JP7405846B2 - 測定方法および測定装置 - Google Patents

Description

本願発明は、血液の液体成分中の被測定物質の量を測定する測定方法および測定装置に関する。

臨床検査などにおいて、血液中のタンパク質やＤＮＡなどの微量の被測定物質を高感度かつ定量的に測定することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、血液中の被測定物質を高感度かつ定量的に測定できる方法が求められている。

血液中の被測定物質を高感度に測定できる方法として、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）法および表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。これらの方法では、所定の条件で光を金属膜に照射すると表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が生じることを利用する。

たとえば、ＳＰＦＳでは、被測定物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、被測定物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被測定物質を含む検体（例えば血液）を提供すると、被測定物質は反応場に結合する。次いで、蛍光物質で標識された捕捉体（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、反応場に結合した被測定物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被測定物質を標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、被測定物質の存在またはその量を検出することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度で被測定物質を測定することができる。

一方、ＳＰＲ法やＳＰＦＳなどに限らず、各種測定方法で血液中の被測定物質を測定する場合、その測定値は、血液中の液体成分（血漿または血清）の単位体積当たりの被測定物質の質量や、それに相当するシグナル量などで示される。血液中の液体成分の割合は個々人で異なるため、血液（全血）の測定値を一律に液体成分の測定値に変換することはできない。このため、検体として血液を用いる場合は、その血液のヘマトクリット値（血液中の血球の体積の割合）を測定し、ヘマトクリット値を用いて血液の測定値を液体成分（血漿または血清）の測定値に変換することが行われている。

たとえば、特許文献１には、表面プラズモン共鳴を利用して血液の液体成分中の被測定物質の量を測定する際に、表面プラズモン共鳴を利用して測定されたヘマトクリット値を用いて変換係数を算出し、血液の測定値を液体成分（血漿または血清）の測定値に変換する測定方法が記載されている。当該測定方法では、ヘマトクリット値を用いて測定値の補正を行うことにより、遠心分離機や電気伝導度またはヘモグロビン濃度の測定装置などのヘマトクリット値を測定するための装置を新たに用意しなくても、血液の液体成分中の被測定物質の量を測定することができるとされている。

国際公開第２０１５／１２９６１５号

本願発明者は、特許文献１に記載の測定方法には、変換係数を用いて血液の測定値から算出される血液の液体成分の測定値の精度に改善の余地があることを見出した。

本願発明の目的は、血液の液体成分中の被測定物質の量をより高い精度で測定することができる測定方法および測定装置を提供することである。

上記課題を解決するため、本願発明の一実施の形態に係る測定方法は、血液の液体成分中の被測定物質の量を測定する方法であって、捕捉体が固定化された反応場を有する測定チップの前記反応場上に血液の希釈液を提供して、前記希釈液に含まれる被測定物質と前記捕捉体とを結合させる工程と、前記被測定物質と前記捕捉体とが結合しており、かつ前記反応場上に前記希釈液が存在しない状態で、前記希釈液中の前記被測定物質の量を示す第１のシグナル値を得る工程と、前記第１のシグナル値を前記血液の液体成分中の前記被測定物質の量を示す第２のシグナル値に変換する工程と、を含み、前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換する工程では、前記第１のシグナル値に、以下の式（１）で表される変換係数ｃを掛けることで、前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換する。

（式（１）中、ｄｆは以下の式（２）で算出される前記希釈液の血漿についての希釈率であり、Ｈｔは前記血液のヘマトクリット値である。）

（式（２）中、ａは前記希釈液中の前記血液の量であり、Ｈｔは前記血液のヘマトクリット値であり、ｅは前記希釈液中の前記血液以外の液体の量である。）

また、上記課題を解決するため、本願発明の一実施の形態に係る測定装置は、血液の液体成分中の被測定物質の量を測定する装置であって、捕捉体が固定化された反応場を有する測定チップを保持するためのホルダーと、前記ホルダーに保持された前記測定チップにおける、前記測定チップの前記反応場上に提供された血液の希釈液中に含まれる被測定物質と前記捕捉体との結合に起因する光学的変化を検出する検出部と、前記検出部の検出結果から前記血液の希釈液中の前記被測定物質の量を示す第１のシグナル値を算出するとともに、前記第１のシグナル値を前記血液の液体成分中の前記被測定物質の量を示す第２のシグナル値に変換する処理部と、を有し、前記処理部は、前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換する際に、前記第１のシグナル値に、以下の式（１）で表される変換係数ｃを掛けることで、前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換する。

（式（１）中、ｄｆは以下の式（２）で算出される前記希釈液の血漿についての希釈率であり、Ｈｔは前記血液のヘマトクリット値である。）

（式（２）中、ａは前記希釈液中の前記血液の量であり、Ｈｔは前記血液のヘマトクリット値であり、ｅは前記希釈液中の前記血液以外の液体の量である。）

本願発明によれば、血液の液体成分中の被測定物質をより高い精度で測定することができる。

図１は、実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光分析装置の構成を示す模式図である。 図２は、図１に示される装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図３Ａは、ヘマトクリット値が０％の血液を２倍に希釈した様子を示す模式図であり、図３Ｂは、ヘマトクリット値が５０％の血液を２倍に希釈した様子を示す模式図である。 図４Ａおよび図４Ｂは、血漿の希釈液を測定して得られた第２のシグナル（横軸）と、その血漿の元となる血液の希釈液を測定して得られた第２のシグナル（縦軸）との関係を示すグラフである。 図５Ａは、心筋トロポニンを２倍希釈したときの補正前と補正後の近似直線を示したグラフである。図５Ｂは、補正前と補正後の血漿中の被測定物質の濃度に対する血液中の被測定物質の濃度の差を示すグラフである。

以下、本願発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る測定装置および測定方法の代表例として、血液（全血：分離および希釈をしていない血液）に含まれる被測定物質の量を表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いて測定する表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）について説明する。

図１は、本願発明の一実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、反射光検出ユニット１２０、蛍光検出ユニット１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御部１６０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、搬送ユニット１５０のチップホルダー１５２に測定チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、測定チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。

測定チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０と、を有する。通常、測定チップ１０は、分析のたびに交換される。測定チップ１０は、各片の長さが数ｍｍ～数ｃｍの構造物であることが好ましいが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射ユニット１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面で反射して反射光βとなる。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射して反射光βとなる。出射面２３は、反射光βをプリズム２０の外部に出射させる。

プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３と、が対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。

入射面２１は、励起光αが励起光照射ユニット１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される反射光βの光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、測定チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）δの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。

なお、測定チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に捕捉された被測定物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。

プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、屈折率が１.４～１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂であることが好ましい。

金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（ＳＰＲ）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。

金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウム、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０～７０ｎｍの範囲内が好ましい。

また、図１では図示しないが、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面（金属膜３０の表面）には、被測定物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体を固定化することで、被測定物質を選択的に測定することが可能となる。本実施の形態では、金属膜３０上の所定の領域（反応場）に、捕捉体が均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被測定物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体は、被測定物質に特異的な抗体またはその断片である。

流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、液体が流れる流路４１を形成する。液体の例には、被測定物質を含む血液、血漿、血清またはこれらの希釈液や、蛍光物質で標識された捕捉体を含む標識液、基準液、洗浄液などが含まれる。金属膜３０に固定化されている捕捉体は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が注入されると、液体は捕捉体に接触する。

流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光γおよびプラズモン散乱光δを外部に取り出す部分が蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。

図１に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（ＳＰＲが生じる角度）で入射する。このように金属膜３０に対して励起光αをＳＰＲが生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被測定物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光γが出射される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光γの光量を測定することで、被測定物質の量を測定する。

次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、反射光検出ユニット１２０、蛍光検出ユニット１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御部１６０を有する。励起光照射ユニット１１０と、蛍光検出ユニット１３０（ＳＰＦＳで被測定物質を測定する場合）または反射光検出ユニット１２０（後述するようにＳＰＲ法で被測定物質を測定する場合）とは、チップホルダー１５２に保持された測定チップ１０における、血液中に含まれる被測定物質と捕捉体との結合に起因する光学的変化を検出する検出部として機能する。

励起光照射ユニット１１０は、チップホルダー１５２に保持された測定チップ１０の金属膜３０にプリズム２０側から励起光αを照射する。蛍光γまたはプラズモン散乱光δの測定時には、励起光照射ユニット１１０は、金属膜３０に対する入射角がＳＰＲを生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０にＳＰＲが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。励起光照射ユニット１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。

光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。

光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。

ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。

ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。

温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。

角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１５２とを相対的に回転させる。

たとえば、角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。

前述のとおり、金属膜３０に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光δの光量が最大となる角度が増強角である。励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光γを測定することが可能となる。測定チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路４１内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４１内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。

光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

反射光検出ユニット１２０は、共鳴角の測定などを行うために、励起光照射ユニット１１０が測定チップ１０の金属膜３０に励起光αを照射したときに、金属膜３０（プリズム２０の成膜面２２）で反射した励起光α（反射光β）の光量を検出する。反射光検出ユニット１２０は、受光センサー１２１、角度調整機構１２２およびセンサー制御部１２３を含む。

受光センサー１２１は、反射光βが入射する位置に配置され、反射光βの光量を測定する。受光センサー１２１の種類は、特に限定されない。たとえば、受光センサー１２１は、フォトダイオード（ＰＤ）である。

角度調整機構１２２は、金属膜３０に対する励起光αの入射角に応じて、受光センサー１２１の位置（角度）を調整する。角度調整機構１２２は、反射光βが受光センサー１２１に入射するように、受光センサー１２１とチップホルダー１５２とを相対的に回転させる。

センサー制御部１２３は、受光センサー１２１の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１２１の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２１の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

蛍光検出ユニット１３０は、励起光照射ユニット１１０が測定チップ１０の金属膜３０に励起光αを照射したときに、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面の近傍から出射される光の光量を検出する。具体的には、蛍光検出ユニット１３０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じた蛍光γを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出ユニット１３０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光δも検出する。蛍光検出ユニット１３０は、受光ユニット１３１、位置切り替え機構１３２およびセンサー制御部１３３を含む。

受光ユニット１３１は、測定チップ１０の金属膜３０の法線方向に配置される。受光ユニット１３１は、第１レンズ１３４、光学フィルター１３５、第２レンズ１３６および受光センサー１３７を含む。

第１レンズ１３４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１３６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１３４で集光された光を受光センサー１３７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１３５は、両レンズの間に配置されている。

光学フィルター１３５は、蛍光成分のみを受光センサー１３７に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光γを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光δ）を除去する。光学フィルター１３５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１３５は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。

受光センサー１３７は、蛍光γおよびプラズモン散乱光δを検出する。受光センサー１３７は、微小量の被測定物質からの微弱な蛍光γを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１３７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。

位置切り替え機構１３２は、光学フィルター１３５の位置を、受光ユニット１３１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１３７が蛍光γを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路上に配置し、受光センサー１３７がプラズモン散乱光δを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。

センサー制御部１３３は、受光センサー１３７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１３７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１３７の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１３３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

送液ユニット１４０は、チップホルダー１５２に保持された測定チップ１０の流路４１内に、検体（血液の希釈液）や標識液、基準液、洗浄液などを供給する。送液ユニット１４０は、液体チップ１４１、シリンジポンプ１４２および送液ポンプ駆動機構１４３を含む。

液体チップ１４１は、検体（血液または血液の希釈液）や標識液、基準液、洗浄液などの液体を収容する容器である。液体チップ１４１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。

シリンジポンプ１４２は、シリンジ１４４と、シリンジ１４４内を往復動作可能なプランジャー１４５とによって構成される。プランジャー１４５の往復運動によって、液体の吸引および排出が定量的に行われる。シリンジ１４４が交換可能であると、シリンジ１４４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ１４４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ１４４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ１４４を交換せずに使用することが可能となる。

送液ポンプ駆動機構１４３は、プランジャー１４５の駆動装置、およびシリンジポンプ１４２の移動装置を含む。シリンジポンプ１４２の駆動装置は、プランジャー１４５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ１４２の送液量や送液速度を管理できるため、測定チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１４２を、シリンジ１４４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。

送液ユニット１４０は、液体チップ１４１より各種液体を吸引し、測定チップ１０の流路４１内に供給する。このとき、プランジャー１４５を動かすことで、測定チップ１０中の流路４１内を液体が往復し、流路４１内の液体が攪拌される。これにより、液体の濃度の均一化や、流路４１内における反応（例えば抗原抗体反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、測定チップ１０の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ１４４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、測定チップ１０およびシリンジ１４４が構成されていることが好ましい。

流路４１内の液体は、再びシリンジポンプ１４２で吸引され、液体チップ１４１などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応、洗浄などを実施し、流路４１内の反応場に、蛍光物質で標識された被測定物質を配置することができる。

搬送ユニット１５０は、測定チップ１０を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射ユニット１１０が測定チップ１０に励起光αを照射し、それに伴い発生する反射光β、蛍光γまたはプラズモン散乱光δを反射光検出ユニット１２０または蛍光検出ユニット１３０が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液ユニット１４０が測定チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または測定チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。搬送ユニット１５０は、搬送ステージ１５１およびチップホルダー１５２を含む。チップホルダー１５２は、搬送ステージ１５１に固定されており、測定チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１５２の形状は、測定チップ１０を保持することが可能であり、かつ励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１５２には、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ１５１は、チップホルダー１５２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１５１も、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１５１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。

制御部１６０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、角度調整機構１２２、センサー制御部１２３、位置切り替え機構１３２、センサー制御部１３３、送液ポンプ駆動機構１４３および搬送ステージ１５１を制御する。また、制御部１６０は、蛍光検出ユニット１３０（検出部）の検出結果から血液の希釈液中の被測定物質の量を示す第１のシグナル値を算出するとともに、算出した第１のシグナル値を血液の液体成分中の被測定物質の量を示す第２のシグナル値に変換する処理部としても機能する。この後説明するように、制御部１６０（処理部）は、第１のシグナル値に、血液の希釈液の血漿についての希釈率を考慮した変換係数ｃを掛けることで、第１のシグナル値を第２のシグナル値に変換する。制御部１６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作（本願発明の一実施の形態に係る測定方法）について説明する。図２は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。

まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１５２に測定チップ１０を設置する。また、測定チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に検体（血液の希釈液）に含まれる被測定物質を捕捉できるように、流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。

次いで、測定チップの金属膜３０の反応場上に血液の希釈液（検体）を提供して、血液の希釈液に含まれる被測定物質と捕捉体とを結合させる（１次反応；工程Ｓ２０）。ここで「希釈液」とは、血液を血液以外の液体で希釈した液体を意味する。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、測定チップ１０を送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、測定チップ１０の流路４１内の液体を除去するとともに、液体チップ１４１内の血液の希釈液を流路４１内に導入する。流路４１内では、抗原抗体反応によって、金属膜３０の反応場上に被測定物質が捕捉される。この後、流路４１内の血液の希釈液は除去され、流路内は洗浄液で洗浄される。

次いで、増強角を決定する（工程Ｓ３０）。具体的には、制御部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、測定チップ１０の流路４１内の洗浄液を測定用の基準液（例えば緩衝液）に置換する。次いで、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、測定チップ１０を測定位置に移動させる。この後、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０を操作して金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査しつつ、蛍光検出ユニット１３０を操作してプラズモン散乱光を検出する。このとき、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を操作して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。そして、制御部１６０は、プラズモン散乱光の光量が最大の時の励起光αの入射角を増強角として決定する。決定された増強角は、制御部１６０に記録される。

次いで、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ４０）。ここで「光学ブランク値」とは、蛍光γの測定（工程Ｓ６０）において測定チップ１０の上方に放出される背景光の光量を意味する。具体的には、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および蛍光検出ユニット１３０を操作して、金属膜３０に励起光αを照射するとともに、受光センサー１３７の出力値（光学ブランク値）を記録する。このとき、制御部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。測定された光学ブランク値は、制御部１６０に記録される。

次いで、金属膜３０の反応場上に捕捉されている被測定物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ５０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、測定チップ１０を送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ユニット１３０を操作して、測定チップ１０の流路４１内の基準液を除去し、蛍光物質で標識された捕捉体を含む液体（標識液）を導入する。流路４１内では、抗原抗体反応によって、金属膜３０上に捕捉されている被測定物質が蛍光物質で標識される。この後、流路４１内の標識液は除去され、流路内は洗浄液で洗浄される。

次いで、被測定物質と反応場の捕捉体とが結合しており、かつ反応場上に血液の希釈液が存在しない状態で、血液の希釈液中の被測定物質の量を示す第１のシグナル値を得る（工程Ｓ６０）。本実施の形態では、蛍光βの光量を測定して、血液の希釈液中の被測定物質の量を示す第１のシグナル値を得る。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、測定チップ１０を測定位置に移動させる。この後、制御部１６０は、励起光照射ユニット１１０および蛍光検出ユニット１３０を操作して、金属膜３０に励起光αを照射するとともに、受光センサー１３７の出力値を記録する。このとき、制御部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切り替え機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。制御部１６０は、検出値から光学ブランク値を引き、血液の希釈液中の被測定物質の量を示す第１のシグナル値を算出する。第１のシグナル値は、必要に応じて、被測定物質の量や濃度などに換算される。第１のシグナル値は、制御部１６０に記録される。

次いで、別途測定された血液のヘマトクリット値を用いて、工程Ｓ６０で測定された第１のシグナル値を、血液の液体成分中の被測定物質の量を示す第２のシグナル値に変換する（工程Ｓ７０）。具体的には、制御部１６０は、第１のシグナル値に、以下の式（１）で表される変換係数ｃを掛けることで、第１のシグナル値を第２のシグナル値に変換する。このとき、第１のシグナル値および第２のシグナル値は、蛍光βの光量であってもよいし、被測定物質の量や濃度などの換算値であってもよい。

（式（１）中、ｄｆは以下の式（２）で算出される血液の希釈液の血漿についての希釈率であり、Ｈｔは血液のヘマトクリット値である。）

（式（２）中、ａは血液の希釈液中の血液の量であり、Ｈｔは血液のヘマトクリット値であり、ｅは血液の希釈液中の血液以外の液体の量である。）

上記式（１）は、特許文献１に記載の変換係数の式と同じ式であるが、上記式（１）に含まれる希釈率ｄｆの内容が本願発明と特許文献１に記載の発明とで異なっている。

特許文献１に記載の発明では、ｄｆは、血液の希釈液の、血液についての希釈率（ａ＋ｅ／ａ）である。たとえば、血液７５μＬに生理食塩水７５μＬを添加して血液の希釈液（１５０μＬ）を調製した場合、特許文献１に記載の発明におけるｄｆは、血液のヘマトクリット値に関係なく２（倍）である。

一方、本願発明では、ｄｆは、上記式（２）で表されるように、血液の希釈液の、血液の液体成分（血漿）についての希釈率である。たとえば、ヘマトクリット値が５０％の血液７５μＬに生理食塩水７５μＬを添加して血液の希釈液（１５０μＬ）を調製した場合、本願発明におけるｄｆは、３（倍）である（この後説明する図３Ｂを参照）。

このように、本願発明では、希釈率ｄｆを、血液全体を基準とするのではなく、血液中の液体成分（血漿）を基準として規定している。このようにすることで、血液の希釈液中の被測定物質の量を示す第１のシグナル値から、希釈する前の血液中の被測定物質の量をより正確に算出することができる。このことについて、図３Ａおよび図３Ｂを用いて説明する。

図３Ａは、ヘマトクリット値が０％の血液２００に同量の生理食塩水２４０を添加して血液の希釈液２５０を調製した様子を示す模式図である。ヘマトクリット値が０％の血液は、被測定物質２２０を含む血漿２１０から構成される。この場合、血液の希釈液２５０中の被測定物質２２０の濃度は、希釈前の血液２００中の被測定物質２２０の濃度の半分となっている。

図３Ｂは、ヘマトクリット値が５０％の血液２００に同量の生理食塩水２４０を添加して血液の希釈液２５０を調製した様子を示す模式図である。ヘマトクリット値が５０％の血液は、被測定物質２２０を含む血漿２１０と、同体積の血球２３０（主として赤血球）とから構成される。この場合も、血液の希釈液２５０中の被測定物質２２０の濃度は、希釈前の血液２００中の被測定物質２２０の濃度の半分となっている。

図３Ａでも図３Ｂでも血液２００を２倍に希釈している点では同じであるが、図３Ａと図３Ｂとを比較すると、液体成分中の被測定物質の希釈率が異なっていることがわかる。すなわち、図３Ａに示す例では、液体成分が２倍になっていることから、希釈液２５０における液体成分中の被測定物質の希釈率は２倍である。一方、図３Ｂに示す例では、液体成分が３倍になっていることから、希釈液２５０における液体成分中の被測定物質の希釈率は３倍である。

このように、血液を同じように希釈した場合であっても、血液のヘマトクリット値が異なると、液体成分中の被測定物質の希釈率が変化してしまう。本願発明では、この点に着目して、上記式（１）に含まれる希釈率ｄｆを、上記式（２）で表される、血液の希釈液の、血液の液体成分（血漿）についての希釈率と規定している。このようにすることで、血液の希釈液中の被測定物質の量を示す第１のシグナル値から、希釈する前の血液中の被測定物質の量をより正確に算出することができる。参考のため、血液のヘマトクリット値と、血液の希釈率と、上記式（２）で算出される血漿の希釈率との関係を表１に示す。

なお、上記式（１）および式（２）を用いて第２のシグナル値を算出する際には、血液のヘマトクリット値Ｈｔを別途測定する必要がある。血液のヘマトクリット値の測定方法は、特に限定されず、ミクロヘマトクリット法やウィントローブ法、電気抵抗法、特許文献１に記載の方法など公知の方法から適宜選択されうる。

以上の手順により、血液の液体成分中の被測定物質の量を測定することができる。

なお、上記実施の形態では、ＳＰＦＳを利用する測定方法および測定装置について説明したが、本願発明に係る測定方法および測定装置は、ＳＰＦＳを利用する測定方法および測定装置に限定されない。たとえば、本願発明に係る測定方法および測定装置は、ＳＰＲ法を利用する測定方法および測定装置であってもよい。この場合、測定装置１００は、蛍光γの光量を測定せずに、第１のシグナル値として反射光βの光量を測定することで被測定物質を測定する。したがって、光学ブランク値の測定（工程Ｓ４０）および２次反応（工程Ｓ５０）は不要である。また、本願発明に係る測定方法および測定装置は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用せずに血液に含まれる被測定物質の量を測定してもよい。

以下、本願発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本願発明はこれらの実施例により限定されない。

［実験１］
ヘマトクリット値を２０％、４０％、６０％に調整し、かつ液体成分（血漿）中に所定の濃度で心筋トロポニンＩ（被測定物質）を含む血液、およびこれらの血液から分離した血漿を準備した。これらの血液および血漿にそれぞれ２倍量の生理食塩水を添加して、３倍希釈液を調製した。

図１に示されるＳＰＦＳ装置１００を用いて、血液の希釈液および血漿の希釈液中の心筋トロポニンＩの濃度を示す第１のシグナル値を測定した。血漿の希釈液から得られた第１のシグナル値については、血漿の希釈率（３倍）を掛けることで、第１のシグナル値を第２のシグナル値に変換した。血液の希釈液から得られた第１のシグナル値については、以下の式（１）で表される変換係数ｃを掛けることで、第１のシグナル値を第２のシグナル値に変換した。式（１）において、Ｈｔは、血液のヘマトクリット値である。ｄｆは、以下の式（２）で算出される希釈液の血漿についての希釈率（実施例）、または、以下の式（３）で算出される希釈液の血液についての希釈率（比較例、特許文献１参照）とした。

（式（１）中、ｄｆは以下の式（２）で算出される血液の希釈液の血漿についての希釈率であり、Ｈｔは血液のヘマトクリット値である。）

（式（２）中、ａは希釈液中の血液の量であり、Ｈｔは血液のヘマトクリット値であり、ｅは希釈液中の血液以外の液体の量である。）

（式（３）中、ａは希釈液中の血液の量であり、ｅは希釈液中の血液以外の液体の量である。）

図４Ａおよび図４Ｂは、血漿の希釈液を測定して得られた第２のシグナル（横軸）と、その血漿の元となる血液の希釈液を測定して得られた第２のシグナル（縦軸）との関係を示すグラフである。これらのグラフでは、ヘマトクリット値が２０％の血液（およびそれから得られた血漿）の結果の近似直線、ヘマトクリット値が４０％の血液（およびそれから得られた血漿）の結果の近似直線、ヘマトクリット値が６０％の血液（およびそれから得られた血漿）の結果の近似直線も示している。各点について見てみると、横軸の値も縦軸の値も同じ血液の同じ血漿中の心筋トロポニンＩの濃度を示していることから、本来は同じ値となり、近似直線の傾きは１となるはずである。

図４Ａは、ｄｆとして上記式（３）で算出される希釈液の血液についての希釈率を用いた場合（比較例、特許文献１参照）の結果を示すグラフである。なお、図４Ａ中、ヘマトクリット値２０％を黒い四角形（■）で、ヘマトクリット値４０％を黒い三角形（▲）で、ヘマトクリット値６０％を黒い丸（●）で示している。このグラフに示されるように、ヘマトクリット値が２０％および４０％の血液については、従来（特許文献１に記載）の計算式で算出された変換係数ｃを用いて補正をすることで、血液の希釈液を測定して得られた第２のシグナル（縦軸の値）を実際の値（横軸の値）とほぼ同じ値にすることができた（近似直線の傾きがほぼ１．０となっている）。しかしながら、ヘマトクリット値が６０％の血液については、血液の希釈液を測定して得られた第２のシグナル（縦軸の値）が実際の値（横軸の値）から大きくずれてしまった（近似直線の傾きが０．６となっている）。これは、ヘマトクリット値が大きい場合は、血液を希釈したときの、血液の希釈率と血液の液体成分の希釈率との差が大きくなるためと考えられる。

図４Ｂは、ｄｆとして上記式（２）で算出される希釈液の血液の液体成分についての希釈率を用いた場合（実施例）の結果を示すグラフである。なお、図４Ｂ中、ヘマトクリット値２０％の結果を白い四角形（□）で、ヘマトクリット値４０％の結果を黒い三角形（▲）で、ヘマトクリット値６０％の結果を黒い丸（●）で示している。このグラフに示されるように、上記式（２）で表される希釈率ｄｆを用いた上記式（１）で算出される変換係数ｃを用いて補正をすることで、ヘマトクリット値に関係なく、血液の希釈液を測定して得られた第２のシグナル（縦軸の値）を実際の値（横軸の値）とほぼ同じ値にすることができた（近似直線の傾きがほぼ１．０となっている）。

以上の結果から、上記式（２）の希釈率を上記式（１）に組み込むことにより、血液のヘマトクリット値の影響を受けることなく、血液の液体成分中の被測定物質の量を正確に測定できることがわかった。

［実験２］
ヘマトクリット値を６０％に調整し、かつ液体成分（血漿）中に所定の濃度で心筋トロポニンＩ（被測定物質）を含む血液、およびこれらの血液から分離した血漿を準備した。これらの血液および血漿にそれぞれ同量の生理食塩水を添加して、２倍希釈液を調製した。

実験１と同様に、図１に示されるＳＰＦＳ装置１００を用いて、血液の希釈液および血漿の希釈液中の心筋トロポニンＩの濃度を示す第１のシグナル値を測定した。血漿の希釈液から得られた第１のシグナル値については、血漿の希釈率（２倍）を掛けることで、第１のシグナル値を第２のシグナル値に変換した。血液の希釈液から得られた第１のシグナル値については、以下の式（１）で表される変換係数ｃを掛けることで、第１のシグナル値を第２のシグナル値に変換した。式（１）において、Ｈｔは、血液のヘマトクリット値である。ｄｆは、以下の式（２）で算出される希釈液の血漿についての希釈率（実施例）、または、以下の式（３）で算出される希釈液の血液についての希釈率（比較例、特許文献１参照）とした。また、第２のシグナル値から、血漿中の心筋トロポニンＩの濃度を算出した。

（式（１）中、ｄｆは以下の式（２）で算出される血液の希釈液の血漿についての希釈率であり、Ｈｔは血液のヘマトクリット値である。）

（式（２）中、ａは希釈液中の血液の量であり、Ｈｔは血液のヘマトクリット値であり、ｅは希釈液中の血液以外の液体の量である。）

（式（３）中、ａは希釈液中の血液の量であり、ｅは希釈液中の血液以外の液体の量である。）

図５Ａは、血漿の希釈液を測定して得られた心筋トロポニンＩの濃度（横軸）と、その血漿の元となる血液の希釈液を測定して得られた心筋トロポニンＩの濃度（縦軸）との関係を示すグラフである。なお、図５Ａ中、従来（特許文献１に記載）の計算式で算出された変換係数ｃを用いて補正した結果を黒い丸（●）で、本願発明の計算式で算出された変換係数ｃを用いて補正した結果を白い三角形（△）で示している。また、このグラフでは、従来の計算式で算出された変換係数ｃを用いて補正した結果の近似直線を点線で、本願発明の計算式で算出された変換係数ｃを用いて補正した結果の近似直線を一点鎖線で示している。このグラフから、従来の計算式で算出された変換係数ｃを用いた場合（近似直線の傾き：１．２０、相関係数Ｒ：０．９９６）よりも、本願発明の計算式で算出された変換係数ｃを用いた場合（近似直線の傾き：１．０５、相関係数Ｒ：０．９９９）の方が、血液の希釈液を測定して得られた心筋トロポニンＩの濃度（縦軸の値）を実際の値（横軸の値）とほぼ同じ値にできることがわかる。

図５Ｂは、血漿の希釈液を測定して得られた心筋トロポニンＩの濃度（横軸）と、その値の実際の値からの乖離度（縦軸）との関係を示すグラフである。なお、図５Ｂ中、従来（特許文献１に記載）の計算式で算出された変換係数ｃを用いて補正した結果を黒い丸（●）で、本願発明の計算式で算出された変換係数ｃを用いて補正した結果を白い三角形（△）で示している。また、このグラフでは、従来の計算式で算出された変換係数ｃを用いて補正した結果の乖離度の平均値を点線で、本願発明の計算式で算出された変換係数ｃを用いて補正した結果の乖離度の平均値を一点鎖線で示している。このグラフからも、従来の計算式で算出された変換係数ｃを用いた場合（乖離度の平均値：１４．８％）よりも、本願発明の計算式で算出された変換係数ｃを用いた場合（乖離度の平均値：２．７％）の方が、血液の希釈液を測定して得られた心筋トロポニンＩの濃度（縦軸の値）を実際の値（横軸の値）とほぼ同じ値にできることがわかる。

以上の結果から、上記式（２）の希釈率を上記式（１）に組み込むことにより、血液中の被測定物質を高い信頼性で測定できることがわかった。

本出願は、２０１９年５月３１日出願の特願２０１９－１０２８９２に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本願発明に係る測定方法および測定装置は、血液中の被測定物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば、臨床検査などに有用である。

１０ 測定チップ
２０ プリズム
２１ 入射面
２２ 成膜面
２３ 出射面
３０ 金属膜
４０ 流路蓋
４１ 流路
１００ ＳＰＦＳ装置
１１０ 励起光照射ユニット
１１１ 光源ユニット
１１２ 角度調整機構
１１３ 光源制御部
１２０ 反射光検出ユニット
１２１ 受光センサー
１２２ 角度調整機構
１２３ センサー制御部
１３０ 蛍光検出ユニット
１３１ 受光ユニット
１３２ 位置切り替え機構
１３３ センサー制御部
１３４ 第１レンズ
１３５ 光学フィルター
１３６ 第２レンズ
１３７ 受光センサー
１４０ 送液ユニット
１４１ 液体チップ
１４２ シリンジポンプ
１４３ 送液ポンプ駆動機構
１４４ シリンジ
１４５ プランジャー
１５０ 搬送ユニット
１５１ 搬送ステージ
１５２ チップホルダー
１６０ 制御部
２００ 血液
２１０ 血漿
２２０ 被測定物質
２３０ 血球
２４０ 生理食塩水
２５０ 血液の希釈液
α 励起光
β 反射光
γ 蛍光
δ プラズモン散乱光

Claims (4)

1. 血液の液体成分中の被測定物質の量を測定する方法であって、
   捕捉体が固定化された反応場を有する測定チップの前記反応場上に血液の希釈液を提供して、前記希釈液に含まれる被測定物質と前記捕捉体とを結合させる工程と、
   前記被測定物質と前記捕捉体とが結合しており、かつ前記反応場上に前記希釈液が存在しない状態で、前記希釈液中の前記被測定物質の量を示す第１のシグナル値を得る工程と、
   前記第１のシグナル値を前記血液の液体成分中の前記被測定物質の量を示す第２のシグナル値に変換する工程と、
   を含み、
   前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換する工程では、前記第１のシグナル値に、以下の式（１）で表される変換係数ｃを掛けることで、前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換する、
   測定方法。
   

   

   （式（１）中、ｄｆは以下の式（２）で算出される前記希釈液の血漿についての希釈率であり、Ｈｔは前記血液のヘマトクリット値である。）
   

   

   （式（２）中、ａは前記希釈液中の前記血液の量であり、Ｈｔは前記血液のヘマトクリット値であり、ｅは前記希釈液中の前記血液以外の液体の量である。）
2. 前記測定チップは、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された前記捕捉体とを有し、
   前記第１のシグナル値を得る工程では、前記金属膜の前記捕捉体が固定化されている領域である前記反応場において前記被測定物質と前記捕捉体とが結合しており、かつ前記反応場上に前記希釈液が存在しない状態で、前記プリズム側から前記金属膜に励起光を照射して、前記金属膜の前記プリズムと対向しない面の近傍から出射される蛍光の光量、または前記成膜面で反射した励起光の光量を測定する、
   請求項１に記載の測定方法。
3. 血液の液体成分中の被測定物質の量を測定する装置であって、
   捕捉体が固定化された反応場を有する測定チップを保持するためのホルダーと、
   前記ホルダーに保持された前記測定チップにおける、前記測定チップの前記反応場上に提供された血液の希釈液中に含まれる被測定物質と前記捕捉体との結合に起因する光学的変化を検出する検出部と、
   前記検出部の検出結果から前記血液の希釈液中の前記被測定物質の量を示す第１のシグナル値を算出するとともに、前記第１のシグナル値を前記血液の液体成分中の前記被測定物質の量を示す第２のシグナル値に変換する処理部と、
   を有し、
   前記処理部は、前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換する際に、前記第１のシグナル値に、以下の式（１）で表される変換係数ｃを掛けることで、前記第１のシグナル値を前記第２のシグナル値に変換する、
   測定装置。
   

   

   （式（１）中、ｄｆは以下の式（２）で算出される前記希釈液の血漿についての希釈率であり、Ｈｔは前記血液のヘマトクリット値である。）
   

   

   （式（２）中、ａは前記希釈液中の前記血液の量であり、Ｈｔは前記血液のヘマトクリット値であり、ｅは前記希釈液中の前記血液以外の液体の量である。）
4. 前記測定チップは、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された前記捕捉体とを有し、
   前記検出部は、前記ホルダーに保持された前記測定チップの前記金属膜に前記プリズム側から励起光を照射する励起光照射部と、
   前記励起光照射部が前記金属膜に励起光を照射したときに、前記金属膜の前記プリズムと対向しない面の近傍から出射される光の光量、または前記プリズムの成膜面で反射した励起光の光量を検出する光検出部と、
   を有する、
   請求項３に記載の測定装置。

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