図1は、本発明の一実施の形態に係るSPFS装置100の構成を示す模式図である。SPFS装置100は、誘電体プリズム上の金属膜に対して励起光を表面プラズモン共鳴が生じる角度で入射することで、金属膜表面上に局在場光(一般に、「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる)を発生させることができる。この局在場光により金属膜上に配置された被検出物質または被検出物質を標識する蛍光物質が選択的に励起され、蛍光物質から放出された蛍光の光量を検出することで、被検出物質の濃度または量を検出する。
SPFS装置100は、図1に示されるように、励起光学系ユニット110、受光光学系ユニット120、送液ユニット130、分析チップ移動機構140および制御部160から構成される。SPFS装置100は、被検出物質の測定では、不図示のチップホルダーに分析チップ10を装着した状態で使用される。そこで、分析チップ10について先に説明し、その後にSPFS装置100の各構成要素について説明する。
分析チップ10は、図1に示されるように、入射面21、成膜面22および出射面23を有するプリズム20と、成膜面22に形成された金属膜30と、成膜面22または金属膜30上に配置された流路蓋40とを有する。通常、分析チップ10は、分析のたびに交換される。分析チップ10は、好ましくは、各片の長さが数mm〜数cmである構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
プリズム20は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム20は、入射面21、成膜面22および出射面23を有する。入射面21は、励起光学系ユニット110からの励起光αをプリズム20の内部に入射させる。成膜面22の上には、金属膜30が形成される。プリズム20の内部に入射した励起光αは、金属膜30で反射する。より具体的にはプリズム20と金属膜30との界面(成膜面22)で反射する。出射面23は、金属膜30で反射した励起光αをプリズム20の外部に出射させる。
プリズム20の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム20の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面22であり、一方の脚に対応する面が入射面21であり、他方の脚に対応する面が出射面23である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面21と出射面23とが対称になり、励起光αのS波成分がプリズム20内に滞留しにくくなる。
入射面21は、励起光αが励起光学系ユニット110に戻らないように形成される。励起光αが励起光源であるレーザーダイオードに戻ると、レーザーダイオードの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまうからである。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面21に垂直に入射しないように、入射面21の角度が設定される。たとえば、入射面21と成膜面22との角度および成膜面22と出射面23との角度は、いずれも約80°である。
なお、分析チップ10の設計により共鳴角(およびその極近傍にある増強角)が凡そ決まる。設計要素は、プリズム屈折率、金属の屈折率、金属の膜厚、金属の消衰係数、励起波長などである。金属膜に固定された被検出物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
プリズム20は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム20の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム20の材料は、好ましくは、屈折率が1.4〜1.6であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
金属膜30は、プリズム20の成膜面22上に形成されている。これにより、成膜面22に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜30中の自由電子との間で相互作用、すなわち表面プラズモン共鳴が生じ、金属膜30の表面上に局在場光を生じさせることができる。
金属膜30の素材は、表面プラズモン共鳴を生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜30の素材の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜30は、金薄膜である。金属膜30の形成方法は、特に限定されない。金属膜30の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜30の厚みは、特に限定されないが、30〜70nmの範囲内が好ましい。
また、図1では図示しないが、金属膜30のプリズム20と対向しない面(金属膜30の表面)には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定されていてもよい。捕捉体を固定することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。本実施の形態では、金属膜30上の所定の領域に、捕捉体が均一に固定されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体またはその断片である。
流路蓋40は、金属膜30のプリズム20と対向しない面上に(後述する流路を隔てて)配置されている。金属膜30がプリズム20の成膜面22の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋40は、成膜面22上に(後述する流路を隔てて)配置されていてもよい。流路蓋40は、金属膜30(およびプリズム20)と共に、液体が流れる流路を形成する。当該液体の例には、被検出物質の溶液である試料液および薬液が含まれ、薬液の例には、蛍光物質の溶液および洗浄液が含まれる。捕捉体は、不図示の流路内に露出している。流路の両端は、流路蓋40の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路内へ液体が注入されると、流路内において、当該液体は捕捉体に接触する。
流路蓋40は、金属膜30上から放出された光(プラズモン散乱光および蛍光)に対して透明な材料からなる。流路蓋40の材料の例には、樹脂が含まれる。これらの光を受光光学系ユニット120に導くことができれば、流路蓋40は、少なくとも、被検出物質を標識した蛍光物質からの蛍光を外部に取り出す面が、光学的に透明であれば、流路蓋40の一部は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋40は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜30またはプリズム20に接合されている。
このように構成される分析チップ10には、流路内に直接もしくは流路内での反応により蛍光物質が供給される。そして、金属膜上に供給され、蛍光物質で標識された被検出物質を有する分析チップは、チップホルダーに所定の姿勢で設置保持される。
励起光学系ユニット110は、励起光αをプリズム20に向けて出射するための構成と、金属膜30の裏面に対する励起光αの入射角度を走査するための構成とを含む。励起光学系ユニット110は、例えば、光源ユニット111、角度調整機構112および光源制御部113によって構成される。ここで、「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズムを介して金属膜30に向けて表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されて金属膜30の表面上に局在場光を生じさせる光であり、この局在場光により蛍光物質を間接的に励起させる光である。
光源ユニット111は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜30裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット111は、例えば、励起光の光源、ビーム整形光学系、APC機構および温度調整機構(いずれも不図示)を有する。励起光αの光源は、例えば、レーザーダイオード(以下「LD」とも言う)である。
上記LDは、チップホルダーに保持された分析チップ10の入射面21に向けて励起光α(シングルモードレーザー光)を出射する。より具体的には、光源ユニット111は、分析チップ10の金属膜30に対して励起光αが表面プラズモン共鳴を生じる角度で、金属膜30に対するP波のみを入射面21に向けて出射する。
なお、光源ユニット111に含まれる光源の種類は、特に限定されず、LDでなくてもよい。光源の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
光源ユニット111における上記ビーム整形光学系は、例えば、コリメーター、バンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリットおよびズーム手段によって構成される。ビーム整形光学系は、上記の構成要素の全てによって構成されていてもよいし、一部によって構成されていてもよい。コリメーターは、LDから出射された励起光αをコリメートする。LDは、射出状態で既に形状が扁平であり、且つ偏光方向が概ね一方に偏っている。コリメート化しても、該LDは、全反射条件(浅い角度)で照射される位置において照射面が円形になるように、短軸側から入射するように保持されている。
バンドパスフィルターは、光源ユニット111からの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源ユニット111からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源ユニット111からの励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜30にP波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜30裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
光源ユニット111における上記APC機構は、コリメートされた後の励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出し、励起光αの光量が一定になるように、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、出力を一定に制御している。
光源ユニット111における上記温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。LDの出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動する。このため、温度調整機構でLDの温度を一定に保つことにより、当該波長を一定に制御する。
角度調整機構112は、金属膜30の裏面(プリズム20と金属膜30との界面(成膜面22))への励起光αの入射角度を走査して調整する。角度調整機構112は、プリズム20を介して金属膜30(成膜面22)の所定の位置に向けて所定の入射角で、励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダーとを相対的に回転させる。
たとえば、角度調整機構112は、光源ユニット111を励起光αの光軸と直交する軸(図1の紙面に対して垂直な軸)を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜30(成膜面22)上での照射位置がほとんど移動しないように、上記軸の位置を設定する。
光源ユニット111を入射光軸と直交する軸を回転軸として、光源ユニット111を回転(1軸回転)して励起光αの入射角度を走査することで、プリズム20に、入射角度を変えて励起光αを照射する。当該入射角度の走査のための回転を行っても、分析チップ10の金属膜30(成膜面22)上での照射位置がほとんどずれないように上記回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における2つの励起光αの光軸の交点近傍(成膜面22上の照射位置と入射面21との間)に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
励起光αの入射角度のうち、上記走査によりプラズモン散乱光の最大光量を得られる角度が増強角度であり、その増強角度またはその近傍の角度に励起光αの入射角度を設定することで、大きな強度の蛍光を測定することが可能となる。なお、分析チップに付随のプリズムの材質、形状、金属膜厚、流路内の流体の屈折率などにより、基本の励起光入射条件が決まるが、流路内の蛍光物質の材質や量、プリズム側の誤差などにより若干条件のゆらぎが発生する。このため、測定毎に最適な増強角度を求めることが好ましい。増強角度は、例えば、小数点第一位まで求められる。
光源制御部113は、光源ユニット111を構成する前述した各種機器を作動させ、制御し、光源ユニット111の出射光の出射を制御する。光源制御部113は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
受光光学系ユニット120には、金属膜30(成膜面22)への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光や蛍光などの光が入射する。受光光学系ユニット120は、例えば、受光ユニット121、位置切り替え機構122およびセンサー制御部123によって構成される。
受光ユニット121は、分析チップ10の金属膜30(成膜面22)の法線方向に配置される。受光ユニット121は、例えば、第一レンズ124、光学フィルター125、第二レンズ126および受光センサー127によって構成される。
第一レンズ124は、例えば、集光レンズであり、金属膜30上から出射される光を集光する。第二レンズ126は、例えば、結像レンズであり、第一レンズ124で集光された上記光を受光センサー127の受光面に再結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター125は、両レンズの間に配置されている。
光学フィルター125は、蛍光成分のみを受光センサー127に導き、高いS/N比で当該蛍光成分を検出するために、励起光成分(プラズモン散乱光)を除去する。光学フィルター125の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター125は、例えば、所定の光成分を反射することで除去する多層膜からなるフィルターであるが、所定の光成分を一般的には吸収することで除去する色ガラスフィルターであってもよい。
受光センサー127は、微小量の被検出物質からの微弱な蛍光を検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー127は、図2に示されるように、例えば、ヘッドオンタイプの光電子増倍管(PMT)である。
図2は、受光センサー127をその中心軸CAに沿って切断したときの断面を示す図である。図2中の矢印は、入射窓(受光面)25に入射する光、光電子、二次電子またはそれ以降に発生した電子、を表す。中心軸CAは、入射窓25の中心を通る、z方向(光電面26の法線方向)に平行な直線である。
受光センサー127は、図2に示されるように、受光ユニット121から入射する光が通過する入射窓(受光面)25と、入射窓25を覆うように受光センサー127内側に入射窓(受光面)25に対して平行に配置され、当該入射する光によって光電子を発生させるための光電面26と、光電面26で発生した光電子が最初に衝突する、当該光電子を増幅するための第一ダイノード27と、第一ダイノード27で増幅された光電子(二次電子)が衝突する、当該増幅された光電子をさらに増幅するための第二ダイノード28とを含む。光電面26は、入射する光の入射方向に沿って光電子を放出する透過型光電面である。受光センサー127は、不図示の第三、第四などの複数の高次ダイノードをさらに有する。
第一ダイノード27および第二ダイノード28は、例えば板状の電極を曲げた形状であり、それぞれyz平面での断面形状は、中心角が約45°の略円弧状である。第一ダイノード27は、光電面26で発生した光電子が第一ダイノード27に衝突し、第二ダイノード28に向けて二次電子を放出するように、光電面26に対して傾斜して配置されている。たとえば、湾曲した凹面を正面としたときに、第一ダイノード27は、光電面26と第二ダイノード28のいずれに対しても対向して配置されている。同様に、第二ダイノード28は、第一ダイノード27および不図示の後段の第三ダイノードのいずれに対しても対向して配置されている。
なお、ダイノードの形状は、板状部材を曲げたようなシリンドリカル的な形状だけでなく、x軸方向にも曲げられた3D的な曲面であってもよい。x軸方向にも曲げることで、放出された光電子(2次電子)を次のダイノードに向けて集めることが可能となる。
受光センサー127は、中心軸CAを回転軸とする回転方向における任意の向きで固定可能に構成されている。たとえば、受光センサー127は、受光センサー127の感度の変化が少ない方向が、後述する励起光αの入射角度を走査した時の光軸が移動する方向に対して平行になる向きで配置されている。
位置切り替え機構122は、光学フィルター125の位置を、受光ユニット121における光路中の位置または当該光路から外れた位置に切り替える。位置切り替え機構122は、例えば、回転駆動部と、光学フィルター125を有するターンテーブルやラックアンドピニオンなどの、回転運動によって光学フィルター125を上記光路に対して進出させ、当該光路から後退させる公知の機構とによって構成される。
センサー制御部123は、受光センサー127の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー127の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー127の感度の変更、などを制御する。センサー制御部123は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
なお、受光ユニット121は、励起光αが金属膜30(成膜面22)に入射したときに金属膜30の表面上から出射される光が受光センサー127の受光面に入射したときの入射スポットを、上記受光面よりも小さくするように、構成されている。
送液ユニット130は、分析チップ10に試料液または薬液を供給する。送液ユニット130は、例えば、薬液チップ131、シリンジポンプ132および送液ポンプ駆動機構133によって構成される。
薬液チップ131は、試料液および薬液を収容する容器である。薬液チップ131は、通常、試料液および薬液の種類に応じて複数配置される。
シリンジポンプ132は、シリンジ134と、シリンジ134内を往復動作可能なプランジャー135とによって構成される。プランジャー135の往復運動によって、試料液または薬液の吸引および排出が定量的に行われる。
シリンジ134が交換可能であると、シリンジ134の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などの影響を抑える観点から好ましい。シリンジ134が交換可能に構成されていないと、シリンジ134内を洗浄する構成をさらに有することにより、シリンジ134を交換せずに使用することが可能となる。このため、シリンジ134の消費を抑制する観点から好ましい。
送液ポンプ駆動機構133は、例えば、プランジャー135の駆動装置と、シリンジポンプ132の移動装置とによって構成される。
シリンジポンプ132の駆動装置は、プランジャー135を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む当該駆動装置は、シリンジポンプ132の送液量や送液速度を一定に管理し、分析チップ10の残液量を一定に管理する観点から好ましい。
シリンジポンプ132の移動装置は、例えば、シリンジポンプ132を、シリンジ134の軸方向(例えば垂直方向)と、当該軸方向を横断する方向(例えば水平方向)との二方向に自在に動かす装置である。シリンジポンプ132の移動装置は、例えば、ロボットアーム、2軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
送液ユニット130は、シリンジ134の先端の位置を検出する装置をさらに有することが、シリンジ134と分析チップ10との相対的な高さを一定に調整し、分析チップ10内での残液量を一定に管理する観点から好ましい。
送液ユニット130は、薬液チップ131より各種の薬液などの液体を吸引し、後述する分析チップ移動機構140で送液操作位置(送液ユニット130によって分析チップ10に対して試料液または薬液が供給または排出される位置)まで搬送された分析チップ10まで移動し、当該薬液を分析チップ10に供給する。この際、プランジャー135を、分析チップ10に対して進出、後退する方向、例えば上下方向、に動かすことで、分析チップ10中の流路内を液体が往復し、当該流路内の液体が攪拌される。上記の操作を行う観点から、分析チップ10における、分析チップ10に供給されるべき液体が収容される液挿入部は、多層フィルムで保護されており、シリンジ134が当該液体の供給のために当該多層フィルムを貫通した時に、上記液挿入部を密閉するように、分析チップ10およびシリンジ134が構成されていることが好ましい。
上記の操作により、当該液体の濃度の均一化や、分析チップ10の所定位置への被検出物質の固定化反応の促進などが行われる。反応後の液体は、再びシリンジポンプ132で吸引され、薬液チップ131などに排出される。上記の動作の繰り返しにより、各種薬液による反応、洗浄などを実施し、分析チップ10の所定位置に、被検出物質が配置され、当該被検出物質が蛍光物質によって標識される。
分析チップ移動機構140は、少なくとも分析チップ10を、測定位置(より詳しくは、光源ユニット111によって励起光αが照射され、発生した蛍光を受光光学系ユニット120で検出できる位置、または上記送液操作位置に自在に搬送する。分析チップ移動機構140は、例えば、搬送ステージによって構成される。分析チップ10は、チップホルダーを介して搬送ステージ上に配置される。搬送ステージは、例えば、ステッピングモーターなどで駆動させる。それにより、分析チップ10は、上記測定位置と上記送液操作位置との間を自在に移動し、また当該位置のそれぞれに正確に固定される。
制御部160は、角度調整機構112、光源制御部113、位置切り替え機構122、センサー制御部123、送液ポンプ駆動機構133および分析チップ移動機構140を駆動させ、制御する。制御部160は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
SPFS装置100は、プリズム20の一面上に配置された金属膜30に対して、プリズム20を介して励起光αを照射し、金属膜30上に捕捉された被検出物質または被検出物質を標識する蛍光物質を選択的に励起させ、蛍光物質から放出された蛍光を検出して被検出物質の量を測定する。SPFS装置100におけるシーケンス制御の一例に基づき、SPFS装置100によるSPFS方法の実施を説明する。
制御部160は、図3に示されるように、制御部160は、分析チップ移動機構140に、分析チップ10を送液操作位置に配置させる(ステップ301)。
分析チップ10の流路内には、保湿剤が塗布されている場合がある。たとえば、分析チップ10の金属膜30上に、被検出物質を捕捉する固相膜が配置されている場合では、当該固相膜での当該被検出物質を捕捉する感度が長期間の固定の間に低下しないよう、通常、当該固相膜に保湿剤が塗布される。当該固相膜は、例えば、前述した捕捉体を含む膜である。当該固相膜が金属膜30に配置されている場合、制御部160は、送液ユニット130に、分析チップ10の流路内の保湿剤を洗浄させる(ステップ302)。当該洗浄により、分析チップ10における被検出物質を補足する高い感度が回復する。
次いで、制御部160は、送液ユニット130に、試料液を薬液チップ131から分析チップ10の流路内に供給させる(ステップ303)。それにより、免疫反応(1次反応)によって、上記流路中(金属膜30の表面の固相膜)に被検出物質が捕捉される。捕捉後、余剰な試料液は、上記流路から除去される。そして上記流路は、必要に応じて適当な洗浄液で、送液ユニット130によって洗浄される。
次いで、制御部160は、分析チップ移動機構140に、分析チップ10を測定位置に配置させる(ステップ304)。そして、制御部160は、励起光反射フィルターなどの光学フィルター125が受光ユニット121に配置されている場合には、位置切り替え機構122に、光学フィルター125を受光ユニット121における光路から退避させる(ステップ305)。さらに、制御部160は、励起光学系ユニット110と受光光学系ユニット120を協働させて、増強角を測定させ(ステップ306)、求めた増強角の入射角度となるよう、励起光学系ユニット110に、増強角が得られる位置および向きに光源ユニット111の照射角度を設定させる(ステップ307)。
次いで、制御部160は、受光光学系ユニット120に、受光ユニット121における光路中に光学フィルター125を配置させる(ステップ308)。受光光学系ユニット120中に減光フィルターを配置している場合には、制御部160は、必要に応じて、減光フィルターを上記光路中から退避させる。そして、制御部160は、光学フィルター125が介在するときの受光センサー127の出力値(光学ブランク値)を記録する(ステップ309)。
次いで、制御部160は、分析チップ移動機構140に、分析チップ10を送液操作位置に搬送させる(ステップ310)。
次いで、制御部160は、送液ユニット130に、蛍光物質を含む薬液を薬液チップ131から分析チップ10の流路内に供給させ、抗原標識化反応(2次反応)によって、当該流路中に固定された上記被検出物質に上記蛍光物質を結合させる(ステップ311)。こうして上記被検出物質が蛍光物質で標識化され、被検出物質の量に応じた光量の蛍光が得られる。標識化反応後、余剰な蛍光物質は、被検出物質の量に関わりなく発光し、ノイズとなる。よって、制御部160は、送液ユニット130に、上記流路中の余剰な蛍光物質を除去させ、当該流路を洗浄させる。
次いで、制御部160は、分析チップ移動機構140に、分析チップ10を測定位置に配置させ(ステップ312)、励起光学系ユニット110に、分析チップ10に向けて励起光αを出射させるとともに、受光光学系ユニット120に、蛍光を検出させる(ステップ313)。
蛍光シグナルは、ステップ309の光学ブランク値の測定時と同じ入射角で励起光αを照射することによって測定される。プリズム20へ導かれた励起光αは、入射面21からプリズム20内に入射すると、表面プラズモン共鳴により金属膜30の表面上に発生したプラズモン散乱光および蛍光が、受光ユニット121へ出射する。
プラズモン散乱光は、光学フィルター125により反射または吸収され、蛍光は、受光センサー127に入射する。受光センサー127における蛍光の出力値(蛍光シグナル)(S)は、受光センサー127から出力され、制御部160またはセンサー制御部123に記憶され、蛍光シグナル(S)から、ステップ309で測定された光学ブランク値(oB)を引いた差が算出され、被検出物質の量に相関する蛍光強度(ΔS)が求められる(下記式参照)。上記の計算は、制御部160が行ってもよいし、センサー制御部123で行われてもよい。
ΔS=S−oB
次いで、制御部160は、分析チップ移動機構140に、分析チップ10を送液操作位置または分析チップ10を取り出す位置(廃棄位置)に移動させる(ステップ314)。
以上に説明したように、SPFS装置100は、SPFS方法を実施する。
SPFS装置100は、高い定量性で被検出物質を検出することができる。これは、前述したように、受光センサー127の感度の変化が少ない方向が、励起光αの入射角度を走査した時の、金属膜30裏面における励起光αの入射領域が移動する方向と平行になる向きで受光センサー127が配置されているためである。以下、その理由を説明する。
増強角の測定において、図4Aに示されるように、例えば、励起光αのプリズム20の入射面21に対する入射角度をa(一点鎖線)からb(破線)に走査する。第一の入射領域410は、入射角度aのときの金属膜30の裏面における励起光αの入射領域であり、第二の入射領域420は、入射角度bのときの金属膜30の裏面における励起光αの入射領域である。上記走査によって、励起光αの入射領域は、第一の入射領域410から第二の入射領域420へ移動する。励起光αの光軸は、図4A中のxz平面にある。このため、励起光αの入射領域の移動方向は、x方向である。励起光αの入射領域の直径は、x方向に変化するがy方向には変化しない。
増強角の測定において、金属膜30の裏面に励起光αが入射すると、金属膜30上(表面およびその近傍)からプラズモン散乱光が出射される。プラズモン散乱光は、図4Bに示されるように、受光センサー127の受光面(入射窓)25に入射する。第一の入射スポット411は、入射角度aのときに受光面(入射窓)25に入射した光(プラズモン散乱光)の入射スポットであり、第二の入射スポット421は、入射角度bのときに入射窓(受光面)25に入射した光(プラズモン散乱光)の入射スポットである。上記走査によって、当該受光面における光の入射スポットは、第一の入射スポット411から第二の入射スポット421へ、すなわちx方向へ移動する。
受光センサー127において、第一ダイノード27は、湾曲する板状の電極であり、図2に示されるように、yz平面での断面形状は、略円弧状であり、かつ湾曲した凹面を正面としたときに、光電面26と第二ダイノード28のいずれに対しても対向するように配置されている。入射窓(受光面)25と光電面26は平行である。
したがって、入射窓25への光線の入射位置がy軸方向に変化すると、入射窓(受光面)25から第一ダイノード27の凹面までの距離が大きく変化する。
これに対し、入射窓25への光線の入射位置がx軸方向に変化した場合は、一定の距離となる。すなわち、この場合、x軸方向が、前記受光面から前記初段ダイノードまでの距離の変化が小さい直線に沿う方向となる。
受光センサー127の感度は、一般に、第一ダイノード27から発生する二次電子の数に主に依存する。第一ダイノード27からの二次電子の数が一定であると、受光センサー127の感度は一定となる。第一ダイノード27が放出する二次電子の数は、一般に、第一ダイノード27に到達する光電子の飛行距離や第一ダイノード27の凹面に対する当該光電子の入射角度などに応じて変化する。
受光センサー127では、光電面26と第一ダイノード27との距離は、x方向において一定であることから、受光センサー127の感度は、x方向において一定となる。よって、図5Aに示されるように、受光センサー127の感度は、x方向では凹凸がほとんどなくほぼ一定である。
これに対して、y方向に沿って入射窓(受光面)25への光線の入射位置が変化すると、受光面から第一ダイノード27までの距離は、図2から明らかなように、漸次変化する。あわせて、第一ダイノードへの入射角度も漸次変化する。したがって、受光センサー127の感度は、y方向において漸次変化する。よって、図5Bに示されるように、受光センサー127の感度は、y方向では細かな凹凸が存在し、かつ巨視的にもうねりが見られ不均一である。
今、便宜上、入射窓25と第一ダイノードとの距離・入射角度の変化で、受光センサーの感度を説明したが、受光センサー27に光電子が到達するまでには、第一ダイノード以降、第ニダイノード等、複数のダイノードへの入射と二次電子の放出を繰り返す。したがって、図5に示される感度の変化(細かな凹凸や巨視的なうねり)は、それら全体の積み重ねの結果である。ただ、本発明のように、入射面と第一ダイノードとの距離・入射角度は、感度に大きく影響し、この場合、当該感度の変化は、特に重要である。
以上より、本実施の形態では、増強角の測定時に励起光αの入射角度を走査することにより、受光センサー27での入射スポット位置が移動する方向に上記x方向が沿うように受光センサー127の向きを調整する、という簡単な操作によって、被検出物質が高い定量性で検出される。
なお、上記感度の変化は、図4B中、第一の入射スポット411および第二の入射スポット421が受光面(入射窓)25の範囲内に収まる範囲において、受光面(入射窓)25の面積に対して、第一の入射スポット411または第二の入射スポット421の面積の占める割合を大きくすることや、第一の入射スポット411と第二の入射スポット421の位置のズレ量を小さくすること、などによっても小さくすることが可能である。
また、上記の実施形態において、第一ダイノード27は板状の電極が湾曲したシリンドリカルの様な2次元的な曲面としたが、板状ではなくx方向にも凹面となる3次元的な曲面となっていてもよい。x方向にもわずかに凹面とすることで、次の第ニダイノードに向け光電子を効率よく集めて入射させることができる。この場合、x方向においても、入射窓(受光面)25と第一ダイノードとの距離が変化することになるが、その変化量はわずかであり、y方向に比べて小さい。したがって、x方向が距離の変化が小さい方向、すなわち感度の変化が小さい方向となり、同様の効果が得られる。
さらに、上記の実施形態において、光電面26を用いず、かつ第一ダイノード27に代えて、入射窓25から入射した光が最初に反射する反射型光電面を配置しても、同様の効果が得られる。また、第一ダイノード27または当該反射型光電面が湾曲していない部材、例えば平板状の部材、であっても、同様の効果が得られる。
受光センサー127の受光面(入射窓)25における「感度の変化が小さい」とは、受光面(入射窓)25の範囲において、一定の強度の入射光に対して一定範囲の受光センサー127の出力値が得られることを言い、例えば、当該出力値の平均値の±5%の範囲内であり、より望ましくは±2%の範囲内である。当該感度の変化は、前述したように、受光面(入射窓)25から第一ダイノード27までの距離の変化が小さい方向(x方向)で小さくなる。当該方向は、受光センサー127におけるダイノードの形状および配置から決めることも可能である。
また、上記感度の変化は、受光面(入射窓)25における一方向(本実施の形態ではx方向)において、他の方向における当該変化に比べて小さい。「一方向」とは、一定の強度の入射光に対して一定範囲の受光センサー127の出力値が得られる範囲の向きである。たとえば、「一方向」は、上記感度の変化が最も小さい方向(あるいは、上記ダイノードの左右対称方向)に対して±20°、の角度をなす方向を含みうるが、より好ましくは±10°以内に設定する。「一方向」は、前述したように、受光センサー127と光源ユニット111との平面視したときの向きを相対的に調整することによって、金属膜30の表面からの光の受光面(入射窓)25における入射スポットの、増強角測定時における移動方向に沿わせることが可能である。たとえば、受光センサー127の向きを「一方向」に調整することは、受光面(入射窓)25における光の入射スポットの移動方向を測定し、当該測定方向と受光センサー127の上記左右対称方向とが一致するよう、受光センサー127を光電面26の法線(例えば、中心軸CA)を中心に回転させることで可能である。
なお、上記の実施形態では、受光ユニット121からの主光線は、光電面26の法線方向に沿って、受光センサー127に入射している。本発明では、受光センサー127の上記受光面に対して、上記光を斜めに入射させることによって、受光センサー127の感度をより高めることが可能である。
図6は、受光センサー127を、その中心軸に沿って切断した断面を示す図である。図6に示される受光センサー127では、受光ユニット121からの主光線は、受光センサー127の受光面(入射窓)25に対して斜めに(角度θで)入射している。なお、図6中の矢印は、受光面(入射窓)25に入射する光、光電子、二次電子またはそれ以降に発生した電子を表している。
図6において、x方向は、光電面26から第一ダイノード27までの距離の変化が小さい方向であり、受光センサー127の感度の変化が小さい方向(前記一方向)である。y方向は、光電面26から第一ダイノード27までの距離の変化が大きい方向であり、x方向に直交する方向(上記感度の変化が大きい方向)である。z方向は、光電面26に対して垂直な方向であり、光電面26の法線方向である。
受光ユニット121から入射する主光線の光軸は、図6から明らかなように、z方向に対してy方向側に角度θで傾いている。このように、受光センサー127は、x方向に直交するyz平面において、光電面26の法線に対して光電面26に入射する主光線の光軸が斜めになるように配置されている。
図7の実線の大きな円は、z方向から見た時の入射窓25の形状、点線はy方向側に角度θ傾斜させた入射光の主光線の方向から見た入射窓25の形状である。すなわち、受光ユニット121からの入射光の主光線の方向から見ると、入射窓25の縁の形状が点線の形状となり、この縁で遮られない範囲の光を受光センサー127内に入射可能である。
このように、y方向に傾斜させることで、入射光の主光線方向から見た入射窓25の形状はy方向に小さくなる。しかしながら、増強角の測定時の励起光αの走査では、受光面(入射窓)25における入射スポットは、x方向に移動し、y方向には移動しない。したがって、上記破線内に、第一の入射スポット411および第二の入射スポット421の両方が十分に含まれており、入射窓25の縁で遮られることなく、y方向に上記光軸を傾けた状態で、前述した増強角の測定および蛍光の測定が可能である。
すなわち、図6に示されるy方向に上記光軸を傾けた実施例においても、法線方向から入射させる図2の実施例と同様に、増強角走査時の入射スポットの移動方向を、受光面の感度の変化が少ないx方向とすることで、光センサーの感度が実質的に変化せず、被検出物質を高い定量性で検出することが可能である。
加えて、図6の受光センサー127では、受光センサー127に入射する光は、光電面26に対して斜めに入射する。よって、当該光の光電面26の通過距離が、法線方向から入射する場合に比べてより長くなる。このため、当該光による光電子がより多く発生するので、受光センサー127の感度がより高くなる。よって、図6に示される受光センサー127は、法線方向から入射する場合に比べてより微弱な光を検出することが可能となる。
このように、受光面(入射窓)25に入射する光の光軸を光電面26に対して傾けることにより、受光センサー127の感度をより一層高める効果が得られる。この感度向上効果は、上記光軸を、y方向のうち、図6に示されるように、当該光軸方向より見たときの第一ダイノード27の面積がより大きくなる方向(図6中であれば、第二ダイノード28側)へ傾けることによって、より一層高めることが可能である。これは、上記光から発生した光電子を漏れなく第一ダイノード27に到達させられるためである。
上記感度向上効果は、上記光軸を、y方向のうち、第二ダイノード28とは反対側に傾けることによっても得られる。しかしながら、この場合では上記光軸を傾けすぎると、上記光電子の一部が第一ダイノード27に衝突しなくなる可能性がある。
また、上記感度向上効果は、上記光軸を、x方向に傾けることによっても得られる。しかしながら、x方向に傾斜させた場合、その光軸方向から見た入射窓25の形状は、x方向に小さくなり、図7と同様の表現をすると、縦長の楕円形状となる。この場合、入射スポットは411,421とx方向に移動するので、光軸をx方向に傾けられる範囲は、第二の入射スポット421が入射窓25の縦長の楕円形状で遮られない範囲、となり、y方向に比べて傾斜可能な角度は狭くなる。
また、上記の説明では、受光センサー127としてヘッドオンタイプの光電子倍増管を例示したが、本実施の形態では、サイドオンタイプの光電子倍増管を使用することも可能である。サイドオンタイプの光電子倍増管は、x方向における感度とy方向における感度の差がより大きい。よって、サイドオンタイプの光電子倍増管は、受光センサー127と光源ユニット111との平面視したときの向きの調整によって、定量性のより一層の向上効果が得られる。
また、励起光αの入射角度の走査は、分析チップ10と光源ユニット111の相対的な位置関係により行われればよい。したがって、光源ユニット111を固定し、分析チップ10を回転させて、当該入射角度の走査を行ってもよい。分析チップ10の回転に伴い、像面が傾くが、当該傾きは数度であること、実際に検出される光が蛍光であり、被検出物質を標識する蛍光物質は、全方位に等しく蛍光を放出すること、などから、受光センサー127が受光する光量の、当該回転による差は、無視することが可能である。
また、本発明において、蛍光を十分に増強するための励起光αの、金属膜30の裏面(プリズム20と金属膜30との界面(成膜面22))への入射角度は、共鳴角度であってもよい。あるいは、当該入射角度は、増強角度と共鳴角度との差が一般にわずかであることから、当該増強角度と共鳴角度との間の特定の角度であってもよい。共鳴角度は、例えば、当該反射光を測定するための受光センサーをSPFS装置100にさらに配置することによって測定することが可能である。
前述の実施の形態の説明から明らかなように、本実施の形態に係るSPFS装置は、上記分析チップを着脱可能に保持するチップホルダーと、上記励起光を出射する光源と、上記プリズムを介して上記金属膜に所定の入射角で励起光を照射するために、上記金属膜に対する励起光の入射角を走査して調整する角度調整部と、上記蛍光物質から放出された蛍光を検出する受光センサーと、を有し、上記受光センサーの受光面における感度の変化は、一方向において、他の方向の感度の変化に比べて小さく、上記受光センサーは、上記角度調整部によって励起光の入射角を走査したときの上記受光面における光の入射スポットが、上記一方向に沿って移動するように配置されている。よって、受光センサーの受光面における入射スポットの位置が変化しても、受光センサーの感度の変化が少ない。このため、受光センサーが、受光面における入射スポットの位置によっては異なる感度を有する場合であっても、被検出物質を高い定量性で検出することが可能である。
また、金属膜への励起光の入射領域の位置がずれても、受光センサーで検出される光の出力値が受光センサーの感度の変化に影響されない。よって、励起光の金属膜における入射位置を厳密に制御する必要がない。したがって、従来のSPFS装置に比べて、SFPS装置を簡便に構成することが可能である。
また、上記装置において、上記受光センサーは光電子増倍管であると、簡便な構成で、被検出物質を高い定量性で検出する観点からより効果的である。これは、受光面における入射位置による感度変化が小さいx方向と大きいy方向が存在するためである。
また、上記装置において、上記光電子増倍管が、上記受光面から入射した光を光電子に変換する光電面と、複数のダイノードとを有し、上記光電子が最初に入射するダイノードを初段ダイノードとした時、上記一方向は、上記受光面上において、上記受光面から上記初段ダイノードまでの距離の変化が小さい直線に沿う方向であると、光電子増倍管のダイノードの配置によって、感度の変化が小さな方向を決めることができる。このため、簡便な構成で、被検出物質を高い定量性で検出する観点からより効果的である。
また、上記装置において、上記光電子増倍管が透過型の光電面を含み、上記光電子増倍管が、上記一方向に直交する平面において、上記透過型光電面の法線に対して上記透過型光電面に入射する光の光軸が斜めになるように配置されていると、受光面に入射した光の、光電面の通過距離がより長くなる。このため、受光センサーの感度をより高くすることが可能であり、より微弱な光でも検出可能となる観点からより一層効果的である。
また、上記装置において、上記金属膜から上記受光面に入射する光の上記受光面における入射スポットが、上記受光面よりも小さいと、受光光学系ユニットに入射した全ての光を受光センサーで受光するので、高い定量性で被検出物質を検出する観点からより効果的である。また、受光センサーの受光面の一部のみに光が入射するため、当該光の入射位置における感度の差の影響をより大きく受けやすい。よって、当該定量性を高める効果がより一層発揮されやすい。
以上の説明から明らかなように、SPFS装置100は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発生した蛍光を受光センサーで検出して、上記被検出物質の量を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、プリズムの一面上に配置された金属膜に対する入射角を変化させながら、上記プリズムを介して上記金属膜に励起光を照射する工程を含み、上記受光センサーの受光面における感度の変化が、一方向において、他の方向の上記変化に比べて小さく、上記受光面における光の入射スポットが上記受光面において上記一方向に移動するように、上記入射角度を変化させる表面プラズモン共鳴蛍光分析方法の実施に、特に好ましく適用される。