JP6777090B2 - 表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）を利用して試料液中に含まれる被検出物質を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置に関する。

タンパク質やＤＮＡなどの生体物質を検出する測定において、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できれば、即時に患者の状態を把握し治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質に起因する微弱な光を、高感度かつ定量的に検出する分析方法および分析装置が求められている。被検出物質を高感度で検出する１つの方法としては、表面プラズモン共鳴蛍光分析法（表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：ＳＰＦＳ）が知られている（例えば、特許文献１参照）。

ＳＰＦＳでは、金属膜が所定の面上に配置されたプリズムを用いる。そして、プリズムを介して、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光照射部から励起光を金属膜に照射すると、金属膜表面上に局在場光（増強された電場）を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が励起されるため、蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。

国際公開第２０１２／１７２９８７号

一般的に、ＳＰＦＳでは、励起光照射部のパワー低下による誤検出を防ぐ観点から、ＳＰＦＳ装置に受光センサーを設け、励起光を測定することで、励起光照射部が正常か否かを確認している。受光センサー（例えば、フォトダイオード（ＰＤ））と、ハイパワー（例えば、１ｍＷ／ｍｍ^２以上）な励起光の光源とが使用される場合、光源のパワーが高すぎると、検出される励起光の光量が多すぎて受光センサーが飽和してしまうことがある。このように、受光センサーが飽和してしまうと、受光センサーの出力の直線性が失われ、正確な測定ができない。これにより、励起光照射部が正常か否かを正確に判断することができなくなってしまうことがある。そこで、受光センサーの飽和を防ぐ観点から、減光（ＮＤ）フィルターや光拡散板などの光量調整手段も受光センサーと組み合わせて使用されている。

しかしながら、上記の光量調整手段は、経時的な劣化や使用環境における埃などの影響を受けてしまう。このため、当該影響を除去して、正確な測定を行うには、光量調整手段の交換や清掃などの定期的なメンテナンスが必要となるという問題がある。

本発明の目的は、ハイパワーな光源を使用した場合に、光量調整手段を別途設けなくても、励起光照射部が正常か否かを正確に判断できる表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置を提供することである。

上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された捕捉体とを含み、チップホルダーに設置された分析チップに励起光照射部から励起光を照射するとともに、前記分析チップで反射された励起光を検出して、前記励起光照射部の出力情報を取得する工程を含む。

また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された捕捉体とを含む分析チップを着脱可能に保持するためのチップホルダーと、前記チップホルダーに保持された前記分析チップに励起光を照射する励起光照射部と、前記分析チップで反射された励起光を検出する励起光検出部と、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する蛍光検出部と、前記励起光検出部の検出結果に基づいて、前記励起光照射部の出力情報を取得する処理部と、を有する。

本発明によれば、ハイパワーな光源を使用した場合に、光量調整手段を別途設けなくても、励起光照射部が正常か否かを正確に判断できるため、励起光照射部の異常による誤検出を防止することができる。また、光量調整用部品の交換や清掃などのメンテナンスに要する手間とコストを抑えることができる。

図１は、本発明の実施の形態１、２に係るＳＰＦＳ装置の構成を模式的に示す図である。 図２は、本発明の実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の第１の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図３は、図２に示される位置調整工程（工程Ｓ１２０）内の工程を示すフローチャートである。 図４Ａ〜Ｃは、分析チップの位置情報と励起光照射ユニットの出力情報とを取得する工程（工程Ｓ１２０１）を説明するための模式図である。 図５Ａ、Ｂは、第１受光センサーによる反射光の検出結果の例を示すグラフである。 図６Ａ、Ｂは、分析チップの位置情報と励起光照射ユニットの出力情報とを取得する工程（工程Ｓ１２０１）の変形例を説明するための模式図である。 図７は、分析チップの別の例を示す断面図である。 図８Ａ、Ｂは、分析チップを測定位置に配置する工程（工程Ｓ１２０４）を説明するための模式図である。 図９Ａ、Ｂは、分析チップを測定位置に配置する工程（工程Ｓ１２０４）を説明するための模式図である。 図１０は、本発明の実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の第２の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図１１Ａは、図１０に示される位置調整工程（工程Ｓ２２０）内の工程を示すフローチャートであり、図１１Ｂは、図１０に示される算出および補正工程（工程Ｓ２５５）内の工程を示すフローチャートである。 図１２は、本発明の実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図１３は、図１２に示される位置および出力調整工程（工程Ｓ３２０）内の工程を示すフローチャートである。 図１４は、４つの受光面を有するＰＤを使用した場合において、励起光照射ユニットの出力情報を取得する工程（工程Ｓ３２０１）を説明するための模式図である。 図１５は、励起光照射ユニットのパワーに関する情報を取得するための他の方法を説明するためのグラフである。 図１６Ａ、Ｂは、励起光の入射角と反射率との関係を示すグラフである。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

［実施の形態１］
実施の形態１では、励起光照射ユニット（励起光照射部）の出力情報として、励起光照射ユニットのパワーに関する情報を取得することができる表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）について説明する。

図１は、本発明の実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット（励起光照射部）１１０、励起光検出ユニット（励起光検出部）１２０、蛍光検出ユニット（蛍光検出部）１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御処理部（処理部）１６０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、搬送ユニット１５０のチップホルダー１５４に分析チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、分析チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。

（検出チップの構成）
分析チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２上に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。通常、分析チップ１０は、分析のたびに交換される。分析チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれない、より小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射ユニット１１０からの励起光α大部分をプリズム２０の内部に入射させ、励起光照射ユニット１１０からの励起光αの一部を反射させる。励起光照射ユニット１１０からの励起光αのうち、入射面２１で反射される励起光α（以下、「反射光β」ともいう）の光量の割合（反射率）は、プリズム２０の屈折率と、プリズム２０の周囲の気体の屈折率と、入射面２１に対する励起光αの入射角とに応じて決まる（後述の参考実験参照）。通常プリズム２０の周囲は空気であるため、反射率は、プリズム２０の材料と、励起光αの入射角とが同じであればほぼ一定となる。たとえば、プリズム２０の材料が屈折率１．４〜１．６の樹脂である場合、反射率は４．２％程度である。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面で反射する。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射する。出射面２３は、金属膜３０で反射した励起光αをプリズム２０の外部に出射させる。

プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。

入射面２１は、励起光αが励起光照射ユニット１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。ここで「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、分析チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）δの光量が最大となるときの入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。

なお、分析チップ１０の設計により、増強角（およびその極近傍にある共鳴角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に固定化された被検出物質によって増強角および共鳴角がシフトするが、その量は数度未満である。ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、成膜面２２で反射され、出射面２３から出射される反射光（不図示）の光量が最小となるときの、入射角を意味する。

プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０を構成する樹脂の例には、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、およびシクロオレフィン系ポリマーが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。

金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光を生じさせることができる。

金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。

また、図１では図示しないが、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面（金属膜３０の表面）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体を固定化することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。本実施の形態では、金属膜３０上の所定の領域（反応場）に、捕捉体が均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体は、被検出物質に特異的に結合可能な抗体またはその断片である。反応場では、捕捉体および被検出物質の結合（１次反応）や、被検出物質の蛍光標識（２次反応）などの反応が行われる。

流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、液体が流れる流路４１を形成する。金属膜３０に固定化されている捕捉体は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が注入されると、液体は捕捉体に接触する。

流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される光（蛍光γおよびプラズモン散乱光δ）に対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。これらの光に対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。

流路４１を流れる液体の種類は、特に限定されない。液体の種類の例には、被検出物質を含む検体、蛍光物質を含む蛍光標識液、および緩衝液が含まれる。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。

図１に示されるように、励起光αの大部分は、入射面２１からプリズム２０内に入射する。このとき、励起光αの一部は、入射面２１で反射して反射光βとなる。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）で入射する。このように金属膜３０に対して励起光αを表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光γが出射される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光γの光量（強度）を検出することで、被検出物質の存在または量を検出する。また、詳細については後述するが、ＳＰＦＳ装置１００は、反射光βの光量（強度）を検出することで、分析チップ１０の位置情報と励起光照射ユニット１１０の出力情報とを取得することができる。

（ＳＰＦＳ装置の構成）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット（励起光照射部）１１０、励起光検出ユニット（励起光検出部）１２０、蛍光検出ユニット１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御処理部（処理部）１６０を有する。

励起光照射ユニット１１０は、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０に励起光αを照射する。蛍光γの検出時には、励起光照射ユニット１１０は、金属膜３０に対する入射角が表面プラズモン共鳴を生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、励起光αは、分析チップ１０の位置決めと、励起光照射ユニット１１０の異常検出とにも使用される。

励起光照射ユニット１１０は、励起光αをプリズム２０に向けて出射するための構成と、金属膜３０の裏面に対する励起光αの入射角度を走査するための構成とを含む。本実施の形態では、励起光照射ユニット１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。

光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量（強度）が一定の励起光αを、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。

光源の種類は、特に限定されないが、第２受光センサー１３７としてフォトダイオード（ＰＤ）などの高感度でない光検出器を使用する観点からは、ハイパワーの光源であることが好ましい。本実施の形態では、光源は、レーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。

ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。

コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。

バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。

直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。

スリットおよびズーム手段は、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。

温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。

角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））への励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１５４とを相対的に回転させる。

たとえば、角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。

前述のとおり、金属膜３０に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光δの最大光量を得られる角度が増強角である。増強角またはその近傍の角度に励起光αの入射角を設定することで、高強度の蛍光γを検出することが可能となる。なお、分析チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。本実施の形態では、金属膜３０の法線（図１におけるｚ軸方向の直線）に対する励起光αの好適な出射角は、約７０°である。

光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１の出射光（励起光α）の出力を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

励起光検出ユニット１２０は、光学測定（例えば、増強角の検出や光学ブランク値の測定、蛍光γの検出など）を行う際の、分析チップ１０の位置決めと励起光照射ユニット１１０の異常検出とのために、分析チップ１０への励起光αの照射によって生じた反射光βを検出する。

好ましくは、励起光検出ユニット１２０は、最初の光学測定を行う前に、分析チップ１０の位置決めと、励起光照射ユニット１１０の異常検出とのために反射光βを検出する。多くの場合、最初の光学測定は、増強角の検出であることから、増強角の検出の前に反射光βを検出することが好ましい。増強角の検出を実施しない場合は、光学ブランク値の測定前に反射光βを検出する。増強角の検出および光学ブランク値の測定の両方を実施しない場合は、蛍光γの検出前に反射光βを検出する。

励起光照射ユニット１１０の異常を検出するための反射光βの検出と、分析チップ１０の位置決めのための反射光βの検出とは、同時に行われてもよいし、別々に行われてもよい。本実施の形態では、励起光照射ユニット１１０の異常を検出するための反射光βの検出と、分析チップ１０の位置決めのための反射光βの検出とは、同時に行われる。

励起光検出ユニット１２０は、第１受光センサー１２１および第１センサー制御部１２２を含む。

第１受光センサー１２１は、励起光αの反射光βを検出する。第１受光センサー１２１の種類は、励起光αの反射光βを検出可能であれば特に限定されない。たとえば、第１受光センサー１２１は、フォトダイオード（ＰＤ）や位置検出素子（ＰＳＤ）などである。第１受光センサー１２１の受光面の大きさは、励起光αのビーム径よりも大きいことが好ましい。たとえば、励起光αのビーム径が１〜１.５ｍｍ程度の場合、第１受光センサー１２１の受光面の１辺の長さは３ｍｍ以上であることが好ましい。

第１受光センサー１２１は、励起光αの反射光βが入射する位置に配置されている。本実施の形態では、第１受光センサー１２１は、入射面２１からの反射光βが入射する位置に配置されている。好ましくは、第１受光センサー１２１は、蛍光γの検出時と同じかまたはそれに近い角度で出射された励起光αの反射光βが入射する位置に配置されている。励起光αの照射位置（照射方向）は、入射角の変化によりわずかに変化するため、分析チップ１０の位置決め時と蛍光γの検出時とで励起光αの入射角を同じかまたはそれに近い角度にすることで、蛍光γの検出時の位置決め精度をより高くすることが可能となる。本実施の形態では、金属膜３０の法線（図１におけるｚ軸方向の直線）に対する励起光αの出射角が約７０°である場合、入射面２１からの反射光βは、搬送ステージの進行方向（図１におけるｘ軸方向）にほぼ水平に進む。したがって、第１受光センサー１２１は、この水平方向に進む反射光βが入射する位置に配置されている（図４Ｃ参照）。

第１センサー制御部１２２は、第１受光センサー１２１の出力値の検出や、検出した出力値による第１受光センサー１２１の感度の管理、適切な出力値を取得するための第１受光センサー１２１の感度の変更、などを制御する。第１センサー制御部１２２は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成されている。

蛍光検出ユニット１３０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じた蛍光γを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出ユニット１３０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光δも検出する。蛍光検出ユニット１３０は、例えば、受光ユニット１３１、位置切替機構１３２および第２センサー制御部１３３を含む。

受光ユニット１３１は、分析チップ１０の金属膜３０の法線方向（図１におけるｚ軸方向）に配置される。受光ユニット１３１は、第１レンズ１３４、光学フィルター１３５、第２レンズ１３６および第２受光センサー１３７を含む。

第１レンズ１３４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１３６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１３４で集光された光を第２受光センサー１３７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。

光学フィルター１３５は、第１レンズ１３４および第２レンズ１３６の間に配置されている。光学フィルター１３５は、蛍光検出時においては、光学フィルター１３５に入射する光のうち、蛍光成分のみを透過させ、励起光成分（プラズモン散乱光δ）を除去する。これにより、蛍光成分のみを第２受光センサー１３７に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光γを検出することができる。光学フィルター１３５の種類の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１３５の例には、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルターと、所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターとが含まれる。

第２受光センサー１３７は、分析チップ１０から放出される蛍光γおよびプラズモン散乱光δを検出する。第２受光センサー１３７の例には、フォトダイオード（ＰＤ）、光電子増倍管（ＰＭＴ）およびアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）が含まれる。

位置切替機構１３２は、光学フィルター１３５の位置を、受光ユニット１３１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、第２受光センサー１３７が蛍光γを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路上に配置し、第２受光センサー１３７がプラズモン散乱光δを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。位置切替機構１３２は、例えば、回転駆動部と、回転運動を利用して光学フィルター１３５を水平方向に移動させる公知の機構（ターンテーブルやラックアンドピニオンなど）とによって構成される。

第２センサー制御部１３３は、第２受光センサー１３７の出力値の検出や、検出した出力値による第２受光センサー１３７の感度の管理、適切な出力値を取得するための第２受光センサー１３７の感度の変更、などを制御する。第２センサー制御部１３３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成されている。

送液ユニット１４０は、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０の流路４１内に、試料液や標識液、洗浄液などを供給する。送液ユニット１４０は、薬液チップ１４１、シリンジポンプ１４２および送液ポンプ駆動機構１４３を含む。

薬液チップ１４１は、試料液や標識液、洗浄液などの液体を収容する容器である。薬液チップ１４１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。

シリンジポンプ１４２は、シリンジ１４４と、シリンジ１４４内を往復動作可能なプランジャー１４５とによって構成される。プランジャー１４５の往復運動によって、液体の吸引および吐出が定量的に行われる。シリンジ１４４が交換可能であると、シリンジ１４４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ１４４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ１４４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ１４４を交換せずに使用することが可能となる。

送液ポンプ駆動機構１４３は、プランジャー１４５の駆動装置、およびシリンジポンプ１４２の移動装置を含む。

シリンジポンプ１４２の駆動装置は、プランジャー１４５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ１４２の送液量や送液速度を管理できるため、分析チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。

シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１４２を、シリンジ１４４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成されている。

シリンジ１４４と分析チップ１０との相対的な高さを一定に調整し、分析チップ１０内での残液量を一定に管理する観点からは、送液ユニット１４０は、シリンジ１４４の先端の位置を検出する装置をさらに有することが好ましい。

送液ユニット１４０は、薬液チップ１４１より各種液体を吸引し、分析チップ１０の流路４１内に供給する。このとき、プランジャー１４５を動かすことで、分析チップ１０中の流路４１内を液体が往復し、流路４１内の液体が撹拌される。これにより、液体の濃度の均一化や、流路４１内における反応（例えば抗原抗体反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、分析チップ１０の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ１４４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、分析チップ１０およびシリンジ１４４が構成されていることが好ましい。

流路４１内の液体は、再びシリンジポンプ１４２で吸引され、薬液チップ１４１などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応、洗浄などを実施し、流路４１内の反応場に、蛍光物質で標識された被検出物質を配置することができる。

搬送ユニット１５０は、分析チップ１０を設置位置、測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「設置位置」とは、分析チップ１０をＳＰＦＳ装置１００（より具体的には、チップホルダー１５４）に設置するための位置である。ここで「測定位置」とは、励起光照射ユニット１１０が分析チップ１０に励起光αを照射したときに発生する蛍光γを蛍光検出ユニット１３０が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液ユニット１４０が分析チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または分析チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。

搬送ユニット１５０は、搬送ステージ１５２およびチップホルダー１５４を含む。

搬送ステージ１５２は、チップホルダー１５４を一方向（図１におけるｘ軸方向）およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１５２は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。

チップホルダー１５４は、搬送ステージ１５２に固定されており、分析チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１５４の形状は、分析チップ１０を保持することが可能であり、かつ励起光αや反射光β、蛍光γなどの光の光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１５４には、これらの光が通過するための開口が設けられている。

制御処理部１６０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、第１センサー制御部１２２、位置切替機構１３２、第２センサー制御部１３３、送液ポンプ駆動機構１４３および搬送ステージ１５２を制御する。また、制御処理部１６０は、励起光検出ユニット１２０の検出結果に基づいて、分析チップ１０の位置情報と励起光照射ユニット１１０の出力情報とを取得する。そして、制御処理部１６０は、取得された位置情報に基づいて、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０の位置を特定する。また、制御処理部１６０には、あらかじめ取得されている励起光照射ユニット１１０の基準となる出力情報が記憶されている。詳細については後述するが、制御処理部１６０は、取得された出力情報と、基準となる出力情報とを比較することで、励起光照射ユニット１１０が正常か否かを判断する。励起光照射ユニット１１０の出力情報は、励起光照射ユニット１１０のパワーに関する情報、励起光αの照射方向に関する情報またはこれら両方である。基準となる出力情報は、正常な状態にある励起光照射ユニット１１０の出力情報であり、例えば、初期状態における励起光照射ユニット１１０である。本実施の形態では、励起光照射ユニット１１０の出力情報は、励起光照射ユニット１１０のパワーに関する情報である。また、本実施の形態では、基準となる出力情報は、初期状態における励起光照射ユニット１１０の出力情報である。制御処理部１６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成されている。

（ＳＰＦＳ装置の動作）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の動作（本実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法（単に「分析方法」ともいう））について説明する。本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、例えば、後述する２つの動作を行うことができる。

（第１の動作手順）
第１の動作では、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０の出力情報として、励起光照射ユニット１１０のパワーに関する情報を取得する。そして、励起光照射ユニット１１０のパワーに異常があると判断した場合には、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０のパワーを調整する。

図２は、ＳＰＦＳ装置１００の第１の動作手順の一例を示すフローチャートである。図３は、図２に示される位置および出力調整工程（工程Ｓ１２０）内の工程を示すフローチャートである。第１の動作では、位置および出力調整工程（工程Ｓ１２０）内に異常検出工程（工程Ｓ１２０２）が含まれる。

まず、分析チップ１０をＳＰＦＳ装置１００の設置位置に設置する（工程Ｓ１００）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１５４に分析チップ１０を設置する。

次いで、制御処理部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を送液位置に移動させる（工程Ｓ１０５）。

次いで、制御処理部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、薬液チップ１４１内の試料液を分析チップ１０の流路４１内に導入する（工程Ｓ１１０）。流路４１内では、抗原抗体反応（１次反応）によって、金属膜３０上に被検出物質が捕捉される。この後、流路４１内の試料液は除去され、流路４１内は洗浄液で洗浄される。なお、分析チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被検出物質を捕捉できるように、試料液を導入する前に流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。

次いで、制御処理部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を測定位置の近くまで移動させる（工程Ｓ１１５）。

次いで、制御処理部１６０は、励起光照射ユニット１１０、励起光検出ユニット１２０および搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０の位置情報と励起光照射ユニット１１０の出力情報とを取得する。制御処理部１６０は、取得された位置情報に基づいて分析チップ１０の位置を調整する。また、制御処理部１６０は、取得された出力情報に基づいて励起光照射ユニット１１０が正常か否かを判断する。そして、制御処理部１６０は、励起光照射ユニット１１０のパワーに異常があると判断した場合には、取得された出力情報に基づいて励起光照射ユニット１１０のパワーを調整する（工程Ｓ１２０）。

図３に示されるように、この工程では、まず、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、分析チップ１０の表面で反射された、励起光αの反射光βを検出して、分析チップ１０の位置情報と励起光照射ユニット１１０の出力情報（パワーに関する情報）とを取得する（工程Ｓ１２０１）。

次いで、制御処理部１６０は、上記出力情報に基づいて、励起光照射ユニット１１０（より具体的には、光源ユニット１１１）のパワーが正常か否かを判断する（工程Ｓ１２０２）。制御処理部１６０には、励起光照射ユニット１１０の初期状態におけるパワーに関する情報が記憶されている。より具体的には、制御処理部１６０には、初期状態における励起光照射ユニット１１０から出射された励起光αの分析チップ１０の表面からの反射光βの強度（以下、単に「初期値」ともいう）が記憶されている。制御処理部１６０は、工程Ｓ１２１で検出された反射光βの検出値と、あらかじめ制御処理部１６０に記憶されている初期値とを比較することで、励起光照射ユニット１１０のパワーが正常か否かを判断する。たとえば、制御処理部１６０は、初期値と検出値との差が所定の基準値（閾値）を超えている場合には、励起光照射ユニット１１０のパワーが異常であると判断する。この基準値（閾値）は、分析に求められる精度に応じて、適宜設定されうる。

制御処理部１６０は、励起光照射ユニット１１０のパワーが低下している（異常）と判断した場合には、励起光照射ユニット１１０の出力を所期のパワーに調整する（工程Ｓ１２０３）。制御処理部１６０は、励起光照射ユニット１１０のパワーが正常であると判断した場合には、その後の動作を継続する。

次いで、制御処理部１６０は、分析チップ１０の位置情報に基づいて、分析チップ１０の位置を調整する（工程Ｓ１２０４）。詳細については後述するが、制御処理部１６０は、上記位置情報に基づいて、測定位置からの分析チップ１０の位置ずれの程度を特定することができる。制御処理部１６０は、取得された位置情報に基づいて、搬送ステージ１５２を操作し、チップホルダー１５４を移動させて、分析チップ１０を適切な測定位置に配置する。

図４Ａ、Ｂは、分析チップ１０の位置情報と励起光照射ユニット１１０の出力情報とを取得する工程（Ｓ１２０１）を説明するための模式図である。まず、図４Ａに示されるように、分析チップ１０が光源ユニット１１１から離れた位置にある場合、光源ユニット１１１が励起光αを出射すると、励起光αは流路蓋４０で反射して、下側（搬送ステージ１５２側）に向かう。したがって、励起光検出ユニット１２０の第１受光センサー１２１には、分析チップ１０の表面からの反射光βは入射しない。

この状態で分析チップ１０を光源ユニット１１１に近づけていくと、光源ユニット１１１からの励起光αは、プリズム２０と流路蓋４０との境界部（以下「エッジ部」という）に到達する。この場合、図４Ｂに示されるように、流路蓋４０で反射した励起光α（反射光β）は第１受光センサー１２１に入射しないが、入射面２１で反射した励起光α（反射光β）は第１受光センサー１２１に入射する。したがって、第１受光センサー１２１には、分析チップ１０からの反射光βの一部が入射する。

さらに分析チップ１０を光源ユニット１１１に近づけていくと、光源ユニット１１１からの励起光αは、すべてプリズム２０の入射面２１に到達する。したがって、図４Ｃに示されるように、第１受光センサー１２１には、分析チップ１０の表面からの反射光βのすべてが入射する。

図５Ａ、Ｂは、第１受光センサー１２１による反射光βの検出結果の例を示すグラフである。この例では、搬送ステージ１５２により分析チップ１０を一方向（ｘ軸方向）に１００μｍずつ移動させながら、第１受光センサー１２１により反射光βの強度を測定した。励起光αのビーム径は１〜１.５ｍｍ程度である。図５Ａでは、検出結果のみを示しており、図５Ｂでは、３本の近似直線も示している。

図５Ａに示されるように、分析チップ１０の移動距離が０〜約１０００μｍの間は、第１受光センサー１２１には、分析チップ１０の表面からの反射光βは入射しない。これは、励起光αが、流路蓋４０で反射して、下側（搬送ステージ１５２側）に向かうためである（図４Ａ参照）。一方、分析チップ１０の移動距離が約１０００〜約２０００μｍの間は、第１受光センサー１２１に入射する反射光βの強度が徐々に増大する。これは、励起光αの一部が、入射面２１で反射して、第１受光センサー１２１に入射するためである（図４Ｂ参照）。分析チップ１０の移動距離が約２０００μｍを超えると、第１受光センサー１２１に入射する反射光βの強度がほぼ一定かつ最大となる。これは、反射光βのすべてが、第１受光センサー１２１に入射するためである（図４Ｃ参照）。したがって、グラフ中の傾斜部（移動距離：約１０００〜約２０００μｍ）が、エッジ部に対応する。なお、傾斜部の幅は、励起光αのｘ軸方向のビーム径（１〜１.５ｍｍ程度）に対応している。

図５Ｂでは、前半の水平部（移動距離：０〜約１０００μｍ）と、傾斜部（移動距離：約１０００〜約２０００μｍ）と、後半の水平部（移動距離：約２０００μｍ超）のそれぞれを直線近似している。グラフ中の点Ａは、前半の水平部の近似直線と傾斜部の近似直線との交点である。点Ｂは、傾斜部の近似直線と後半の水平部の近似直線との交点である。点Ｃは、点Ａと点Ｂとの中点である。点Ａは、反射光βの強度の最小値に対応する。点Ｂは、反射光βの強度の最大値に対応する。点Ｃは、反射光βの強度の中間値に対応する。

図５Ｂのグラフにおいて、分析チップ１０の位置を特定するには、点Ａ〜Ｃのいずれかを使用すればよい。点Ａおよび点Ｂは、励起光αのビームの縁がエッジ部に到達した地点を示している。したがって、励起光αのビーム径を考慮すれば、エッジ部の位置を特定することができ、結果として分析チップ１０の位置を特定することができる。一方、点Ｃは、励起光αのビームの中心がエッジ部に到達した地点を示している。点Ｃを利用する場合は、励起光αのビーム径を考慮することなく、エッジ部の位置を特定することができ、結果として分析チップ１０の位置を特定することができる。したがって、励起光αのビーム径の影響を抑制する観点からは、励起光αの反射光βの強度の中間値を用いて、分析チップ１０の位置を特定することが好ましい。

また、励起光照射ユニット１１０のパワーに関する情報を取得するためには、点Ｂを使用すればよい。点Ｂは、励起光照射ユニット１１０から出射された励起光αの反射光βの強度の最大値であり、照射光照射ユニット１１０から出射された励起光αの出力値でもある。したがって、反射光βの強度の最大値と初期値とを比較することで、励起光照射ユニット１１０（光源ユニット１１１）のパワーが低下しているか否かを判断することができる。

また、前述のとおり、分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、分析チップ１０の表面で反射された、励起光αの反射光βを検出することで、分析チップ１０の位置を特定することができる。しかしながら、分析チップ１０の位置を水平方向（ｘ軸方向）だけでなく高さ方向（ｚ軸方向）についても高精度に特定する観点からは、図４Ａ〜Ｃに示されるように、分析チップ１０の互いに隣接する２つの面に励起光αを照射することで、分析チップ１０の位置を特定することが好ましい。この場合、搬送ステージ１５２によるチップホルダー１５４の移動方向に対して平行および垂直ではない方向に励起光αを照射することが好ましい。なお、図６Ａに示されるように、流路蓋４０からの反射光βが入射し、入射面２１からの反射光βが入射しない位置に第１受光センサー１２１を配置しても、図４Ａ〜Ｃに示される例と同様の効果を得られる（反射光βの強度は、移動距離が短いときに高くなり、移動距離が長いときに低くなる）。

また、入射面２１の位置が特に重要であることから、分析チップ１０の互いに隣接する２つの面に励起光αを照射する場合は、分析チップ１０の入射面２１と入射面２１に隣接する面（本実施の形態では流路蓋４０の裏面）とに励起光αを照射することが好ましい。この場合、図６Ｂに示されるように、プリズム２０の入射面２１とプリズム２０の下面とに励起光αを照射してもよい。しかしながら、図６Ｂに示される例では、分析チップ１０の位置を特定するときに（工程Ｓ１２０１）、分析チップ１０が測定位置よりも光源ユニット１１１に近づいてしまう。したがって、分析チップ１０を測定位置に移動させるときに（工程Ｓ１２０４）、搬送ステージ１５２によりチップホルダー１５４を逆方向に移動させなければならない。このように搬送ステージ１５２を２方向に動作させることは、搬送ステージ１５２を１方向にのみ動作させる場合に比べて、動作精度の低下に繋がるおそれがある。これに対し、図４Ａ〜Ｃおよび図６Ａに示される例では、搬送ステージ１５２によりチップホルダー１５４を逆方向に移動させる必要はない。したがって、分析チップ１０の位置を高精度に調整する観点からは、分析チップ１０の位置情報を取得する工程（工程Ｓ１２０１）および分析チップを測定位置に移動させる工程（工程Ｓ１２０４）では、搬送ステージ１５２によりチップホルダー１５４を励起光αの光源（光源ユニット１１１）に近づく方向（ｘ軸方向）にのみ移動させることが好ましい。

なお、上記「分析チップ１０の互いに隣接する２つの面」には、実質的に隣接する２つの面が含まれる。たとえば、図７に示されるように、プリズム２０と、プリズムの成膜面２２上に配置された金属膜３０と、金属膜３０の上に配置されたスペーサー４２と、スペーサー４２の上に配置された流路蓋４０とを有する分析チップ１０’を使用するとする。流路４１の形状は、スペーサー４２により形作られている。一方、流路蓋４０は、透明の平板である。この場合、厳密には、プリズム２０の入射面２１と流路蓋４０の下面との間にスペーサー４２の側面が存在するため、入射面２１と流路蓋４０の下面とは隣接していない。しかしながら、励起光αのビーム径（例えば１〜１.５ｍｍ）に比べてスペーサー４２の厚みが非常に薄い（例えば１００μｍ）場合、入射面２１と流路蓋４０の下面とが実質的に隣接していると考えられる。したがって、この場合は、実質的に隣接する入射面２１および流路蓋４０の下面からの反射光βを検出してエッジ部を検出する。接着剤や両面テープなどの接合部材や金属膜３０などについても同様に無視することができる。

このように反射光βを検出する際に無視できる部材（例えばスペーサー４２）の厚さは、励起光αのビーム径の１／５以下であり、好ましくは１／１０以下である。たとえば、励起光αが、励起光αのビーム径の１／５以下または１／１０以下の厚みのスペーサー４２を含む領域に照射された場合、分析チップ１０’の表面からの反射光βは、その大半（４／５以上または９／１０以上）が入射面２１または流路蓋４０の下面からの反射光βであり、位置検出に利用されうる。したがって、スペーサー４２の影響を受けることなく、分析チップ１０’の位置を特定することができる。このように、励起光αのビーム径の１／５以下の厚みの部材（スペーサー４２や、接合部材、金属膜３０など）は、反射光βを検出する際に無視することができる。すなわち、分析チップ１０’の入射面２１と流路蓋４０の下面は実質的に隣接する２面として考えることができる。

図８Ａ、Ｂは、分析チップ１０を適切な測定位置に配置する工程（工程Ｓ１２０４）を説明するための模式図である。まず、図８Ａに示されるように、エッジ部の位置を特定したとする。この場合、エッジ部の位置と金属膜３０裏面の励起光αを照射すべき領域（反応場の裏側の領域）との距離は決まっている。このため、図８Ｂに示されるように、搬送ステージ１５２にチップホルダー１５４を所定の距離移動させることで、分析チップ１０を適切な測定位置に配置することができる。

また、図９Ａ、Ｂに示されるように、分析チップ１０が高さ方向（ｚ軸方向）にずれて配置されていた場合（例えば、分析チップ１０とチップホルダー１５４との間にごみが挟まっていた場合）も、分析チップ１０を適切な測定位置に配置することができる。すなわち、図９Ａに示されるように、エッジ部の位置を特定したとする。この場合、分析チップ１０がｚ軸方向にずれていない場合（図中破線で示す）に比べて、ｘ軸方向における分析チップ１０の位置はずれている。しかしながら、この場合であっても、図９Ｂに示されるように、エッジ部の位置に基づいて、搬送ステージ１５２にチップホルダー１５４を所定の距離移動させることで、分析チップ１０を適切な測定位置に配置することができる。

ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の説明に戻る（図２参照）。次いで、制御処理部１６０は、励起光照射ユニット１１０および蛍光検出ユニット１３０を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、励起光αと同一波長のプラズモン散乱光δを検出して、増強角を検出する（工程Ｓ１２５）。具体的には、制御処理部１６０は、励起光照射ユニット１１０を操作して金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査しつつ、蛍光検出ユニット１３０を操作してプラズモン散乱光δを検出する。このとき、制御処理部１６０は、位置切替機構１３２を操作して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。そして、制御処理部１６０は、プラズモン散乱光δの光量が最大の時の励起光αの入射角を増強角として決定する。

次いで、制御処理部１６０は、励起光照射ユニット１１０および蛍光検出ユニット１３０を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、第２受光センサー１３７の出力値（光学ブランク値）を記録する（工程Ｓ１３０）。このとき、制御処理部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御処理部１６０は、位置切替機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。

次いで、制御処理部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を送液位置に移動させる（工程Ｓ１３５）。

次いで、制御処理部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、蛍光物質で標識された２次抗体を含む液体（標識液）を分析チップ１０の流路４１内に導入する（工程Ｓ１４０）。流路４１内では、抗原抗体反応（２次反応）によって、金属膜３０上に捕捉されている被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、流路４１内の標識液は除去され、流路内は洗浄液で洗浄される。

次いで、制御処理部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を工程Ｓ１２０で決定された適切な測定位置に移動させる（工程Ｓ１４５）。

次いで、制御処理部１６０は、励起光照射ユニット１１０および蛍光検出ユニット１３０を操作して、適切な測定位置に配置された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光γを検出する（工程Ｓ１５０）。

最後に、制御処理部１６０は、蛍光γの検出値から光学ブランク値を引き、被検出物質の量に相関する蛍光強度を算出する（工程Ｓ１５５）。算出された蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。

以上の手順により、試料液中の被検出物質の存在またはその量を検出することができる。

（第２の動作手順）
第２の動作でも、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０の出力情報として、励起光照射ユニット１１０のパワーに関する情報を取得する。そして、第２の動作では、励起光照射ユニット１１０のパワーに異常があると判断した場合には、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０のパワーの値に応じて蛍光γの検出値を補正する。

図１０は、ＳＰＦＳ装置１００の第２の動作手順の一例を示すフローチャートである。図１１Ａは、図１０に示される位置調整工程（Ｓ２２０）内の工程を示すフローチャートであり、図１１Ｂは、図１０に示される被検出物質の量に相関する蛍光強度の算出工程（Ｓ２５５）内の工程を示すフローチャートである。第２の動作手順では、被検出物質の量などの算出工程（工程Ｓ２５５）内に異常検出工程（工程Ｓ２５５２）が含まれる。

まず、分析チップ１０をＳＰＦＳ装置１００の設置位置に設置する（工程Ｓ２００）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１５４に分析チップ１０を設置する。

次いで、制御処理部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を送液位置に移動させる（工程Ｓ２０５）。

次いで、制御処理部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、薬液チップ１４１内の試料液を分析チップ１０の流路４１内に導入する（工程Ｓ２１０）。流路４１内では、抗原抗体反応（１次反応）によって、金属膜３０上に被検出物質が捕捉される。この後、流路４１内の試料液は除去され、流路４１内は洗浄液で洗浄される。なお、分析チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被検出物質を捕捉できるように、試料液を導入する前に流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。

次いで、制御処理部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を測定位置の近くまで移動させる（工程Ｓ２１５）。

次いで、制御処理部１６０は、励起光照射ユニット１１０、励起光検出ユニット１２０および搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０の位置情報と励起光照射ユニット１１０の出力情報とを取得する。制御処理部１６０は、取得された位置情報に基づいて分析チップ１０の位置を調整する（工程Ｓ２２０）。

図１１Ａに示されるように、この工程では、まず、チップホルダー１５４に保持された分析チップ１０に励起光αを照射するとともに、分析チップ１０の表面で反射された、励起光αの反射光βを検出して、分析チップ１０の位置情報と励起光照射ユニット１１０の出力情報（パワーに関する情報）とを取得する（工程Ｓ２２０１）。このとき取得された出力情報は、制御処理部１６０に記録される。

制御処理部１６０は、分析チップ１０の位置情報に基づいて、分析チップ１０の位置を調整する（工程Ｓ２２０２）。分析チップ１０の位置情報と、励起光照射ユニット１１０の出力情報とを取得する工程（工程Ｓ２２０１）は、工程Ｓ１２０１と同様であり、取得された位置情報に基づいて分析チップ１０を適切な測定位置に配置する工程（工程Ｓ２２０２）は、工程Ｓ１２０４と同様であるため、それらの説明を省略する。

次いで、制御処理部１６０は、工程Ｓ１２５と同様にして増強角を検出する（工程Ｓ２２５）。

次いで、制御処理部１６０は、工程Ｓ１３０と同様にして、光学ブランク値を測定し、記録する（工程Ｓ２３０）。

次いで、制御処理部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を送液位置に移動させる（工程Ｓ２３５）。

次いで、制御処理部１６０は、工程Ｓ１４０と同様にして、金属膜３０上に捕捉されている被検出物質を蛍光物質で標識する（工程Ｓ２４０）。

次いで、制御処理部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を工程Ｓ２２０で決定された適切な測定位置に移動させる（工程Ｓ２４５）。

次いで、制御処理部１６０は、工程Ｓ１５０と同様にして、捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光γを検出する（工程Ｓ２５０）。

最後に、制御処理部１６０は、被検出物質の量や濃度などを算出する（工程Ｓ２５５）。

図１１Ｂに示されるように、まず、蛍光γの検出値から光学ブランク値を引き、被検出物質の量に相関する蛍光強度を算出する（工程Ｓ２５５１）。

次いで、制御処理部１６０は、工程Ｓ２２０１で取得された上記出力情報に基づいて、励起光照射ユニット１１０のパワーが正常か否かを判断する（工程Ｓ２５５２）。制御処理部１６０には、工程Ｓ２２０１で検出された反射光βの検出値と、反射光βの初期値とが記憶されている。制御処理部１６０は、上記の検出値と初期値とを比較することで、励起光照射ユニット１１０のパワーが正常か否かを判断する。

制御処理部１６０は、励起光照射ユニット１１０のパワーが低下している（異常である）と判断した場合には、工程Ｓ２５５１で算出された蛍光強度を補正する（工程Ｓ２５５３）。具体的には、制御処理部１６０は、反射光βの検出値と初期値とに基づいて、励起光照射ユニット１１０のパワーがどの程度低下しているかを算出し、パワーの低下分を補うように設定された補正係数（例えば、励起光照射ユニット１１０のパワーが７０％に低下している場合は、１００／７０）を、工程Ｓ２５５１で算出された蛍光強度にかける。このようにして、制御処理部１６０は、算出された蛍光強度を補正する。補正された蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。

以上の手順により、試料液中の被検出物質の存在またはその量を検出することができる。

（効果）
以上のとおり、本実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置１００）では、励起光αの反射光βを検出することで、励起光照射ユニット１１０の出力情報（パワーに関する情報）を取得することができる。分析チップ１０の表面（本実施の形態では、入射面２１）で反射する反射光βは、励起光照射ユニット１１０からの励起光αの数％程度であるため、第１受光センサー１２１が飽和することがない。したがって、本実施の形態に係る分析方法およびＳＰＦＳ装置１００では、光量調整手段を別途設けなくても、励起光照射ユニット１１０が正常か否かを正確に判断でき、励起光照射ユニット１１０の異常による誤検出を防止することができる。また、光量調整用部品の交換や清掃などのメンテナンスに要する手間とコストを抑えることができる。

さらに、分析チップ１０は、分析のたびに交換され、励起光照射ユニット１１０からの励起光αは、常に清浄な面で反射されるため、反射面の経時劣化や埃などによる影響がない。このような観点からも、励起光照射ユニット１１０が正常か否かを正確に判断できる。

［実施の形態２］
実施の形態２では、励起光照射ユニット（励起光照射部）の出力情報として、励起光照射ユニット１１０のパワーと励起光αの照射方向とに関する情報を取得することができるＳＰＦＳ装置について説明する。

実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００は、励起光検出ユニット２２０の第１受光センサー２２１の構成のみが、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。このため、ＳＰＦＳ装置２００の構成としては、第１受光センサー２２１についてのみ説明し、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００の構成要素と同一の構成要素については、同一の符号を付して、その説明を省略する。また、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００で使用される分析チップ１０は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００で使用されるものと同じであるため、その説明を省略する。

（ＳＰＦＳ装置の構成）
図１は、本発明の実施の形態２に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット（励起光照射部）１１０、励起光検出ユニット（励起光検出部）２２０、蛍光検出ユニット（蛍光検出部）１３０、送液ユニット１４０、搬送ユニット１５０および制御処理部（処理部）１６０を有する。

励起光検出ユニット２２０は、第１受光センサー２２１および第１センサー制御部１２２を含む。

第１受光センサー２２１は、反射光βの光量および位置を検出する。たとえば、受光センサー２２１は、複数の受光面を有するフォトダイオード（ＰＤ）または位置検出素子（ＰＳＤ）である。第１受光センサー２２１が複数の受光面を有するＰＤである場合、第１受光センサー２２１の受光面の数は、特に限定されないが、４つ以上であることが好ましい。本実施の形態では、第１受光センサー２２１は、４つの受光面を有するＰＤである。また、第１受光センサー２２１がＰＳＤの場合、第１受光センサー２２１の受光面の大きさは、励起光αの照射位置を正確に検出する観点から、励起光αのビーム径よりも大きく構成されている。たとえば、励起光αのビーム径が１〜１.５ｍｍ程度の場合、第１受光センサー２２１の受光面の１辺の長さは３ｍｍ以上であることが好ましい。

第１受光センサー２２１は、励起光αの反射光βが入射する位置に配置されている。本実施の形態では、第１受光センサー２２１は、入射面２１からの反射光βが入射する位置に配置されている。好ましくは、第１受光センサー２２１は、蛍光γの検出時と同じかまたはそれに近い角度で出射された励起光αの反射光βが入射する位置に配置されている。励起光αの照射位置（照射位置）は、入射角の変化によりわずかに変化するため、分析チップ１０の位置決め時と蛍光γの検出時とで励起光αの入射角を同じかまたはそれに近い角度にすることで、蛍光γの検出時の位置決めの精度をより高くすることが可能となる。本実施の形態では、金属膜３０の法線（図１におけるｚ軸方向の直線）に対する励起光αの出射角が約７０°である場合、入射面２１からの反射光βは、搬送ステージの進行方向（図１におけるｘ軸方向）にほぼ水平に進む。したがって、第１受光センサー２２１は、この水平方向に進む反射光βが入射する位置に配置されている。

（ＳＰＦＳ装置の検出動作）
次に、ＳＰＦＳ装置２００の検出動作（本実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法）について説明する。本実施の形態では、ＳＰＦＳ装置２００は、励起光照射ユニット１１０の出力情報として、励起光照射ユニット１１０のパワーと励起光αの照射方向に関する情報とを取得する。そして、励起光照射ユニット１１０のパワーに異常があると判断した場合には、ＳＰＦＳ装置２００は、励起光照射ユニット１１０のパワーを調整する。また、励起光照射ユニット１１０からの励起光αの照射方向に異常があると判断した場合には、その後の動作を中止する。

図１２は、ＳＰＦＳ装置２００の動作手順の一例を示すフローチャートである。図１３は、図１２に示される位置および出力調整工程（工程Ｓ３２０）内の工程を示すフローチャートである。本実施の形態では、位置・出力調整工程（工程Ｓ３２０）内に異常検出工程（工程Ｓ３２０２および工程Ｓ３２０３）が含まれる。

まず、分析チップ１０をＳＰＦＳ装置２００の設置位置に設置する（工程Ｓ３００）。具体的には、ＳＰＦＳ装置２００のチップホルダー１５４に分析チップ１０を設置する。

次いで、制御処理部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を送液位置に移動させる（工程Ｓ３０５）。

次いで、制御処理部１６０は、送液ユニット１４０を操作して、薬液チップ１４１内の試料液を分析チップ１０の流路４１内に導入する（工程Ｓ３１０）。流路４１内では、抗原抗体反応（１次反応）によって、金属膜３０上に被検出物質が捕捉される。この後、流路４１内の試料液は除去され、流路４１内は洗浄液で洗浄される。なお、分析チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被検出物質を捕捉できるように、試料液を導入する前に流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。

次いで、制御処理部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を測定位置の近くまで移動させる（工程Ｓ３１５）。

次いで、制御処理部１６０は、励起光照射ユニット１１０、励起光検出ユニット２２０および搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０の位置情報と励起光照射ユニット１１０の出力情報とを取得する。制御処理部１６０は、取得された位置情報に基づいて分析チップ１０の位置を調整し、取得された出力情報に基づいて励起光照射ユニット１１０の出力を調整する（工程Ｓ３２０）。また、制御処理部１６０は、取得された出力情報に基づいて励起光照射ユニット１１０の励起光αの照射方向が異常であると判断した場合には、その後の工程を中止する。

制御処理部１６０は、取得された出力情報に基づいて、励起光照射ユニット１１０からの励起光αの照射方向が正常か否かを判断する（工程Ｓ３２０２）。制御処理部１６０には、励起光照射ユニット１１０の初期状態における励起光αの照射方向に関する情報が記憶されている。より具体的には、制御処理部１６０には、反射光βの第１受光センサー２２１に対する照射位置（以下、単に「初期位置」ともいう）に関する情報が記憶されている。詳細については後述するが、制御処理部１６０は、工程Ｓ３２０１で検出された反射光βの第１受光センサー２２１上の照射スポットの位置と、あらかじめ制御処理部１６０に記憶されている初期位置とを比較することで、励起光照射ユニット１１０からの励起光αの照射方向が正常か否かを判断する。

制御処理部１６０は、励起光αの照射方向が正常であると判断した場合には、その後の動作を継続し、励起光αの照射方向が所期の方向からずれている（異常）と判断した場合には、動作を終了する。

パワーの異常を検出する工程（工程Ｓ３２０３）と、励起光照射ユニット１１０のパワーを調整する工程（工程Ｓ３２０４）と、分析チップ１０の位置情報に基づいて分析チップ１０を適切な測定位置に配置する工程（工程Ｓ３２０５）とは、実施の形態１における工程Ｓ１２０２〜Ｓ１２０４とそれぞれ同様であるため、その説明を省略する。

図１４は、４つの受光面を有するＰＤを使用した場合において、励起光照射ユニット１１０の出力情報（パワーと励起光αの照射方向とに関する情報）を取得する工程（工程Ｓ３２０１）を説明するための模式図である。図１４において、梨地の部分は、第１受光センサー２２１の受光面２２１ａ〜ｄに照射された励起光αの照射スポットを示している。

図１４に示されるように、本実施の形態では、第１受光センサー２２１は、４つの受光面２２１ａ〜ｄを有するＰＤである。各受光面２２１ａ〜ｄに励起光αが入射したときに、各受光面２２１ａ〜ｄでは、照射された反射光βの光量に応じた光電流Ｉａ〜ｄがそれぞれ発生する。各受光面２２１ａ〜ｄから出力される光電流Ｉａ〜ｄの大きさを比較することで、受光面２２１ａ〜ｄの面内方向における励起光αの照射位置を特定することができる。制御処理部１６０は、反射光βの第１受光センサー２２１への照射位置に基づいて、励起光αの照射方向に関する情報を取得することができる。例えば、（Ｉ_ａ＋Ｉ_ｂ）：（Ｉ_ｃ＋Ｉ_ｄ）の比から、図１４中の上下方向における反射光βの照射位置を特定し、（Ｉ_ａ＋Ｉ_ｃ）：（Ｉ_ｂ＋Ｉ_ｄ）の比から、図１４中の左右方向における反射光βの照射位置を特定することができる。本実施の形態では、制御処理部１６０には、上記初期位置として第１受光センサー２２１の各受光面２２１ａ〜ｄから出力された光電流値Ｉ_ａ〜ｄが記憶されており、工程Ｓ３２０１で測定された光電流値Ｉ_ａ〜ｄと、あらかじめ記憶されている光電流値Ｉ_ａ〜ｄとを比較することで、制御処理部１６０は、励起光αの照射方向がずれているか否かを判断することができる。

また、本実施の形態では、制御処理部１６０は、各受光面２２１ａ〜ｄから出力される光電流Ｉ_ａ〜ｄの総和（Ｉ_ａ＋Ｉ_ｂ＋Ｉ_ｃ＋Ｉ_ｄ）により、反射光βの強度を測定でき、励起光照射ユニット１１０のパワーに関する情報を取得することができる。制御処理部１６０は、工程Ｓ３２０１で測定された光電流Ｉ_ａ〜ｄの総和（Ｉ_ａ＋Ｉ_ｂ＋Ｉ_ｃ＋Ｉ_ｄ）と、あらかじめ記憶されている光電流Ｉ_ａ〜ｄの総和（Ｉ_ａ＋Ｉ_ｂ＋Ｉ_ｃ＋Ｉ_ｄ）とを比較することで、励起光照射ユニット１１０のパワーが低下しているか否かを判断することができる。

なお、励起光αの照射方向の異常を検出する工程（工程Ｓ３２０２）と励起光照射ユニット１１０のパワーの異常を検出する工程（工程Ｓ３２０３）との順番は、これに限定されず、パワーの異常を検出する工程（工程Ｓ３２０３）を行った後に、励起光αの照射方向の異常を検出する工程（工程Ｓ３２０２）を行ってもよい。

また、第１受光センサー２２１としてＰＤの代わりにＰＳＤを使用した場合も、励起光照射ユニット１１０の出力情報（パワーと励起光αの照射方向とに関する情報）を取得することができる。分割された複数の受光面を有するＰＤでは、隣接する受光面間の領域（励起光βを受光しない領域）に入射した反射光βが検出されないため、反射光βのすべての光量を検出することはできない。これに対し、ＰＳＤの受光面は、連続した１つの面であるため、反射光βのすべての光量を検出することができる。このように、より正確に反射光βの光量を検出する観点からは、第１受光センサー２２１としてＰＳＤを使用することがより好ましい。

次いで、制御処理部１６０は、工程Ｓ１２５と同様にして増強角を検出する（工程Ｓ３２５）。

次いで、制御処理部１６０は、工程Ｓ１３０と同様にして、光学ブランク値を測定し、記録する（工程Ｓ３３０）。

次いで、制御処理部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を送液位置に移動させる（工程Ｓ３３５）。

次いで、制御処理部１６０は、工程Ｓ１４０と同様にして、金属膜３０上に捕捉されている被検出物質を蛍光物質で標識する（工程Ｓ３４０）。

次いで、制御処理部１６０は、搬送ステージ１５２を操作して、分析チップ１０を工程Ｓ３２０で決定された適切な測定位置に移動させる（工程Ｓ３４５）。

次いで、制御処理部１６０は、工程Ｓ１５０と同様にして、捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光γを検出する（工程Ｓ３５０）。

最後に、制御処理部１６０は、蛍光γの検出値から光学ブランク値を引き、被検出物質の量に相関する蛍光強度を算出する（工程Ｓ３５５）。検出された蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。

以上の手順により、試料液中の被検出物質の存在またはその量を検出することができる。

（効果）
実施の形態２に係る分析方法およびＳＰＦＳ装置では、実施の形態１の効果に加え、励起光照射ユニット１１０からの励起光αの照射方向の異常についても検出することができる。

なお、上記実施の形態１、２に係る分析方法およびＳＰＦＳ装置では、図５Ｂにおける点Ｂ（反射光βの強度の最大値）に基づいて、励起光照射ユニット１１０のパワーに関する情報を取得したが、本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、これに限定されない。図１５は、励起光照射ユニットのパワーに関する情報を取得するための他の方法を説明するためのグラフである。たとえば、図５Ｂにおける点Ｂの代わりに、点Ａ−Ｃ間の直線の傾き（分析チップ１０の移動距離の変化量に対する反射光強度の変化量の比）に基づいて、励起光照射ユニット１１０のパワーに関する情報を取得してもよい。この場合、制御処理部１６０には、励起光照射ユニット１１０のパワーに関する情報として、点Ａ−Ｃ間の直線の傾きが記憶される。図１５において、黒丸（●）は、初期状態の励起光照射ユニット１１０を使用したときの第１受光センサーによる反射光の検出結果を示し、白丸（○）は、パワーが低下した状態の励起光照射ユニット１１０を使用したときの第１受光センサーによる反射光の検出結果を示している。ここでは、励起光照射ユニット１１０のパワーが初期状態におけるパワーの１／２に低下した場合の結果を示している。図１５に示されるように、初期状態の励起光照射ユニット１１０を使用した場合と比較して、パワーが低下した状態の励起光照射ユニット１１０を使用した場合の反射光βの最大値は、１／２になっている。これにともない、傾斜部（移動距離：約２３２０〜約２３８０μｍ）の傾きも１／２になっている。このように、分析チップ１０の移動距離の変化量に対する反射光強度の変化量の比によっても、励起光照射ユニット１１０のパワーに関する情報を取得することができる。

また、本発明に係る分析方法における各工程の順番は、上記実施の形態１、２に限定されない。

たとえば、分析チップ１０の位置調整は、励起光照射ユニット１１０のパワーを調整する前に行ってもよいし、励起光照射ユニット１１０のパワーを調整した後に行ってもよいし、励起光照射ユニット１１０のパワーの調整と同時に行ってもよい。

また、増強角の検出（工程Ｓ１２５、Ｓ２２５、Ｓ３２５）は、１次反応（工程Ｓ１１０、Ｓ２１０、Ｓ３１０）の前に行ってもよい。この場合、位置（位置および出力）調整（工程Ｓ１２０、Ｓ２２０、Ｓ３２０）も、１次反応（工程Ｓ１１０、Ｓ２１０、Ｓ３１０）の前に実施される。このようにすることで、図２、図１０および図１２に示されるフローチャートにおいて１次反応（工程Ｓ１２０、Ｓ２２０、Ｓ３２０）と２次反応（工程Ｓ１４０、Ｓ２４０、Ｓ３４０）の間に行っていた分析チップ１０を送液位置に移動させる工程（工程Ｓ１３５、Ｓ２３５、Ｓ３３５）を省略することができる。また、１次反応（工程Ｓ１２０、Ｓ２２０、Ｓ３２０）を行う前の分析チップ１０を送液位置に移動させる工程（工程Ｓ１０５、Ｓ２０５、Ｓ３０５）における位置精度が高まり、１次反応（工程Ｓ１２０、Ｓ２２０、Ｓ３２０）および２次反応（工程Ｓ１４０、Ｓ２４０、Ｓ３４０）において、送液ユニット１４０のシリンジ１４４の先端を分析チップ１０内により確実に挿入できるようになる。このため、ユーザーがチップホルダー１５４に分析チップ１０を設置する工程（工程Ｓ１００、Ｓ２００、Ｓ３００）において要求される分析チップ１０の位置精度が緩くなり、ユーザビリティが向上する。

また、上記の説明では、被検出物質と捕捉体とを反応させる工程（１次反応、工程Ｓ１１０、Ｓ２１０、Ｓ３１０）の後に、被検出物質を蛍光物質で標識する工程（２次反応、工程Ｓ１４０、Ｓ２４０、Ｓ３４０）を行った（２工程方式）。しかしながら、被検出物質を蛍光物質で標識するタイミングは、特に限定されない。たとえば、分析チップ１０の流路内に試料液を導入する前に、試料液に標識液を添加して被検出物質を予め蛍光物質で標識しておいてもよい。また、分析チップ１０の流路内に試料液と標識液を同時に注入してもよい。前者の場合は、分析チップ１０の流路内に試料液を注入することで、蛍光物質で標識されている被検出物質が捕捉体により捕捉される。後者の場合は、被検出物質が蛍光物質で標識されるとともに、被検出物質が捕捉体により捕捉される。いずれの場合も、分析チップ１０の流路内に試料液を導入することで、１次反応および２次反応の両方を完了することができる（１工程方式）。このように１工程方式を採用する場合は、抗原抗体反応の前に増強角の検出（工程Ｓ１２５、Ｓ２２５、Ｓ３２５）が実施され、さらにその前に、位置（位置および出力）調整（工程Ｓ１２０、Ｓ２２０、Ｓ３２０）が実施される。

さらに、上記実施の形態１、２では、出力情報とともに位置情報を得る場合について説明したが、本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、これに限定されない。たとえば、本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、出力情報のみを取得するために使用されてもよい。

［参考実験］
１．励起光の入射角と反射率との関係
まず、プリズムに対する励起光の入射角と反射率との関係について計算を行った。プリズムの屈折率は、１．５に設定した。計算結果を図１６Ａ、Ｂに示す。

図１６Ａ、Ｂは、励起光の入射角と反射率との関係を示すグラフである。図１６Ａは、励起光がプリズムの外部からプリズムの面に入射する場合の結果を示しており、図１６Ｂは、励起光がプリズムの内部からプリズムの面に入射する場合の結果を示している。図１６Ａ、Ｂにおいて、実線は、ｐ偏光の光を示しており、破線は、ｓ偏光の光を示している。

図１６Ａ、Ｂに示されるように、励起光の反射率は、プリズムに対する励起光の入射角が小さいときは、ほぼ一定であることがわかった。

２．プリズムの屈折率と反射率との関係
次いで、プリズムの屈折率と励起光のｐ偏光の反射率との関係について計算を行った。本実施例では、金属膜への入射角が７１°となるように、入射面に対する励起光の入射角を９°（０．１５８ラジアン）と設定した。プリズムの屈折率１．５２７を基準として、±０．００２変化させた場合の励起光の反射率と、±０．００３変化させた場合の励起光の反射率について計算を行った。計算の結果を表１に示す。屈折率の差は、１．５２７を基準としたときの屈折率の差である。また、反射率の変化率［％］は、プリズムの屈性率が１．５２７のときの反射率を基準としたときの変化率である。

表１に示されるように、プリズムの屈折率が１．５２７のとき、励起光のｐ偏光の反射率は、約４．２％であった。また、屈折率のばらつきが±０．００２のとき、反射率の変化率は、±０．６１％程度であり、屈折率のばらつきが±０．００３のとき、反射率の変化率は、±０．９１％程度であった。すなわち、屈折率のばらつきが±０．００３程度であれば、反射率の変化率は１％以内となり、反射率はほぼ一定となることがわかる。

以上より、励起光のプリズムに対する入射角が小さい場合には、プリズムの材料が同じであれば、励起光の反射率はほぼ一定となるため、励起光のプリズムからの反射光を検出することで、励起光照射ユニットのパワーに関する情報を取得して、パワーの異常を正確に検出することができることがわかる。

本出願は、２０１５年１１月１３日出願の特願２０１５−２２３０５９に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、被検出物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば臨床検査などに有用である。

１０、１０’ 分析チップ
２０ プリズム
２１ 入射面
２２ 成膜面
２３ 出射面
３０ 金属膜
４０ 流路蓋
４１ 流路
４２ スペーサー
１００、２００ ＳＰＦＳ装置
１１０ 励起光照射ユニット
１１１ 光源ユニット
１１２ 角度調整機構
１１３ 光源制御部
１２０、２２０ 励起光検出ユニット
１２１、２２１ 第１受光センサー
２２１ａ〜ｄ 受光面
１２２ 第１センサー制御部
１３０ 蛍光検出ユニット
１３１ 受光ユニット
１３２ 位置切替機構
１３３ 第２センサー制御部
１３４ 第１レンズ
１３５ 光学フィルター
１３６ 第２レンズ
１３７ 第２受光センサー
１４０ 送液ユニット
１４１ 薬液チップ
１４２ シリンジポンプ
１４３ 送液ポンプ駆動機構
１４４ シリンジ
１４５ プランジャー
１５０ 搬送ユニット
１５２ 搬送ステージ
１５４ チップホルダー
１６０ 制御処理部
α 励起光
β 励起光の反射光
γ 蛍光
δ プラズモン散乱光

Claims (14)

1. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
   入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された捕捉体とを含み、チップホルダーに設置された分析チップに励起光照射部から励起光を照射するとともに、前記分析チップで反射された励起光を検出して、前記励起光照射部の出力情報を取得する工程を含む、表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
2. 搬送ステージに固定された前記チップホルダーに設置された前記分析チップに前記励起光照射部から励起光を照射するとともに、前記分析チップで反射された励起光を検出して、前記分析チップの位置情報を取得する工程をさらに含む、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
3. 前記励起光照射部の出力情報を取得する工程と、前記分析チップの位置情報を取得する工程とは、同時に行われる、請求項２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
4. 前記励起光照射部の出力情報を取得する工程および前記分析チップの位置情報を取得する工程では、前記分析チップの互いに隣接する２つの面に励起光を照射し、
   前記２つの面で反射された励起光の強度に基づいて、前記分析チップの位置情報を取得し、
   前記分析チップで反射された励起光の強度の最大値に基づいて、前記励起光照射部の出力情報を取得する、
   請求項３に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
5. 前記励起光照射部の出力情報を取得する工程および前記分析チップの位置情報を取得する工程では、前記分析チップの前記入射面と前記入射面に隣接する面とに励起光を照射する、請求項４に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
6. 前記励起光照射部の出力情報を取得する工程では、前記入射面からの反射光を検出する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
7. 前記励起光照射部の出力情報と、あらかじめ取得されている前記励起光照射部の基準となる出力情報とを比較して、前記励起光照射部が正常か否かを判断する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
8. 前記分析チップに前記励起光照射部から励起光を照射するとともに、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
9. 前記位置情報に基づいて前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップを測定位置に移動させる工程と、
   前記測定位置に配置されている前記分析チップに前記励起光照射部から励起光を照射するとともに、前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、
   をさらに含む、
   請求項２〜７のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
10. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
    入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定化された捕捉体とを含む分析チップを着脱可能に保持するためのチップホルダーと、
    前記チップホルダーに保持された前記分析チップに励起光を照射する励起光照射部と、
    前記分析チップで反射された励起光を検出する励起光検出部と、
    前記捕捉体に捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光を検出する蛍光検出部と、
    前記励起光検出部の検出結果に基づいて、前記励起光照射部の出力情報を取得する処理部と、
    を有する、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
11. 前記チップホルダーを移動させる搬送ステージをさらに有し、
    前記処理部は、
    前記励起光検出部の検出結果に基づいて、前記チップホルダーに保持された前記分析チップの位置情報をさらに取得し、
    前記位置情報に基づいて、前記搬送ステージにより前記チップホルダーを移動させて、前記分析チップを測定位置に移動させる、
    請求項１０に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
12. 前記励起光検出部は、複数の受光面を有するフォトダイオードであり、
    前記励起光照射部の出力情報は、前記励起光照射部のパワーと前記励起光照射部の励起光の照射方向とに関する情報である、
    請求項１０または請求項１１に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
13. 前記励起光検出部は、位置検出素子であり、
    前記励起光照射部の出力情報は、前記励起光照射部のパワーと前記励起光照射部からの励起光の照射方向とに関する情報である、
    請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
14. 前記処理部は、
    前記励起光照射部の基準となる出力情報を記憶しており、
    前記励起光照射部の出力情報と前記励起光照射部の基準となる出力情報とを比較して、前記励起光照射部が正常か否かを判断する、
    請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。

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