JP7170653B2 - 反応方法 - Google Patents

Description

本発明は、ピペットノズルに装着された、液体を吸入または排出するためのピペットチップを用いて、２以上の物質を反応させる反応工程を含む反応方法に関する。

特許文献１，２にも記載されるように、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出するためにピペットノズル及びこの先端に装着されるピペットチップが利用されている。微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出するためには、検体や標識液を精度よく反応場に供給し、反応場から除去する必要がある。一般的に、検体や標識液の供給および除去には、ピペットチップが使用される。
特許文献１に記載の液体を供給および除去する方法では、ピペットノズルに装着された樹脂製のピペットチップの先端位置をフォトセンサで検出している。そして、ピペットチップの先端位置の情報に基づいて、ピペットノズルの位置を調整して、液体を精度よく供給および除去している。

しかし、ピペットチップをピペットノズルに装着してピペットチップの先端位置の検出を行った後であって反応工程開始前に、ピペットチップに温度変化があるとピペットチップが膨張し、先端検知した際の先端位置よりもピペットチップの先端位置が低くなり、送液時にピペットチップの先端が流路底面に近づきすぎて、正常な送液ができなくなる。膨張量によっては、ピペットチップ先端が流路底面により閉塞し、吸引もしくは吐出ができなくなる。その結果、反応及び反応量の測定が正常に行えないという課題がある。
特許文献２に記載の方法では、このようなピペットチップの熱膨張による先端位置ズレの課題に対して、反応工程時の推定温度に基づくか、反応工程時に測定したピペットチップの温度に基づいてピペットチップ先端位置を補正し、送液、吸液時の流路底面からのピペットチップ先端位置を制御することを行っている。

特開２００６－２７５８２０号公報 国際公開第２０１７／０８２０６９号

しかしながら、特許文献２に記載の方法によれば、反応工程時の推定温度に基づきピペットチップ先端位置を補正する場合、環境温度次第でズレが生じ得るという課題がある。また、反応工程時に測定したピペットチップの温度に基づいてピペットチップ先端位置を補正する場合、ピペットチップの温度測定手段が必要であることなどの課題が残る。また、推定温度によっても、測定温度によっても反応工程中にピペットチップ先端位置を補正制御するという煩雑さがある。

本発明は以上の従来技術における問題に鑑みてなされたものであって、反応工程中のピペットチップの先端位置を、反応工程前に正確かつ短時間に検出できる反応方法を提供することを課題とする。

以上の課題を解決するための請求項１記載の発明は、ピペットノズルに装着された、液体を吸引または排出するためのピペットチップを用いて、反応場に液体の供給及び前記反応場からの液体の除去を複数回行うことで２以上の物質を反応させる反応工程を含む反応方法であって、
前記ピペットチップを設定温度に従って加熱、保温するヒーターを前記ピペットノズルの先端方向の前記ピペットチップの装着位置に近接して配置し、
前記ピペットチップを前記ピペットノズルに装着するとともに、前記ヒーターにより前記ピペットチップを第一の設定温度で加熱し、
前記第一の設定温度による前記ピペットチップの加熱時間が設定時間を経過した時点で、前記ヒーターを前記第一の設定温度より低い第二の設定温度に切り替えて前記ピペットチップを第二の設定温度で保温し、
前記第二の設定温度に切り替えた時点以降に、前記ピペットノズルの軸方向の前記ピペットチップの先端位置を検出し、
検出した前記先端位置を基準に、前記ピペットノズルの軸方向移動制御により前記ピペットチップの先端位置を制御して前記反応工程を実行し、当該反応工程中の少なくとも前記ピペットチップによる作業工程までは前記ヒーターによる前記第二の設定温度での前記ピペットチップの保温を続行する反応方法である。

請求項２記載の発明は、前記ピペットチップは樹脂製であり、前記ピペットチップの線膨張係数は、５．８×１０^－５／℃以上である請求項１に記載の反応方法である。

請求項３記載の発明は、前記第一の設定温度を、前記第二の設定温度より１０～１５℃高く設定する請求項１又は請求項２に記載の反応方法である。

請求項４記載の発明は、前記設定時間を、５～１０〔ｓ〕とする請求項１、請求項２又は請求項３に記載の反応方法である。

請求項５記載の発明は、前記第二の設定温度に切り替えた時点から１０～２０〔ｓ〕経過後に、前記ピペットチップの先端位置を検出し、検出した前記先端位置を基準に、前記ピペットノズルの移動制御により前記ピペットチップの先端位置を制御して前記反応工程を実行する請求項１から請求項４のうちいずれか一に記載の反応方法である。

本発明によれば、反応工程前にピペットチップの先端位置を検出する。ピペットチップの先端位置の検出時と反応工程中は第二の設定温度によりピペットチップの温度が維持されるから、反応工程中のピペットチップの先端位置を、反応工程前に正確に検出できる。また、先に第二の設定温度より高い第一の設定温度によるピペットチップの加熱時間があるため、第二の設定温度に切替後早期に温度を収束させることができ、ピペットチップの装着時（ヒーターによる加熱開始時）から短時間でピペットチップの先端位置の検出を行うことができる。
以上のようにして反応工程中のピペットチップの先端位置を、反応工程前に正確かつ短時間に検出できる。

本発明の反応方法を実施する装置の概要を示す模式図である。 本発明の反応方法の手順であって、制御装置の制御ステップを示すフローチャートである。 比較例１に係り、ピペットチップの先端位置の時間変化を示したグラフである。 比較例２に係り、ピペットチップの先端位置の時間変化を示したグラフである。 比較例３に係り、ピペットチップの先端位置の時間変化を示したグラフである。 比較例４に係り、ピペットチップの先端位置の時間変化を示したグラフである。 比較例５に係り、ピペットチップの先端位置の時間変化を示したグラフである。 比較例６に係り、ピペットチップの先端位置の時間変化を示したグラフである。 本発明例１に係り、ピペットチップの先端位置の時間変化を示したグラフである。 本発明例２に係り、ピペットチップの先端位置の時間変化を示したグラフである。 本発明例３に係り、ピペットチップの先端位置の時間変化を示したグラフである。 本発明例４に係り、ピペットチップの先端位置の時間変化を示したグラフである。 本発明例５に係り、ピペットチップの先端位置の時間変化を示したグラフである。 本発明例６に係り、ピペットチップの先端位置の時間変化を示したグラフである。

以下、本発明の一実施の形態について、添付した図面を参照して詳細に説明する。本発明の一実施の形態に係る反応方法は、ピペットノズルに装着された、液体を吸引または排出するためのピペットチップを用いて、反応場への液体の供給および反応場からの液体の除去を複数回行い、２以上の物質を反応させる反応工程を含む。

（装置構成概要）
図１に示すようにピペットノズル１の先端部にピペットチップ２が装着される。ヒーター３をピペットノズル１の先端方向のピペットチップ２の装着位置に近接して配置する。ヒーター３は、ピペットノズル１に装着されたピペットチップ２を加温対象とする。
制御装置１０は、本実施形態の反応方法を実施する分析装置の動作を司る。本発明に関係するところとしては、制御装置１０は、ノズル移動アクチュエーター１１を介してピペットノズル１を軸方向Ｚに移動制御し、検出チップ２０の流路底面２１に対するピペットチップ２の先端の高さを制御する。また、制御装置１０は、ヒーター駆動回路１２を介してヒーター３の出力を制御する。また、制御装置１０は、先端位置検出手段１３を制御して軸方向Ｚのピペットチップ２の先端位置を検出させ、そのＺ軸座標を取得する。先端位置検出手段１３としては、特許文献１に記載されるような光学センサーでもよいし、特許文献２に記載されるようなピペットチップ２からの空気圧を測定する構成でもよく、本発明ではピペットチップ２の先端位置を検出する手段や方法は限定されない。

ピペットチップ２の線膨張係数は、ピペットチップ２の材料毎に決まる。ピペットチップ２は、容易にかつ安価に製造できる観点から、樹脂製であることが好ましい。ポリプロピレンを用いた場合のピペットチップ２の線膨張係数は、５．８×１０^－５～１２×１０^－５／℃程度であり、ポリスチレンを用いた場合のピペットチップＡの線膨張係数は、６．０×１０^－５～８．０×１０^－５／℃程度である。また、ポリエチレンを用いた場合のピペットチップＡの線膨張係数は、１１×１０^－５～１５×１０^－５／℃程度であり、低密度ポリエチレンを用いた場合のピペットチップ２の線膨張係数は、１６×１０^－５～２０×１０^－５／℃程度である。さらに、フッ素樹脂を用いた場合のピペットチップ２の線膨張係数は、１０×１０^－５～１２×１０^－５／℃程度である。

制御装置１０と、ヒーター駆動回路１２とは、第一の設定温度と、第二の設定温度とでヒーター３を駆動するように構成されている。第二の設定温度は反応工程中に用いる設定温度であり、反応の種類により設定される。第一の設定温度は予熱に用いる温度である。第一の設定温度は第二の設定温度より高く設定される。

（反応方法の手順）
次に図２のフローチャートを参照しつつ本実施形態の反応方法の手順を説明する。制御装置１０の制御により以下の手順を実行する。
まず、ピペットチップ２をピペットノズル１に装着する。この時既にヒーター３を第一の設定温度に出力を調整しておく。反応工程に短時間で移行できるようにするためである。
したがって、ピペットチップ２をピペットノズル１に装着するとともに、ヒーター３によりピペットチップ２を第一の設定温度で加熱することが開始される（ステップＳ１）。

第一の設定温度によるピペットチップ２の加熱時間が第一の設定時間を経過した時点（ステップＳ２でＹｅｓ）で、ヒーター３を第二の設定温度に切り替えてピペットチップを第二の設定温度で保温する（ステップＳ３）。ヒーター３の出力を第二の設定温度で維持する。

次に、第二の設定温度に切り替えた時点以降に、先端位置検出手段１３によりピペットチップ２の先端位置を検出する。ここでは、第二の設定温度に切り替えた時点を始点として第二の設定時間を設定する。すなわち、第二の設定時間が経過した時点（ステップＳ４でＹｅｓ）で、先端位置検出手段１３によりピペットチップ２の先端位置を検出する。第二の設定時間を０に設定すれば、第二の設定温度に切り替えた時点でピペットチップ２の先端位置を検出することとなる。第二の設定時間を１０〔ｓ〕に設定すれば、第二の設定温度に切り替えた時点の１０〔ｓ〕後にピペットチップ２の先端位置を検出することとなる。

次に、ステップＳ５で検出した先端位置を基準に、ノズル移動アクチュエーター１１を制御してピペットノズル１の軸方向移動制御によりピペットチップ２の先端位置を制御して反応工程を実行する（ステップＳ６）。反応工程においては、ピペットチップ２の先端開口から液体を検出チップ２０に排出したり、検出チップ２０から液体をピペットチップ２の先端開口へ吸引したりするが、その際、ステップＳ５で検出した先端位置を基準に検出チップ２０の流路底面２１に対するピペットチップ２の先端の高さを、排出や吸引が良好となるよう適切に制御する。
ステップＳ３で第二の設定温度に切り替えてから、ここまで第二の設定温度を維持する。但し、反応工程中の少なくともピペットチップ２による作業工程までヒーター３による第二の設定温度でのピペットチップ２の保温を続行すればよい。ピペットチップ２による作業が済んだ後は必要ないからである。

例えば、以上の第一の設定温度を、第二の設定温度より１０～１５℃高く設定し、第一の設定時間を５～１０〔ｓ〕とし、第二の設定温度を１０～２０〔ｓ〕とする。

（実証実験）
図３から図１４は、軸方向Ｚについてのピペットチップ２の先端位置の時間変化を示したグラフである。図３から図８は比較例に係り、図９から図１４は本発明例に係る。但し、反応工程及び反応工程のための基準となる先端検出を行わず、一定の時間レートでピペットチップ２の先端の検出を行ったものである。
グラフのＮ１，Ｎ２，Ｎ３は、ピペットチップ２のサンプルの違いによる。
比較例では、ヒーター３を一の設定温度で維持する。比較例では、ピペットチップ２をピペットノズル１に装着した時点（従ってヒーター３による加熱が開始された時点）がグラフ横軸である時間軸の０に相当する。
本発明例では、ヒーター３を第一の設定温度から第二の設定温度に変遷させる。本発明例では、第二の設定温度に切り替えた時点がグラフ横軸である時間軸の０に相当する。

各例の詳細条件は以下の通りである。
図３に示す比較例１においては、設定温度を４０℃とし、環境温度は１０℃である。
図４に示す比較例２においては、設定温度を４０℃とし、環境温度は２３℃である。
図５に示す比較例３においては、設定温度を４０℃とし、環境温度は３０℃である。

図６に示す比較例４においては、設定温度を４５℃とし、環境温度は１０℃である。
図７に示す比較例５においては、設定温度を４５℃とし、環境温度は２３℃である。
図８に示す比較例６においては、設定温度を４５℃とし、環境温度は３０℃である。

図９に示す本発明例１においては、第一の設定温度を５０℃、第一の設定時間を５〔ｓ〕、第二の設定温度を４０℃とし、環境温度は１０℃である。
図１０に示す本発明例２においては、第一の設定温度を５０℃、第一の設定時間を５〔ｓ〕、第二の設定温度を４０℃とし、環境温度は２３℃である。
図１１に示す本発明例３においては、第一の設定温度を５０℃、第一の設定時間を５〔ｓ〕、第二の設定温度を４０℃とし、環境温度は３０℃である。

図１２に示す本発明例４においては、第一の設定温度を５０℃、第一の設定時間を１０〔ｓ〕、第二の設定温度を４０℃とし、環境温度は１０℃である。
図１３に示す本発明例５においては、第一の設定温度を５０℃、第一の設定時間を１０〔ｓ〕、第二の設定温度を４０℃とし、環境温度は２３℃である。
図１４に示す本発明例６においては、第一の設定温度を５０℃、第一の設定時間を１０〔ｓ〕、第二の設定温度を４０℃とし、環境温度は３０℃である。

結果はグラフに示す通り、比較例に対し本発明例の方が早期に一定の変動範囲に収束した。詳しく分析すると以下の通りである。
収束点±１０μｍの範囲に変動量が収束した時点（Ｔｃ）を複数サンプルの平均値で計算し、グラフ中と表Ｉに示した。収束点は最後から１０点のデータの平均値とした。表Ｉにおいて本発明例については第一の設定時間を加算した値を併記する。

＊但し、本発明例５，６に関しては、データを取った範囲で最初から収束していたため、より早期に収束していた可能性がある。

（まとめ）
図１、図２、図９から図１４に示すように本発明例によれば、ピペットチップ２の先端位置の検出時と反応工程中は第二の設定温度によりピペットチップの温度が維持されるから、反応工程中のピペットチップの先端位置を、反応工程前に正確に検出できる。
また本発明例によれば、先に第二の設定温度より高い第一の設定温度によるピペットチップ２の加熱時間があるため、第二の設定温度に切替後早期に温度を収束させることができ、比較例１－６に比較してもピペットチップの装着時（ヒーターによる加熱開始時）から短時間でピペットチップ２の先端位置の検出を行うことができる。ピペットチップ２の装着当初から第二の設定温度（反応工程時の設定温度）であると、ピペットチップ２の先端位置が収束するまで長時間を要する。本発明では高温予熱期間として第一の設定温度での加熱期間を置き、第二の設定温度での熱環境下での収束点に急速にピペットチップ２を膨張させることで、収束を早期に迎えることができる。これにより早期に先端位置検出、反応工程への移行が可能となる。
本実施形態によれば以上のようにして反応工程中のピペットチップの先端位置を、反応工程前に正確かつ短時間に検出できる。

本発明は、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出するための反応方法に利用することができる。

１ ピペットノズル
２ ピペットチップ
３ ヒーター
１０ 制御装置
１１ ノズル移動アクチュエーター
１２ ヒーター駆動回路
１３ 先端位置検出手段
２０ 検出チップ
Ｔｃ 収束時間

Claims (5)

1. ピペットノズルに装着された、液体を吸引または排出するためのピペットチップを用いて、反応場に液体の供給及び前記反応場からの液体の除去を複数回行うことで２以上の物質を反応させる反応工程を含む反応方法であって、
   前記ピペットチップを設定温度に従って加熱、保温するヒーターを前記ピペットノズルの先端方向の前記ピペットチップの装着位置に近接して配置し、
   前記ピペットチップを前記ピペットノズルに装着するとともに、前記ヒーターにより前記ピペットチップを第一の設定温度で加熱し、
   前記第一の設定温度による前記ピペットチップの加熱時間が設定時間を経過した時点で、前記ヒーターを前記第一の設定温度より低い第二の設定温度に切り替えて前記ピペットチップを第二の設定温度で保温し、
   前記第二の設定温度に切り替えた時点以降に、前記ピペットノズルの軸方向の前記ピペットチップの先端位置を検出し、
   検出した前記先端位置を基準に、前記ピペットノズルの軸方向移動制御により前記ピペットチップの先端位置を制御して前記反応工程を実行し、当該反応工程中の少なくとも前記ピペットチップによる作業工程までは前記ヒーターによる前記第二の設定温度での前記ピペットチップの保温を続行する反応方法。
2. 前記ピペットチップは樹脂製であり、前記ピペットチップの線膨張係数は、５．８×１０^－５／℃以上である請求項１に記載の反応方法。
3. 前記第一の設定温度を、前記第二の設定温度より１０～１５℃高く設定する請求項１又は請求項２に記載の反応方法。
4. 前記設定時間を、５～１０〔ｓ〕とする請求項１、請求項２又は請求項３に記載の反応方法。
5. 前記第二の設定温度に切り替えた時点から１０～２０〔ｓ〕経過後に、前記ピペットチップの先端位置を検出し、検出した前記先端位置を基準に、前記ピペットノズルの移動制御により前記ピペットチップの先端位置を制御して前記反応工程を実行する請求項１から請求項４のうちいずれか一に記載の反応方法。

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