JP5565125B2 - Ｓｐｆｓ（表面プラズモン励起増強蛍光分光法）またはそれを利用した測定方法ならびにそれらの測定方法用の表面プラズモン共鳴センサ - Google Patents

Description

本発明は、医療、バイオテクノロジー等の分野で利用されるＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）またはそれを利用するＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ（Localized surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：局在表面プラズモン励起増強蛍光分光法）などの測定系に関し、より具体的には、それらの測定系に用いられる手法および表面プラズモン共鳴センサの構造に関する。

ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライト（分析対象物）を標識する蛍光色素を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中にアナライトがごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。ＳＰＦＳの基本的な態様は、たとえば特許文献１および２に開示されている。

また、ＬＰＦＳは、上記ＳＰＦＳと組み合わせて利用することのできる方法であって、コロイド液を流すなどして金属コロイド粒子を蛍光色素近傍に位置させると、この金属コロイド粒子にもプラズモンが発生して局所的な電場増強効果が得られることを利用し、さらに効率良く蛍光色素を励起させてその蛍光シグナルを測定する方法である。

ＳＰＦＳおよびそれを利用するＳＰＦＳ−ＬＰＦＳなどの測定方法（以下「ＳＰＦＳ等」と総称する。）などによれば、たとえば、血液中の極微量の腫瘍マーカーを定量することにより、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができるようになるため、医療、バイオテクノロジー等の分野における活用が期待される。

このようなＳＰＦＳ等において、蛍光シグナルに含まれる何らかのノイズを排除してより測定精度を高めるための手法、たとえばノイズの強度を反映する指標を用いることにより測定されたシグナル強度を補正してより正確なシグナル強度を求めるような手法は報告されていない。

特許第３２９４６０５号公報 特開２００６−２１８１６９号公報

ＳＰＦＳ等を臨床検査システムで実用化し、たとえば１時間程度で問診、採血、検査、およびその結果に基づく診断が行えるようにすることを考慮した場合、測定データの精度保証は極めて重要であり、かつ短時間の測定でそれを実現することが望まれる。

本発明は、ＳＰＦＳ等の測定系において用いることのできる、従来よりも測定精度を高
めるための手段を提供することを目的とする。

本発明者は、ＳＰＦＳ等において金属薄膜に励起光を照射したときに、表面プラズモン共鳴に由来する増強されたエバネッセント波（非伝播光）のみが発生するわけではなく、おそらくセンサ表面の金属薄膜の態様（たとえば微細な凹凸、膜厚、金属種）に起因する複数種の伝播光（本発明において「プラズモン散乱光」と称する。）も発生することを見出した。

プラズモン散乱光の主成分は金属薄膜に入射した励起光と同一の波長成分であり、そのような波長成分も蛍光色素を励起しうるため、蛍光色素が生ずる蛍光の一部は（増強されたエバネッセント波由来の励起光波長成分ではなく）プラズモン散乱光の励起光波長成分に由来しうる。また、プラズモン散乱光の一部は、アナライトを標識する蛍光色素が発する蛍光と同一の波長成分であるため、光検出器で測定された蛍光の一部はプラズモン散乱光の蛍光波長成分に由来しうる。しかも、プラズモン散乱光の要因となる金属薄膜の微細な凹凸などはセンサ（製造ロット）ごとに相違するため、上記のようなプラズモン散乱光による影響の程度は一定ではない。

つまり、従来はアナライトを標識した蛍光色素から非伝播光により発生した蛍光として測定されていたシグナルには、実はセンサごとに程度の異なる上記のようなノイズが含まれていた可能性がある。特に、プラズモン散乱光の一部の蛍光波長成分は、サンプル中にアナライトが存在しない場合にも蛍光シグナルとして検出されるものであり、ブランクシグナルを高める原因として問題である。極めて高感度なＳＰＦＳ等においてはそのようなノイズが測定結果に重大な影響を及ぼすおそれがあり、測定の精度や信頼性を高めるためには極力そのようなノイズの影響を排除することが望ましい。

そこで本発明者は、上記の問題を解消すべくさらに研究を進めた結果、プラスモン散乱光（伝播光）の励起光波長成分によって蛍光を発する蛍光色素を含有する層（単に「蛍光色素層」と記載することもある。）を備えた領域を表面プラズモン共鳴センサに設け、この領域でＳＰＦＳ等により測定されるシグナルを利用することにより、プラズモン散乱光に由来するノイズの影響を排除した上で、検体中のアナライトの定量を行うことができるようになることを見出した。

すなわち、本発明は、次のようなＳＰＦＳ（表面プラズモン励起増強蛍光分光法）またはそれを利用した測定方法を提供する。

［１］
少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜上に形成された固定化リガンドを含む層とにより構成された測定領域（Ａ）に、まず試料を送液し、次いで標識リガンド溶液を送液し、これを流下させた後、標識リガンドの蛍光色素の励起光を所定の入射角で金属薄膜裏面に照射し、金属薄膜を透過した非伝播光であるエバネッセント波（Ｅ_e）により当該蛍光色素から発せられた蛍光シグナルを含むシグナル（Ｓ_a）を光検出器で測定する工程を含む、ＳＰＦＳ（表面プラズモン励起増強蛍光分光法）またはそれを利用した測定方法であって、
上記シグナル（Ｓ_a）に含まれる、伝播光であるプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）に起因する、少なくとも上記エバネッセント波（Ｅ_e）および上記プラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）の両方が到達する距離にあるアナライトに結合した標識リガンドが発する蛍光（Ｆ₂）を含み、さらに上記エバネッセント波（Ｅ_e）が到達せず上記プラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）のみが到達する距離にあるアナライトに結合した標識リガンドが発する蛍光（Ｆ₃）を含んでいてもよい蛍光シグナルを補正するためのステップ（Ｔ１）を含み、
上記補正のためのステップ（Ｔ１）が、
少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜と光検出器との間に、エバネッセント波（Ｅ _e ）が到達せずプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ _t ）のみが到達するよう当該金属薄膜からの距離をあけて配置された蛍光色素層とにより構成されたプラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）において、前記測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ _a ）の測定と同条件でシグナル（Ｓ _p ）を測定すること、
少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜と光検出器との間に、厚みの少なくとも一部がエバネッセント波（Ｅ _e ）およびプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ _t ）の両方が到達する距離にあるようにして配置された蛍光色素層とにより構成されたプラズモン散乱リファレンス領域（Ｑ）において、前記測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ _a ）の測定と同条件でシグナル（Ｓ _q ）を測定すること、
上記シグナル（Ｓ _p ）の測定値より、入射光のうちプラズモン散乱光になるものの割合を示す散乱係数（ｋ１）を求めること、
上記シグナル（Ｓ _q ）の測定値および上記散乱係数（ｋ１）より、入射光のうちエバネッセント波になるものの割合を示すプラズモン係数（ｋ２）を求めること、ならびに
上記散乱係数（ｋ１）およびプラズモン係数（ｋ２）に基づいて前記シグナル（Ｓ _a ）から補正されたシグナル（Ｓ _a ′）を求めることを含むことを特徴とする、上記測定方法。

［２］
さらに、前記シグナル（Ｓa）に含まれる、プラズモン散乱光中の蛍光波長成分（Ｆt）に起因する蛍光シグナルの補正のためのステップ（Ｔ２）を含むことを特徴とする、前記［１］に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法。

［３］
さらに、前記シグナル（Ｓ_a）に含まれる、プラズモン散乱光中の蛍光波長成分（Ｆ_t）に起因する蛍光シグナルの補正のためのステップ（Ｔ２）を含み、
上記補正のためのステップ（Ｔ２）が、
前記測定領域（Ａ）と同様の構成を有するアッセイリファレンス領域（Ｒ）に、アナライトも標識リガンドも含まない液体を送液し、流路をこれで満たした状態で測定すること以外は前記測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ_a）の測定と同条件でシグナル（Ｓ_r1）を測定すること、
上記アッセイリファレンス領域（Ｒ）に、前記測定領域（Ａ）で用いたものと同じ標識リガンド溶液を送液し、流路をこれで満たした状態で測定すること以外は前記測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ_a）の測定と同条件で、シグナル（Ｓ_r2）を測定すること、
前記シグナル（Ｓ_p）の測定値から上記シグナル（Ｓ_r1）の測定値を引いた値より散乱係数（ｋ１）を求めること、
前記シグナル（Ｓ_q）の測定値から上記シグナル（Ｓ_r2）の測定値を引いた値および上記散乱係数（ｋ１）よりプラズモン係数（ｋ２）を求めること、ならびに
上記散乱係数（ｋ１）およびプラズモン係数（ｋ２）に基づいて前記シグナル（Ｓ_a）から補正されたシグナル（Ｓ_a′）を求めることを含むことを特徴とする、前記［１］に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法。

［４］
前記シグナル（Ｓ_a′）が、下記式で表されることを特徴とする、前記［１］または［３］に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法。

Ｓ_a′＝Ｓ_a×(ｋ１＋ｋ２)／ｋ２
［５］
少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜上に形成された固定化リガンドを含む層とにより構成された測定領域（Ａ）、
少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜と光検出器の間に、エバネッセント波（Ｅ_e）が到達せずプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）のみが到達するよう当該金属薄膜からの距離をあけて配置された蛍光色素層とにより構成されたプラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）、および
少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜と光検出器の間に、厚みの少なくとも一部がエバネッセント波（Ｅ_e）およびプラズモン散
乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）の両方が到達する距離にあるように配置された蛍光色素層とにより構成されたプラズモン散乱リファレンス領域（Ｑ）
を備えることを特徴とする、ＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法用の表面プラズモン共鳴センサ。

［６］
さらに、前記測定領域（Ａ）と同一の構成を有するアッセイリファレンス領域（Ｒ）を備えることを特徴とする、前記［５］に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法用の表面プラズモン共鳴センサ。

［７］
前記プラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）および増強電場リファレンス領域（Ｑ）の蛍光色素層が、上記領域のセンサ表面と光検出器の間にセンサ表面に対向するよう設置された部材を、蛍光色素を含有する光透過性材料で形成するか、またはそのように設置された蛍光色素を含有しない光透過性材料で形成された部材に蛍光色素を含有する薄層を積層することにより配置されていることを特徴とする、前記［５］または［６］に記載の表面プラズモン共鳴センサ。

［８］ 前記プラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）の蛍光色素層が、蛍光色素を含有しない光透過性材料で形成された流路天板に積層された蛍光色素を含有する薄層であることを特徴とする、前記［７］に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法用の表面プラズモン共鳴センサ。

［９］
前記増強電場リファレンス領域（Ｑ）の蛍光色素層が、金属薄膜上に積層された蛍光色素を含有する薄層であって、当該蛍光色素層の厚みすべてがエバネッセント波（Ｅ_e）およびプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）の両方が到達する距離にあることを特徴とする、前記［７］または［８］に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法用の表面プラズモン共鳴センサ。

本発明によりプラズモン散乱光に由来するノイズの影響を排除することができるようになるため、ＳＰＦＳ等の測定精度や信頼性を従来よりも一層高めることができるため、実用化に大きく貢献する。

本発明の実施態様の一例（第１実施形態）を表す模式図である。 本発明の実施態様の別の例（第２実施形態）を表す模式図である。 従来の実施態様の例を表す模式図である。

本発明に係る測定方法は、以下に述べるようなシグナル（Ｓ_a）に含まれる、伝播光で
あるプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）に起因する蛍光シグナルを補正するた
めのステップ（Ｔ１）を含み、さらに、前記シグナル（Ｓ_a）に含まれる、プラズモン散
乱光中の蛍光波長成分（Ｆ_t）に起因する蛍光シグナルの補正のためのステップ（Ｔ２）
を含んでもよいものである。以下、このような測定方法およびそれに用いられる表面プラ
ズモン共鳴センサについて、本発明の典型的な実施形態である第１実施形態および第２実施形態に則し、また図面を参照しながら説明する。ただし、本発明の方法は、以下で説明する測定領域（Ａ）、プラズモン散乱レファレンス領域（Ｐ）、増強電場リファレンス領域（Ｒ）などに相当する領域を設けた表面プラズモン共鳴センサ（センサ基板、センサチップ）を用いて、上記ステップ（Ｔ）を含むように構成されたものであれば、第１実施形態および第２実施形態に限定されることなく、他の態様により実施することもできる。また、本発明はＳＰＦＳのみならず、ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳなどのＳＰＦＳを利用した他の測定方法においても適用されるものであり、その場合は表面プラズモン共鳴センサの構造や測定手順等を、適用される測定系に応じて適切に変更すればよい。

［第１実施形態］
図１は、本発明の第１の実施形態を表す模式図である。この第１実施形態の表面プラズモン共鳴センサには、測定領域（Ａ）と、プラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）と、さらに増強電場リファレンス領域（Ｑ）とが設置される。この第１実施形態は、シグナル（Ｓ_a）に含まれうる蛍光のうち、主に、センサ表面に捕捉されたアナライト２２に結合し
た標識リガンド２１がプラズモン散乱光中の励起光波長成分（伝播光）（Ｅ_t）により発
する蛍光（Ｆ₂）による影響を排除する場合の方法として適している（シグナル（Ｓ_a）における蛍光（Ｆ₃）、ならびにシグナル（Ｓ_a）、（Ｓ_p）および（Ｓ_q）における蛍光（Ｆ₄）は十分に小さいものとして扱う）。

なお、これら３つの領域で行われる以下に説明するようなシグナルの測定は、同時並行的に進行させると分析時間の短縮化が図れるため好都合であるが、所定のタイミングで順次進行させるようにしてもよい。

・測定領域（Ａ）
第１実施形態の測定領域（Ａ）は、少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜上に形成された固定化リガンドを含む層とにより構成される。アナライト２２を捕捉するための固定化リガンド２０は、金属薄膜１０の直上に形成してもよいし、金属薄膜１０上にＳＡＭ、スペーサ層等（いずれも図示せず）を形成してからその上に形成してもよい。また、標識リガンド２１がセンサ表面等に非特異的に結合しないよう、通常は固定化リガンド２０からなる層が設けられた後にブロッキング処理がなされる。

領域（Ａ）は、通常のＳＰＦＳと同様の手順でシグナルを測定する。すなわち、領域（Ａ）に、まず試料を送液し、次いで標識リガンド溶液を送液し、これを流下させた後、標識リガンドの蛍光色素の励起光を所定の入射角で金属薄膜裏面に照射し、金属薄膜を透過した非伝播光であるエバネッセント波（Ｅ_e）により当該蛍光色素から発せられた蛍光シ
グナルを含むシグナル（Ｓ_a）を光検出器で測定する。

この測定の際、通常は、アナライトも標識リガンドも含まない液体（たとえば試料液や測定液を調製するために用いられる溶媒ないし緩衝液単独）が新たに送液され、流路はこの液体で満たされた状態にされる。また、標識リガンド溶液を流下させた後、流路に洗浄液を送液循環させる洗浄工程が設けられることもある。しかしながらそれでも、シグナル（Ｓ_a）が測定される時点で、領域（Ａ）の流路側壁および天板３０には、標識リガンド
溶液を送液したときに非特異的に結合した標識リガンド２１が残留しうる。

したがって上記シグナル（Ｓ_a）には、センサ表面に捕捉されたアナライト２２に結合
した標識リガンド２１が増強されたエバネッセント波（非伝播光）（Ｅ_e）により発する
蛍光（Ｆ₁）、センサ表面に捕捉されたアナライト２２に結合した標識リガンド２１がプ
ラズモン散乱光中の励起光波長成分（伝播光）（Ｅ_t）により発する蛍光（Ｆ₂）、流路側
壁および天板３０に非特異的に結合した標識リガンド２１がプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）により発する蛍光（Ｆ₃）、およびプラズモン散乱光中の標識抗体が発するものと同じ蛍光波長成分（伝播光）（Ｆ_t）である蛍光（Ｆ₄）それぞれによるシグナルが含まれうる。

なお、エバネッセント波（非伝播光）は金属薄膜１０表面からせいぜい数百ナノメートル（一波長程度）しか到達しないため、センサ表面に固定化された標識リガンド２１であってもその距離よりも遠い位置にあるもの（そのようなものが生じないように固定化リガンド（反応層）およびその他の層の厚みを調整しておくことが望ましい）、ならびにセンサ表面からその距離よりも遠い位置にある流路側壁または天板３０に非特異的に結合した標識リガンド２１は、伝播光（Ｆ_t）のみによって励起されて蛍光を発し、エバネッセン
ト波（Ｅ_e）によっては励起されず蛍光を発しない。一方、上記エバネッセント波（Ｅ_e）が到達する距離にある標識リガンド２１は、エバネッセント波（Ｅ_e）と伝播光（Ｆ_t）の両方によって励起されて蛍光を発する。

また、センサ表面をブロッキング処理しておくことにより、標識リガンド２１がセンサ表面に非特異的に結合して非伝播光（Ｅ_e）または伝播光（Ｅ_t）によりノイズとなる蛍光を発することを抑制できる。さらに、流路側壁および天板３０もブロッキング処理をしておけば、そこに非特異的に結合する標識抗体から発せられる蛍光（Ｆ₃）も抑制すること
も可能であるが、本発明では流路側壁および天板３０へのブロッキング処理の有無にかかわらず、ノイズとなる可能性のある上記蛍光（Ｆ₃）の影響を補正することができる。

・プラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）
第１実施形態のプラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）は、少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜と光検出器の間に、非伝播光であるエバネッセント波（Ｅ_e）が到達せず、伝播光であるプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）のみが到達するよう当該金属薄膜からの距離をあけて配置された蛍光色素層とにより構成される。一方、通常は金属薄膜１０上にアナライトを捕捉するための固定化リガンド２０を含む層が設けられない。それ以外は、領域（Ｐ）は領域（Ａ）と同様の構成を有する。領域（Ｐ）の金属薄膜は領域（Ａ）の金属薄膜と同じ 工程で形成されたものである。

領域（Ｐ）では、領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ_a）の測定と同条件で、すなわち、
通常はアナライトも標識リガンドも含まない液体で流路を満たした状態で、標識リガンドの蛍光色素の励起光を所定の入射角で金属薄膜裏面に照射し、シグナル（Ｓ_p）を測定す
る。このシグナル（Ｓ_p）には、プラズモン散乱光中の標識リガンドが発するものと同じ
蛍光波長成分（Ｆ_t）である蛍光（Ｆ₄）、および蛍光色素層３１がプラズモン散乱光の励起光波長成分（Ｅ_t）により発する蛍光（Ｆ₆）によるシグナルが含まれうる。

・増強電場リファレンス領域（Ｑ）
第１実施形態の増強電場リファレンス領域（Ｑ）は、少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜と光検出器の間に配置された、次に述べるような蛍光色素層３２とにより構成される。一方、通常は金属薄膜１０上にアナライトを捕捉するための固定化リガンド２０を含む設けられない。それ以外は、領域（Ｑ）は領域（Ａ）と同様の構成を有する。領域（Ｐ）の金属薄膜は領域（Ａ）の金属薄膜と同じ工程で形成されたものである。

領域（Ｑ）の蛍光色素層３２は、領域（Ｐ）の蛍光色素層３１と異なり、厚みの少なくとも一部（Ｌ１）は、金属薄膜１０の表面からエバネッセント波（Ｅ_e）およびプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）の両方が到達する距離にあり、残りの厚みの部分（Ｌ２）は、金属薄膜１０の表面からエバネッセント波（Ｅ_e）が到達せず、プラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）のみが到達する距離にあるようにする。蛍光色素層３２の厚みすべてが上記Ｌ１に該当し、Ｌ２に該当する厚みの部分がないような態様であってもよい。そのためには、領域（Ｑ）の蛍光色素層３２を金属薄膜上に積層させるようにすることが好適である。たとえば、蛍光色素層３２を金属薄膜の直上に積層させてもよい。また、領域（Ａ）には、金属消光を防止するための誘電体からなるスペーサ層が金属薄膜上に形成されていてもよいが、領域（Ｑ）にもそれと同様のスペーサ層を形成し、蛍光色素層３２をそのスペーサ層上に積層させるようにしてもよい。

領域（Ｑ）では、領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ_a）の測定（および領域（Ｐ）にお
けるシグナル（Ｓ_p）の測定）と同様の条件で、すなわち、通常はアナライトも標識リガ
ンドも含まない液体で流路を満たした状態で、標識リガンドの蛍光色素の励起光を所定の入射角で金属薄膜裏面に照射し、シグナル（Ｓ_q）を測定する。このシグナル（Ｓ_q）には、プラズモン散乱光中の標識リガンドが発するものと同じ蛍光波長成分（Ｆ_t）である蛍
光（Ｆ₄）、蛍光色素層３２のＬ１の厚みの部分が増強されたエバネッセント波（非伝播
光）（Ｅ_e）により発する蛍光（Ｆ₇）、および蛍光色素層３２のＬ１＋Ｌ２（＝Ｌ）の厚みの部分がプラズモン散乱光（伝播光）の励起光波長成分（Ｅ_t）により発する蛍光（Ｆ₈）が含まれうる。

・シグナル（Ｓ_a）の補正
（１）散乱係数（ｋ１）の算出
入射光のうちプラズモン散乱光になるものの割合を示す「散乱係数（ｋ１）」は、シグナル（Ｓ_p）の測定値より、次のようにして求めることができる。

領域（Ｐ）で測定されたシグナル（Ｓ_p）を、下記式で表すことができるものとみなす
。
［式１］
Ｓ_p≒Ｆ₆
＝Ｅ×ｄ１×ｋ１×ｒ×α×Ｌ×φ×ｚ×ｆ
Ｅ：入射光子数（金属薄膜裏面に照射した励起光の光子数）
ｄ１：伝播光（プラズモン散乱光等）についての電場増強度
ｋ１：散乱係数（入射光のうちプラズモン散乱光になるものの割合）
ｒ：受光効率（金属薄膜から発せられた光のうち蛍光色素層に受光されるものの割合）
α：吸収係数
Ｌ：蛍光色素層の厚さ
φ：蛍光色素の量子収率
ｚ：集光効率
ｆ：フィルタ透過率
プラズモン散乱光は、プラズモン共鳴により電場増強されない（電場増強度ｄ１＝１）伝播光であり、Ｅ×ｄ１×ｋ１が蛍光Ｆ₆に関する「励起光子数」となる。Ｅ［photon/sec］は光源から照射される励起光によって決定される、すなわち、励起光の出力［J/sec］を、光子１つあたりのエネルギーｈν＝ｈｃ／λ［J］（ｈ＝プランク定数、ν＝振動数
、ｃ＝光速度定数、λ＝波長）で除することにより求められる値である。ｒは、金属薄膜と蛍光色素層との距離などによって決定される。αは、蛍光色素層の蛍光色素のモル濃度（Ｃ）および蛍光色素層のモル吸光係数（ε）に比例し、たとえばＣ×εにさらに所定の定数（２．３）をかけた値とみなすことができる。φは蛍光色素層に用いる蛍光色素の種類によって決定される。ｚおよびｆは測定装置によって変動する値であり、光源から光検出器へ直接励起光を入射するなどして、別途測定しておくことが可能である。そして、下記式１’に各変数の値およびシグナル（Ｓ_p）の測定値を代入することにより、散乱係数
ｋ１を算出することができる。
［式１’］
ｋ１≒Ｓ_p／（Ｅ×ｄ１×ｒ×α×Ｌ×φ×ｚ×ｆ）
なお、シグナル（Ｓ_p）の測定値は単位a.u.を用いて表されることもあるが、光検出器
で受光した光子数（photon/sec）ないしカウント数（counts）との間で換算可能である。換算率は光検出器によって調整されるが、たとえば後記実施例で用いた光検出器（測定装置）では、1a.u.＝38 photon/sec、1 count＝7.8 photon/secとして換算される。

（２）プラズモン係数（ｋ２）の算出
入射光のうちエバネッセント波になるものの割合を示す「プラズモン係数（ｋ２）」は、シグナル（Ｓ_q）の測定値および前述した散乱係数（ｋ１）より、次のようにして求め
ることができる。

領域（Ｑ）で測定されたシグナル（Ｓ_q）を、下記式で表すことができるものとみなす
。
［式２］
Ｓ_q≒Ｆ₇＋Ｆ₈
＝[Ｅ×ｄ２×ｋ２×ｒ×α×Ｌ１×φ×ｚ×ｆ]
＋[Ｅ×ｄ１×ｋ１×ｒ×α×（Ｌ１＋Ｌ２）×φ×ｚ×ｆ]
ｄ２：非伝播光（エバネッセント波）についての電場増強度
ｋ２：プラズモン係数（入射光のうちエバネッセント波になるものの割合）
Ｌ１：蛍光色素層３１のうち、非伝播光であるプラズモン共鳴により増強されたエバネッセント波と、伝播光であるプラズモン散乱光の両方が到達する部分の厚み
Ｌ２：蛍光色素層３１のうち、伝播光であるプラズモン散乱光のみが到達し、非伝播光であるプラズモン共鳴により増強されたエバネッセント波が到達しない部分の厚み
式２におけるＥ，ｄ１，ｒ，α，φ，ｚ，ｆの定義は式９と同じである。

エバネッセント波は、プラズモン共鳴により電場増強される（電場増強度ｄ２＞１）非伝播光であり、Ｅ×ｄ２×ｋ２が蛍光Ｆ₇に関する「励起光子数」となる。ｄ２は、金属
薄膜の厚さや反応層および必要に応じてその下に積層されている誘電体部材（スペーサ層）の屈折率から求めることが可能である。

典型的な態様においては（後記実施例参照）、Ｌ２が０、すなわちＬ１＝Ｌとなるような厚みでもって、蛍光色素層（および当該蛍光色素層と金属薄膜との中間に形成されるその他の層）が形成される。このような態様によらない場合、Ｌ１を別途測定結果に基づいて決定し、Ｌ２を、蛍光色素層３１の厚さＬから上記Ｌ１を引いた値とする（Ｌ２＝Ｌ−Ｌ１）ことも可能である。また、蛍光色素層が金属薄膜の上面に直接積層される場合あるいはそれらの距離が十分に近い場合（たとえばＬ１＝Ｌとなるような距離の場合）には、蛍光色素層から発せられたプラズモン散乱光は全て蛍光色素層に受光されるとみなし、ｒ＝１とする（式２にｒを用いないようにする）ことができる。

領域（Ｐ）の蛍光色素層３１と同様の素材で領域（Ｑ）の蛍光色素層３２を形成するようにすれば、式２中のαおよびφの値は、式１中のそれらと共通化することができる。また、シグナル（Ｓ_p）および（Ｓ_q）を同一条件、同一装置で測定すれば、式２中のＥ、ｚおよびｆの値も、式１中のそれらと共通化することができる。そして、下記式２’に各変数および式１から算出された散乱係数ｋ１の値、ならびにシグナル（Ｓ_q）の測定値を代
入することにより、プラズモン係数ｋ２を算出することができる。
［式２’］
ｋ２≒［Ｓ_q−[Ｅ×ｄ１×ｋ１×ｒ×α×（Ｌ１＋Ｌ２）×φ×ｚ×ｆ]］
／[Ｅ×ｄ２×ｒ×α×Ｌ１×φ×ｚ×ｆ]
（３）補正されたシグナル（Ｓ_a′）の算出
シグナル（Ｓ_a）は、前述した散乱係数（ｋ１）およびプラズモン係数（ｋ２）に基づ
いて、次のようにして補正することができる。

領域（Ａ）で測定されたシグナル（Ｓ_a）を、下記式で表すことができるものとみなす
。
［式３］
Ｓ_a≒Ｆ₁＋Ｆ₂
≒Ｅ×[(ｋ２×ｄ２)＋(ｋ１×ｄ１)]×Ｃｘ×ε×φ×ｚ×ｆ
Ｃｘ：センサ表面に補足された蛍光色素の物質量（モル数）
なお、領域（Ａ）のセンサ表面に補足されたＣｘモルの蛍光色素はすべて、エバネッセント波が到達する距離の範囲内にあるものとする。

式３におけるＥ，ｋ２，ｄ２，ｋ１，ｄ１，ε，φ，ｚ，ｆの定義は式１または式２と同じである。Ｅ，ｄ２，ｄ１，ε，φ，ｚ，ｆは式１または２と共通化することが可能であり、ｋ１は領域（Ｐ）におけるシグナル（Ｓ_p）の測定から式１により求められ、ｋ２
は領域（Ｑ）におけるシグナル（Ｓ_q）の測定から式２により求められる。

補正されたシグナル（Ｓ_a′）とは、プラズモン散乱光中の励起光波長成分（伝播光）
（Ｅ_t）により発する蛍光（Ｆ₂）の影響を排除したシグナル、すなわち、プラズモン散乱光が発生せず、入射光すべてがプラズモン共鳴により増強されたエバネッセント波に変換されたと仮定したときに得られるシグナルをいい、そのような補正されたシグナル（Ｓ_a
′）を、下記式で表すことができるものとみなす。
［式４］
Ｓ_a′＝Ｓ_a×(ｋ１＋ｋ２)／ｋ２
各サンプルについてこのような式により補正されたシグナル（Ｓ_a′）を用いることに
より、センサごとに程度の異なるプラズモン散乱光に起因するノイズの影響を排除した上で、各サンプルに含まれるアナライトの定量やサンプル間の公正な対比を行うことが可能となる。

なお、散乱係数（ｋ１）とプラズモン係数（ｋ２）の和は、理論的には１になる。したがって、領域（Ｐ）におけるシグナル（Ｓ_p）の測定から散乱係数ｋ１を求めたのち、１
−ｋ１の値をｋ２として用いることもできなくはないが、実用上は、領域（Ｑ）におけるシグナル（Ｓ_q）の測定結果を用いてプラズモン係数ｋ２を求めることが望ましい。通常
、領域（Ｑ）は、シグナル（Ｓ_q）がシグナル（Ｓ_a）よりもかなり大きい絶対的な一定の強度を確保できるように設計されるが、もしもシグナル（Ｓ_q）が通常想定される範囲よ
りも低い場合、測定条件（入射角度、入射光量、金属薄膜の膜厚など）に何らかの問題がある可能性があると判断する、という利用の仕方もできるためである。シグナル（Ｓ_q）
が通常想定される範囲内であれば、シグナル（Ｓ_a）が小さくても、それは測定系の異常
に起因するものではなく、センサ表面に補足された蛍光色素の物質量を反映したものだといえるため、シグナル（Ｓ_a）の信頼性を高めることができる。

［第２実施形態］
図２は、本発明の第２の実施形態を表す模式図である。この第２実施形態の表面プラズモン共鳴センサには、第１実施形態と同様の前記測定領域（Ａ）、前記プラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）および増強電場リファレンス領域（Ｑ）に加えて、さらにアッセイリファレンス領域（Ｒ）が設置される。この第２実施形態は、より高精度の測定とするために、第１実施形態では扱わなかった蛍光（Ｆ₃）および（Ｆ₄）の影響をも排除する場合の方法として適している。所望により、蛍光（Ｆ₃）または（Ｆ₄）のどちらか一方の影響を排除するように調整することも可能である。

・測定領域（Ａ）
第２実施形態の測定領域（Ａ）は、前記第１実施形態の領域（Ａ）と同様であるため、ここでの説明は省略する。

・プラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）
第２実施形態のプラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）は、前記第１実施形態の領域（Ｐ）と同様であるため、ここでの説明は省略する。

・増強電場リファレンス領域（Ｑ）
第２実施形態の増強電場リファレンス領域（Ｑ）は、前記第１実施形態の領域（Ｑ）と同様であるため、ここでの説明は省略する。

・アッセイリファレンス領域（Ｒ）
第２実施形態のアッセイリファレンス領域（Ｒ）は、領域（Ａ）と同様の構成を有する。すなわち、金属薄膜１０上にはアナライト２２を捕捉するための固定化リガンド２０が設けられ、センサ表面は通常ブロッキング処理される。

領域（Ｒ）では、まず、アナライトも標識リガンドも含まない液体（たとえば試料液や測定液を調製するために用いられる溶媒ないし緩衝液単独）を送液し、流路をこれで満たした状態で測定すること以外は領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ_a）の測定と同条件で、
シグナル（Ｓ_r1）を測定する。上記シグナル（Ｓ_r1）には、プラズモン散乱光中の標識抗体が発するものと同じ蛍光波長成分（伝播光）（Ｆ_t）である蛍光（Ｆ₄）によるシグナルのみが含まれうる。

次いで、領域（Ａ）で用いたものと同じ標識リガンド溶液を同条件で送液し、これを流下させた後、領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ_a）の測定と同条件（流路を満たす液体、
励起光等について）で、シグナル（Ｓ_r2）を測定する。このとき、領域（Ｒ）の流路側壁および天板３０には、標識リガンド溶液を送液したときに非特異的に結合した標識リガンド２１が残留しうる。したがって、上記シグナル（Ｓ_r2）には、流路側壁および天板３０に非特異的に結合した標識リガンド２１がプラズモン散乱光の励起光波長成分（Ｅ_t）に
より発する蛍光（Ｆ₃）、およびプラズモン散乱光中の蛍光波長成分（Ｆ_t）である蛍光（Ｆ₄）それぞれによるシグナルが含まれうる。

なお、蛍光（Ｆ₃）の影響を考慮する必要がない場合には、上記シグナル（Ｓ_r2）を測
定するステップを省略することも可能である。

・シグナル（Ｓ_a）の補正
（１）Ｆ₃およびＦ₄の算出
領域（Ｒ）で測定されたシグナル（Ｓ_r1）をＦ₄とみなし、シグナル（Ｓ_r2）をＦ₃＋Ｆ₄とみなす。なお、Ｓ_r1−Ｓ_r2をＦ₃とみなすことができる。

（２）プラズモン散乱係数の算出
領域（Ｐ）で測定されたシグナル（Ｓ_p）を、下記式で表すことができるものとみなす
。
［式５］
Ｓ_p＝Ｆ₄＋Ｆ₆
＝Ｓ_r1＋Ｆ₆
式５中、Ｆ₆に関する部分の説明は、第１実施形態の式１と同様である。したがって、
式１において、Ｓ_pの代わりにＳ_p−Ｓ_r1を用い、それ以外は同様に計算するようにすれば、より精密に散乱係数ｋ１を算出することができる。

（３）プラズモン係数の算出
領域（Ｑ）で測定されたシグナル（Ｓ_q）を、下記式で表すことができるものとみなす
。
［式６］
Ｓ_q＝Ｆ₄＋Ｆ₇＋Ｆ₈
＝Ｓ_r1＋Ｆ₇＋Ｆ₈
式６中、Ｆ₇およびＦ₈に関する部分の説明は、第１実施形態の式２と同様である。したがって、式２において、Ｓ_qの代わりにＳ_q−Ｓ_r1を用い、またｋ１として上記式５に基づくより精密な値を用い、それ以外は同様に計算するようにすれば、より精密にプラズモン係数ｋ２を算出することができる。

（４）補正されたシグナル（Ｓ_a"）の算出
領域（Ａ）で測定されたシグナル（Ｓ_a）を、下記式で表すことができるものとみなす
。
［式７］
Ｓ_a＝Ｆ₁＋Ｆ₂＋Ｆ₃＋Ｆ₄
＝Ｆ₁＋Ｆ₂＋Ｓ_r2
式７中、Ｆ₁およびＦ₂に関する部分の説明は、第１実施形態の式４と同様である。したがって、式４において、Ｓ_aの代わりにＳ_a−Ｓ_r2を用い、またｋ１およびｋ２としてそれぞれ上記式５および６に基づくより精密な値を用い、それ以外は同様に計算するようにすれば、より精密に補正されたシグナル（Ｓ_a"）を算出することができる。

［従来の形態］
本発明の方法との対比のため、従来の方法によってＳ／Ｎ比を測定する態様を以下に示す。図３は、そのような従来法が適用される表面プラズモン共鳴センサの形態の一例を表す模式図である。当該表面プラズモン共鳴センサには、ともに本発明について上述した測定領域（Ａ）と同様の構成を有する、測定領域（Ａ）およびアッセイリファレンス領域（Ｂ）が併設される。

領域（Ａ）では、本発明の測定領域（Ａ）におけるシグナルの測定と同様、まず試料を送液し、次いで標識リガンド溶液を送液し、これを流下させた後、標識リガンドの蛍光色素の励起光を所定の入射角で金属薄膜裏面に照射し、光検出器でシグナル（Ｓ_a）を測定
する。このシグナル（Ｓ_a）には、前述のような蛍光（Ｆ₁）、（Ｆ₂）、（Ｆ₃）および（Ｆ₄）によるシグナルが含まれうる。

一方、領域（Ｂ）では、試料を送液することなく、標識リガンド溶液を送液し、あとは領域（Ａ）と同様、これを流下させた後、標識リガンドの蛍光色素の励起光を所定の入射角で金属薄膜裏面に照射し、光検出器でシグナル（Ｓ_b）を測定する。このシグナル（Ｓ_b）には、シグナル（Ｓ_a）に関する４つの蛍光のうち、試料中のアナライトがリガンドに
補足されることにより発生する蛍光（Ｆ₁）および（Ｆ₂）によるシグナルは含まれず、蛍光（Ｆ₃）および（Ｆ₄）によるシグナルが含まれうる。

従来の方法では、領域（Ａ）で測定されたシグナル（Ｓ_a）の値を領域（Ｂ）で測定さ
れたシグナル（Ｓ_b）の値で除して得られた値（Ｓ_a／Ｓ_b）をＳ／Ｎ比とする。そして、
アナライトの濃度が既知の標準試料から作成された検量線に基づいて、上記Ｓ／Ｎ比からサンプルのアナライトの濃度を決定する。

［式１］ Ｓ／Ｎ＝Ｓ_a／Ｓ_b
このような方法は、シグナル（Ｓ_a）に含まれる蛍光のうち、シグナル（Ｓ_b）にも含まれる、流路側壁・天板に非特異的に結合した標識抗体がプラズモン散乱光の励起光波長成
分により発する蛍光（Ｆ₃）およびプラズモン散乱光中の蛍光波長成分である蛍光（Ｆ₄）をノイズとして排除しうるが、センサ表面に捕捉されたアナライトに結合した標識抗体が増強されたエバネッセント波により発する蛍光（Ｆ₁）およびプラズモン散乱光の励起光
波長成分により発する蛍光（Ｆ₂）の両方をシグナルとして捉えてしまう。すなわち、シ
グナル（Ｓ_a）の測定値をそのままアナライトの定量に用いるような方法よりは精度が改
善されているが、センサごとに変動しうるプラズモン散乱光に起因する蛍光（Ｆ₂）の影
響を十分に排除できないといえる。さらに、前述したような、領域（Ｑ）で測定されるシグナル（Ｓ_q）に基づく測定系の異常の判断ということも行えない。

（蛍光色素層）
前述のようなプラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）および増強電場リファレンス領域（Ｑ）には、蛍光色素を含有する層すなわち蛍光色素層が配置される。この蛍光色素層は、センサ表面と光検出器の間に、センサ表面（床面）と略平行に設置されたものであれば、その態様は特に限定されるものではないが、たとえば、以下に挙げるような態様をとり得る。

（１）センサ表面と光検出器の間にセンサ表面（床面）に対向するよう設置された部材を、蛍光色素を含有する光透過性材料で形成する。

蛍光色素を含有する光透過性材料の調製方法は特に限定されるものではないが、たとえば、通常の天板等を形成するために用いられる光透過性樹脂（ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリスチレン、ポリビニルブチラールなど）と蛍光色素とを溶媒中（ケトン類、芳香族類、エステル類、含ハロゲン系炭化水素類など）で混合することにより調製することができる。なお、上で挙げた樹脂はタンパク質等が非特異的に吸着しにくいという利点も有する。

（２）センサ表面またはそれと光検出器の間にセンサ表面（床面）に対向するよう設置された部材に蛍光色素を含有する薄層を積層する。

たとえば、上記部材がヒドロキシ基を有する誘電体（ポリマー、または酸化チタン、二酸化ケイ素など）である場合、シランカップリング剤を上記部材に反応させ、必要であればカルボキシメチルデキストラン等の蛍光色素を担持できる分子を介して、蛍光色素をアミンカップリング法等の公知の手法に従って結合させる方法や、上記部材に蛍光色素を蒸着させる方法により、蛍光色素を含有する（蛍光色素からなる）薄層を積層させることができる。

また、あらかじめ蛍光色素を蒸着させたり配合したりした材料で薄層（たとえば樹脂、ゼラチン等を用いたプレート、シートないしフィルム）を調製しておき、これを上記部材と積層するような方法でもよい。これらの方法では、上記部材の内側（流体と接触する側）、外側（流体と接触しない側）のいずれに積層させてもよいが、外側にすれば蛍光色素が流体中に溶出するおそれがない。

プラズモン散乱リファレンス領域領域（Ｐ）に設けられる蛍光色素層３１の典型的な態様としては、チップ基板とともにセンサチップを構成する「流路天板」を「センサ表面と光検出器の間にセンサ表面（床面）に対向するよう設置された部材」として用いること、特に、蛍光色素を含有しない光透過性材料で形成した流路天板に積層された蛍光色素を含有する薄層である態様が挙げられる。なお、そのような部材はチップ基板と一体化されている必要はなく、チップ基板とは分離した部材であってもよい。また、センサチップの天板であれば、少なくとも領域（Ｐ）の上部に位置する部分について、上記のような態様が適用されていればよい。

一方、増強電場リファレンス領域（Ｑ）に設けられる蛍光色素層３２の典型的な態様としては、金属薄膜上に、蛍光色素を含有する光透過性材料で形成された部材、または蛍光色素を含有する薄層を積層したものが挙げられる。ここで、金属薄膜上に積層された蛍光色素層３２は、金属薄膜の直上に積層されていてもよいし、金属薄膜上に形成されたスペーサ層ないしＳＡＭの上に積層されていてもよい。このような蛍光色素層３２であれば、たとえば厚み全部がエバネッセント波が到達する距離の範囲となるようにすることも比較的容易に行える。

蛍光色素層の厚さ、樹脂等への蛍光色素の配合量などは、上述したような測定方法が行える範囲で適切に調整すればよい。

なお、蛍光色素層を調製する際には、蛍光色素の経時安定剤を向上させるために酸化防止剤を併用してもよい。酸化防止剤としては、例えば、ペンタエリスリチルテトラキス［３−(３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)］プロピオネート、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，２’−ジオキシ−３，３’−ジ−ｔ−ブチル−５，５’−ジメチルジフェニルメタン、テトラキス［メチレン−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］メタンなどが挙げられる。

（蛍光色素）
「蛍光色素」は、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称である。本発明における、蛍光色素層３１・３２に含まれる蛍光色素、および標識リガンド２１に結合してアナライトを蛍光標識するための蛍光色素としては、公知のＳＰＦＳ等または蛍光標識法等で用いられている、公知の各種の蛍光色素を用いることができる。蛍光色素層３１・３２の蛍光色素と標識リガンド２１の蛍光色素は、同一であっても、励起波長は同じで発光波長が異なるものであってもよい。

本発明で用いることのできる蛍光色素としては、たとえば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Integrated DNA Technologies社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミ
リーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス(株)製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン(株)製）などが挙げられる。これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。

また、上記のような有機蛍光色素以外に、Ｅｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素を用いることもできる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ³⁺が挙げられる。

さらに、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）またはＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ；ＬｙｏＦｌｏｇｅｎ（登録商標））などに代表される蛍光タンパク質、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子なども、蛍光色素に含まれる。

なお、ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ測定系においては、ＬＰＦＳに関与する金属コロイドによる吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を、標識リガンドに用いることが望ましい。たとえば金コロイドを用いる場合には、金コロイドによる吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素、たとえばＣｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７などの近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、銀コロイドを用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を用いることが望ましい。

− 表面プラズモン共鳴センサ −
表面プラズモン共鳴センサは、少なくとも誘電体部材（プリズムまたは透明平面基板）と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜上に形成された固定化リガンドを含む層（反応層）とにより構成される、ＳＰＦＳ等によるシグナルを測定するため
の構造いう。便宜上、表面プラズモン共鳴センサの金属薄膜、反応層等が積層される方向を「上」または「表」、その反対の方向を「下」または「裏」と称することがある。

金属薄膜等は、プリズムの水平面に直接形成されていてもよいが、多数のサンプルを分析するための利便性などを考慮すると、プリズムの水平面上に着脱可能な透明平面基板の一方の表面に形成されていることが望ましい。そのような金属薄膜等が形成された透明平面基板を「センサ基板」と称する。また、反応層は金属薄膜の表面に直接形成されていてもよいが、必要に応じて、金属薄膜上に誘電体からなるスペーサ層および／またはＳＡＭを形成し、その上に形成するようにしてもよい。

センサ基板は、ＳＰＦＳ等の測定に用いられる各種の流体（試料液、標識リガンド溶液、測定液など）を貯留したり各領域を連通して送液が行えるようにしたりするための「流路」を形成する部材（流路の側壁を形成するシート、天板等）と組み合わせて用いられる。これらはしばしば一体化され、チップ状の構造体（「センサチップ」と称する。）の態様をとる。また、表面プラズモン共鳴センサないしセンサチップには、流体を導入または排出するための開口が設けられ、ポンプや、たとえば柔軟な部材（シリコーンゴム等）で形成された断面が略円形のチューブなどを用いて、外部と流体を行き来させる。送液の条件（流速、時間、温度、検体や標識リガンドの濃度等）は、適宜調整することができる。

表面プラズモン共鳴センサないしセンサチップは、小規模ロット（実験室レベル）では、たとえば、あらかじめ金属薄膜等が形成された表面プラズモン共鳴センサないしセンサ基板を作製しておき、その金属薄膜等が形成されている側の表面上に、一定の厚さ（流路の高さ）を有する、中央部に任意の形状および大きさを有する穴が開けられたシリコーンゴム製シートまたはＯリングを載せて流路の側面構造を形成し、次いでその上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板を載せて流路の天井面を形成した後、これらを圧着してビス等の留め具により固定することによって作製することができる。また、工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、たとえば、透明平面基板の所定の領域に金属薄膜、反応層等を形成してセンサ基板とし、一方でプラスチックの成形加工やフォトリソグラフィ等により微細な凹凸を形成して天板・側壁部材とし、これらを組み合わせることによりセンサチップを作製することができる。

（透明平面基板）
センサチップ（センサ基板）に用いられる透明平面基板は、ガラス製や、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製のもの、好ましくはｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎ_d〕が１．４０〜２．２０の範囲にある材
質のものを用いることができる。厚さは、たとえば０．０１〜１０ｍｍの範囲で調整することができる。また、金属薄膜を形成する前に、当面平面基板の表面は酸またはプラズマによる洗浄処理がなされていることが好ましい。

（金属薄膜）
表面プラズモン共鳴センサの金属薄膜は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強効果が大きい、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなる（合金の形態であってもよい）ことが好ましく、特に金からなることが好ましい。透明平面基板としてガラス製平面基板を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着するため、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。

透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの
薄膜および金属薄膜を形成することが好ましい。

表面プラズモンが発生し易いよう、金、銀、アルミニウム、銅、白金、またはそれらの合金からなる金属薄膜の厚さはそれぞれ５〜５００ｎｍが好ましく、クロム薄膜の厚さは１〜２０ｎｍが好ましい。電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍがより好ましい。

（スペーサ層）
表面プラズモン共鳴センサには、必要に応じて、金属薄膜による蛍光色素の金属消光を防止するため、金属薄膜と反応層（またはＳＡＭ）の間に誘電体からなるスペーサ層を形成してもよい。

誘電体としては、光学的に透明な各種無機物や、天然または合成ポリマーを用いることができる。なかでも、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）または二酸化チタン（ＴｉＯ₂）を用いることが好ましい。

スペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強効果の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。また、ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ測定系においては、センサ表面（金属薄膜）と金属コロイド粒子との間に生じる電場をより効果的に増強させるため、スペーサ層の厚さは１０〜１００ｎｍであることが望ましい。

誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。

（ＳＡＭ）
表面プラズモン共鳴センサには、必要に応じて、金属薄膜（またはスペーサー層）と反応層の間にＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer：自己組織化単分子膜）を形成してもよい。

ＳＡＭを構成する分子としては、分子の一方の末端に金属薄膜等と結合可能な官能基（シラノール基、チオール基等）を、もう一方の末端に反応層を構成する分子と結合可能な反応性官能基（アミノ基、カルボキシル基、グリシジル基等）を有する化合物が用いられる。このような化合物はシランカップリング剤やＳＡＭ形成試薬として容易に入手できる。たとえば、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（１０−カルボキシ−１−デカンチオールなど）は、光学的な影響が少ない、つまり透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いＳＡＭを形成することができるため好適である。ＳＡＭ構成分子の溶液（エタノール溶液等）を金属薄膜等に接触させ、当該分子の一方の官能基を金属薄膜等に結合させることにより、ＳＡＭを形成することができる。

− 測定装置 −
本発明の表面プラズモン共鳴センサ（特にセンサチップの態様をとるもの）は、従来の表面プラズモン共鳴センサと同様、公知のＳＰＦＳ等用の測定装置に装着して使用することができる。この測定装置は、基本的に光源、プリズム、光検出器などを備え、通常はさらに集光レンズ、カットフィルタなどを備える。各種の流体を所定の流速、タイミング等で所定の領域に送液するための手段（送液ポンプなど）や、各種の操作や情報処理を制御
するコンピュータなどが上記測定装置に一体化されていてもよい。

特に、本発明の測定方法が、測定領域（Ａ）、プラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）、増強電場リファレンス領域（Ｑ）、第２実施態様であればさらにアッセイリファレンス領域（Ｒ）を全て備えた一枚のセンサチップを用いて行われる場合、上記測定装置は、それら複数の領域に同時にレーザー光を照射するための手段（同一の光源から発せられたレーザー光を二等分以上に分割することのできるビームスプリッタなど）をさらに備えることが望ましい。また、光検出器で測定されたシグナル（Ｓ_a）、（Ｓ_p）、（Ｓ_q）、（Ｓ_r）等を記憶し、前述のような計算式により補正されたシグナル（Ｓ_a′）を算出し、検量
線に基づいて最終的に各サンプルのアナライトの濃度を決定してその情報も記憶するといった情報処理手段を備えていてもよい。さらに、検出すべき蛍光と異なる波長成分を有するノイズ光、たとえばプラズモン散乱光のうちのそのような波長成分、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、各種部材が発する自家蛍光などを除去するためのカットフィルタを備えていることが好ましい。

− 測定方法 −
・検体／試料溶液
アナライトを含むまたは含んでいる可能性のある、ＳＰＦＳ等に供される物質を「検体」と称す。たとえば、ヒト、ヒト以外のほ乳類（モデル動物、ペット等）、その他の動物から採取される血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが検体として挙げられる。分析の際、検体は必要に応じて、純水、生理食塩水、緩衝液、試薬溶液などの各種の溶媒と混合して用いてもよい。このような検体の混合液または検体そのもの、あるいは所定の目的のために調製したアナライトを含有する溶液など、ＳＰＦＳ等によるシグナルを測定するために表面プラズモン共鳴センサの所定の領域に送液される流体（溶液、懸濁液、ゾル、その他流動性を有する物質を含む。）をいずれも「試料」と総称する。

なお、「標識リガンド溶液」を調製する際にも上記溶媒を用いると好都合である。また、ＳＰＦＳ等においてシグナルを測定する際、流路は通常、アナライトも標識リガンドも含まない液体で満たされた状態にされるが、そのような液体としては、試料液の調製に用いられる上記溶媒を単独で用いると好都合である。

・アナライト
ＳＰＦＳ等により定量ないし検出すべき対象となる物質を「アナライト」と称する。センサ表面に捕捉することのできる物体であれば特に限定されることなくアナライトとなり得るが、代表的なアナライトとしては、たとえば腫瘍マーカーとなるような、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等を含む）またはその複合体が挙げられる。また、リガンドに認識される部位（エピトープ等）を表面に有する細胞やウイルス等もアナライトとなり得る。さらに、核酸（一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を含む）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等を含む）、脂質などのその他の分子も、必要に応じてビオチン化等の処理をした上で、アナライトとすることも可能である。

・リガンド
アナライトと特異的に結合し得る分子を「リガンド」と称する。特に、センサ表面に固定化された、アナライトをセンサ表面に捕捉するためのリガンドを「固定化リガンド」（リガンドが抗体であれば「固定化抗体」）、アナライトを標識するために液中に存在する、蛍光色素と結合したリガンドを「標識リガンド」（リガンドが抗体であれば「標識抗体」）と称する。なお、固定化リガンドと標識リガンドのリガンド部分は、同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、固定化リガンドがポリクローナル抗体である場合、標識
リガンドはモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、固定化リガンドがモノクローナル抗体である場合、標識リガンドはその固定化リガンドが認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。

リガンドは捕捉しようとするアナライトに応じて適切なものを選択すればよく、アナライトの所定の部位と特異的に結合しうる抗体、受容体、その他の特定の分子（たとえばビオチン化したアナライトを捕捉するためのアビジン）などをリガンドとすることができる。

固定化リガンドをセンサ表面に設ける方法は特に限定されるものではないが、典型的には、固定化リガンドが有する官能基とＳＡＭ形成分子（シランカップリング剤等）が有する官能基とを、アミンカップリング法、チオールカップリング法、間接的捕捉法（キャプチャー法）等、公知の手法に従って結合させることにより、ＳＡＭ形成分子を介して金属薄膜（またはスペーサ層）に固定化リガンドを連結するような方法が用いられる。たとえば、アミンカップリング法では、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）とを反応させてＳＡＭのカルボキシル基を活性化（ＮＨＳを導入）した後、アミノ基を有するリガンドを反応させ、ＮＨＳを介してリガンドをＳＡＭに結合させる。

なお、アナライトの非特異的吸着を防止するため、上記固定化リガンドをセンサ表面に固定化した後に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等のブロッキング剤によりセンサ表面、流路の側壁・天板等を処理することが好ましい。

一方、標識リガンドは、一般的な免疫染色法でも用いられているリガンドと蛍光色素との複合体（コンジュゲート）と同様にして作製することができる。たとえば、リガンドとアビジン（ストレプトアビジン等を含む）との複合体、および蛍光色素とビオチンとの複合体をそれぞれ作製し、これらを反応させることにより、アビジン／ビオチンを介してリガンドに蛍光色素が結合した複合体（１のアビジンに対し最大４のビオチンが結合しうる）が得られる。上述のようなビオチンとアビジンの反応以外にも、蛍光標識法で用いられている一次抗体−二次抗体の反応様式や、カルボキシル基とアミノ基、イソチオシアネートとアミノ基、スルホニルハライドとアミノ基、ヨードアセトアミドおよびチオール基などの反応を用いてもよい。

＜標識抗体：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体の調製＞
抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、(
株)日本医学臨床検査研究所製）を、市販のビオチン化キット（(株)同仁化学研究所製）
を用いてビオチン化した。手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。

次に、得られたビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液と、「Alexa Fluor 647
」ストレプトアビジンコンジュゲート（Molecular Probes社製）の溶液とを混合し、４℃で６０分間攪拌して反応させた。

最後に、未反応抗体および未反応酵素を除去するため、分子量カットフィルタ（日本ミリポア(株)製）を用いて反応物を精製し、Alexa Fluor 647標識抗ＡＦＰモノクローナル
抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。

＜基板の作製＞
厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板「S-LAL 10」（(株)オハラ製、屈折率〔ｎ_d〕＝
１．７２）を、プラズマドライクリーナー「ＰＤＣ２００」（ヤマト科学(株)製）でプラズマ洗浄した。プラズマ洗浄された基板の片面に、まずクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。このクロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。

次いで、上記工程により得られた基板を２５ｍｇ／ｍＬに調整した１０−カルボキシ−１−デカンチオールのエタノール溶液１０ｍＬに２４時間浸漬し、金薄膜の表面にＳＡＭを形成した。この基板をエタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで順次洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。

以上の工程を４反復行うことにより、金属薄膜、スペーサ層およびＳＡＭが形成された（反応層は未形成の）基板Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄを作製した。

＜センサチップの作製＞
上記のようにして作製された基板Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄそれぞれについて、下記工程［１］によりセンサチップの構成とした後、下記工程［２］により測定領域（Ａ）を、下記工程［３］によりプラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）を、下記工程［４］により増強電場リファレンス領域（Ｑ）を作製し、それぞれセンサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄとした。

［１］センサチップの構成
基板の金属薄膜およびＳＡＭが形成された側の面に、測定領域（Ａ）、プラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）および増強電場リファレンス領域（Ｑ）を形成するための、それぞれ流路長１０ｍｍ、幅５ｍｍの３個の穴があいた、厚さ０．５ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを載せた。さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した（このシリコーンゴム製スペーサは送液に触れない状態にある。）。このＰＤＭＳ製シートおよびシリコーンゴム製スペーサの上に、上記領域（Ａ）、（Ｐ）および（Ｑ）それぞれの内側に位置するよう、送液導入用の穴（送液導入口）および送液排出用の穴（送液排出口）が形成されたポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製天板を載せた。これらセンサ基板、ＰＤＭＳ製シート、およびＰＭＭＡ製天板の積層物を外周部で圧着してビスで固定し、センサチップとした。

［２］領域（Ａ）の作製
センサチップの領域（Ａ）の送液導入口および送液排出口に、シリコーンゴム製のチューブおよびペリスタポンプを連結した（以下に記載する各種流体の送液および循環はすべて、同様のチューブおよびペリスタポンプを用いて行った）。

５０ｍＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）および１００ｍＭの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５ｍＬを送液して２０分間循環させた後、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、(株)日本医学臨床検査研究所製）溶液２.５ｍＬを送液して３０分間循環することで、当該抗体をＳＡＭ
に固定化した。その後、１重量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）および１Ｍのアミノエタノールを含むＰＢＳを３０分間循環送液させ、ブロッキング処理とした。

［３］領域（Ｐ）の作製
以下の手順により、センサチップの天板の領域（Ｐ）が位置する部分の上面に、厚さ３μｍの蛍光色素層を形成した。

丸底フラスコに湯浴を付し、酢酸エチル１００ｇを加熱還流し、さらにステアリルメタクリレート２０ｇ、メチルメタクリレート５０ｇ及び２−アセトアセトキシエチルメタク
リレート３０ｇ、Ｎ，Ｎ′−アゾビスイソバレロニトリル０．１ｇを各々溶解した混合液を２時間かけて滴下し、同温度にて１０時間反応させて樹脂Ｒ−１の酢酸エチル溶液を得た。この樹脂溶液Ｒ−１を１ｍｌ計量し、更に蛍光色素Cy5（蛍光色素）モノNHS体を同モルのラウリルアミンと反応させたアミド体（Ｆ−１）を２０ｍＭ/ｍｌ含む酢酸エチル溶
液を１ｍｌ加え撹拌した。調製した溶液を、天板としてのポリメチルメタクリレート（PMMA）基板の一方の面の、上記所定の部位に、前記蛍光剤塗布液を乾燥膜厚が３μｍになるようにスピンコーターで塗布し、乾燥温度１００℃で５分間の乾燥を行い、蛍光色素層を形成した。

［４］領域（Ｑ）の作製
以下の手順により、領域（Ｑ）のＳＡＭの表面に、厚さ１００ｎｍの蛍光色素層を形成した。

丸底フラスコに湯浴を付し、酢酸エチル１００ｇを加熱還流し、さらにステアリルメタクリレート２０ｇ、メチルメタクリレート５０ｇ及び２−アセトアセトキシエチルメタクリレート３０ｇ、Ｎ，Ｎ′−アゾビスイソバレロニトリル０．１ｇを各々溶解した混合液を２時間かけて滴下し、同温度にて１０時間反応させて樹脂Ｒ−１の酢酸エチル溶液を得た。この樹脂溶液Ｒ−１を１ｍｌ計量し、更に蛍光色素Cy5（蛍光色素）モノNHS体を同モルのラウリルアミンと反応させたアミド体（Ｆ−１）を２０ｍＭ/ｍｌ含む酢酸エチル溶
液を１ｍｌ加え撹拌した。調製した溶液を、センサ基板のＳＡＭが形成された面に、前記蛍光剤塗布液を乾燥膜厚が１００ｎｍになるようにスピンコーターで塗布し、乾燥温度１００℃で５分間の乾燥を行い、蛍光色素層を形成した。

＜シグナルの測定＞
上記のようにして作製されたセンサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄそれぞれについて、下記工程［５］により測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ_a）の測定を、下記工程［６］により
測定領域（Ｐ）におけるシグナル（Ｓ_p）の測定を、下記工程［７］により領域（Ｑ）に
おけるシグナル（Ｓ_q）の測定を行った。

［５］シグナル（Ｓ_a）の測定
測定領域（Ａ）に、まず、ＡＦＰ（２．０ｍｇ／ｍＬ溶液、Acris Antibodies GmbH社
）が１０ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、１０μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。つづいて、前述のようにして調製した標識抗体：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体が２．５μｇ／ｍＬとなるよう
１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、１０μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。洗浄工程として、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだＴＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を１０μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローさせた。その後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で流路を満たした状態にして、表面プラズモン共鳴センサの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６３５ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサ表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。この測定値をシグナル（Ｓ_a）とした。

［６］シグナル（Ｓ_p）の測定
領域（Ｐ）にＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を送液し、流路をこのバッファーで満たした状態にして、表面プラズモン共鳴センサの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６３５ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサ表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。この測定値をシグナル（Ｓ_p）とした。

［７］シグナル（Ｓ_q）の測定
領域（Ｑ）にＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を送液し、流路をこのバッファーで満たした状態にして、表面プラズモン共鳴センサの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６
３５ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサ表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。この測定値をシグナル（Ｓ_p）とした。

＜ｋ１およびｋ２ならびに補正されたシグナル（Ｓ_a′）の算出＞
センサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄそれぞれについて、下記のようにして補正されたシグナル（Ｓ_a′）を算出した。

前記［式１’］に基づき、領域（Ｐ）で測定されたシグナル（Ｓ_p）の測定値から散乱
係数ｋ１を算出した。次いで、前記［式２’］に基づき、このｋ１を用い、領域（Ｑ）で測定されたシグナル（Ｓ_q）の測定値からプラズモン係数ｋ２を算出した。そして、前記
［式４］に基づき、これらのｋ１およびｋ２を用い、領域（Ａ）で測定されたシグナル（Ｓ_a）の測定値から、補正されたシグナル（Ｓ_a′）を算出した。

結果は表２−１〜２−４および表３に示す通りである。センサチップＢ，Ｃ，Ｄの、補正されたシグナル（Ｓ_a′）についての「基板Ａ一致率」は、シグナル（Ｓ_a）の測定値についての「基板Ａ一致率」よりも改善している。このような結果から、本発明により求められる補正されたシグナル（Ｓ_a′）の値を利用すれば、基板ごとに異なるプラズモン散
乱の影響を補正した、より精度の高いアナライトの定量が可能になることが示された。

１：測定領域（Ａ）
２：プラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）
３：増強電場リファレンス領域（Ｑ）
４：アッセイリファレンス領域（Ｒ）
５：アッセイリファレンス領域（Ｂ）
１０：金属薄膜
２０：固定化リガンド（反応層）
２１：標識リガンド
２２：アナライト
３０：天板
３１：蛍光色素層（蛍光色素を含有する光透過性材料で形成された天板）
３２：蛍光色素層

Claims (9)

1. 少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜上に形成された固定化リガンドを含む層とにより構成された測定領域（Ａ）に、まず試料を送液し、次いで標識リガンド溶液を送液し、これを流下させた後、標識リガンドの蛍光色素の励起光を所定の入射角で金属薄膜裏面に照射し、金属薄膜を透過した非伝播光であるエバネッセント波（Ｅ_e）により当該蛍光色素から発せられた蛍光シグナルを含むシグナル（Ｓ_a）を光検出器で測定する工程を含む、ＳＰＦＳ（表面プラズモン励起増強蛍光分光法）またはそれを利用した測定方法であって、
   上記シグナル（Ｓ_a）に含まれる、伝播光であるプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）に起因する、少なくとも上記エバネッセント波（Ｅ_e）および上記プラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）の両方が到達する距離にあるアナライトに結合した標識リガンドが発する蛍光（Ｆ₂）を含み、さらに上記エバネッセント波（Ｅ_e）が到達せず上記プラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）のみが到達する距離にあるアナライトに結合した標識リガンドが発する蛍光（Ｆ₃）を含んでいてもよい蛍光シグナルを補正するためのステップ（Ｔ１）を含み、
   上記補正のためのステップ（Ｔ１）が、
   少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜と光検出器との間に、エバネッセント波（Ｅ _e ）が到達せずプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ _t ）のみが到達するよう当該金属薄膜からの距離をあけて配置された蛍光色素層とにより構成されたプラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）において、前記測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ _a ）の測定と同条件でシグナル（Ｓ _p ）を測定すること、
   少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜と光検出器との間に、厚みの少なくとも一部がエバネッセント波（Ｅ _e ）およびプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ _t ）の両方が到達する距離にあるようにして配置された蛍光色素層とにより構成されたプラズモン散乱リファレンス領域（Ｑ）において、前記測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ _a ）の測定と同条件でシグナル（Ｓ _q ）を測定すること、
   上記シグナル（Ｓ _p ）の測定値より、入射光のうちプラズモン散乱光になるものの割合を示す散乱係数（ｋ１）を求めること、
   上記シグナル（Ｓ _q ）の測定値および上記散乱係数（ｋ１）より、入射光のうちエバネッセント波になるものの割合を示すプラズモン係数（ｋ２）を求めること、ならびに
   上記散乱係数（ｋ１）およびプラズモン係数（ｋ２）に基づいて前記シグナル（Ｓ _a ）から補正されたシグナル（Ｓ _a ′）を求めることを含むことを特徴とする、上記測定方法。
2. さらに、前記シグナル（Ｓ_a）に含まれる、プラズモン散乱光中の蛍光波長成分（Ｆ_t）に起因する蛍光シグナルの補正のためのステップ（Ｔ２）を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法。
3. さらに、前記シグナル（Ｓ_a）に含まれる、プラズモン散乱光中の蛍光波長成分（Ｆ_t）に起因する蛍光シグナルの補正のためのステップ（Ｔ２）を含み、
   上記補正のためのステップ（Ｔ２）が、
   前記測定領域（Ａ）と同様の構成を有するアッセイリファレンス領域（Ｒ）に、アナライトも標識リガンドも含まない液体を送液し、流路をこれで満たした状態で測定すること以外は前記測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ_a）の測定と同条件でシグナル（Ｓ_r1）を測定すること、
   上記アッセイリファレンス領域（Ｒ）に、前記測定領域（Ａ）で用いたものと同じ標識リガンド溶液を送液し、流路をこれで満たした状態で測定すること以外は前記測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓ_a）の測定と同条件で、シグナル（Ｓ_r2）を測定すること、
   前記シグナル（Ｓ_p）の測定値から上記シグナル（Ｓ_r1）の測定値を引いた値より散乱係数（ｋ１）を求めること、
   前記シグナル（Ｓ_q）の測定値から上記シグナル（Ｓ_r2）の測定値を引いた値および上記散乱係数（ｋ１）よりプラズモン係数（ｋ２）を求めること、ならびに
   上記散乱係数（ｋ１）およびプラズモン係数（ｋ２）に基づいて前記シグナル（Ｓ_a）から補正されたシグナル（Ｓ_a′）を求めることを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法。
4. 前記シグナル（Ｓ_a′）が、下記式で表されることを特徴とする、請求項１または３に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法。
   Ｓ_a′＝Ｓ_a×(ｋ１＋ｋ２)／ｋ２
5. 少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜上に形成された固定化リガンドを含む層とにより構成された測定領域（Ａ）、
   少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜と光検出器の間に、エバネッセント波（Ｅ_e）が到達せずプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）のみが到達するよう当該金属薄膜からの距離をあけて配置された蛍光色素層とにより構成されたプラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）、および
   少なくとも誘電体部材と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜と、当該金属薄膜と光検出器の間に、厚みの少なくとも一部がエバネッセント波（Ｅ_e）およびプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）の両方が到達する距離にあるように配置された蛍光色素層とにより構成されたプラズモン散乱リファレンス領域（Ｑ）
   を備えることを特徴とする、ＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法用の表面プラズモン共鳴センサ。
6. さらに、前記測定領域（Ａ）と同一の構成を有するアッセイリファレンス領域（Ｒ）を備えることを特徴とする、請求項５に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法用の表面プラズモン共鳴センサ。
7. 前記プラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）および増強電場リファレンス領域（Ｑ）の蛍光色素層が、上記領域のセンサ表面と光検出器の間にセンサ表面に対向するよう設置された部材を、蛍光色素を含有する光透過性材料で形成するか、またはそのように設置された蛍光色素を含有しない光透過性材料で形成された部材に蛍光色素を含有する薄層を積層することにより配置されていることを特徴とする、請求項５または６に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法用の表面 プラズモン共鳴センサ。
8. 前記プラズモン散乱リファレンス領域（Ｐ）の蛍光色素層が、蛍光色素を含有しない光透過性材料で形成された流路天板に積層された蛍光色素を含有する薄層であることを特徴とする、請求項７に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法用の表面プラズモン共鳴センサ。
9. 前記増強電場リファレンス領域（Ｑ）の蛍光色素層が、金属薄膜上に積層された蛍光色素を含有する薄層であって、当該蛍光色素層の厚みすべてがエバネッセント波（Ｅ_e）およびプラズモン散乱光中の励起光波長成分（Ｅ_t）の両方が到達する距離にあることを特徴とする、請求項７または８に記載のＳＰＦＳまたはそれを利用した測定方法用の表面プラズモン共鳴センサ。

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