JP6634784B2 - 測定方法および測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、検体中の被測定物質を測定する測定方法および測定装置に関する。

臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被測定物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。そこで、微量の被測定物質を高感度かつ定量的に測定するための測定方法および測定装置が求められている。また、検体における被測定物質について、低濃度から高濃度に亘る広い濃度範囲で検出可能な測定方法および測定装置も求められている。

被測定物質を高感度かつ定量的に検出できる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている（例えば、特許文献１参照）。

特許文献１に記載の測定方法および測定装置では、プリズムと、プリズムの所定の面上に配置されている金属膜と、金属膜上に固定化されており、被測定物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば１次抗体）と、を有する測定チップが使用される。そして、金属膜上に被測定物質を含む検体を提供すると、被測定物質は捕捉体に結合する（１次反応）。次いで、蛍光物質で標識された別の捕捉体（例えば２次抗体）を金属膜上に提供すると、捕捉体に結合した被測定物質は蛍光物質で標識される（２次反応）。この状態でプリズムを介して金属膜に励起光を照射すると、被測定物質を標識する蛍光物質は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により増強された電場（局在場光）によって励起され、蛍光を放出する。ＳＰＦＳでは、放出された蛍光を検出することで、被測定物質の存在またはその量を測定することができる。ＳＰＦＳでは、金属膜の表面近傍に存在する蛍光物質のみを選択的に励起することができ、測定チップの内部全体を励起する一般的な測定方法および測定装置よりもバックグラウンドノイズを小さくすることができるため、より正確に被測定物質を測定することができる。

国際公開第２０１２／１７２９８７号

一般的に、検体に低濃度で含まれる被測定物質を高感度に測定し、かつ広い濃度範囲で被測定物質の測定を可能とする観点から、照射する励起光の光量を多くして、放出される蛍光の光量を多くする方法と、検出した蛍光の蛍光信号を、ゲインアンプにより異なる大きさの複数のゲインで増幅する方法との組み合わせが採用されている。しかしながら、最適な大きさのゲインに設定するためには、本測定の前にあらかじめ、それぞれの大きさのゲインについてプレ測定を行っておかなければならない。また、複数のゲインアンプを互いに切替えた後は、出力値が安定するのを待つ必要がある。これらの結果として、プレ測定工程の測定時間が長くなるという問題がある。また、このような問題は、ゲインアンプの数が増えるほど、一層顕在化してしまう。蛍光物質は、励起光が照射されるほど褪色してしまうため、上記のようにプレ測定工程の測定時間が長くなると、プレ測定工程において蛍光物質が褪色してしまい、本測定工程において検出される蛍光の光量が少なくなってしまう。

以上のように、プレ測定工程において蛍光信号を複数のゲインで増幅する従来の測定方法には、ゲイン判定のための励起光の照射による蛍光物質の褪色に起因して、被測定物質を高精度に測定できないという問題がある。

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、ゲイン判定のための励起光の照射による蛍光物質の褪色を抑制することができる測定方法および測定装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定方法は、被測定物質を標識している蛍光物質から放出される蛍光の光量を測定することにより、前記被測定物質を測定する測定方法であって、前記蛍光物質で標識されている前記被測定物質が測定チップの捕捉体に捕捉されている状態で、前記測定チップに第１の光量で励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出し、検出された蛍光の光量を示す蛍光信号を、ゲインアンプにより複数のゲインでそれぞれ増幅して、複数の増幅値を得るプレ測定工程と、蛍光信号を増幅するためのゲインの大きさを設定するゲイン設定工程と、前記蛍光物質で標識されている前記被測定物質が前記捕捉体に捕捉されている状態で、前記第１の光量よりも多い第２の光量で、前記測定チップに励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出し、検出された蛍光の光量を示す蛍光信号を、ゲインアンプにより前記ゲイン設定工程で設定された大きさのゲインで増幅して、増幅値を得る本測定工程と、を含み、前記ゲイン設定工程では、前記第１の光量および前記第２の光量の光量差と、前記複数の増幅値とに基づいて、ゲインの大きさを設定する。

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定装置は、被測定物質を標識している蛍光物質から放出される蛍光の光量を測定することにより、前記被測定物質を測定する測定装置であって、前記被測定物質を捕捉するための捕捉体を含む測定チップを着脱可能に保持するためのチップホルダーと、前記チップホルダーに保持されている前記測定チップに、第１の光量で、または前記第１の光量より多い第２の光量で励起光を照射する励起光照射部と、前記捕捉体に捕捉されている前記被測定物質を標識している蛍光物質から放出された蛍光を検出し、検出した蛍光の光量を示す蛍光信号を出力する蛍光検出部と、互いにゲインの大きさが異なる複数のゲインアンプ、またはゲインの大きさを調整可能なゲインアンプを含み、前記励起光照射部が励起光を照射したときに、前記蛍光検出部が検出した蛍光の光量を示す蛍光信号を増幅する増幅部と、前記蛍光信号を増幅するための前記ゲインアンプのゲインの大きさを設定する制御処理部と、を有し、前記制御処理部は、前記励起光照射部が前記第１の光量で励起光を出射したときに、前記蛍光検出部が出力した蛍光信号を、前記増幅部が増幅することで得られる複数の増幅値を取得し、前記第１の光量および前記第２の光量の光量差と、前記複数の増幅値とに基づいて、前記励起光照射部が前記第２の光量で励起光を出射したときにおける前記増幅部のゲインの大きさを設定し、前記励起光照射部が前記第２の光量で励起光を出射したときに、前記蛍光検出部が出力した蛍光信号を、前記制御処理部が設定した大きさのゲインで前記増幅部が増幅することで得られる増幅値を取得する。

本発明によれば、ゲイン判定のための励起光の照射による蛍光物質の褪色を抑制しつつ、最適なゲインのアンプを選択することができる。このため、本発明によれば、被測定物質を広い濃度範囲で高精度に測定することができる。

図１は、本発明の実施の形態に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。 図２は、本発明の実施の形態に係るＳＰＦＳ装置の増幅部の構成の一例を示す回路図である。 図３は、ＬＰＦと蛍光信号の立ち上がり時間との関係を示すグラフである。 図４は、本発明の実施の形態に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図５は、図４に示される入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２０）内の工程を示すフローチャートである。 図６は、図４に示される光学ブランク値の測定工程（工程Ｓ１３０）内の工程を示すフローチャートである。 図７は、図４に示される蛍光値の測定工程（工程Ｓ１６０）内の工程を示すフローチャートである。 図８Ａは、励起光の照射時間と、蛍光物質から放出される蛍光の相対蛍光強度との関係を示すグラフであり、図８Ｂは、励起光の照射時間と、蛍光信号の出力値との関係を示すグラフである。 図９は、本発明の実施の形態に係る測定方法と、従来の測定方法とを比較するためのグラフである。 図１０Ａ、Ｂは、本発明の実施の形態に係る測定方法の変形例を説明するためのグラフである。

以下、本発明の一実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る測定装置の代表例として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）を利用した測定装置（ＳＰＦＳ装置）について説明する。

［ＳＰＦＳ装置および測定チップの構成］
図１は、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射部１１０、光検出部（蛍光検出部）１２０、送液部１３０、搬送部１４０および制御処理部１５０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、搬送部１４０のチップホルダー（ホルダー）１４２に測定チップを装着した状態で使用される。そこで、先に測定チップについて説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００について説明する。

（測定チップ）
測定チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２上に配置された金属膜３０と、金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。測定チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないようなより小型の構造物、またはより大型の構造物であってもよい。

プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射部１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面で反射されて反射光（不図示）となる。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射されて反射光となる。出射面２３は、反射光をプリズム２０の外部に出射させる。

プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。

入射面２１は、励起光αが励起光照射部１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。

ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される反射光の光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、測定チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）γの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。

なお、測定チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に捕捉された被測定物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。

プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０を構成する樹脂の例には、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、およびシクロオレフィン系ポリマーが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。

金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。本実施の形態では、金属膜３０は、成膜面２２の全面に形成されている。

金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウム、およびこれらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。

流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。本実施の形態では、流路蓋４０は、金属膜３０の上に配置されている。金属膜３０上に流路蓋４０を配置することで液体を収容するための収容部（微小空間）が形成される。収容部の形状や大きさなどは、液体を収容することができれば特に限定されない。たとえば、収容部は、液体を収容するウェルであってもよいし、液体が連続して供給される流路であってもよい。本実施の形態では、収容部は、液体が流れる流路４１である。流路蓋４０の裏面には、流路溝が形成されており、金属膜３０（およびプリズム２０）上に流路蓋４０が配置されることで、流路４１が形成されている。流路４１の底面には、金属膜３０が配置されている。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。

流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される光（蛍光βおよびプラズモン散乱光γ）に対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、ガラスおよび樹脂が含まれる。これらの光に対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。

図１に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（ＳＰＲが生じる角度）で入射する。このように金属膜３０に対して励起光αをＳＰＲが生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被測定物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光βの光量（強度）を検出することで、被測定物質の存在または量を測定することができる。

（ＳＰＦＳ装置）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射部１１０、光検出部（蛍光検出部）１２０、送液部１３０、搬送部１４０および制御処理部１５０を有する。

励起光照射部１１０は、チップホルダー１４２に保持されている測定チップ１０に、第１の光量または第２の光量で励起光αを照射する。詳細については後述するが、第２の光量は、第１の光量より多い。蛍光βの検出時には、励起光照射部１１０は、金属膜３０でＳＰＲが発生するように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接もしくは間接に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。励起光照射部１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。

光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の光を、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。

光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオードや水銀灯などのレーザー光源が含まれる。光源から出射される励起光αがビームでない場合は、励起光αは、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される励起光αが単色光でない場合は、励起光αは、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される励起光αが直線偏光でない場合は、励起光αは、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。

ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。

コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。

バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源から出射された励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。

直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。

半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように光の偏光方向を調整する。

スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、光源から出射された励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。

ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。

温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源から出射された励起光αの波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源から出射された励起光αの波長およびエネルギーを一定に制御する。

角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する、光源から出射された励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で光を照射するために、光源から出射された励起光αの光軸とチップホルダー１４２とを相対的に回転させる。

たとえば、角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を光源から出射された励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。特に、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの光源から出射された励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。

前述のとおり、金属膜３０に対する光源から出射された励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光γの光量が最大となる角度が増強角である。光源から出射された励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出することが可能となる。プリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路４１内の液体の屈折率などにより、光源から出射された励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４１内の捕捉体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。

光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

光検出部１２０は、励起光照射部１１０が金属膜３０へ光を照射することにより測定チップ１０から放出される光（蛍光βまたはプラズモン散乱光γ）を検出し、検出した光の光量を示す信号を出力する。光検出部１２０は、受光光学系ユニット１２１、位置切替え機構１２２および増幅部１２７を含む。

受光光学系ユニット１２１は、測定チップ１０の金属膜３０の法線方向に配置される。受光光学系ユニット１２１は、第１レンズ１２３、光学フィルター１２４、第２レンズ１２５および受光センサー１２６を含む。

第１レンズ１２３は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１２５は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１２３で集光された光を受光センサー１２６の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。

光学フィルター１２４は、第１レンズ１２３および第２レンズ１２５の間に配置されている。光学フィルター１２４は、蛍光検出時においては、光学フィルター１２４に入射する光のうち、蛍光成分のみを透過させ、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。これにより、蛍光成分のみを受光センサー１２６に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光βを検出することができる。光学フィルター１２４の種類の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１２４の例には、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルターと、所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターとが含まれる。

受光センサー１２６は、蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出する。受光センサー１２６は、微量の被測定物質からの微弱な蛍光βを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１２６は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、シリコンフォトダイオード（ＳｉＰＤ）などである。

位置切替え機構１２２は、光学フィルター１２４の位置を、受光光学系ユニット１２１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１２６が蛍光βを検出する時には、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路上に配置し、受光センサー１２６がプラズモン散乱光γを検出する時には、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路外に配置する。

増幅部１２７は、受光センサー１２６が検出した光（蛍光βまたはプラズモン散乱光γ）の光量を示す信号（例えば、蛍光信号）を増幅する。増幅部１２７は、受光センサー１２６と制御処理部１５０（ＣＰＵ）との間に配置されている。

図２は、本実施の形態に係る増幅部１２７の構成の一例を説明するための回路図である。図２に示されるように、増幅部１２７は、Ｉ／Ｖ変換回路１２７１、アンプ回路１２７２およびＡ／Ｄ変換回路１２７４を含む。

Ｉ／Ｖ変換回路１２７１は、受光センサー１２６からの信号（電流値）を電圧値に変換する。本実施の形態では、Ｉ／Ｖ変換回路１２７１は、カットオフ周波数ｆ_ｃが１６Ｈｚのローパスフィルタ（ＬＰＦ）を含む。ＬＰＦは、必須の構成要素ではないが、信号に含まれるノイズを除去する観点からは、Ｉ／Ｖ変換回路１２７１は、ＬＰＦを含むことが好ましい。

アンプ回路１２７２は、電圧値に変換された信号を増幅させる。アンプ回路１２７２は、互いにゲイン（増幅率）の大きさが異なる複数のゲインアンプ、またはゲインの大きさを調整可能なゲインアンプを含む。本実施の形態では、アンプ回路１２７２は、互いにゲインの大きさが異なる複数のゲインアンプを含む。ゲインの大きさは特に限定されず、ゲインの大きさの例には、１倍、１０倍、１００倍、１０００倍、０．１倍および０．０１倍が含まれる。本実施の形態では、ゲインアンプの数は４つであり、ゲインが１倍のゲインアンプと、ゲインが１０倍のゲインアンプと、ゲインが１００倍のゲインアンプと、ゲインが１０００倍のゲインアンプとが並列に配置されている（図２参照）。また、４つのゲインアンプは、スイッチ１２７３で切替え可能に構成されている。

本実施の形態では、アンプ回路１２７２は、カットオフ波長ｆ_ｃが１６ＨｚであるＬＰＦを含み、ゲインが１倍、１０倍または１００倍のゲインアンプは、カットオフ波長ｆ_ｃが１．７ｋＨｚであるＬＰＦを含み、ゲインが１０００倍のゲインアンプは、カットオフ波長ｆ_ｃが１７０ＨｚであるＬＰＦを含む。ＬＰＦは、必須の構成要素ではないが、信号に含まれるノイズを除去する観点からは、アンプ回路１２７２は、ＬＰＦを有することが好ましい。

Ａ／Ｄ変換回路１２７４は、アンプ回路１２７２で増幅された蛍光信号をアナログ値からデジタル値に変換して制御処理部１５０（ＣＰＵ）に入力する。

前述のとおり、Ｉ／Ｖ変換回路１２７１およびアンプ回路１２７２には、ＬＰＦがそれぞれ含まれる。これにより、信号に含まれるノイズの振幅を減衰させて、信号中のノイズを除去することができる。本実施の形態では、受光センサー１２６の受光光量に因るものの、制御処理部１５０に出力される出力値のバラツキを約０．６％程度（１％以下）に抑えることができる。

送液部１３０は、チップホルダー１４２に保持された測定チップ１０の流路４１内に、検体や標識液、洗浄液などを供給する。送液部１３０は、液体チップ１３１、シリンジポンプ１３２および送液ポンプ駆動機構１３３を含む。

液体チップ１３１は、検体や標識液、洗浄液などの液体を収容する容器である。液体チップ１３１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。

液体チップ１３１に収容される液体の例には、被測定物質を含む検体（例えば、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液など）や、蛍光物質で標識された捕捉体を含む標識液、洗浄液（緩衝液）などが含まれる。

シリンジポンプ１３２は、シリンジ１３４と、シリンジ１３４内を往復動作可能なプランジャー１３５とによって構成される。プランジャー１３５の往復運動によって、液体の吸引および吐出が定量的に行われる。シリンジ１３４が交換可能であると、シリンジ１３４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ１３４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ１３４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ１３４を交換せずに使用することが可能となる。

送液ポンプ駆動機構１３３は、プランジャー１３５の駆動装置、およびシリンジポンプ１３２の移動装置を含む。

シリンジポンプ１３２の駆動装置は、プランジャー１３５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ１３２の送液量や送液速度を管理できるため、測定チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。

シリンジポンプ１３２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１３２を、シリンジ１３４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ１３２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。

送液部１３０は、液体チップ１３１より各種液体を吸引し、測定チップ１０の流路４１内に供給する。このとき、プランジャー１３５を動かすことで、流路４１内を液体が往復し、流路４１内の液体が撹拌される。これにより、液体の濃度分布の均一化や、流路４１内における反応（例えば、１次反応および２次反応）を促進することができる。このような操作を行う観点から、測定チップ１０の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ１３４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、測定チップ１０およびシリンジ１３４が構成されていることが好ましい。

流路４１内の液体は、再びシリンジポンプ１３２で吸引され、液体チップ１３１などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応、洗浄などを実施し、流路４１内に、蛍光物質で標識された被測定物質を配置することができる。

搬送部１４０は、測定チップ１０を設置位置、測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「設置位置」とは、測定チップ１０をＳＰＦＳ装置１００に設置するための位置である。また、「測定位置」とは、励起光照射部１１０が測定チップ１０に光を照射したときに測定チップ１０から放出される蛍光βまたはプラズモン散乱光γを光検出部１２０が検出する位置である。さらに、「送液位置」とは、送液部１３０が測定チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または測定チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。

搬送部１４０は、搬送ステージ１４１およびチップホルダー１４２を含む。

チップホルダー１４２は、搬送ステージ１４１に固定されており、測定チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１４２の形状は、測定チップ１０を保持することができ、かつ励起光αや反射光、蛍光β、プラズモン散乱光γなどの光の光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１４２には、励起光αや反射光、蛍光β、プラズモン散乱光γなどの光が通過するための開口が設けられている。

搬送ステージ１４１は、チップホルダー１４２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１４１も、励起光αや反射光、蛍光β、プラズモン散乱光γなどの光の光路を妨げない形状である。搬送ステージ１４１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。

制御処理部１５０は、特に図示しないが、後述のセンサー制御部を含む。制御処理部１５０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、位置切替え機構１２２、センサー制御部、送液ポンプ駆動機構１３３、搬送ステージ１４１およびスイッチ１２７３を制御する。制御処理部１５０は、スイッチ１２７３を操作して、光検出部１２０から出力された信号を増幅するための増幅部１２７（ゲインアンプ）のゲインの大きさを設定する。制御処理部１５０は、光検出部１２０（受光センサー１２６）の検出結果を処理する処理部としても機能する。このとき、制御処理部１５０は、増幅部１２７が増幅することで得られる複数の増幅値を取得する。制御処理部１５０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

センサー制御部は、前述の受光センサー１２６の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１２６の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２６の感度の変更、信号の安定化時間の変更（後述）、信号の平均化時間の変更（後述）などを制御する。センサー制御部は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

（信号の立ち上がり時間）
前述のとおり、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、増幅部１２７は、複数のＬＰＦを有する。一般的に、信号の立ち上がりは、信号が回路内のＬＰＦを通過するほど遅くなる。そこで、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００における信号の立ち上がり（安定化）について計算を行った。

図３は、ＬＰＦと信号の立ち上がり時間との関係を示すグラフである。図３において、実線は、図２のＡ点における信号の電圧−時間曲線であり、破線は、図２のＢ点における信号の電圧−時間曲線であり、一点鎖線は、図２のＣ点における信号の電圧−時間曲線である。Ａ点は、Ｉ／Ｖ変換回路内のＬＰＦ（ｆ_ｃ＝１６Ｈｚ）を通過した地点であり、Ｂ点は、さらにアンプ回路１５２内のＬＰＦ（ｆ_ｃ＝１６Ｈｚ）を通過した地点であり、Ｃ点は、さらにアンプ回路１５２内のゲインアンプ部分（１倍のゲインアンプ）のＬＰＦ（ｆ_ｃ＝１．７ｋＨｚ）を通過した地点である。なお、図３では、入力電圧が５Ｖのときの電圧−時間曲線を示している。

図３に示されるように、信号がＡ点、Ｂ点およびＣ点の順に通過するにつれて、信号の立ち上がりが遅くなることがわかる。しかしながら、最も立ち上がりの遅いＣ点であっても、約０．０７秒で信号がほぼ立ち上がる（安定化する）ことがわかる。すなわち、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、０．０７秒以上経過すれば信号を安定化できることがわかる。この結果から、誤差などを考慮しても、０．１秒あれば信号を十分に安定化できると考えられる。

（ＳＰＦＳ装置の動作手順）
次に、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００の動作手順（本発明の実施の形態に係る測定方法）について説明する。図４は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。図５は、図４に示される入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２０）内の工程を示すフローチャートである。図６は、図４に示される光学ブランク値の測定工程（工程Ｓ１３０）内の工程を示すフローチャートである。図７は、図４に示される蛍光値の測定工程（工程Ｓ１６０）内の工程を示すフローチャートである。

まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００の設置位置に配置されたチップホルダー１４２に、測定チップ１０を設置する。また、測定チップ１０の金属膜３０上に保存試薬が存在する場合は、捕捉体が適切に被測定物質を捕捉できるように、金属膜３０上を洗浄して保存試薬を除去する。

次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する（工程Ｓ１２０）。

図５に示されるように、この工程では、まず、測定チップ１０に第１の光量で励起光αを照射するとともに、測定チップ１０から放出されたプラズモン散乱光γを検出し、検出されたプラズモン散乱光γの光量を示す光信号を、ゲインアンプにより増幅して、増幅値を得る（第１プレ測定工程；工程Ｓ１２１）。ゲインの大きさは、プラズモン散乱光γの光量に応じて適宜設定される。本実施の形態では、ゲインの大きさは、１０倍および１倍の２種類である。

具体的には、制御処理部１５０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を設置位置から測定位置に移動させる。この後、制御処理部１５０は、光源制御部１１３を制御して、光源ユニット１１１から第１の光量で励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に所定の角度で照射する。このとき、制御処理部１５０は、位置切替え機構１２２を制御して、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路外に移動させる。制御処理部１５０は、スイッチ１２７３を操作して、ゲインが１０倍のゲインアンプに切替える。これとともに、制御処理部１５０は、センサー制御部を制御して、受光センサー１２６でプラズモン散乱光γを検出し、検出されたプラズモン散乱光γの光量を示す光信号を、ゲインアンプにより増幅して、増幅値を得る。第１プレ測定工程（工程Ｓ１２１）では、プラズモン散乱光γの検出は、励起光αの入射角度を、ある特定の１つの角度（例えば、６５°）に固定して行われる。１つの入射角のみについて検出を行うことで、第１プレ測定工程（工程Ｓ１２１）の測定時間を短縮することができる。

次いで、制御処理部１５０は、スイッチ１２７３を操作して、ゲインが１倍のゲインアンプに切替え、上記操作と同様の操作を繰り返して、ゲインが１倍のときの増幅値を得る。

なお、第１プレ測定工程（工程Ｓ１２１）で光源ユニット１１１から照射される励起光αの第１の光量は、後述の第１本測定工程（工程Ｓ１２３）で、光源ユニット１１１から照射される励起光αの光量（第２の光量）よりも少ない。

次いで、後述の第１本測定工程（工程Ｓ１２３）において光信号を増幅するためのゲインの大きさに設定する（第１ゲイン設定工程；工程Ｓ１２２）。具体的には、制御処理部１５０は、第１の光量および第２の光量の光量差と、工程Ｓ１２１で得られた２つの増幅値とに基づいて、後述の第１本測定工程（工程Ｓ１２３）において、光信号を増幅するためのゲインの大きさを決定する。第１の光量および第２の光量の光量差に起因して検出されるプラズモン散乱光γの出力値が増加するが、制御処理部１５０は、この出力値の増加分も考慮して、出力値が飽和することがないようにゲインの大きさを決定する。励起光αの光量と、プラズモン散乱光γの光量とは、比例関係にあるため、例えば、第２の光量が第１の光量の６倍である場合、第１本測定工程（工程Ｓ１２３）で得られる出力値の、第１の光量および第２の光量の光量差に起因して増加した出力値は、第１プレ測定工程（工程Ｓ１２１）で得られる出力値の６倍であると計算することができる。次いで、制御処理部１５０は、スイッチ１２７３を操作して、決定された大きさのゲインを有するゲインアンプに切替える。

次いで、測定チップ１０に第２の光量で励起光αを照射するとともに、測定チップ１０から放出されたプラズモン散乱光γを検出し、検出されたプラズモン散乱光γの光量を示す光信号を、工程Ｓ１２２で設定されたゲインを有するゲインアンプにより増幅して、増幅値を得る（第１本測定工程；工程Ｓ１２３）。第１本測定工程（工程Ｓ１２３）では、光源制御部１１３、角度調整部１１２およびセンサー制御部を制御して、光源ユニット１１１から第２の光量で励起光αを、金属膜３０の所定の位置に、金属膜３０に対する励起光αの入射角度を走査しながら照射するとともに、受光センサー１２６でプラズモン散乱光γを検出する。これにより、制御処理部１５０は、励起光αの入射角と、プラズモン散乱光γの光量を示す信号の増幅値との関係を含むデータを得る。得られたデータは、制御処理部１５０に記憶される。

次いで、入射角を増強角に調整する（工程Ｓ１２４）。具体的には、制御処理部１５０は、第１本測定工程（工程Ｓ１２３）で得られたデータを解析して、プラズモン散乱光γの光量が最大となる入射角（増強角）を決定する。最後に、制御処理部１５０は、角度調整部１１２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する。

なお、増強角は、プリズム２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４１内の液体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、測定を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０．１°程度のオーダーで決定される。

次いで、金属膜３０上に蛍光物質が存在しない状態で蛍光βと同じ波長の光を含む光の検出を行い、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ１３０）。ここで、「光学ブランク値」とは、測定チップ１０の上方に放出される背景光の光量を意味する。

図６に示されるように、この工程では、まず、測定チップ１０に、増強角となる入射角度で、第１の光量で励起光αを照射するとともに、測定チップ１０から放出された光を検出し、検出された光の光量を示す光信号を、ゲインアンプにより増幅して、増幅値を得る（第２プレ測定工程；工程Ｓ１３１）。ゲインの大きさは、検出される光の光量に応じて適宜設定される。本実施の形態では、ゲインの大きさは、１０００倍および１００倍の２種類である。

具体的には、制御処理部１５０は、光源制御部１１３を制御して、光源ユニット１１１から第１の光量で励起光αを、プリズム２０側から捕捉体が固定化されている領域に対応する金属膜３０の裏面に照射する。これとともに、制御処理部１５０は、センサー制御部を制御して、受光センサー１２６で光を検出する。このとき、制御処理部１５０は、位置切替え機構１２２を制御して、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路内に移動させる。また、制御処理部１５０は、スイッチ１２７３を操作して、ゲインが１０００倍のゲインアンプに切替える。制御処理部１５０は、検出した光の光量を示す信号の増幅値（光学ブランク値）を取得する。測定された光学ブランク値は、制御処理部１５０に送信され、記憶される。第２プレ測定工程（工程Ｓ１３１）で光源ユニット１１１から照射される励起光αの第１の光量は、後述の第２本測定工程（工程Ｓ１３３）で、光源ユニット１１１から照射される励起光αの光量（第２の光量）よりも少ない。

次いで、制御処理部１５０は、スイッチ１２７３を操作して、ゲインが１００倍のゲインアンプに切替える。そして、制御処理部１５０は、上記操作と同様の操作を繰り返して、光学ブランク値を測定し、記憶する。

次いで、後述の第２本測定工程（工程Ｓ１３３）において光信号を増幅するためのゲインの大きさに設定する（第２ゲイン設定工程；工程Ｓ１３２）。具体的には、制御処理部１５０は、前述の工程Ｓ１２２と同様に、第１の光量および第２の光量の光量差と、工程Ｓ１３１で得られた２つの増幅値（光学ブランク値）とに基づいて、後述の第２本測定工程（工程Ｓ１３３）において、光信号を増幅するためのゲインの大きさを決定する。第１の光量および第２の光量の光量差に起因して光学ブランク値が増加するが、制御処理部１５０は、この光学ブランク値の増加分も考慮して、検出した光の出力値が飽和することがないようにゲインの大きさを決定する。励起光αの光量と、光学ブランク値の測定時に検出される光の光量とは、比例関係にあるため、例えば、第２の光量が第１の光量の６倍である場合、第２本測定工程（工程Ｓ１３３）で得られる出力値の、第１の光量および第２の光量の光量差に起因して増加した出力値は、第２プレ測定工程（工程Ｓ１３１）で得られる出力値の６倍であると計算することができる。次いで、制御処理部１５０は、スイッチ１２７３を操作して、決定された大きさのゲインを有するゲインアンプに切替える。

次いで、測定チップ１０に第２の光量で励起光αを照射するとともに、測定チップ１０から放出された光を検出し、検出された光の光量を示す光信号を、工程Ｓ１３２で設定されたゲインを有するゲインアンプにより増幅して、増幅値（光学ブランク値）を得る（第２本測定工程；工程Ｓ１３３）。励起光αの光量を、第２の光量としたこと以外は、第２プレ測定工程（工程Ｓ１３１）と同様に増幅値（光学ブランク値）を測定する。

次いで、検体中の被測定物質と金属膜３０上の捕捉体とを反応させる（１次反応；工程Ｓ１４０）。具体的には、制御処理部１５０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を測定位置から送液位置に移動させる。この後、制御処理部１５０は、送液ポンプ駆動機構１３３を制御して、液体チップ１３１中の検体を流路４１内に提供する。これにより、検体中に被測定物質が存在する場合は、被測定物質の少なくとも一部は金属膜３０上の捕捉体により捕捉される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄して、捕捉体に捕捉されなかった物質を除去する。

次いで、金属膜３０上の捕捉体に捕捉された被測定物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ１５０）。具体的には、制御処理部１５０は、送液ポンプ駆動機構１３３を制御して、液体チップ１３１中の蛍光標識液を流路４１内に提供する。これにより、被測定物質を蛍光物質で標識することができる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。

次いで、反応場の被測定物質を標識している蛍光物質から放出される蛍光βを検出して、蛍光値を測定する（工程Ｓ１６０）。

図７に示されるように、この工程では、まず、蛍光物質で標識されている被測定物質が捕捉体に捕捉されている状態で、増強角となる入射角度で、測定チップ１０に第１の光量で励起光αを照射するとともに、蛍光物質から放出された蛍光βを検出し、検出された蛍光βの光量を示す蛍光信号を、ゲインアンプにより複数のゲインでそれぞれ増幅して、複数の増幅値を得る（第３プレ測定工程；工程Ｓ１６１）。ゲインの大きさは、検出される蛍光βの光量に応じて適宜設定される。本実施の形態では、ゲインの大きさは、１倍、１０倍、１００倍および１０００倍の４種類である。

具体的には、制御処理部１５０は、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を送液位置から測定位置に移動させる。この後、制御処理部１５０は、増幅部１２７のスイッチ１２７３を操作して、ゲインが１倍のゲインアンプに設定する。次いで、制御処理部１５０は、光源制御部１１３を制御して、励起光照射部１１０の光源ユニット１１１から第１の光量で励起光αを、プリズム２０側から捕捉体が固定化されている領域に対応する金属膜３０の裏面に照射する。これとともに、制御処理部１５０は、センサー制御部を制御して、受光センサー１２６で蛍光βを検出し、検出された蛍光βの光量を示す蛍光信号を増幅部１２７のゲインアンプで増幅して、増幅値を得る。得られた増幅値は、制御処理部１５０に送信され、記録される。第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）で光源ユニット１１１から照射される励起光αの第１の光量は、後述の第３本測定工程（工程Ｓ１６３）で、光源ユニット１１１から照射される励起光αの光量（第２の光量）よりも少ない。

次いで、制御処理部１５０は、スイッチ１２７３を操作して、ゲインが１０倍のゲインアンプに切替える。そして、制御処理部１５０は、上記操作と同様の操作を繰り返して、増幅値を得て、記憶する。制御処理部１５０は、ゲインが１００倍のゲインアンプと、ゲインが１０００倍のゲインアンプとについても、同様の操作を繰り返して、増幅値を得て、記憶する。

次いで、後述の第３本測定工程（工程Ｓ１６３）において蛍光信号を増幅するためのゲインの大きさに設定する（第３ゲイン設定工程；工程Ｓ１６２）。具体的には、制御処理部１５０は、前述の工程Ｓ１２２と同様に、第１の光量および第２の光量の光量差と、工程Ｓ１６１で得られた４つの増幅値とに基づいて、後述の本測定工程（工程Ｓ１６３）において、蛍光信号を増幅するためのゲインの大きさを決定する。第１の光量および第２の光量の光量差に起因して検出される蛍光βの出力値が増加するが、制御処理部１５０は、この出力値の増加分も考慮して、出力値が飽和することがないようにゲインの大きさを決定する。励起光αの光量と、蛍光βの光量とは、比例関係にあるため、例えば、第２の光量が第１の光量の６倍である場合、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）で得られる出力値の、第１の光量および第２の光量の光量差に起因して増加した出力値は、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）で得られる出力値の６倍であると計算することができる。次いで、制御処理部１５０は、スイッチ１２７３を操作して、決定された大きさのゲインを有するゲインアンプに切替える。

次いで、蛍光物質で標識されている被測定物質が捕捉体に捕捉されている状態で、第２の光量で、測定チップ１０に励起光αを照射するとともに、蛍光物質から放出された蛍光βを検出し、検出された蛍光βの光量を示す蛍光信号を、工程Ｓ１６２で設定された大きさのゲインを有するゲインアンプによりにより増幅して、増幅値（蛍光値）を得る（第３本測定工程；工程Ｓ１６３）。

具体的には、光源制御部１１３を制御して、励起光照射部１１０の光源ユニット１１１から第２の光量で励起光α、プリズム２０側から捕捉体が固定化されている領域に対応する金属膜３０の裏面に照射する。これとともに、制御処理部１５０は、センサー制御部を制御して、受光センサー１２６で蛍光βを検出し、検出された蛍光βの光量を示す蛍光信号を増幅部１２７のゲインアンプにより、ゲイン設定工程（工程Ｓ１６２）で設定された大きさのゲインで増幅して、増幅値（蛍光値）を得る。得られた増幅値（蛍光値）は、制御処理部１５０に送信され、記録される。

最後に、被測定物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ１７０）。蛍光値は、主として、被測定物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル値）と、光学ブランク値とを含む。制御処理部１５０は、工程Ｓ１６３で得られた増幅値（蛍光値）から工程Ｓ１３３で得られた光学ブランク値を引くことで、被測定物質の量に相関するシグナル値を算出することができる。シグナル値は、あらかじめ作成しておいた検量線により、被測定物質の量や濃度などに換算される。このとき、第２本測定工程（工程Ｓ１３３）と、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）とで、ゲインの大きさは、同じであることが好ましい。第２本測定工程（工程Ｓ１３３）と、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）とで、ゲインの大きさが異なる場合には、光学ブランク値を補正してシグナル値を算出すればよい。たとえば、第２本測定工程（工程Ｓ１３３）におけるゲインの大きさが、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）におけるゲインの大きさの１０倍大きい場合には、工程Ｓ１３３で得られた光学ブランク値を１／１０倍した数値を用いて、シグナル値を算出すればよい。

以上の手順により、検体中の被測定物質の存在の確認または量の決定をすることができる。なお、本実施の形態では、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２０）、光学ブランク値の測定工程（工程Ｓ１３０）および蛍光値の測定工程（工程Ｓ１６０）のいずれでも、第２の光量が第１の光量の６倍である場合について説明したが、第１の光量と第２の光量の光量比は、任意に変更してもよい。基本的に、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）で得られる蛍光値と、第２本測定工程（工程Ｓ１３３）で得られる光学ブランク値とは、シグナル値の算出の際に減算するので、同じ第２の光量で測定することが望ましい。これに対して、第１本測定工程（工程Ｓ１２３）では、その測定値を用いて増強角を決定できればよいだけなので、第１本測定工程（工程Ｓ１２３）での第２の光量と、第２本測定工程（工程Ｓ１３３）および第３本測定工程（工程Ｓ１６３）での第２の光量とを同じに合わせる必要がない。例えば、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２０）では、第２の光量を第１の光量の２倍の光量に設定してもよい。

次に、本実施の形態に係る測定方法の第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）および第３本測定工程（工程Ｓ１６３）において、光検出部１２０の受光センサー１２６で検出される蛍光βの光量と、光検出部１２０から出力される蛍光信号とに着目して、本発明の特徴について説明する。比較のために、プレ測定工程およびゲイン設定工程を有さない従来の測定方法についても説明する。

図８Ａは、第１の光量で、または第２の光量で励起光αを測定チップ１０に照射した場合に受光センサー１２６で検出される蛍光βの相対強度と、励起光αの照射時間との関係を示すグラフである。図８Ａにおいて、実線は、第１の光量で励起光αを照射したときの結果を示し、破線は、第２の光量で励起光αを照射したときの結果を示す。また、図８Ｂは、光検出部１２０から出力される蛍光信号を示すグラフである。

図８Ａに示されるように、第１の光量で、または第２の光量で励起光αを測定チップ１０に照射した場合、励起光αの照射時間の増大とともに蛍光物質から放出される蛍光βの強度は、減少していく。一般的に、励起光αの照射による蛍光物質の褪色は、蛍光物質の種類と、蛍光物質に照射される励起光αのエネルギー量（強度×時間）とに起因する。したがって、第１の光量で励起光αを照射した場合と比較して、励起光αの光量がより多い第２の光量で励起光αを照射した場合の方が、蛍光物質が褪色し、蛍光物質から放出される蛍光βの光量はより低下する。

次に、光検出部１２０で検出された蛍光βの光量を示す蛍光信号について説明する。

図８Ｂに示されるように、光検出部１２０で検出された蛍光βは、蛍光βの光量を示す蛍光信号として光検出部１２０から出力される。蛍光値の測定工程は、蛍光信号を安定化させるための安定化工程と、安定化工程の後、蛍光信号を平均化するための平均化工程とを含むことが好ましい。

安定化工程に要する時間（以下、単に「安定化時間」ともいう）には、励起光αの光源ユニット１１１を安定化させるための時間と、光検出部１２０を安定化させるための時間とが含まれる。本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、安定化時間には、さらに増幅部１２７を安定化させるための時間が含まれる。増幅部１２７を安定化させるための時間は、例えば、ゲインアンプの切替えや、ゲインの大きさＬＰＦのカットオフ波長ｆ_ｃの大きさなどに応じて変動する。

平均化工程に要する時間（以下、単に「平均化時間」ともいう）は、蛍光信号を平均化することで、ノイズなどによる蛍光信号のばらつきを低減させるための時間である。制御処理部１５０は、一定時間、蛍光信号が平均化された平均値を蛍光値として取得する。図８Ａに平均化時間に測定される蛍光信号の平均値（蛍光値）を黒丸（●）で示した。

前述のように、蛍光値は、安定化工程と平均化工程とを経て測定されることが好ましい。この場合、安定化時間および平均化時間が長くなりすぎると、照射される励起光αの合計光量が大きく、蛍光物質が褪色してしまうため、測定される蛍光値は小さくなる。図８Ｂに示されるように、出力電圧も、励起光αの照射による蛍光物質の褪色により励起光αの照射時間の増大とともに小さくなる。しかし、平均化時間が長くなるほど、蛍光信号のばらつきの影響を低減することができるため、より少ないばらつきで蛍光値を得ることができる。

図９は、本実施の形態に係る測定方法と、従来の測定方法とを比較するためのグラフであり、プレ測定工程および本測定工程において、検出される蛍光βの光量を示すグラフである。図９において、横軸は、励起光αの照射時間を示し、縦軸は、蛍光βの光量を示す。図９において、実線は、本実施の形態に係る測定方法についてのグラフを示し、一点鎖線は、従来の測定方法において、第１の光量で励起光αを照射した場合のグラフを示し、二点鎖線は、従来の測定方法において、第２の光量で励起光αを照射した場合のグラフを示している。ここでは、説明を簡単化する観点から、プレ測定工程では、本測定工程で使用されるゲインアンプのゲインと同じ倍率（ゲイン）である１種類のゲインアンプで蛍光信号を増幅する場合について説明する。図９では、本実施の形態に係る測定方法において、平均化時間に測定される蛍光信号の平均値（蛍光値）を黒丸（●）で示し、従来の測定方法において、第１の光量で励起光αを照射した場合に平均化時間に測定される蛍光信号の平均値（蛍光値）を白三角（△）で示し、従来の測定方法において、第２の光量で励起光αを照射した場合に平均化時間に測定される蛍光信号の平均値（蛍光値）を白丸（○）で示した。

まず、従来の測定方法において、少ない光量（第１の光量）で励起光αを測定チップに照射した場合について説明する。この測定方法では、プレ測定と本測定とにおいて、第１の光量で励起光αを測定チップに照射する。このため、図９において一点鎖線で示されるように、励起光αの照射時間が長くなるほど、蛍光物質から放出される蛍光βの光量は減衰していく。照射される励起光αの光量が少ないため、蛍光物質の褪色が少ないものの、蛍光物質から放出される蛍光βの光量も少ないため、測定される蛍光値も小さくなってしまう（図９の本測定工程における白三角（△）参照）。結果として、検体中の被測定物質の濃度が低い場合には、被測定物質を高精度に測定することができない。一方で、蛍光物質の褪色が小さいため、蛍光物質の個体ごとの褪色量のばらつきに起因する蛍光値のばらつきは生じにくい。

次いで、従来の測定方法において、多い光量（第２の光量）で励起光αを測定チップに照射した場合の結果について説明する。この測定方法では、プレ測定と本測定とにおいて、第２の光量で励起光αを測定チップに照射する。このため、図９において二点鎖線で示されるように、励起光αの照射時間が長くなるほど、蛍光物質から放出される蛍光βの光量は減衰していく。このとき、照射される励起光αの光量が多いため、蛍光物質から放出される蛍光βの光量は多いものの、蛍光物質が顕著に褪色してしまう。励起光αを照射した直後に放出される蛍光βの光量と比べて、蛍光値が測定されるときには、放出される蛍光βの光量は大きく低下してしまう（図９の本測定工程における白丸（○）参照）。結果として、検体中の被測定物質の濃度が低い場合に、検出される蛍光βの光量を増やす観点から照射する励起光αの光量を増やしたとしても、励起光αの光量の増加率に比べて、大きい蛍光値を得ることができず、被測定物質を高精度に測定することができない。また、蛍光βの褪色が顕著なため、蛍光物質の個体ごとの褪色量のばらつきに起因する蛍光値のばらつきも生じてしまう。

以上のように、従来の測定方法では、低濃度の検体中の被測定物質を高精度に測定することができないという問題がある。

これに対して、本実施の形態に係る測定方法では、プレ測定では少ない光量（第１の光量）で励起光αを測定チップに照射し、本測定では多い光量（第２の光量）で励起光αを測定チップに照射する。このため、図９において実線で示されるように、プレ測定工程では、照射される励起光αの光量が少ないため、蛍光物質から放出される蛍光βの光量が少ないものの、蛍光物質の褪色を抑制することができる。プレ測定工程での褪色が少ないため、本測定工程では、プレ測定工程から常時多い光量（第２の光量）で照射した場合と比較して、より高い蛍光値を測定することができる（（図９の本測定工程における黒丸（●）参照））。結果として、従来の測定方法と比較して、より高感度に被測定物質を測定することができる。また、蛍光物質の褪色が小さいため、蛍光物質の個体ごとの褪色量のばらつきが小さくなり、測定される蛍光値のばらつきを小さくすることもできる。

プレ測定で測定チップ１０に照射される励起光αの第１の光量は、本測定で測定チップ１０に第２の光量で励起光αを照射したときに放出される蛍光βの蛍光信号を増幅するときのゲインを決定することができれば、特に限定されない。第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）における蛍光物質の褪色を抑制する観点からは、第１の光量は、第２の光量の１／２以下であることが好ましく、１／５以下であることがより好ましい。一方、ＬＤの安定したレーザー発振を確保する観点からは、第１の光量は、第２の光量の１／１０以上であることが好ましい。第１の光量が少なすぎると、ＬＤがレーザー発振せず、発振波長のばらつきや半値幅の増加などが発生してしまうおそれがある。

また、図１０Ａ、Ｂは、本実施の形態に係る測定方法の変形例を示すためのグラフである。第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）における蛍光物質の褪色を抑制して、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）で高い蛍光値を測定する観点からは、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）における励起光αの照射時間は、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）における励起光αの照射時間よりも短いことが好ましい。たとえば、図１０Ａに示されるように、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）における平均化時間は、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）における平均化時間よりも短いことが好ましく、図１０Ｂに示されるように、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）における安定化時間は、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）における安定化時間よりも短いことが好ましい。また、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）における平均化時間および安定化時間は、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）における平均化時間および安定化時間よりも短いことが好ましい。このように、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）では、正確な出力値を得る必要はなく、出力値のレンジを知ることができればよいため、測定精度を下げてもよく、安定化時間、平均化時間またはこれら両方を短縮化してもよい。これにより、励起光αの照射による蛍光物質の褪色を抑制することができ、かつ被測定物質の測定時間を短縮化することもできる。

前述のとおり、蛍光信号はノイズによりばらつくため、平均化時間は長いことが好ましい。しかしながら、平均化時間が長すぎると、励起光αの照射による蛍光物質の褪色も促進されるため、かえって放出される蛍光βの光量が減少してしまう。このような観点から、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）における平均化時間は、例えば、１秒である。この場合、蛍光物質の褪色を抑制しつつ、蛍光信号のばらつきを１％以下にする抑えることができる。また、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）における平均化時間を０．０１秒（１秒に対して１／１００）とすると、蛍光信号のばらつきは数％程度に増加してしまう。しかし、各ゲインアンプのゲインの大きさは１０倍の差があるため、ゲインの大きさを決定する観点からは、数％程度の蛍光信号のばらつきは、問題とならない。

また、前述のとおり、蛍光信号を安定化させるために、安定化時間は十分に長いことが好ましい。しかしながら、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６３）では、出力値のレンジを知ることができればよいため、蛍光物質の褪色を抑制する観点から、安定化時間は短縮化してもよい。たとえば、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）における安定化時間は、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）における安定化時間０．１秒の１／２程度（例えば、０．０５秒）であることが好ましい。この場合、蛍光信号は完全に立ち上がっていないため、測定される蛍光値は８０％程度に小さくなってしまう。しかし、各ゲインアンプのゲインの大きさは１０倍の差があるため、ゲインの大きさを決定する観点からは、２０％程度の蛍光値の減少であれば問題とならない。

また、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）と第３本測定工程（工程Ｓ１６３）とにおけるゲインの大きさの差が大きいほど、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）における安定化時間をより短縮化することができる。しかしながら、より正確にゲインの大きさを決定する観点からは、蛍光信号が十分立ち上がったときの出力値（例えば、本実施の形態では、安定化時間０．１秒経過時の出力値）を基準としたときに、蛍光信号が５０％以上立ち上がるまで安定化時間を長くすることが好ましく、蛍光信号が８０％以上立ち上がるまで安定化時間を長くすることがより好ましい。たとえば、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）と第３本測定工程（工程Ｓ１６３）とにおけるゲインの大きさの差がＸ倍の場合、蛍光信号が十分立ち上がったときの出力値を基準としたときに、２／Ｘ倍程度の出力値が得ることができるまでであれば、安定化時間を短縮化することができる。

（ＳＰＦＳ装置の動作の一例）
ここで、ＳＰＦＳ装置１００の動作の一例について説明するが、本発明は、以下の例に限定されない。

１．測定チップの準備
プリズム２０の一面上に金属膜３０が配置されている測定チップ１０を準備する。この測定チップ１０の金属膜３０上には、抗ＢＮＰ抗体（捕捉体）が固定化されている。準備した測定チップ１０をＳＰＦＳ装置１００のチップホルダーに設置する。

２．入射角を増強角に設定
（１）プレ測定
まず、５ｍＷのパワーで波長６６０ｎｍの励起光αを測定チップ１０に、特定の１つの角度６５°で照射する。これと同時に測定チップ１０から放出される、波長６６０ｎｍのプラズモン散乱光γを受光センサー１２６で検出する。そして、安定化時間を０．１秒、平均化時間を０．０１秒（合計０．１１秒）と設定し、検出されたプラズモン散乱光γの光量を示す信号を、ゲインが１０倍のゲインアンプにより増幅して、増幅値を得る。また、ゲインが１倍のゲインアンプを使用する場合についても同様の測定をして、合計２つの増幅値を得る。

（２）ゲインの設定
次いで、プレ測定および後述の本測定において照射される励起光αの光量差と、プレ測定で得られた２つの増幅値に基づいて、本測定で光の信号を増幅するためのゲインの大きさを設定する。

次いで、金属膜３０に対する入射角を６１°から７１°まで走査しながら、１０ｍＷのパワーで波長６６０ｎｍの励起光αを測定チップ１０に照射する。これと同時に測定チップ１０から放出されるプラズモン散乱光γを検出する。そして、安定化時間を０．１秒、平均化時間を０．１秒（合計時間０．２秒）と設定し、検出されたプラズモン散乱光γの光量を示す信号をゲインアンプにより、設定された大きさのゲインで増幅して、増幅値を得る。得られた励起光αの入射角と、プラズモン散乱光γの光量を示す信号の増幅値との関係に基づいて、プラズモン散乱光γの光量が最大となるときの入射角を判断する。

３．光学ブランク値の測定
（１）プレ測定
まず、５ｍＷのパワーで波長６６０ｎｍの励起光αを測定チップ１０に増強角で照射する。これと同時に測定チップ１０から放出される、波長６８５〜７７０ｎｍの光を受光センサー１２６で検出する。そして、安定化時間を０．１秒、平均化時間を０．０１秒（合計時間０．１１秒）と設定し、検出された光の光量を示す信号を、ゲインが１０００倍のゲインアンプにより増幅して、増幅値を得る。また、ゲインが１００倍のゲインアンプを使用した場合についても同様に測定をして、合計２つの増幅値を得る。

（２）ゲインの設定
次いで、プレ測定および後述の本測定において照射される励起光αの光量差と、プレ測定で得られた２つの増幅値に基づいて、本測定で光の信号を増幅するためのゲインの大きさを設定する。

（３）本測定
最後に、３０ｍＷのパワーで波長６６０ｎｍの励起光αを測定チップ１０に照射する。これと同時に測定チップ１０から放出される、波長６８５〜７７０ｎｍの光を受光センサー１２６で検出する。そして、安定化時間を０．１秒、平均化時間を１秒（合計時間１．１秒）と設定し、検出された光の光量を示す信号をゲインアンプにより、設定された大きさのゲインで増幅して、増幅値を得ることで、光学ブランク値を測定する。

４．１次反応
次いで、被測定物質としてＢＮＰが１００ｐｇ／ｍＬの濃度で含まれる検体（１００μＬ）を測定チップ１０の流路４１内に提供する。次いで、流路４１内において検体を往復送液して、１次反応を行う。その後、流路４１内の検体を除去し、流路内をリン酸緩衝液で洗浄する。

５．２次反応
蛍光物質としてAlexa-Fluor（登録商標）で標識された抗ＢＮＰ抗体を含む溶液（１００μＬ）を、流路４１内において往復送液をして、２次反応を行う。

６．蛍光値の測定
（１）プレ測定
まず、５ｍＷのパワーで波長６６０ｎｍの励起光αを測定チップ１０に増強角で照射する。これと同時に測定チップ１０から放出される蛍光βを受光センサー１２６で検出する。そして、安定化時間を０．１秒、平均化時間を０．０１秒（合計時間０．１１秒）となるように設定し、検出された蛍光βの光量を示す蛍光信号を、ゲインが１倍のゲインアンプにより増幅して、増幅値を得る。また、ゲインが１０倍、１００倍、１０００倍、０．１倍および０．０１倍のゲインアンプを使用した場合についてもそれぞれ同様の測定をして、合計６つの増幅値を得る。

（２）ゲインの設定
次いで、プレ測定および後述の本測定において照射される励起光αの光量差と、プレ測定で得られた６つの増幅値に基づいて、本測定で蛍光βの信号を増幅するためのゲインの大きさを設定する。

（３）本測定
最後に、３０ｍＷのパワーで波長６６０ｎｍの励起光αを測定チップ１０に照射する。これと同時に測定チップ１０から放出される蛍光βを受光センサー１２６で検出する。そして、安定化時間を０．１秒、平均化時間を１秒（合計時間１．１秒）となるように設定し、検出された蛍光βの光量を示す信号をゲインアンプにより、設定された大きさのゲインで増幅して、増幅値を得ることで、ＢＮＰの量を示す蛍光値を測定する。

以上のとおり、蛍光値を測定する工程において、プレ測定工程では５ｍＷのパワーで光を照射し、本測定工程では、３０ｍＷのパワーで光を照射する。すなわち、プレ測定工程と比較して、本測定工程では、６倍の光量の光を照射することとなる。このため、蛍光物質の褪色を１／６に抑制することができる。

また、６種類のゲインのゲインアンプを使用する場合についてプレ測定を行うため、蛍光値を測定する工程において、プレ測定に要した合計時間は０．６６秒であり、本測定に要した合計時間の１．１秒よりも短時間となる（ゲインアンプの数がより少なければ、より短時間となる）。このため、蛍光物質の褪色を抑制し、かつ短時間に測定することができる。

また、入射角を増強角に設定する工程において、本測定工程では１０ｍＷのパワーで光を測定チップ１０に照射して、増強角を決定する。このように、蛍光値および光学ブランク値の測定時のパワー（３０ｍＷ）よりも、パワー（第２の光量）を低く設定することで、捕捉体の劣化を抑制することができる。

また、光学ブランク値を測定する工程において、プレ測定工程では５ｍＷのパワーで光を照射し、本測定工程では、３０ｍＷのパワーで光を照射する。すなわち、プレ測定工程と比較して、本測定工程では、６倍の光量の励起光を照射することとなる。このため、プレ測定工程における捕捉体の劣化を抑制し、かつ被測定物質の測定時間を短縮化することができる。

（効果）
以上のように、本実施の形態に係る測定方法およびＳＰＦＳ装置１００では、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）では、第１の光量で励起光αを照射し、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）では、第１の光量より多い第２の光量で励起光αを照射する。このため、第３プレ測定工程（工程Ｓ１６１）における蛍光物質の褪色を抑制することができ、第３本測定工程（工程Ｓ１６３）では、光量の多い蛍光βを検出することができる。この結果として、被測定物質を高精度に測定することができる。

また、上記実施の形態に係る測定方法およびＳＰＦＳ装置１００では、金属膜１３０上に蛍光物質が配置されていない、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２０）、光学ブランク値の測定工程（工程Ｓ１３０）においても、プレ測定工程（工程Ｓ１２１、Ｓ１３１）およびゲイン設定工程（工程Ｓ１２２、Ｓ１３２）を行った。このため、励起光αの照射による捕捉体の劣化（例えば、１次反応の反応性の低下など）を抑制することができる。また、励起光αの照射時間を短縮化することができるため、より測定時間を短縮化することができる。

なお、上記実施の形態では、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２０）と、光学ブランク値の測定工程（工程Ｓ１３０）と、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ１６０）とにおいて、プレ測定工程（工程Ｓ１２１、Ｓ１３１、Ｓ１６１）およびゲイン設定工程（工程Ｓ１２２、Ｓ１３２、Ｓ１６２）を行う場合について説明したが、本発明に係る測定方法では、この態様に限定されない。たとえば、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ１６０）のみにおいて、プレ測定工程（工程Ｓ１６１）およびゲイン設定工程（工程Ｓ１６２）を行ってもよい。

また、上記実施の形態では、第１プレ測定工程（工程Ｓ１２１）において、２種類の大きさのゲインについて、プレ測定を行った。しかし、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２０）では、ゲインの大きさを推測することができるため、第１プレ測定工程（工程Ｓ１２１）では、例えば、１種類の大きさのゲインでプレ測定を行ってもよいし、プレ測定を行わなくてもよい。これにより、捕捉体の劣化をより抑制することができ、測定時間をより短縮化することができる。

また、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２０）では、２種類の大きさのゲインから選択するだけであるため、仮にゲインの大きさを推測できないとしても、敢えて第１プレ測定工程（工程Ｓ１２１）を省略してもよい。この場合、２種類のゲイン両方で第１本測定工程（工程Ｓ１２３）を行ってもよい。具体的には、一方のゲインに設定した後に１回目の第１本測定工程を行い、次いで、他方のゲインに設定した後に２回目の第１本測定工程を行えばよい。励起光αの入射角を走査するときに、入射角を変更する毎に、上記操作を繰り返し行うことで、２種類のゲインについての、励起光αの入射角と、プラズモン散乱光γの光量を示す信号の増幅値との関係を含むデータを得ることができる。そして、得られた適切なデータを用いて、増強角を決定してもよい。光源ユニット１１１を回転させて励起光αの入射角度を設定する工程に時間がかかるため（例えば、１秒）、第１本測定工程にかかる時間が安定化時間０．１秒、平均化時間０．１秒の合計時間０．２秒であれば、２種類のゲイン両方で第１本測定を行ってもわずか０．４秒（増加分は０．２秒）と比較的影響は小さい。ゲインの大きさを無理に推測するより、両方のゲインで測定しておいた方が、確実に増強角を算出できる（増強角の決定を失敗するリスクがなくなる）。

また、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２０）では、フィッティングによりプラズモン散乱光γの光量が最大となるときの光の入射角がわかればよいため、正確な光量を求めなくてもよい。たとえば、フィッティングエラーにならない程度（例えば、検出されたプラズモン散乱光γの光量を示す信号のばらつきが１０％以下）に出力値が安定していればよい。このため、第１プレ測定工程（工程Ｓ１２１）および第１本測定工程（工程Ｓ１２３）では、照射される励起光αのパワーをより下げてもよいし（例えば、第１プレ測定工程と同じ５ｍＷなど）、光信号の平均化時間をより短縮してもよい。

また、上記実施の形態では、第２プレ測定工程（工程Ｓ１３１）において、２種類の大きさのゲインについて、プレ測定を行った。しかし、光学ブランク値は、測定チップ１０のプリズム２０から放出される自家蛍光とプラズモン散乱光γの光量とによって変動することがわかっており、ゲインの大きさを推測することができる。このため、第２プレ測定工程（工程Ｓ１３１）では、例えば、１種類の大きさのゲインでプレ測定を行ってもよいし、プレ測定を行わなくてもよい。これにより、捕捉体の劣化をより抑制することができ、測定時間をより短縮化することができる。

上述したように、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ１６０）では、被測定物質の濃度が未知であるため、プレ測定工程を行い、ゲインを設定する必要がある。しかし、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２０）で検出されるプラズモン散乱光γの強度と、光学ブランク値の測定工程（工程Ｓ１３０）で検出される光の強度とは、測定チップ１０に固有の値であるため、おおよその光量を推定することができる。このように検出される光の光量を推定できる場合には、プレ測定工程（工程Ｓ１２１およびＳ１３１）を省略し、ゲインを設定することが可能である。

また、シグナル値を正確に測定する観点からは、第２本測定工程（工程Ｓ１２３）と第３本測定工程（工程Ｓ１６３）とにおいては、同じ励起光αのパワーおよび平均化時間で本測定を行うことが好ましい。また、測定チップの個体ごとの光学ブランク値のばらつきが小さい場合には（例えば、測定チップの個体ごとの光学ブランク値の差が１０倍以内）、プレ測定工程を行わなくてもよい。これにより、捕捉体の劣化をより抑制することができ、かつ、被測定物質の測定時間を短縮化することができる。

また、上記実施の形態では、入射角を増強角に設定する工程（工程Ｓ１２０）、光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１３０）および１次反応を行う工程（工程Ｓ１４０）をこの順番に行う態様について説明した。しかし、本発明に係る測定方法および測定装置では、これらの順番に限定されない。たとえば、１次反応を行った後に入射角を増強角に設定してもよいし、光学ブランク値を測定した後に１次反応を行ってもよい。

また、上記の説明では、１次反応を行う工程（工程Ｓ１４０）の後に、２次反応を行う工程（工程Ｓ１５０）を行った（２工程方式）。しかしながら、被測定物質を蛍光物質で標識するタイミングは、特に限定されない。たとえば、測定チップ１０の流路４１内に試料液を導入する前に、試料液に標識液を添加して被測定物質を予め蛍光物質で標識しておいてもよい。また、測定チップ１０の流路内に試料液と標識液を同時に注入してもよい。前者の場合は、測定チップ１０の流路内に試料液を注入することで、蛍光物質で標識されている被測定物質が捕捉体により捕捉される。後者の場合は、被測定物質が蛍光物質で標識されるとともに、被測定物質が捕捉体により捕捉される。いずれの場合も、測定チップ１０の流路４１内に試料液を導入することで、１次反応および２次反応の両方を完了することができる（１工程方式）。

さらに、上記実施の形態では、金属膜３０を有する測定チップ１０を使用した態様について説明し、ＳＰＦＳを利用した測定方法およびＳＰＦＳ装置１００について説明したが、本発明に係る測定方法および測定装置は、この態様に限定されない。たとえば、本発明に係る測定方法および測定装置では、金属膜３０を有しない測定チップ１０が使用されてもよい。本発明に係る測定方法および測定装置は、検出された蛍光信号をゲインアンプにより増幅する工程を含む測定方法および測定装置であれば、ＳＰＦＳを利用した測定方法およびＳＰＦＳ装置以外にも採用されうる。

本発明に係る被測定物質の測定方法および測定装置は、被測定物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。

１０ 測定チップ
２０ プリズム
２１ 入射面
２２ 成膜面
２３ 出射面
３０ 金属膜
４０ 流路蓋
４１ 流路
１００ ＳＰＦＳ装置
１１０ 励起光照射部
１１１ 光源ユニット
１１２ 角度調整機構
１１３ 光源制御部
１２０ 光検出部
１２１ 受光光学系ユニット
１２２ 位置切替え機構
１２３ 第１レンズ
１２４ 光学フィルター
１２５ 第２レンズ
１２６ 受光センサー
１２７ 増幅部
１２７１ Ｉ／Ｖ変換回路
１２７２ アンプ回路
１２７３ スイッチ
１２７４ Ａ／Ｄ変換回路
１３０ 送液部
１３１ 液体チップ
１３２ シリンジポンプ
１３３ 送液ポンプ駆動機構
１３４ シリンジ
１３５ プランジャー
１４０ 搬送部
１４１ 搬送ステージ
１４２ チップホルダー
１５０ 制御処理部
α 励起光
β 蛍光
γ プラズモン散乱光

Claims (7)

1. 被測定物質を標識している蛍光物質から放出される蛍光の光量を測定することにより、前記被測定物質の量を測定する測定方法であって、
   前記蛍光物質で標識されている前記被測定物質が測定チップの捕捉体に捕捉されている状態で、前記測定チップに第１の光量で励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出し、検出された蛍光の光量を示す蛍光信号を、ゲインアンプにより複数のゲインでそれぞれ増幅して、複数の増幅値を得るプレ測定工程と、
   蛍光信号を増幅するためのゲインの大きさを設定するゲイン設定工程と、
   前記蛍光物質で標識されている前記被測定物質が前記捕捉体に捕捉されている状態で、前記第１の光量よりも多い第２の光量で、前記測定チップに励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出し、検出された蛍光の光量を示す蛍光信号を、ゲインアンプにより前記ゲイン設定工程で設定された大きさのゲインで増幅して、増幅値を得る本測定工程と、
   を含み、
   前記ゲイン設定工程では、前記第１の光量および前記第２の光量の光量差と、前記複数の増幅値とに基づいて、ゲインの大きさを設定する、
   測定方法。
2. 前記プレ測定工程における励起光の照射時間は、前記本測定工程における励起光の照射時間よりも短い、請求項１に記載の測定方法。
3. 前記プレ測定工程および前記本測定工程は、
   前記蛍光信号を安定させるための安定化工程と、
   前記安定化工程の後、前記蛍光信号を平均化するための平均化工程と、
   をそれぞれ含み、
   前記プレ測定工程における前記平均化工程に要する時間は、前記本測定工程における前記平均化工程に要する時間よりも短い、
   請求項１または２に記載の測定方法。
4. 前記プレ測定工程および前記本測定工程は、
   前記蛍光信号を安定させるための安定化工程と、
   前記安定化工程の後、前記蛍光信号を平均化するための平均化工程と、
   をそれぞれ含み、
   前記プレ測定工程における前記安定化工程に要する時間は、前記本測定工程における前記安定化工程に要する時間よりも短い、
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定方法。
5. 前記測定チップは、プリズムと、前記プリズム上に配置されている金属膜と、前記金属膜上に固定化されている前記捕捉体と、を有し、
   前記プレ測定工程および前記本測定工程では、前記プリズム側から前記捕捉体が固定化されている領域に対応する前記金属膜の裏面に励起光を照射するとともに、前記金属膜の表面の前記蛍光物質から放出された蛍光を検出する、
   請求項１〜４のいずれか一項に記載の測定方法。
6. 被測定物質を標識している蛍光物質から放出される蛍光の光量を測定することにより、前記被測定物質の量を測定する測定装置であって、
   前記被測定物質を捕捉するための捕捉体を含む測定チップを着脱可能に保持するためのチップホルダーと、
   前記チップホルダーに保持されている前記測定チップに、第１の光量で、または前記第１の光量より多い第２の光量で励起光を照射する励起光照射部と、
   前記捕捉体に捕捉されている前記被測定物質を標識している蛍光物質から放出された蛍光を検出し、検出した蛍光の光量を示す蛍光信号を出力する蛍光検出部と、
   互いにゲインの大きさが異なる複数のゲインアンプ、またはゲインの大きさを調整可能なゲインアンプを含み、前記励起光照射部が励起光を照射したときに、前記蛍光検出部が検出した蛍光の光量を示す蛍光信号を増幅する増幅部と、
   前記蛍光信号を増幅するための前記ゲインアンプのゲインの大きさを設定する制御処理部と、
   を有し、
   前記制御処理部は、
   前記励起光照射部が前記第１の光量で励起光を出射したときに、前記蛍光検出部が出力した蛍光信号を、前記増幅部が増幅することで得られる複数の増幅値を取得し、
   前記第１の光量および前記第２の光量の光量差と、前記複数の増幅値とに基づいて、前記励起光照射部が前記第２の光量で励起光を出射したときにおける前記増幅部のゲインの大きさを設定し、
   前記励起光照射部が前記第２の光量で励起光を出射したときに、前記蛍光検出部が出力した蛍光信号を、前記制御処理部が設定した大きさのゲインで前記増幅部が増幅することで得られる増幅値を取得する、
   測定装置。
7. 前記チップホルダーは、プリズムと、前記プリズム上に配置されている金属膜と、前記金属膜上に固定化されている前記捕捉体と、を有する前記測定チップを保持し、
   前記励起光照射部は、前記プリズム側から前記捕捉体が固定化されている領域に対応する前記金属膜の裏面に励起光を照射し、
   前記蛍光検出部は、前記金属膜の前記蛍光物質から放出された蛍光を検出する、
   請求項６に記載の測定装置。

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