JP6888548B2 - 測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、検体中の被測定物質の量を測定する方法、並びにこれに用いる測定チップ及び測定用キットに関する。

臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被測定物質を高感度に測定することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被測定物質を高感度かつ特異的に測定できる方法が求められている。

被測定物質を特異的に測定できる方法として、ＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）や、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy、以下「ＳＰＦＳ法」とも称する）、反射干渉分光法（Reflectometric Interference Spectroscopy（以下、「ＲＩｆＳ法」とも称する）、表面プラズモン共鳴法（以下「ＳＰＲ法」とも称する）、水晶振動子マイクロバランス解析（以下、「ＱＣＭ」とも称する）等が知られている。

例えば、ＳＰＦＳ法では、被測定物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば１次抗体）を金属膜上に固定して、被測定物質を捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被測定物質を含む検体（例えば血液）を提供すると、被測定物質が反応場に固定される。次いで、蛍光物質で標識された捕捉体（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、反応場に固定された被測定物質が蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被測定物質を標識する蛍光物質が、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。そして、放出された蛍光を検出することで、被測定物質の存在またはその量を検知できる。

上記ＳＰＦＳ法に限らず、各種測定方法で液体中の被測定物質の量を測定する場合、通常、検体の単位体積当たりに含まれる被測定物質の質量は、それに相当するシグナル量などで示される。ただし、検体中の被測定物質の濃度が高く、測定装置のダイナミックレンジを超える場合には、正確に被測定物質の量を特定することが難しい。そのため、一般的な測定では、検体中の被測定物質の濃度が測定装置のダイナミックレンジ内に収まるよう、多段階の希釈作業が行われていた。希釈は手動もしくは自動で行われ、検体希釈のための各種計量装置や多段階希釈装置等も種々提案されている（例えば特許文献１及び特許文献２）。

特開２０１２−２２０２４６号公報 特開平９−３０４２４８号公報

しかしながら、多段階の希釈を手動で行う場合、工程数が多くなり、作業が煩雑になるとの課題がある。また手動でこのような希釈を行うと、ヒューマンエラーが生じるおそれもある。一方で、各種計量装置や希釈装置にて、検体の多段階希釈を行う場合、装置構成が複雑になったり大型化したりするだけでなく、コストが増大するとの課題がある。

本発明は、このような課題を鑑みてなされたものであり、被測定物質を高濃度に含む検体について、多段階希釈することなく、被測定物質を高精度に測定することができる測定方法や、測定チップ、測定用キットを提供することを目的とする。

上記課題の少なくとも一つを解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定方法は、液体を収容するための収容部と、前記収容部内に固定され、被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第１の捕捉体と、を含む測定チップの前記収容部内に検体を提供し、前記検体に含まれる被測定物質を前記第１の捕捉体に結合させる結合工程と、前記第１の捕捉体に結合した前記被測定物質の量を測定する測定工程と、を有する、検体中の被測定物質の量を測定する方法であって、前記結合工程と同時または前記結合工程より前に、前記被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第２の捕捉体を、前記検体中の一部の前記被測定物質に結合させて、前記第１の捕捉体に結合可能な前記被測定物質の量を減少させる調整工程をさらに有する。

本発明の一実施の形態に係る測定チップは、検体中の被測定物質の量を測定するための測定チップであって、液体を収容するための収容部と、前記収容部内の被測定物質を検出するための検出領域に固定され、かつ前記被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第１の捕捉体と、前記収容部内の、前記検出領域外に固定され、前記被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第２の捕捉体と、を有する。

本発明の一実施の形態に係る測定用キットは、液体を収容するための収容部と、前記収容部内の被測定物質を検出するための検出領域に固定され、かつ前記被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第１の捕捉体と、を有する測定チップ、及び前記被測定物質の前記第１の捕捉体が結合するための部位に、特異的に結合するための認識部位を有する前記第２の捕捉体を含む試薬、を有する。

本発明によれば、被測定物質を高濃度で含む検体について、検体を多段階希釈することなく、被測定物質の量を高精度に測定することができる。したがって、検体中の被測定物質量を低コストで、特異的、かつ高精度に測定することが可能である。

図１は、ＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。 図２は、本発明の実施の形態１の測定方法を行う際の、ＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図３は、本発明の実施の形態２の測定に用いる測定チップの構成の一例を示す模式図である。 図４は、本発明の実施の形態２の測定方法を行う際の、ＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図５は、回折格子を含む金属膜の斜視図である。 図６は、シスタチンＣの量を示すシグナル値と、検体中に含まれるシスタチンＣの濃度との関係を示すグラフである。 図７は、シスタチンＣの量を示すシグナル値と、検体中に含まれるシスタチンＣの濃度との関係を示すグラフである。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る測定方法の代表例として、検体に含まれる被測定物質の量を表面プラズモン励起増強蛍光分光装置（ＳＰＦＳ装置）にて測定する方法を説明するが、本発明の実施の形態は、当該測定装置にて測定する方法に限定されるものではない。

［実施の形態１］
（測定用のチップ及び装置）
図１は、実施の形態１に用いるＳＰＦＳ装置１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、蛍光検出ユニット１２０、送液ユニット１３０、搬送ユニット１４０、および制御部１５０を有する。ＳＰＦＳ装置１００では、搬送ユニット１４０のチップホルダー１４２に測定チップ１０を装着した状態で、検体中の被測定物質量を測定する。まず、実施の形態１に用いる測定チップ１０について説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。

測定チップ１０は、入射面２１、成膜面２２、および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。本実施の形態では、流路蓋４０が、金属膜３０と対向する面に流路溝を有し、金属膜３０や流路蓋４０に囲まれた空間が、液体（例えば検体）を収容するための収容部４１となる。通常、測定チップ１０は、分析のたびに交換される。測定チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射ユニット１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させるための面である。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面、より具体的にはプリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）にて反射し、反射光となる。出射面２３は、反射光をプリズム２０の外部に出射させるための面である。

プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。

入射面２１は、励起光αが励起光照射ユニット１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される反射光の光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、測定チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）γの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。

なお、測定チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に第１の捕捉体を介して捕捉された被測定物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。

プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１．４〜１．６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。

金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（ＳＰＲ）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。

金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内であることが好ましい。

また、図１では図示しないが、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面（金属膜３０の表面）の検出領域には、被測定物質を捕捉するための第１の捕捉体が固定されている。「検出領域」とは、ＳＰＦＳ装置１００により被測定物質を検出するための領域であり、当該検出領域の金属膜３０裏面に、光源ユニット１１１から励起光αが照射される。そして、当該検出領域に固定されている第１の捕捉体は、検体中の被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する。そのため、収容部４１に検体が提供された際に、第１の捕捉体に被測定物質が選択的に結合する。つまり、被測定物質を金属膜３０上に固定することが可能となる。当該第１の捕捉体の種類は、被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有していれば特に制限されず、被測定物質に特異的に結合する生体分子（例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、核酸アプタマー等）、またはその断片等でありうる。また、第１の捕捉体の金属膜３０への固定方法は特に限定されず、例えば物理吸着、化学結合（アミドカップリング、Ａｕとチオールとの反応、シランカップリング）等のいずれでもありうる。

また測定チップ１０における流路蓋４０は金属膜３０上に配置されている。また、流路蓋４０は流路溝を有し、流路溝の壁面及び上面と、金属膜３０とによって、液体を収容するための空間（収容部４１）が形成されている。なお、金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。この場合、収容部４１は、流路蓋４０の流路溝の壁面及び上面と、金属膜３０及びプリズム２０の成膜面２２とによって、形成された空間とされる。収容部４１の形状や大きさは限定されない。収容部４１は、例えばウェル等、液体を一時的に貯留するための空間であってもよいが、本実施の形態では、測定効率等の観点から、収容部４１が液体を流すための流路であることが好ましい。収容部４１が流路である場合、収容部４１の両端もしくは一方の端部は、流路蓋４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口と接続される。

流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される蛍光βおよびプラズモン散乱光γに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光βおよびプラズモン散乱光γを外部に取り出す部分が蛍光βおよびプラズモン散乱光γに対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。

本実施の形態において、収容部４１（以下、「流路４１」ともいう）に提供される液体は、後述するように、検体と第２の捕捉体との混合液や、蛍光物質で標識された捕捉体を含む標識液、洗浄液などである。そして、金属膜３０に固定されている第１の捕捉体は、収容部４１内に露出しているため、流路４１内へ液体が注入されると、液体は第１の捕捉体に接触し、各種反応や洗浄（不純物の除去）等が行われる。

なお、後述の測定方法において、上記測定チップ１０の検出領域には、被測定物質が第１の捕捉体を介して固定される。またさらに、当該被測定物質は、蛍光物質等で標識される。そして、図１に示されるように、測定チップ１０の金属膜３０に励起光αをＳＰＲが生じる角度で照射して、金属膜３０上に局在場光を発生させる。この局在場光により、蛍光物質が励起され、蛍光物質が蛍光βを放出する。この蛍光βの光量を測定することで、金属膜３０上に固定された被測定物質の量が特定される。

次に、ＳＰＦＳ装置１００の測定チップ以外の構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、蛍光検出ユニット１２０、送液ユニット１３０、搬送ユニット１４０および制御部１５０を有する。

励起光照射ユニット１１０は、チップホルダー１４２に保持された測定チップ１０に励起光αを照射する。蛍光βまたはプラズモン散乱光γの測定時には、励起光照射ユニット１１０は、金属膜３０に対する入射角がＳＰＲを生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０にＳＰＲが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。励起光照射ユニット１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。

光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。

光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。

ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。

ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。

温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。

角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１４２とを相対的に回転させる。

たとえば、角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。

前述のとおり、金属膜３０に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光γの光量が最大となる角度が増強角である。励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光βを測定することが可能となる。測定チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路４１内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４１内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。

光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

蛍光検出ユニット１２０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じた蛍光βを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出ユニット１２０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光γも検出する。蛍光検出ユニット１２０は、受光ユニット１２１、位置切り替え機構１２２およびセンサー制御部１２３を含む。

受光ユニット１２１は、測定チップ１０の金属膜３０の法線方向に配置される。受光ユニット１２１は、第１レンズ１２４、光学フィルター１２５、第２レンズ１２６および受光センサー１２７を含む。

第１レンズ１２４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１２６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１２４で集光された光を受光センサー１２７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１２５は、両レンズの間に配置されている。

光学フィルター１２５は、蛍光成分のみを受光センサー１２７に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光βを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。光学フィルター１２５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１２５は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。

受光センサー１２７は、蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出する。受光センサー１２７は、微小量の被測定物質からの微弱な蛍光βを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１２７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。

位置切り替え機構１２２は、光学フィルター１２５の位置を、受光ユニット１２１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１２７が蛍光βを検出する時には、光学フィルター１２５を受光ユニット１２１の光路上に配置し、受光センサー１２７がプラズモン散乱光γを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。

センサー制御部１２３は、受光センサー１２７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１２７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２７の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

送液ユニット１３０は、チップホルダー１４２に保持された測定チップ１０の流路４１内に、各種液体を供給する。本実施の形態では、例えば検体と第２の捕捉体との混合液や標識液、洗浄液などを流路４１に供給する。送液ユニット１３０は、液体チップ１３１、シリンジポンプ１３２および送液ポンプ駆動機構１３３を含む。

液体チップ１３１は、検体や標識液、洗浄液、第２の捕捉体やこれを含む試薬などの液体をそれぞれ収容するための容器である。液体チップ１３１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。液体チップ１３１を構成する各容器には、一種の溶液のみが収容されてもよく、複数種類の溶液が収容されてもよい。

送液ユニット１３０におけるシリンジポンプ１３２は、シリンジ１３４と、シリンジ１３４内を往復動作可能なプランジャー１３５とによって構成される。プランジャー１３５の往復運動によって、液体の吸引および排出が定量的に行われる。シリンジ１３４が交換可能であると、シリンジ１３４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ１３４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ１３４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ１３４を交換せずに使用することが可能となる。

送液ポンプ駆動機構１３３は、プランジャー１３５の駆動装置、およびシリンジポンプ１３２の移動装置を含む。シリンジポンプ１３２の駆動装置は、プランジャー１３５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ１３２の送液量や送液速度を管理できるため、測定チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ１３２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１３２を、シリンジ１３４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ１３２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。

送液ユニット１３０は、液体チップ１３１より各種液体を吸引し、測定チップ１０の流路４１内に供給する。このとき、プランジャー１３５を動かすことで、測定チップ１０中の流路４１内を液体が往復し、流路４１内の液体が攪拌される。これにより、流路４１内に提供された液体の濃度の均一化や、流路４１内における反応（例えば抗原抗体反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、測定チップ１０の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ１３４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、測定チップ１０およびシリンジ１３４が構成されていることが好ましい。

流路４１内の液体は、再びシリンジポンプ１３２で吸引され、液体チップ１３１などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、流路４１内で各種液体を反応させたり、流路４１内を洗浄したりすることができ、流路４１内の検出領域に、蛍光物質で標識された被測定物質を配置することができる。

搬送ユニット１４０は、測定チップ１０を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射ユニット１１０が測定チップ１０に励起光αを照射し、それに伴い発生する蛍光βまたはプラズモン散乱光γを蛍光検出ユニット１２０が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液ユニット１３０が測定チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または測定チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。搬送ユニット１４０は、搬送ステージ１４１およびチップホルダー１４２を含む。チップホルダー１４２は、搬送ステージ１４１に固定されており、測定チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１４２の形状は、測定チップ１０を保持することが可能であり、かつ励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１４２には、励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ１４１は、チップホルダー１４２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１４１も、励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１４１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。

制御部１５０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、位置切り替え機構１２２、センサー制御部１２３、送液ポンプ駆動機構１３３および搬送ステージ１４１を制御する。制御部１５０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

（測定方法）
次に、実施の形態１に係る測定方法を説明する。図２は、実施の形態１の測定方法を行う際のＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。

まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１４２に前述の測定チップ１０を設置する。また、測定チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合には、流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。

次いで、測定チップ１０の金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する（工程Ｓ２０）。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を設置位置から測定位置に移動させる。この後、制御部１５０が、光源制御部１１３および角度調整部１１２を制御して、光源ユニット１１１から励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査する。このとき、制御部１５０は、位置切替え機構１２２を制御して、光学フィルター１２５を受光ユニット１２１の光路外に移動させる。これとともに、制御部１５０は、センサー制御部１２３を制御して、受光センサー１２７でプラズモン散乱光γを検出する。制御部１５０は、励起光αの入射角とプラズモン散乱光γの強度との関係を含むデータを得る。そして、制御部１５０は、データを解析して、プラズモン散乱光γの強度が最大となる入射角（増強角）を決定する。最後に、制御部１５０は、角度調整部１１２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する。

ここで、上記増強角は、プリズム２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４１内の液体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、測定を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０．１°程度のオーダーで決定される。

次いで、流路４１の外部で、検体と第２の捕捉体とを混合し、検体中の一部の被測定物質に第２の捕捉体を特異的に結合させる（調整工程（工程Ｓ３０））。検体と被測定物質との混合方法は特に限定されない。例えば、制御部１５０が、送液ポンプ駆動機構１３３を制御し、別々の容器に収容された検体および第２の捕捉体もしくはその分散液を、液体チップ１３１の一つの容器内に移す方法であってもよい。また、制御部１５０が、送液ポンプ駆動機構１３３を制御し、一つのシリンジ１３４内に検体及び第２の捕捉体をそれぞれ吸入する方法であってもよい。

ここで「第２の捕捉体」とは、被測定物質の第１の捕捉体が結合するための部位に、特異的に結合するための認識部位を有する物質である。そして、検体と第２の捕捉体とを混合することで、検体中の一部の被測定物質が、第２の捕捉体に結合される。つまり、一部の被測定物質の「第１の捕捉体に結合するための部位」が、第２の捕捉体で塞がれる。その結果、第１の捕捉体に結合可能な被測定物質の量が減少する。

なお、本実施の形態で流路４１に提供される検体及び被測定物質の種類は特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。また被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。

一方、第２の捕捉体は、被測定物質の第１の捕捉体が結合するための部位に、特異的に結合するための認識部位を有する物質であれば特に限定されない。第２の捕捉体は、例えば、第１の捕捉体と同一の抗体（例えば、モノクローナル抗体）もしくはその断片であってもよく、第１の捕捉体と異なる抗体またはその断片であってもよい。また、第２の捕捉体やこれを含む試薬は、粉体状であってもよく、溶媒に分散または溶解された状態であってもよい。当該工程における、検体への第２の捕捉体の混合量は、「第１の捕捉体が結合可能な被測定物質の量」が所望の範囲となるよう、適宜調整される。

次いで、検体と第２の捕捉体との混合液を流路４１内に提供する（結合工程（工程Ｓ４０））。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を測定位置から送液位置に移動させる。この後、制御部１５０は、送液ポンプ駆動機構１３３を制御して、液体チップ１３１中の検体と第２の捕捉体との混合液を流路４１内に提供する。これにより、検体中の被測定物質を、流路４１に固定された第１の捕捉体に特異的に結合させ、金属膜３０上に被測定物質を固定する（１次反応）。

上記１次反応後、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ５０）。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を設置位置から測定位置に移動させる。この後、制御部１５０が、光源制御部１１３を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に向けて光源ユニット１１１から励起光αを出射させる。これと同時に、制御部１５０は、センサー制御部１２３を制御して、受光センサー１２７で光の光量を検出し、これをブランク値として記録する。

さらに、金属膜３０上の第１の捕捉体に結合した被測定物質を蛍光物質で標識する（２次反応（工程Ｓ６０））。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を測定位置から送液位置に移動させる。この後、制御部１５０は、送液ポンプ駆動機構１３３を制御して、液体チップ１３１中の蛍光標識液を流路４１内に提供する。これにより、被測定物質が蛍光物質で標識される。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。蛍光物質で標識された抗体は、被測定物質の、第１の捕捉体が特異的に結合する部位とは異なる部位に、特異的に結合する。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。

次いで、流路４１の底面（金属膜３０）上に、蛍光物質で標識された被測定物質が第１の捕捉体を介して固定された状態で、プリズム２０を通して励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射する。そして、被測定物質を標識する蛍光物質からの蛍光値を測定する（測定工程（工程Ｓ７０））。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を送液位置から測定位置に移動させる。この後、制御部１５０は、光源制御部１１３を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に向けて光源ユニット１１１から励起光αを出射させる。これと同時に、制御部１５０は、センサー制御部１２３を制御して、受光センサー１２７で蛍光βと同じ波長の光の光量を検出する。

最後に、被測定物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ８０）。蛍光値は、主として、被測定物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル値）と、光学ブランク値とを含む。したがって、制御部１５０は、工程Ｓ７０で得られた蛍光値から工程Ｓ５０で得られた光学ブランク値を引くことで、被測定物質の量に相関するシグナル値を算出することができる。シグナル値は、第２の捕捉体の添加量等も勘案して、あらかじめ作成しておいた検量線により、被測定物質の量や濃度などに換算される。

（効果）
従来のＳＰＦＳ装置では、検体中に含まれる被測定物質の濃度が高くなるにつれて、検出される蛍光の光量も増大する。このため、検体中に含まれる被測定物質の濃度が過剰に高くなると、受光センサーのダイナミックレンジを超えてしまい、正確な測定をすることができないおそれがある。これに対して、実施の形態１に係る測定方法では、流路４１に検体を提供する前に、検体と第２の捕捉体とを混合し、被測定物質の「第１の捕捉体が結合するための部位」を、第２の捕捉体で塞ぐ。実施の形態１に係る測定方法では、測定対象である検体中に被測定物質が高濃度に含まれていたとしても、第１の捕捉体が結合可能な被測定物質の量が少なくなり、当該量を測定装置のダイナミックレンジ内に収めることができる。したがって、検体を多段階希釈することなく、被測定物質の量を高精度に測定することができる。

なお、当該実施の形態１で使用する測定チップ１０と、第２の捕捉体を含む試薬とを組み合わせて測定用キットとすることができる。当該測定用キットにおいて、第２の捕捉体を含む試薬は、粉体状であってもよく、液体状であってもよい。

また、上記の測定方法では、液体チップ１３１内、もしくはシリンジ１３４内で、検体と第２の捕捉体との混合工程を行っているが、検体と第２の捕捉体は、液体チップ１３１に収容する前に混合してもよい。

［実施の形態２］
実施の形態２は、測定チップ１０’の一部の構成が実施の形態１の測定方法に用いる測定チップ１０と異なる以外は、同一であり、使用するＳＰＦＳ装置も同様である。そこで、実施の形態２に用いる測定チップ１０’を中心に説明し、実施の形態１と同様の構成については同一の符号を付して説明を省略する。

実施の形態２に用いる測定チップ１０’を図３に示す。測定チップ１０’は、実施の形態１の測定チップ１０と同様に、入射面２１、成膜面２２、及び出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。通常、当該測定チップ１０’は、分析のたびに交換される。測定チップ１０’は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

また、図３に示すように、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面（金属膜３０の表面）の検出領域（図中、Ａで示される領域）には、被測定物質を捕捉するための第１の捕捉体が固定されている。「検出領域」とは、ＳＰＦＳ装置により被測定物質を検出するための領域であり、検出領域Ａの金属膜３０裏面に、光源ユニット１１１から励起光αが照射される。第１の捕捉体は、被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する。金属膜３０の検出領域Ａに第１の捕捉体が固定されていると、第１の捕捉体に検体中の被測定物質が特異的に結合する。その結果、被測定物質が金属膜３０上に第１の捕捉体を介して固定され、これを検出することが可能となる。第１の捕捉体の種類は、被測定物質に特異的に結合することができれば特に限定されず、被測定物質に特異的な生体分子（例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、核酸アプタマー等）、またはその断片である。

さらに、本実施の形態では、金属膜３０及び流路蓋４０から構成される収容部４１内の検出領域外（図３中、Ｂで示される領域）に、さらに第２の捕捉体が固定されている。本実施の形態では、収容部４１内に、第１の捕捉体及び第２の捕捉体が露出しており、流路４１内に液体が注入されると、液体は第１の捕捉体及び第２の捕捉体に接触して、各種反応や洗浄（不純物の除去）等が行われる。

ここで、第２の捕捉体が固定されている領域Ｂは、検出領域Ａの外側、つまり第１の捕捉体が固定された領域外であって、検体が接触する領域であれば特に制限されない。例えば、金属膜３０上であってもよく、流路蓋４０の流路溝壁面や上面であってもよい。収容部４１が流路であり、かつ一端が検体の注入口４２と接続され、他端が検体の排出口４３と接続されている場合（図３における矢印は、検体の移動方向を示す）、第２の捕捉体が固定されている領域Ｂは、検体の注入口４２側及び排出口４３側のいずれであってもよいが、検体の注入口４２側であることが好ましい。第２の捕捉体が、検体の注入口４２側に固定されていると、第１の捕捉体に被測定物質が結合する前に、第２の捕捉体に被測定物質が結合しやすくなる。つまり、第１の捕捉体に結合可能な被測定物質の量を確実に減少させることができる。なお、測定チップ１０’の収容部４１内に固定されている第２の捕捉体の量は、検体中の被測定物質の量に応じて適宜選択される。

第２の捕捉体は、被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有するものであれば特に制限されず、例えば、第１の捕捉体と同一であってもよく、第１の捕捉体と異なるものであってもよい。また、被測定物質の第２の捕捉体が結合する部位は、被測定物質の第１の捕捉体が結合する部位と同一であってもよく、異なってもよい。

（測定方法）
次に、本発明の実施の形態２に係る測定方法を説明する。図４は、本実施の形態の測定方法を行う際のＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。

まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１４２に測定チップ１０’を設置する。また、測定チップ１０’の流路４１内に保湿剤が存在する場合には、流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。

次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する（工程Ｓ１２０）。当該工程は、実施の形態１の増強角設定工程（工程Ｓ２０）と同様である。

次いで、検体を流路４１内に提供する（調整工程及び結合工程（工程Ｓ１３０））。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０’を測定位置から送液位置に移動させる。この後、制御部１５０は、送液ポンプ駆動機構１３３を制御して、液体チップ１３１中の検体を流路４１内に提供する。これにより、流路４１（収容部４１）の検出領域外Ｂに固定された第２の捕捉体に、検体中の被測定物質の一部が特異的に結合し、第１の捕捉体に結合可能な被測定物質の量が減少する。その後、流路４１内の検出領域Ａに固定された第１の捕捉体に、検体中に残存する被測定物質が特異的に結合する。つまり、金属膜３０の検出領域Ａ上に被測定物質が捕捉される（１次反応）。なお、本工程で流路４１に提供する検体及び被測定物質の種類は特に限定されず、実施の形態１の測定方法で流路４１に提供する検体及び被測定物質と同様でありうる。

上記１次反応後、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ１４０）。当該工程は、実施の形態１の光学ブランク値の測定工程（工程Ｓ５０）と同様である。次いで、金属膜３０上の第１の捕捉体に結合された被測定物質を蛍光物質で標識する（２次反応工程（工程Ｓ１５０））。当該工程は、実施の形態１の（２次反応工程（工程Ｓ６０））と同様である。

次いで、流路４１の底面（金属膜３０）上に、蛍光物質で標識された被測定物質が第１の捕捉体を介して固定された状態で、プリズム２０を通して励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の検出領域に照射する。そして、検出領域の被測定物質を標識する蛍光物質からの蛍光値を測定する（工程Ｓ１６０）。当該工程は、実施の形態１の測定工程（工程Ｓ７０）と同様である。

最後に、被測定物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ１７０）。蛍光値は、主として、被測定物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル値）と、光学ブランク値とを含む。したがって、制御部１５０は、工程Ｓ１６０で得られた蛍光値から工程Ｓ１４０で得られた光学ブランク値を引くことで、被測定物質の量に相関するシグナル値を算出することができる。シグナル値は、測定チップ１０’に固定されている第２の捕捉体の量を勘案し、あらかじめ作成しておいた検量線により、被測定物質の量や濃度などに換算される。

（効果）
以上のように、実施の形態２に係る測定方法では、収容部に固定された第２の捕捉体によって、検体中に含まれる被測定物質を捕捉し、第１の捕捉体に結合可能な被測定物質の量を減少させる。そのため、実施の形態２に係る測定方法では、測定対象である検体中に被測定物質が高濃度に含まれていたとしても、第１の捕捉体に結合可能な被測定物質の量を測定装置のダイナミックレンジ内に収めることができ、被測定物質の量を高精度に測定することができる。

なお、上記説明では、収容部４１内の検出領域外Ｂに第２の捕捉体が固定されているものとしたが、第２の捕捉体の固定箇所は、測定チップ１０’内に限定されない。例えば、第２の捕捉体は、収容部４１以外の部材に固定されていてもよい。第２の捕捉体が固定される部材は、結合工程（工程Ｓ１３０）前に検体と接触可能な部材であれば特に限定されず、例えば、液体チップ１３１や、シリンジ１３４であってもよい。この場合、測定チップ１０’に第２の捕捉体を固定しなくとも、測定チップ１０’の収容部４１に供給される被測定物質の量を減少させることができる。したがって、第１の捕捉体により結合可能な被測定物質の量を測定装置のダイナミックレンジ内に収めることができ、検体を多段階希釈することなく、被測定物質の量を高精度に測定することができる。

［その他の実施の形態］
上記実施の形態１及び実施の形態２では、金属膜３０が形成されたプリズム２０を使用し、光子と表面プラズモンとを結合（カップリング）させるプリズムカップリング（ＰＣ）−ＳＰＦＳ法を利用する測定方法および測定装置について説明した。しかし、本発明に係る測定方法および測定チップは、この態様に限定されない。図５は、回折格子を含む金属膜３０ａの斜視図である。本発明に係る測定方法および測定装置では、図５に示されるように、回折格子を含む金属膜３０ａを有する測定チップを使用してもよい。この場合も、光子と表面プラズモンとを結合させ、金属膜３０ａからプラズモン散乱光γを放出させることができる。この場合、プリズム２０は不要である。また、励起光照射ユニット１１０は、測定チップの金属膜３０ａ側に配置され、蛍光βの検出工程およびプラズモン散乱光γの検出工程では、回折格子に向けて励起光αを照射する。

また、上記実施の形態１及び実施の形態２では、ＳＰＦＳ装置を利用した測定方法及び測定チップ、測定キットを説明したが、測定方法や測定チップ、測定キットは、これらに限定されない。測定方法は、ＥＬＩＳＡ法や、ＲＩｆＳ法、ＳＰＲ法、ＱＣＭ等にも適用できる。また、測定チップや測定キットは、これらの測定方法に合わせた構造とすることができる。

以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されない。

１．実施の形態１による、シスタチンＣの濃度測定
（１）測定チップの準備
プリズムの一面上に金属膜が配置されている測定チップを準備した。そして、当該プリズムの金属膜の検出領域に、抗シスタチンＣ抗体を固定した。そして、金属膜上に流路蓋を載置し、測定チップとした。当該測定チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。

（２）調整工程
被測定物質であるシスタチンＣを所定の濃度で含む検体１Ａ〜７Ａ（各検体が含むシスタチンＣの濃度を表１に示す）をそれぞれ５μＬずつ準備した。そして、各検体と、反応溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ、３％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬ抗シスタチンＣ抗体含有ＰＢＳ ｐＨ７．４）４４５μＬとを混合した。なお、反応溶液が含む抗シスタチンＣ抗体は、測定チップに固定した抗シスタチンＣ抗体と同一の抗体とした。

（３）結合工程及び測定工程
検体と反応溶液との混合液を１５０μＬ、測定チップの流路内に往復送液することで、流路内の検出領域に固定された抗シスタチンＣ抗体に、混合液中のシスタチンＣを特異的に反応（１次反応）させた。
次いで、流路内の検体を除去し、流路内を洗浄溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ ｐＨ７．４）で洗浄した。その後、流路内に測定溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ、５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ ｐＨ７．４）を入れ、波長６３５ｎｍの励起光をプリズム側から金属膜に増強角で照射した。そして、反応場から放出される光を検出し、光学ブランク値を得た。
その後、蛍光物質としてＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）で標識された抗シスタチンＣ抗体を含む溶液（４０μＬ）を、流路内に往復送液し、検出領域に固定されたシスタチンＣに、蛍光物質で標識された抗シスタチンＣ抗体を特異的に反応（２次反応）させた。
２次反応の後、流路内の溶液を除去し、流路内を上記と同様の洗浄溶液で洗浄した。その後、光学ブランク値の測定と同様に、測定溶液を流路内に入れ、励起光を照射して、反応場から放出される蛍光を検出した。そして、蛍光の検出値から光学ブランク値を引き、シスタチンＣの量を示すシグナル値を得た。

２．一般的な方法による、シスタチンＣの濃度測定
（１）測定チップの準備
実施例１と同様に、測定チップを作製し、これをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。
（２）結合工程及び測定工程
被測定物質であるシスタチンＣを所定の濃度で含む検体１Ｂ〜８Ｂ（各検体が含むシスタチンＣの濃度を表１に示す）をそれぞれ５μＬずつ準備した。そして、各検体と、希釈溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ ｐＨ７．４）４４５μＬとを混合した。そして、当該混合液を測定チップの流路内に往復送液することで、流路内の検出領域に固定された抗シスタチンＣ抗体に混合液中のシスタチンＣを特異的に反応（１次反応）させた以外は、実施例１と同様の手順で反応を行い、シスタチンＣの量を示すシグナルを得た。

３．結果
図６は、検体中に含まれるシスタチンＣの濃度と、シスタチンＣの量を示すシグナル値との関係を示すグラフである。図６における検体Ａ（丸で表示）は、抗シスタチンＣ抗体を含む反応溶液を検体に添加した場合の測定結果である。図６における検体Ｂ（菱形で表示）は、抗シスタチンＣ抗体を含まない希釈溶液を検体に添加した場合の測定結果である。図６において、横軸は検体中に含まれるシスタチンＣの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、縦軸はシスタチンＣの量を示すシグナル値を示す。図６に示されるように、検体Ａ及び検体ＢのいずれもシスタチンＣの濃度が高くなるほどシグナル値が高くなる。ただし、検体Ｂのシグナル値に示されるように、検体に予め抗シスタチンＣ抗体を添加しなかった場合、高濃度域においてシグナルの飽和が見られる。これに対し、図６の検体Ａのシグナル値に示されるように、検体に予め抗シスタチンＣ抗体を添加した場合、高濃度域でもシグナル値の飽和が抑えられ、濃度に応じたシグナル値が得られている。つまり高濃度の領域においても被測定物質の量を高精度に測定できると考えられる。

４．実施の形態２による、シスタチンＣの濃度測定
（１）測定チップの準備
プリズムの一面上に金属膜が配置されている測定チップを準備した。そして、当該プリズムの金属膜の検出領域に、抗シスタチンＣ抗体を固定した。その後、検出領域の手前側、つまり流路に検体を提供する際、検出領域より上流側となる領域（金属膜）に、抗シスタチンＣ抗体をさらに固定した。そして、金属膜上に流路蓋を載置し、測定チップとした。当該測定チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。

（２）調整工程、結合工程、及び測定工程
被測定物質であるシスタチンＣを所定の濃度で含む検体１Ｃ〜５Ｃ（各検体が含むシスタチンＣの濃度を表２に示す）をそれぞれ５μＬずつ準備した。そして、各検体と、希釈溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ ｐＨ７．４）４４５μＬとを混合した。次いで、当該混合液を測定チップの流路内に往復送液することで、流路内の検出領域に固定された抗シスタチンＣ抗体に混合液中のシスタチンＣを特異的に反応（１次反応）させた以外は、実施例１と同様の手順で反応を行い、シスタチンＣの量を示すシグナルを得た。

５．一般的な方法による、シスタチンＣの濃度測定
（１）測定チップの準備
実施例１と同様に、測定チップを作製し、これをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。
（２）結合工程及び測定工程
被測定物質であるシスタチンＣを所定の濃度で含む検体１Ｄ〜８Ｄ（各検体が含むシスタチンＣの濃度を表２に示す）をそれぞれ５μＬずつ準備した。そして、各検体と、希釈溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ ｐＨ７．４）４４５μＬとを混合した。次いで、当該混合液を測定チップの流路内に往復送液することで、流路内の検出領域に固定された抗シスタチンＣ抗体に混合液中のシスタチンＣを特異的に反応（１次反応）させた以外は、実施例１と同様の手順で反応を行い、シスタチンＣの量を示すシグナルを得た。

６．結果
図７は、検体中に含まれるシスタチンＣの濃度と、シスタチンＣの量を示すシグナル値との関係を示すグラフである。図７における検体Ｃ（丸で表示）は、測定チップの検出領域以外の流路にも抗シスタチンＣ抗体を固定した場合の測定結果である。図７における検体Ｄ（菱形で表示）は、検出領域のみに抗シスタチンＣ抗体を固定した場合の測定結果である。
図７において、横軸は検体中に含まれるシスタチンＣの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、縦軸はシスタチンＣの量を示すシグナル値を示す。図７に示されるように、検体Ｃ及び検体ＤのいずれもシスタチンＣの濃度が高くなるほどシグナル値が高くなる。ただし、検体Ｄのシグナル値に示されるように、検出領域以外に抗シスタチンＣ抗体を固定しなかった場合には、高濃度域においてシグナル値の飽和が見られる。これに対し、図７の検体Ｃのシグナル値に示されるように、検出領域以外の流路にも抗シスタチンＣ抗体を固定した場合には、高濃度域でもシグナル値の飽和が抑えられ、濃度に応じたシグナル値が得られている。つまり高濃度の領域においても被測定物質の量を高精度に測定できると考えられる。

以上の結果から分かるとおり、検体中に含まれる被測定物質の濃度が高い場合には、本発明の実施の形態１または実施の形態２の測定方法を採用することにより、多段階希釈を行うことなく、被測定物質の量を正確に測定することができる。

本出願は、２０１５年６月２４日出願の特願２０１５−１２６７４８号に基づく優先権を主張する。これらの出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明に係る被測定物質の測定方法並びに、測定チップ及び測定キットによれば、多段階希釈することなく被測定物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。

１０、１０’ 測定チップ
２０ プリズム
２１ 入射面
２２ 成膜面
２３ 出射面
３０ 金属膜
４０ 流路蓋
４１ 収容部（流路）
１００ ＳＰＦＳ装置
１１０ 励起光照射ユニット
１１１ 光源ユニット
１１２ 角度調整機構
１１３ 光源制御部
１２０ 蛍光検出ユニット
１２１ 受光ユニット
１２２ 位置切り替え機構
１２３ センサー制御部
１２４ 第１レンズ
１２５ 光学フィルター
１２６ 第２レンズ
１２７ 受光センサー
１３０ 送液ユニット
１３１ 液体チップ
１３２ シリンジポンプ
１３３ 送液ポンプ駆動機構
１３４ シリンジ
１３５ プランジャー
１４０ 搬送ユニット
１４１ 搬送ステージ
１４２ チップホルダー
１５０ 制御部
α 励起光
β 蛍光
γ プラズモン散乱光

Claims (2)

1. 液体を収容するための収容部と、前記収容部内に固定され、被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第１の捕捉体と、を含む測定チップの前記収容部内に検体を提供し、前記検体に含まれる前記被測定物質を前記第１の捕捉体に結合させる結合工程と、
   前記第１の捕捉体に結合した前記被測定物質を、蛍光物質で標識する工程と、
   前記第１の捕捉体に結合した前記被測定物質の量を測定する測定工程と、
   を有する、検体中の前記被測定物質の量を測定する方法であって、
   前記結合工程より前に、前記被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第２の捕捉体を、前記検体中の一部の前記被測定物質に結合させて、前記第１の捕捉体に結合可能な前記被測定物質の量を減少させる調整工程をさらに有し、
   前記測定チップは、誘電体からなるプリズムと、前記プリズムの一面上に配置された前記収容部と、前記プリズム上かつ前記収容部の底面に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定された前記第１の捕捉体と、を有し、
   前記測定工程は、前記金属膜上に前記被測定物質が前記第１の捕捉体を介して固定された状態で、前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように光を照射し、前記被測定物質を標識する前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程であり、
   前記第２の捕捉体が、前記結合工程前に、前記検体が接触する部材に固定されており、
   かつ、前記第２の捕捉体は、前記収容部の外部に固定されている、
   測定方法。
2. 液体を収容するための収容部と、前記収容部内に固定され、被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第１の捕捉体と、を含む測定チップの前記収容部内に検体を提供し、前記検体に含まれる前記被測定物質を前記第１の捕捉体に結合させる結合工程と、
   前記第１の捕捉体に結合した前記被測定物質を、蛍光物質で標識する工程と、
   前記第１の捕捉体に結合した前記被測定物質の量を測定する測定工程と、
   を有する、検体中の前記被測定物質の量を測定する方法であって、
   前記結合工程より前に、前記被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第２の捕捉体を、前記検体中の一部の前記被測定物質に結合させて、前記第１の捕捉体に結合可能な前記被測定物質の量を減少させる調整工程をさらに有し、
   前記測定チップは、前記収容部と、前記収容部の底面に配置された、回折格子を含む金属膜と、前記金属膜上に固定された前記第１の捕捉体と、を有し、
   前記測定工程は、前記金属膜上に前記被測定物質が前記第１の捕捉体を介して固定された状態で、前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように光を照射し、前記被測定物質を標識する前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程であり、
   前記第２の捕捉体が、前記結合工程前に、前記検体が接触する部材に固定されており、
   かつ、前記第２の捕捉体は、前記収容部の外部に固定されている、
   測定方法。
   

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