は、搬送ステージ１２２、ピペットノズル駆動機構１１２、送液ポンプ駆動機構１１３を操作して、１次反応液（検体または検体希釈液）が貯留されているウェルから、ピペットチップ１７０を介して、検出チップ１０の流路６０内に１次反応液を注入し、プランジャー１１５を往復動作させることで、一定時間往復送液する。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は１次抗体に結合する。１次反応後、１次反応液を、ピペットチップ１７０内に吸入することで流路６０から検体を除去する。
　なお、検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。また、被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。
　次いで、金属膜３０上を緩衝液などの洗浄液で洗浄する（工程Ｓ１８０）。制御部１６０は、搬送ステージ１２２、ピペットノズル駆動機構１１２、送液ポンプ駆動機構１１３を操作して、洗浄液が貯留されているウェルから、ピペットチップ１７０を介して、検出チップ１０の流路６０内に洗浄液を注入し、プランジャー１１５を往復動作させることで、一定時間往復送液する。次いで、流路６０内から残留した１次反応液を含む洗浄液を除去する。
　この洗浄液を除去する工程では、測定液を除去する工程（工程Ｓ１６０）と同様に、制御部１６０は、前述したいずれかの手段により、ピペットチップ１７０の先端高さの変動を打ち消すように、ピペットノズル１１６の高さを基準高さからの補正量を求める。そして、制御部１６０は、ピペットノズル駆動機構１１２を介して、ピペットノズル１１６の高さを補正後の基準高さに移動させる。そして、制御部１６０は、ピペットノズル駆動機構１１２を介して、ピペットノズル１１６の高さを補正後の基準高さに移動させ、その補正した位置で残留した１次反応液を含む洗浄液を流路６０内から除去する。ピペットノズル１１６基準高さを補正し、ピペットチップ１７０の先端位置を高精度に管理することで、流路６０内の１次反応液の残液量を低減することが可能となり、以後の工程において、残液として残った１次反応液により、さらに検体が捕捉されてしまうことを防止し、１次反応時間を管理することで、検体の濃度を精度よく検出することが可能となる。
　次いで、金属膜３０上に捕捉されている被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ１９０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１２２、ピペットノズル駆動機構１１２、送液ポンプ駆動機構１１３を操作して、２次反応液（標識抗体液）が貯留されているウェルから、ピペットチップ１７０を介して、検出チップ１０の流路６０内に２次反応液を注入し、プランジャー１１５を往復動作させることで、一定時間往復送液する。流路６０内では、抗原抗体反応によって、金属膜３０上に捕捉されている被検出物質が蛍光物質で標識される。この２次反応後、２次反応液を、ピペットチップ１７０内に吸入することで流路６０から検体を除去する。
　次いで、金属膜３０上を緩衝液などの洗浄液で洗浄する（工程Ｓ２００）。制御部１６０は、搬送ステージ１２２、ピペットノズル駆動機構１１２、送液ポンプ駆動機構１１３を操作して、洗浄液が貯留されているウェルから、ピペットチップ１７０を介して、検出チップ１０の流路６０内に洗浄液を注入し、プランジャー１１５を往復動作させることで、一定時間往復送液する。次いで、流路６０内から残留した２次反応液を含む洗浄液を除去する。
　この洗浄液を除去する工程では、測定液を除去する工程（工程Ｓ１６０）および１次反応後の洗浄工程（Ｓ１８０）と同様に、制御部１６０は、前述した本発明のいずれかの手段により、ピペットチップ１７０の先端高さの変動を打ち消すように、ピペットノズル１１６の高さを基準高さからの補正量を求める。そして、制御部１６０は、ピペットノズル駆動機構１１２を介して、ピペットノズル１１６の高さを補正後の基準高さに移動させる。そして、制御部１６０は、ピペットノズル駆動機構１１２を介して、ピペットノズル１１６の高さを補正後の基準高さに移動させ、その補正した位置で残留した２次反応液を含む洗浄液を流路６０内から除去する。ピペットノズル１１６基準高さを補正し、ピペットチップ１７０の先端位置を高精度に管理することで、流路６０内の２次反応液の残液量を低減することが可能となり、以後の被検出物質の検出工程において、残液として残った被検出物質に対して未反応の蛍光物質からの発光を防止し、検体の濃度を精度よく検出することが可能となる。
　なお、１次反応（工程Ｓ１７０）と２次反応（工程Ｓ１９０）との順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜３０上に提供してもよい。また、金属膜３０上に検体と標識液を同時に提供してもよい。
　次いで、被検出物質を検出する（工程Ｓ２１０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１２２を操作して、検出チップ１０を検出位置に移動させる。そして、光源制御部１４３を駆動して励起光αを工程Ｓ１２０で決定した入射角（増強角）で金属膜３０の所定の位置に照射させながら、センサー制御部１５３を駆動して金属膜３０（金属膜３０表面およびその近傍）上から放出される蛍光δの強度を検出するように受光センサー１５７を制御する。
　なお、制御部１６０は、入射角の決定（工程Ｓ１５０）の後（１次反応Ｓ１８０の前）にブランク値を測定してもよい。この場合、増強角で励起光αを金属膜３０に照射し、受光センサー１５７の検出値をブランク値とする。そして、被検出物質を検出する工程（工程Ｓ２１０）では、蛍光δの検出値からブランク値を引くことで、検体中の被検出物質の量を示す蛍光δの量を算出する。
　なお、ピペットノズル１１６の高さを基準高さから補正する工程は、流路６０内から液体を除去する全ての場合において行わなくてもよい。特に、ピペットノズル１６０の高さの基準高さからの補正は、測定液の排出工程（工程Ｓ１６０）と、１次反応後の洗浄工程（工程Ｓ１８０）と、２次反応後の洗浄工程（工程Ｓ２００）とにおいて流路６０内から液体を除去する動作時において行えばよい。また、測定液の排出工程（工程Ｓ１６０）と、２次反応後の洗浄工程（工程Ｓ２００）とにおいて行えばよい。測定液の排出工程（工程Ｓ１６０）において、ピペットノズル１１６の高さを基準高さから補正する工程を行うのは、流路６０内に測定液が余分に残留することによって、１次反応における検体が希釈されてしまうことを防止するためである。また、１次反応後の洗浄工程（工程Ｓ１８０）において、ピペットノズル１１６の高さを基準高さから補正する工程を行うのは、流路６０内に１次反応液が余分に残留することによって、１次反応がその後も継続してしまうのを防止するためである。２次反応後の洗浄工程（工程Ｓ２００）において、ピペットノズル１１６の高さを基準高さから補正する工程を行うのは、標識液内に浮遊した蛍光物質が流路６０内に残留してしまうと、被検出物質と反応した蛍光物質との区別がつかずノイズとなってしまうためである。
　１次反応後の洗浄工程（工程Ｓ１８０）での残液は比較的影響が小さいので、この工程での基準高さからの補正は省略することも可能である。また、測定液の排出工程（工程Ｓ１６０）は、第１工程にて基準高さを設定してからの経過時間が比較的短く、ピペットチップ１７０の温度変化が比較的小さいため、この工程での基準高さからの補正は省略することも可能である。２次反応後の洗浄工程（工程Ｓ２００）は、ピペットチップ１７０の先端高さを検出してからの経過時間が長いため、ピペットチップ１７０の長さの変化量が最も大きいため、基準高さを補正する効果が大きく、最も重要である。
　また、図９に示されるように、ＳＰＦＳ装置は、装着空間の温度を測定するための第１温度測定手段１９０をさらに有していてもよい。第１温度測定手段１９０は、装着したピペットチップ１７０周辺の庫内温度を測定できれば特に限定されない。第１温度測定手段１９０は、温度センサーなどである。第１温度測定手段１９０により、反応工程おける、ピペットチップ１７０の最大温度および最小温度の差の推定値をより精度良く推定できるため、ピペットノズル１１６の高さを基準高さから精度よく補正できる。
　（ＳＰＦＳ装置の構成２）
　図１０は、実施の形態２に係る反応方法を実施するための装置の一例である表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）のピペットチップ周りの構成を示す模式図である。図１０Ａは、第２温度測定手段１９２の配置を説明するための側面図であり、図１０Ｂは、断面図であり、図１０Ｃは、第２温度測定手段１９２の配置および温調機構１９４の配置を説明するための側面図であり、図１０Ｄは、断面図である。
　図１０Ａ、Ｂに示されるように、実施の形態２に係る反応方法を行うことができるＳＰＦＳ装置は、第２温度測定手段１９２を有する。
　第２温度測定手段１９２は、ピペットチップ１７０の温度を測定する。第２温度測定手段１９２は、前述の機能を発揮できれば特に限定されない。第２温度測定手段１９２の例には、熱電対、サーモバイル、ボロメータなどが含まれる。特に、非接触でピペットチップ１７０の温度を短時間で測定でき、かつ安価であることから、第２温度測定手段１９２は、サーモバイルであることが好ましい。
　また、ＳＰＦＳ装置は、ピペットチップ１７０の温度を調整する温調機構１９４を有していてもよい。温調機構１９４は、前述の機能を発揮できれば特に限定されない。温調機構１９４は、例えば、温調ブロックである。この場合、図１０Ｃ、Ｄに示されるように、温調機構１９４は、検出チップ１０’やウェル６０にピペットチップ１７０の先端が入り込む部分を除いた高さに、かつ第２温度測定手段１９２を除いた位置に配置されている。
　制御部１６０は、ピペットチップ１７０をピペットノズル１１６に装着し、第１工程を行った後、反応工程が終わるまで、ピペットチップ１７０の温度を調整するために、温調機構１９４を起動する。
　本出願は、２０１５年１１月１３日出願の特願２０１５－２２３４３６に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
　本発明に係る反応方法は、例えば被検出物質を高い信頼性で測定することができる。よって、本発明に係る反応方法は、非常に簡易な定量免疫測定システムの開発、普及および発展に寄与することも期待される。
　１０、１０’　検出チップ
　２０　プリズム
　２１　入射面
　２２　成膜面
　２３　出射面
　３０　金属膜
　４０　流路蓋
　４１　反応領域
　４２　試薬貯留領域
　４３　流路溝
　４４　第１貫通孔
　４５　第２貫通孔
　４６　凹部
　６０　流路
　６０’　ウェル
　７０　注入部
　８０　貯留部
　１００　ＳＰＦＳ装置
　１１０　送液部
　１１１　ピペット
　１１２　ピペット移動部
　１１３　送液ポンプ移動機構
　１１４　シリンジ
　１１５　プランジャー
　１１６　ピペットノズル
　１２０　搬送部
　１２１　チップホルダー
　１２２　搬送ステージ
　１３０　位置情報取得部
　１３１　空気圧センサー
　１４０　光照射部
　１４１　光源ユニット
　１４２　角度調整機構
　１４３　光源制御部
　１５０　光検出部
　１５１　受光ユニット
　１５２　位置切り替え機構
　１５３　センサー制御部
　１５４　第１レンズ
　１５５　光学フィルター
　１５６　第２レンズ
　１５７　受光センサー
　１６０　制御部
　１７０　ピペットチップ
　１８０　基準部
　１９０　第１温度測定手段
　１９２　第２温度測定手段
　１９４　温調機構
　Ａ　ピペットチップ
　Ｂ　ピペットノズル
　Ｃ　基準部
　α　励起光
　β　反射光
　γ　プラズモン散乱光
　δ　蛍光

Claims (13)

  1. 　ピペットノズルに装着された、液体を吸引または排出するためのピペットチップを用いて、反応場に液体の供給および前記反応場からの液体の除去を複数回行うことで２以上の物質を反応させる反応工程を含む反応方法であって、
    　前記反応工程の前に、前記ピペットチップの先端高さを検出し、前記ピペットチップの先端高さに基づいて、前記ピペットノズルの基準高さを設定する第１工程と、
    　前記反応工程の途中に、前記ピペットチップの温度が変化することによる前記ピペットチップの先端高さの変動を打ち消すように、前記ピペットノズルの高さを前記基準高さから補正する第２工程と
    　を有する、反応方法。
  2. 　前記第２工程では、前記ピペットノズルの高さを前記反応場に対して高くなるように前記基準高さから補正する、請求項１に記載の反応方法。
  3. 　前記第２工程では、前記反応工程の経過時間に応じて、前記ピペットノズルの高さを前記基準高さから補正する、請求項１または請求項２に記載の反応方法。
  4. 　前記第２工程では、
    　前記ピペットチップにおける先端と前記ピペットノズルとの嵌合部との間の長さと、
    　前記ピペットチップの線膨張係数と、
    　前記ピペットチップの温度の経時的な変動と、
    　前記反応工程の経過時間と、
    　に基づいて前記ピペットチップの先端高さの変動を推定し、推定された前記変動に基づいて前記ピペットノズルの高さを前記基準高さから補正する、
    　請求項３に記載の反応方法。
  5. 　前記ピペットチップの先端高さの変動率は、経時的に減少する、請求項４に記載の反応方法。
  6. 　前記第１工程では、第１温度測定手段によって前記ピペットチップを前記ピペットノズルに装着したときの前記ピペットチップの周囲の温度をさらに測定し、その測定値に基づいて推定される前記ピペットチップ温度の最大変化量に応じて前記ピペットノズルの高さを前記基準高さから補正する、請求項４または請求項５に記載の反応方法。
  7. 　前記第１工程では、第２温度測定手段によって前記ピペットチップの温度をさらに測定し、その測定値に基づいて推定される前記ピペットチップ温度の最大変化量に応じて前記ピペットノズルの高さを前記基準高さから補正する、請求項４～６のいずれか一項に記載の反応方法。
  8. 　前記第１工程では第２温度測定手段によって前記ピペットチップの温度をさらに測定し、
    　前記第２工程では、前記第２温度測定手段によって前記ピペットチップの温度をさらに測定するとともに、前記第１工程において第２温度測定手段によって測定された、前記ピペットチップの先端高さを検出したときの前記ピペットチップの温度と、前記反応工程における前記第２温度測定手段によって測定された前記ピペットチップの温度との差に応じて、前記ピペットノズルの高さを前記基準高さから補正する、請求項１～３のいずれか一項に記載の反応方法。
  9. 　前記第２工程では、
    　前記ピペットチップにおける先端と前記ピペットノズルとの嵌合部との間の長さと、
    　前記ピペットチップの線膨張係数と、
    　前記第２温度測定手段によって前記ピペットチップの温度をさらに測定するとともに、前記第１工程において第２温度測定手段によって測定された、前記ピペットチップの先端高さを検出したときの前記ピペットチップの温度と、前記反応工程における前記第２温度測定手段によって測定された前記ピペットチップの温度との差とに基づいて、前記ピペットノズルの基準高さを補正する、
    　請求項８に記載の反応方法。
  10. 　前記ピペットチップは、樹脂製であり、
    　前記ピペットチップの線膨張係数は、５．８×１０－５／℃以上である、
    　請求項１～９のいずれか一項に記載の反応方法。
  11. 　前記ピペットチップの温度は、温調手段により調整されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の反応方法。
  12. 　前記第２工程は、前記反応場に液体を供給した後であって、前記反応場から当該液体を除去する前までに行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の反応方法。
  13. 　前記反応場は、液体を貯留可能な流路の底面またはウェルの底部に配置されており、
    　前記反応工程は、前記反応場上における免疫反応を含む、
    　請求項１～１２のいずれか一項に記載の反応方法。
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