JP6213160B2 - 分析チップ - Google Patents

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）を利用して試料液中に含まれる被検出物質を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法で使用される分析チップに関する。

タンパク質やＤＮＡなどの生体物質を検出する測定において、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できれば、即時に患者の状態を把握し治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質に起因する微弱な光を、高感度かつ定量的に検出する分析方法および分析装置が求められている。被検出物質を高感度で検出する１つの方法としては、表面プラズモン共鳴蛍光分析（表面プラズモン励起増強蛍光分光（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：ＳＰＦＳ）法が知られている。

ＳＰＦＳ法では、金属膜が所定の面上に配置されたプリズムを用いる（例えば、特許文献１参照）。そして、プリズムを介して、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光を金属膜に照射すると、金属膜表面上に局在場光（増強された電場）を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が励起されるため、蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。

特開平１０−３０７１４１号公報

ＳＰＦＳ法では、高感度かつ高精度な検出を行うためには、検体の種類や分析装置のバラつき、分析チップのバラつきなどに応じて金属膜に対する励起光の入射角を高い精度で調整する必要がある。しかしながら、励起光の光学系が単純な場合、金属膜に対する励起光の入射角を変化させると、励起光の照射スポットの形状および位置が大きく変化してしまう。このため、少なくとも、励起光の入射角を変化させても、励起光の照射スポットが反応場に対応する領域内に収まることが要求される。

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、表面プラズモン共鳴蛍光分析方法で使用される分析チップであって、励起光の入射角を変化させても、励起光の照射スポットを反応場に対応する領域内に収めることができる分析チップを提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る分析チップは、励起光を照射したときに生じる表面プラズモン共鳴に基づく増強電場により被検出物質を標識する蛍光物質が励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法で使用される分析チップであって、励起光に対する屈折率が１.５１〜１.６３の樹脂またはガラスからなり、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された、金、銀、銅、アルミニウムまたはこれらの合金により構成される金属膜と、を有し、前記成膜面に対する前記入射面の角度が、７５°以上で８５°以下である。

本発明によれば、励起光の光学系が単純な場合であっても、励起光の入射角に関係なく、励起光の照射スポットを反応場に対応する領域内に収めることができる。したがって、本発明によれば、励起光の光学系が単純な分析装置を使用しても、被検出物質の高感度かつ高精度な検出を実現することができる。

本発明の一実施の形態に係る分析チップの構成、および分析チップを使用して、ＳＰＦＳ法を実施する様子を示す模式的に示す図である。 プリズムの屈折率と成膜面に対する励起光の好適な入射角θ_ａｕとの関係を示すグラフである。 成膜面に対する入射面の角度θ_αと成膜面上の励起光の照射スポットの変形率との関係を示すグラフである。 成膜面に対する入射面の角度θ_αと励起光源の走査角との関係を示すグラフである。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

図１は、本発明の一実施の形態に係る分析チップ１００の構成、および分析チップ１００を使用して、表面プラズモン共鳴蛍光分析（ＳＰＦＳ）法を実施する様子を示す模式図である。

図１に示されるように、分析チップ１００は、入射面１１１、成膜面１１２および出射面１１３を有するプリズム１１０と、成膜面１１２に形成された金属膜１２０と、成膜面１１２または金属膜１２０上に配置された流路蓋１３０とを有する。通常、分析チップ１００は、分析装置の固定具２１０により固定されており、分析のたびに交換される。分析チップ１００は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

プリズム１１０は、光源２２０から出射された励起光３１０に対して透明であり、かつ屈折率が１.５１〜１.６３の誘電体からなる。プリズム１１０の材料の例には、屈折率が１.５１〜１.６３の樹脂およびガラスが含まれる。プリズム１１０の材料は、好ましくは、屈折率が１.５１〜１.６３であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。なお、本明細書において「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。本実施の形態では、励起光３１０は、プリズム１１０を介して金属膜１２０に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を金属膜１２０の表面上に生じさせる光である。たとえば、励起光３１０は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定のシングルモードレーザー光である。

プリズム１１０は、入射面１１１、成膜面１１２および出射面１１３を有する。入射面１１１は、光源２２０からの励起光３１０をプリズム１１０の内部に入射させる。本明細書においては、入射面１１１に対する励起光３１０の入射角を「θ_ｐ」と表す（図１参照）。成膜面１１２上には、金属膜１２０が配置されている。プリズム１１０の内部に入射した励起光３１０は、金属膜１２０の裏面で反射する。より具体的には、励起光３１０は、プリズム１１０と金属膜１２０との界面（成膜面１１２）で反射する。本明細書においては、成膜面１１２に対する励起光３１０の入射角を「θ_ａｕ」と表す（図１参照）。出射面１１３は、金属膜１２０で反射した励起光３１０をプリズム１１０の外部に出射させる。

成膜面１１２に対する入射面１１１の角度θ_α（図１参照）は、６０°以上である。また、角度θ_αは、９０°未満であり、８５°以下であることが好ましい。これらの理由については、別途説明する。プリズム１１０の形状は、上記θ_αの条件を満たしていれば、特に限定されない。入射面１１１と成膜面１１２とが、互いに隣接していてもよいし、隣接していなくてもよい。本実施の形態では、プリズム１１０の形状は、台形を底面とする柱体（四角柱）である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面１１２であり、一方の脚に対応する面が入射面１１１であり、他方の脚に対応する面が出射面１１３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面１１１と出射面１１３とが対称になり、金属膜１２０の裏面で反射した励起光３１０がプリズム１１０内に滞留しにくくなる。

また、入射面１１１は、励起光３１０が光源２２０に戻らないように形成される。光源２２０がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光３１０がＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光３１０の波長や出力が変動してしまう。そこで、入射角θ_ａｕを計算上最適と思われる入射角（増強角）を中心として±５°程度走査した場合であっても、励起光３１０が光源２２０に戻らないように、入射面１１１の角度が設定される。具体的には、計算上最適と思われる入射角（増強角）を中心として±５°程度走査した場合に、入射面１１１に対する励起光３１０の入射角θ_ｐが常に３°以上となるように、成膜面１１２に対する入射面１１１の角度θ_αが設定される。なお、入射面１１１に対する励起光３１０の計算上最適と思われる入射角θ_ｐ（増強角）は、主としてプリズム１１０の屈折率により決まる。

金属膜１２０は、プリズム１１０の成膜面１１２上に配置されている。これにより、成膜面１１２に全反射条件で入射した励起光３１０の光子と、金属膜１２０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴）が生じ、金属膜１２０の表面上に局在場光を生じさせることができる。

金属膜１２０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜１２０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜１２０は、金薄膜である。金属膜１２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜１２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜１２０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。

金属膜１２０のプリズム１１０と対向しない面（流路蓋１３０側の面）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体を固定化することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。本実施の形態では、金属膜１２０上の所定の領域（反応場１２１）に、捕捉体が均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体またはその断片である。

流路蓋１３０は、金属膜１２０上に配置されている。金属膜１２０がプリズム１１０の成膜面１１２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋１３０は、成膜面１１２上に配置されていてもよい。流路蓋１３０は、金属膜１２０（およびプリズム１１０）と共に、液体が流れる流路１３１を形成する。液体の例には、被検出物質を含む試料液や、蛍光物質で標識された抗体を含む標識液、洗浄液などが含まれる。金属膜１２０に固定化されている捕捉体は、流路１３１内に露出している。流路１３１の両端は、流路蓋１３０の上面に形成された注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路１３１内へ液体が注入されると、液体は捕捉体に接触する。

流路蓋１３０は、金属膜１２０上から放出される蛍光３２０に対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋１３０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光３２０を外部に取り出す部分が蛍光３２０に対して透明であれば、流路蓋１３０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋１３０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜１２０またはプリズム１１０に接合されている。

図１に示されるように、光源２２０からの励起光３１０は、入射面１１１で屈折しつつプリズム１１０内に入射する（入射角θ_ｐ）。プリズム１１０内に入射した励起光３１０は、金属膜１２０に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）で入射する（入射角θ_ａｕ）。このように金属膜１２０に対して励起光３１０を表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射することで、金属膜１２０上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜１２０上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光３２０が出射される。蛍光３２０は、集光部材２３０（例えば対物レンズ）やフィルター２４０（例えば励起光カットフィルター）などを透過した後、受光センサー２５０で検出される。ＳＰＦＳ法では、蛍光物質から放出された蛍光３２０の光量を検出することで、被検出物質の存在または量を検出する。

上述のとおり、金属膜１２０に対する励起光３１０の入射角θ_ａｕは、金属膜１２０において表面プラズモン共鳴が生じるように調整される。検出感度および定量性を高める観点からは、励起光３１０の入射角θ_ａｕは、プラズモン散乱光の最大光量を得られる角度である増強角であることが好ましい。励起光３１０の入射角θ_ａｕを増強角に設定することで、高強度の蛍光３２０を検出することが可能となる。前述のとおり、増強角は、主としてプリズム１１０の屈折率により決まり、計算で算出されうる。

図２は、プリズム１１０の屈折率と、成膜面１１２に対する励起光３１０の最適な入射角θ_ａｕ（増強角）との関係を示すグラフである。このグラフに示されるように、プリズム１１０の屈折率が決まることで、成膜面１１２に対する励起光３１０の最適な入射角θ_ａｕ（増強角）も決まる。ただし、プリズム１１０の形状誤差や、金属膜１２０の材料および膜厚、流路１３１内に存在する液体の屈折率などにより、最適な入射角θ_ａｕ（増強角）はわずかに変動する。したがって、実際の分析では、算出された最適な入射角θ_ａｕ（増強角）を中心として±５°程度の範囲で入射角θ_ａｕを走査することが好ましい。
本実施の形態では、光源２２０を励起光３１０の光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角θ_ａｕを走査しても金属膜１２０上での照射スポットの形状および位置がなるべく変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角θ_ａｕの走査範囲の両端における２つの励起光３１０の光軸の交点（通常、プリズム１１０内に位置する）の近傍に設定することで、照射位置の形状および位置の変化を極小化することができる。

しかしながら、上記のように回転軸を設定したとしても、光源２２０を回動させて入射角θ_ａｕを走査すると、成膜面１１２上の励起光３１０の照射スポットの形状および位置が変化してしまうため、金属膜１２０裏面の所定の領域（反応場に対応する領域）に適切に励起光３１０を照射できないおそれがある。この問題について、本実施の形態に係る分析チップ１００では、成膜面１１２に対する入射面の角度θ_αを６０°以上で９０°未満（好ましくは８５°以下）とすることで対応している。

図３は、成膜面１１２に対する入射面１１１の角度θ_αと成膜面１１２上の励起光３１０の照射スポットの変形率との関係を示すグラフである。このグラフでは、屈折率および角度θ_αがそれぞれ異なるプリズム１１０を用いて、図２に示される増強角を中心として±５°程度の範囲で入射角θ_ａｕを走査したときの、成膜面１１２上の励起光３１０の照射スポットの変形率を示している。照射スポットの変形率は、図１に示されるｘ軸方向のスポット径の最大値を最小値で除すことで算出した。したがって、照射スポットの変形率は、１.０以上であり、１.０に近いほど好ましい。照射スポットの変形率は、２.０以下であれば、照射スポットを金属膜１２０裏面の所定の領域（反応場に対応する領域）内に収めることができ、十分な検出感度および定量性を実現できると考えられる。図３に示されるように、角度θ_αが６０°以上で９０°以下である場合、プリズム１１０の屈折率に関係なく照射スポットの変形率が２.０以下となる。したがって、本実施の形態に係る分析チップ１００では、成膜面１１２に対する入射面の角度θ_αを６０°以上で９０°未満としている。

図４は、成膜面１１２に対する入射面１１１の角度θ_αと光源２２０の走査角との関係を示すグラフである。ここで「光源の走査角」とは、図２に示される増強角を中心として±５°程度の範囲で入射角θ_ａｕを走査したときの、角度θ_ｍの最大値から最小値を引いた値を意味する。光源２２０の走査角が大きいほど、照射スポットの形状および位置が変化しやすいことから、光源２２０の走査角は小さいほど好ましい。現実的には、光源２２０の走査角は、２０.０°以下であれば、照射スポットを金属膜１２０裏面の所定の領域（反応場に対応する領域）内に収めることができ、十分な検出感度および定量性を実現できると考えられる。図４に示されるように、角度θ_αが６０°以上で８５°以下である場合、プリズム１１０の屈折率に関係なく光源２２０の走査角は、２０.０°以下となる。したがって、本実施の形態に係る分析チップ１００では、成膜面１１２に対する入射面の角度θ_αを６０°以上で８５°以下とすることが好ましい。

以上のように、本実施の形態に係る分析チップ１００は、成膜面１１２に対する入射面の角度θ_αを６０°以上で９０°未満（好ましくは８５°以下）としているため、励起光３１０の光学系が単純な場合であっても、励起光３１０の入射角θ_ａｕに関係なく、励起光３１０の照射スポットを金属膜１２０裏面の所定の領域（反応場に対応する領域）内に収めることができる。したがって、本実施の形態に係る分析チップ１００によれば、励起光３１０の光学系が単純な分析装置を使用しても、被検出物質の高感度かつ高精度な検出を実現することができる。

本発明に係る分析チップは、ＳＰＦＳ法で用いることで被検出物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば臨床検査などに有用である。

１００ 分析チップ
１１０ プリズム
１１１ 入射面
１１２ 成膜面
１１３ 出射面
１２０ 金属膜
１２１ 反応場
１３０ 流路蓋
１３１ 流路
２１０ 固定具
２２０ 光源
２３０ 集光部材
２４０ フィルター
２５０ 受光センサー
３１０ 励起光
３２０ 蛍光
θ_ａｕ 成膜面における励起光の入射角
θ_ｍ 成膜面の法線に対する励起光の光軸の角度
θ_ｐ 入射面における励起光の入射角
θ_α 成膜面に対する入射面の角度

Claims (3)

1. 励起光を照射したときに生じる表面プラズモン共鳴に基づく増強電場により被検出物質を標識する蛍光物質が励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法で使用される分析チップであって、
   励起光に対する屈折率が１.５１〜１.６３の樹脂またはガラスからなり、入射面および成膜面を有するプリズムと、
   前記成膜面上に配置された、金、銀、銅、アルミニウムまたはこれらの合金により構成される金属膜と、を有し、
   前記成膜面に対する前記入射面の角度が、７５°以上で８５°以下である、
   分析チップ。
2. 前記樹脂または前記ガラスの励起光に対する屈折率は、１.５２〜１.６３の範囲内である、請求項１に記載の分析チップ。
3. 前記入射面における励起光の入射角が、３°以上である、請求項１または請求項２に記載の分析チップ。

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