WO2015008492A1 - 表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法 - Google Patents

表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法 Download PDF

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WO2015008492A1
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light
metal film
excitation light
substance
prism
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PCT/JP2014/003805
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藤井　英之
野田　哲也
幸司 宮崎
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コニカミノルタ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a surface plasmon resonance fluorescence analysis apparatus and a surface plasmon resonance fluorescence analysis method for detecting a substance to be detected contained in a specimen using surface plasmon resonance (SPR).
  • SPR surface plasmon resonance
  • SPFS surface plasmon resonance fluorescence analysis
  • Patent Documents 1 and 2 disclose an analysis method and an analysis apparatus using SPFS.
  • a sensor chip having a prism made of a dielectric, a metal film formed on one surface of the prism, and a capturing body (for example, an antibody) fixed on the metal film is used.
  • the substance to be detected is captured by the capturing body (primary reaction).
  • the captured substance to be detected is further labeled with a fluorescent substance (secondary reaction).
  • This localized field light selectively excites the fluorescent substance that labels the substance to be detected captured on the metal film, and the fluorescence emitted from the fluorescent substance is observed.
  • fluorescence is detected to detect the presence or amount of a substance to be detected.
  • a highly sensitive optical sensor such as a photomultiplier (PMT) or an avalanche photodiode (APD) is used. It is necessary to use it.
  • PMT photomultiplier
  • APD avalanche photodiode
  • an excitation light cut filter that blocks excitation light and transmits fluorescence is installed.
  • Patent Document 1 describes that excitation light is irradiated at an incident angle (hereinafter referred to as “resonance angle”) when the intensity of reflected light from a metal film is minimized.
  • incident angle hereinafter referred to as “resonance angle”
  • the analysis method and the analysis apparatus described in Patent Document 1 have room for improvement in detection sensitivity and detection accuracy.
  • the incident angle (hereinafter referred to as “enhancement angle”) when the intensity of the scattered light generated by surface plasmon resonance (hereinafter referred to as “plasmon scattered light”) is maximized.
  • plasmon scattered light when the intensity of the scattered light generated by surface plasmon resonance (hereinafter referred to as “plasmon scattered light”) is maximized.
  • the analysis method and analysis apparatus described in Patent Document 2 are compared with the analysis method and analysis apparatus described in Patent Document 1. Excellent in detection sensitivity and detection accuracy.
  • plasmon scattered light is also detected using an optical sensor for detecting fluorescence, excitation light is cut from the optical path of the light receiving optical system when determining the enhancement angle. There is a problem that the filter must be evacuated.
  • An object of the present invention is to provide a surface plasmon resonance fluorescence analyzer and a surface plasmon resonance fluorescence analysis method capable of determining an enhancement angle at which the plasmon scattered light is maximized without retracting the excitation light cut filter from the optical path of the light receiving optical system. Is to provide.
  • an apparatus for analyzing surface plasmon resonance fluorescence is equipped with an analysis chip including a prism having a metal film on one side, and excitation light is applied to the metal film via the prism.
  • the surface plasmon that detects the presence or amount of the substance to be detected by exciting the fluorescent substance that labels the substance to be detected on the metal film and detecting the fluorescence emitted from the fluorescent substance.
  • a resonance fluorescence analyzer for irradiating excitation light at a predetermined incident angle to the metal film through a chip holder that detachably holds the analysis chip, a light source that emits excitation light, and the prism ,
  • An angle adjusting unit that adjusts an incident angle of excitation light to the metal film, a first photosensor that detects fluorescence emitted from the fluorescent material, and light emitted from the metal film
  • a light receiving optical system that leads to the first optical sensor, and an excitation light that is disposed in the light receiving optical system and reflects light having the same wavelength as the excitation light emitted from the light source out of the light emitted from the metal film.
  • a light reflection filter ; a second light sensor that detects light reflected by the excitation light reflection filter; and a control unit that controls the angle adjustment unit, wherein the control unit is based on the second light sensor. Based on the detection result of light, the angle adjustment unit controls the incident angle of the excitation light to the metal film.
  • the surface plasmon resonance fluorescence analysis method emits a fluorescent substance that is to be detected by being excited by localized field light based on surface plasmon resonance.
  • a step of determining an enhancement angle, which is an incident angle, a step of disposing a detection target substance labeled with a fluorescent substance on the metal film, and an incident angle with respect to the metal film The intensity of the fluorescence emitted from the fluorescent material for labeling the substance to be detected and transmitted through the excitation light reflection filter while irradiating the metal film with excitation light through the prism so as to have the enhancement angle Detecting.
  • the enhancement angle at which the plasmon scattered light is maximized is determined without retracting the excitation light cut filter (excitation light reflection filter) from the optical path of the light receiving optical system. can do. Therefore, according to the present invention, it is possible to detect the presence or amount of a substance to be detected with high sensitivity, high accuracy, and high speed.
  • the surface plasmon resonance fluorescence analyzer can be reduced in size and cost.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon resonance fluorescence analyzer according to Embodiment 1.
  • FIG. It is a partial expansion schematic diagram of the apparatus shown by FIG. It is a flowchart which shows an example of the operation
  • movement procedure of the apparatus shown by FIG. 6 is a partially enlarged schematic diagram of a surface plasmon resonance fluorescence analyzer according to Embodiment 2.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon resonance fluorescence analyzer according to Embodiment 1.
  • FIG. 6 is a partial expansion schematic diagram of the apparatus shown by FIG. It is a flowchart which shows an example of the operation
  • movement procedure of the apparatus shown by FIG. 6 is a partially enlarged schematic diagram of a surface plasmon resonance fluorescence analyzer according to Embodiment 2.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a surface plasmon resonance fluorescence analyzer according to Embodiment 1.
  • FIG. 6 is a
  • Embodiment 1 (Configuration of measuring device) First, a surface plasmon resonance fluorescence analyzer (hereinafter also referred to as “SPFS apparatus”) according to Embodiment 1 of the present invention will be described.
  • SPFS apparatus surface plasmon resonance fluorescence analyzer
  • the SPFS device is used in a state where an analysis chip having a prism made of a dielectric and a metal film formed on one surface of the prism is mounted.
  • the substance to be detected is captured by the capturing body.
  • the substance to be detected may be labeled with a fluorescent substance or may not be labeled.
  • the captured substance to be detected is not labeled with a fluorescent substance, the captured substance to be detected is further labeled with a fluorescent substance.
  • the metal film is irradiated with excitation light at an angle at which surface plasmon resonance occurs, localized field light can be generated in the vicinity of the metal film.
  • This localized field light selectively excites the fluorescent substance that labels the substance to be detected captured on the metal film, and the fluorescence emitted from the fluorescent substance is observed.
  • the SPFS device detects the presence or amount of a substance to be detected by measuring the amount of fluorescent light.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the SPFS apparatus 100 according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a partially enlarged schematic view of the SPFS apparatus 100 shown in FIG.
  • the SPFS device 100 includes a chip holder (not shown) for detachably holding the analysis chip 10, and an excitation optical system unit 110 for irradiating the analysis chip 10 with excitation light ⁇ . And a light receiving optical system unit 120 for detecting light (plasmon scattered light ⁇ and fluorescence ⁇ ) emitted from the analysis chip 10 and a control unit 130 for controlling them.
  • the SPFS apparatus 100 is used in a state where the analysis chip 10 is mounted on the chip holder. Therefore, the analysis chip 10 will be described first, and then each component of the SPFS device 100 will be described.
  • the analysis chip 10 includes a prism 20 having an incident surface 21, a film formation surface 22 and an emission surface 23, a metal film 30 formed on the film formation surface 22, and a film formation surface. 22 or a flow path lid 40 disposed on the metal film 30.
  • the analysis chip 10 is replaced for each analysis.
  • the analysis chip 10 is preferably a structure in which each piece has a length of several millimeters to several centimeters, but is a smaller structure or a larger structure not included in the category of “chip”. Also good.
  • the prism 20 is made of a dielectric that is transparent to the excitation light ⁇ .
  • the prism 20 has an incident surface 21, a film forming surface 22, and an exit surface 23.
  • the incident surface 21 allows the excitation light ⁇ from the excitation optical system unit 110 to enter the prism 20.
  • a metal film 30 is formed on the film formation surface 22.
  • the excitation light ⁇ incident on the inside of the prism 20 is reflected by the metal film 30. More specifically, the light is reflected at the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30.
  • the emission surface 23 emits the excitation light ⁇ reflected by the metal film 30 to the outside of the prism 20.
  • the shape of the prism 20 is not particularly limited.
  • the shape of the prism 20 is a column having a trapezoidal bottom surface.
  • the surface corresponding to one base of the trapezoid is the film formation surface 22, the surface corresponding to one leg is the incident surface 21, and the surface corresponding to the other leg is the emission surface 23.
  • the trapezoid serving as the bottom surface is preferably an isosceles trapezoid.
  • the entrance surface 21 and the exit surface 23 are symmetric, and the S wave component of the excitation light ⁇ is less likely to stay in the prism 20.
  • the incident surface 21 is formed so that the excitation light ⁇ does not return to the excitation optical system unit 110.
  • the angle of the incident surface 21 is set so that the excitation light ⁇ does not enter the incident surface 21 perpendicularly in the scanning range centered on the ideal enhancement angle.
  • the angle between the incident surface 21 and the film formation surface 22 and the angle between the film formation surface 22 and the emission surface 23 are both about 80 °.
  • the material of the prism 20 include resin and glass.
  • the material of the prism 20 is preferably a resin having a refractive index of 1.4 to 1.6 and a small birefringence.
  • the metal film 30 is formed on the film formation surface 22 of the prism 20.
  • an interaction surface plasmon resonance
  • the material of the metal film 30 is not particularly limited as long as it is a metal that causes surface plasmon resonance.
  • Examples of the material of the metal film 30 include gold, silver, copper, aluminum, and alloys thereof.
  • the metal film 30 is a gold thin film.
  • the method for forming the metal film 30 is not particularly limited. Examples of the method for forming the metal film 30 include sputtering, vapor deposition, and plating.
  • the thickness of the metal film 30 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 70 nm.
  • a capturing body for capturing a substance to be detected may be fixed to a surface of the metal film 30 that does not face the prism 20. By fixing the capturing body, it becomes possible to selectively detect the substance to be detected.
  • the capturing body is uniformly fixed to a predetermined region on the metal film 30.
  • the type of capturing body is not particularly limited as long as it can capture the substance to be detected.
  • the capturing body is an antibody specific to the substance to be detected or a fragment thereof.
  • the channel lid 40 is disposed on the surface of the metal film 30 that does not face the prism 20 with the channel 41 interposed therebetween.
  • the flow path cover 40 may be disposed on the film formation surface 22 with the flow path 41 interposed therebetween.
  • the channel lid 40 and the metal film 30 (and the prism 20) form a channel 41 through which a liquid such as a specimen, a fluorescent labeling solution, and a cleaning solution flows.
  • the capturing body is exposed in the flow path 41. Both ends of the channel 41 are connected to an inlet and an outlet (both not shown) formed on the upper surface of the channel lid 40, respectively.
  • the channel lid 40 is made of a material that is transparent to the light (plasmon scattered light ⁇ and fluorescence ⁇ ) emitted from the surface of the metal film 30 that does not face the prism 20 and the vicinity thereof.
  • An example of the material of the flow path lid 40 includes a resin.
  • a part of the channel lid 40 may be formed of an opaque material.
  • the channel lid 40 is bonded to the metal film 30 or the prism 20 by, for example, adhesion using a double-sided tape or an adhesive, laser welding, ultrasonic welding, or pressure bonding using a clamp member.
  • the excitation light ⁇ guided to the prism 20 enters the prism 20 from the incident surface 21.
  • the excitation light ⁇ incident on the prism 20 is incident on the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30 so as to have a total reflection angle (an angle at which surface plasmon resonance occurs).
  • the reflected light from the interface is emitted from the emission surface 23 to the outside of the prism 20 (not shown).
  • plasmon scattered light ⁇ and fluorescence ⁇ are emitted from the metal film 30 and the vicinity thereof toward the light receiving optical system unit 120.
  • the SPFS device 100 includes a chip holder (not shown), the excitation optical system unit 110, the light receiving optical system unit 120, and the control unit 130.
  • a chip holder (not shown) holds the analysis chip 10 at a predetermined position.
  • the analysis chip 10 is irradiated with the excitation light ⁇ from the excitation optical system unit 110 while being held by the chip holder.
  • plasmon scattered light ⁇ having the same wavelength as the excitation light ⁇ , fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent material, and the like are emitted upward from the surface of the metal film 30 not facing the prism 20 and the vicinity thereof. Further, the excitation light ⁇ is reflected at the interface between the prism 20 and the metal film 30 and is emitted to the outside of the prism 20 (not shown).
  • the excitation optical system unit 110 includes a light source unit 111 that emits excitation light ⁇ , and an angle adjustment unit 112 that adjusts the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30.
  • the light source unit 111 has a laser diode (hereinafter abbreviated as “LD”) as an excitation light source, and emits excitation light ⁇ (single mode laser light) toward the incident surface 21 of the analysis chip 10 held by the chip holder. To do. More specifically, the light source unit 111 has only a P wave with respect to the interface so that the excitation light ⁇ has a total reflection angle with respect to the interface (film formation surface 22) between the prism 20 and the metal film 30 of the analysis chip 10. Is emitted toward the incident surface 21.
  • the light source unit 111 includes an LD unit, a first wave adjuster, and a shaping optical system (all not shown).
  • the LD unit emits the collimated excitation light ⁇ having a constant wavelength and light amount so that the shape of the irradiation spot at the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30 is substantially circular.
  • the LD unit includes an LD as an excitation light source, a collimator that collimates the excitation light ⁇ emitted from the LD, and a temperature adjustment circuit for making the light amount of the excitation light ⁇ constant.
  • the excitation light ⁇ emitted from the LD has a flat outline shape even when collimated.
  • the LD is held in a predetermined posture or a slit having a predetermined shape is inserted into a shaping optical system, which will be described later, so that the shape of the irradiation spot at the interface (deposition surface 22) is substantially circular.
  • the wavelength and light amount of the excitation light ⁇ emitted from the LD vary depending on the temperature.
  • the temperature adjustment circuit monitors the amount of light branched from the collimated excitation light ⁇ with a photodiode or the like, and installs a heater or a Peltier element so that the wavelength and amount of the excitation light ⁇ are constant. Use to adjust LD temperature.
  • the first wave adjuster includes a first bandpass filter (hereinafter abbreviated as “BPF1”) and a linear polarization filter (hereinafter abbreviated as “LP”), and tunes the excitation light ⁇ emitted from the LD unit. . Since the excitation light ⁇ from the LD unit has a slight wavelength distribution width, the BPF 1 makes the excitation light ⁇ from the LD unit narrow-band light having only the center wavelength. In addition, since the excitation light ⁇ from the LD unit is not completely linearly polarized light, the LP converts the excitation light ⁇ from the LD unit into completely linearly polarized light.
  • the first wave harmonizer may include a half-wave plate that adjusts the polarization direction of the excitation light ⁇ so that the P-wave component is incident on the metal film 30.
  • the shaping optical system adjusts the beam diameter, contour shape, and the like of the excitation light ⁇ so that the shape of the irradiation spot at the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30 is a predetermined size.
  • the excitation light ⁇ emitted from the shaping optical system is applied to the prism 20 of the analysis chip 10.
  • the shaping optical system is, for example, a slit or zoom means.
  • the type of light source included in the light source unit 111 is not particularly limited, and may not be LD.
  • Examples of light sources include light emitting diodes, mercury lamps, and other laser light sources.
  • the light emitted from the light source is not a beam
  • the light emitted from the light source is converted into a beam by a lens, a mirror, a slit, or the like.
  • the light emitted from the light source is not monochromatic light
  • the light emitted from the light source is converted into monochromatic light by a diffraction grating or the like.
  • the light emitted from the light source is not linearly polarized light
  • the light emitted from the light source is converted into linearly polarized light by a polarizer or the like.
  • the angle adjusting unit 112 adjusts the incident angle of the excitation light ⁇ to the metal film 30 (the interface between the prism 20 and the metal film 30 (film formation surface 22)).
  • the angle adjusting unit 112 applies the optical axis of the excitation light ⁇ and the chip holder to irradiate the excitation light ⁇ to the predetermined position of the metal film 30 (deposition surface 22) through the prism 20 at a predetermined incident angle. Rotate relatively.
  • the angle adjustment unit 112 rotates the light source unit 111 around an axis orthogonal to the optical axis of the excitation light ⁇ .
  • the position of the rotation axis is set so that the irradiation position on the metal film 30 (deposition surface 22) hardly moves even when the incident angle is scanned.
  • the position of the rotation center in the vicinity of the intersection of the optical axes of the two excitation lights ⁇ at both ends of the scanning range of the incident angle (between the irradiation position on the film forming surface 22 and the incident surface 21), The deviation of the irradiation position can be minimized.
  • the light receiving optical system unit 120 is disposed so as to face a surface of the metal film 30 of the analysis chip 10 held by the chip holder that does not face the prism 20. More specifically, the first lens 121, the second lens 123, and the first optical sensor 124 described later pass through the irradiation spot of the excitation light ⁇ on the metal film 30 (deposition surface 22), and the metal film 30.
  • the light receiving optical system unit 120 is arranged so as to be positioned on a straight line perpendicular to the surface.
  • the light receiving optical system unit 120 detects light (plasmon scattered light ⁇ and fluorescence ⁇ ) emitted from the metal film 30.
  • the light receiving optical system unit 120 includes a first lens 121, an excitation light reflection filter 122, a second lens 123, a first light sensor 124, and a second light sensor 125.
  • the first lens 121 and the second lens 123 constitute a conjugate optical system that is not easily affected by stray light.
  • the light traveling between the first lens 121 and the second lens 123 becomes substantially parallel light.
  • the first lens 121 and the second lens 123 cause the fluorescence ⁇ emitted from the metal film 30 to form an image on the light receiving surface of the first optical sensor 124.
  • the first lens 121 collects the plasmon scattered light ⁇ emitted from the metal film 30 (analysis chip 10) together with the excitation light reflection filter 122 on the light receiving surface of the second optical sensor 125. Light up.
  • the excitation light reflection filter 122 is disposed between the first lens 121 and the second lens 123.
  • the excitation light reflection filter 122 reflects the light having the wavelength of the excitation light ⁇ (plasmon scattered light ⁇ ) while transmitting the fluorescence ⁇ , so that light other than the wavelength of the fluorescence ⁇ reaches the first optical sensor 124. prevent. That is, the excitation light reflection filter 122 functions as an “excitation light cut filter” that removes noise components from the light reaching the first optical sensor 124 and contributes to improvement in detection accuracy and sensitivity of weak fluorescence ⁇ .
  • the excitation light reflection filter 122 for example, a transparent substrate having one surface or both surfaces coated with a dielectric multilayer film can be used.
  • the dielectric multilayer film can be formed by alternately and repeatedly laminating a layer made of a high refractive index material and a layer made of a low refractive index material.
  • a filter having desired transmission and reflection characteristics can be obtained by appropriately setting the thickness and number of each layer.
  • the high refractive index material include oxides such as Ti, Nb, Ta, and La (eg, TiO 2 , Nb 2 O 5 , Ta 2 O 5, etc.).
  • the low refractive index material include oxides such as Si and Al (for example, SiO 2 ).
  • the excitation light reflection filter 122 can be manufactured.
  • the excitation light reflection filter 122 obtained in this way, when the incident angle of the principal ray to the filter is 20 °, the reflectance of light having a wavelength of 635 to 645 nm is 99% or more, and the light having a wavelength of 665 to 675 nm is reflected. The reflectance is 1% or less.
  • the excitation light reflection filter 122 is disposed so as to be inclined with respect to the optical axis of the conjugate optical system (light receiving optical system) constituted by the first lens 121 and the second lens 123. ing. Therefore, the plasmon scattered light ⁇ reflected by the excitation light reflection filter 122 goes to the second optical sensor 125 without returning to the analysis chip 10.
  • the inclination angle ⁇ (°) of the perpendicular line of the excitation light reflection filter 122 with respect to the optical axis of the conjugate optical system (light receiving optical system) shown in FIG. 2 preferably satisfies the following formula (1).
  • the inclination angle ⁇ exceeds 45 °, the transmittance of the fluorescent ⁇ decreases, which is not preferable.
  • a is the optical axis of the conjugate optical system (light receiving optical system) and the intersection A of the excitation light reflection filter 122, the optical axis of the conjugate optical system (light receiving optical system), and the film formation surface of the prism 20. This is the distance from 22 intersections B.
  • b is the shortest distance from the intersection B to the end of the analysis chip 10 in the direction orthogonal to the optical axis of the conjugate optical system (light receiving optical system) (see FIG. 2).
  • the first optical sensor 124 detects the fluorescence ⁇ emitted from the metal film 30.
  • the first photosensor 124 is a photomultiplier tube with high sensitivity and high S / N ratio.
  • the first optical sensor 124 may be an avalanche photodiode (APD) or the like.
  • the size of the irradiation spot of the excitation light ⁇ on one surface of the metal film 30 (surface facing the prism 20) is the same as that of the first light on the other surface of the metal film 30 (surface facing the first lens 121). Adjustment is made to be smaller than the size of the measurement area by the sensor 124 (see FIG. 1). By doing in this way, even if the irradiation spot is slightly displaced due to the error of each parameter of the prism 20, it is possible to prevent the irradiation spot from deviating from the measurement region.
  • the second optical sensor 125 detects the plasmon scattered light ⁇ emitted from the metal film 30 (the surface of the metal film 30 and the vicinity thereof).
  • the second optical sensor 125 is disposed at a position where the plasmon scattered light ⁇ reflected by the excitation light reflection filter 122 can be detected.
  • the second optical sensor 125 is disposed in the vicinity of the condensing point of the plasmon scattered light ⁇ reflected by the excitation light reflecting filter 122 and condensed by the first lens 121.
  • the second photosensor 125 is a photomultiplier tube, an avalanche photodiode (APD), a general photodiode (PD), or the like.
  • APD avalanche photodiode
  • PD general photodiode
  • the control unit 130 centrally performs control of each driving unit, quantification of the amount of light received by the first optical sensor 124 and the second optical sensor 125, and the like.
  • the control unit 130 controls the light source unit 111, the first light sensor control unit 132 that controls the first light sensor 124, and the second light sensor 125.
  • the optical sensor control unit 133 and the control processing unit 134 are included.
  • the control processing unit 134 comprehensively controls the angle adjustment unit 112, the light source control unit 131, the first light sensor control unit 132, and the second light sensor control unit 133 to control the overall operation of the SPFS device 100.
  • the control unit 130 is, for example, a computer that executes software.
  • control unit 130 control processing unit 134
  • the excitation light ⁇ for the metal film 30 film formation surface 22
  • control unit 130 causes the second optical sensor 125 to generate the plasmon scattered light ⁇ in order to determine the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22).
  • the light source unit 111 is controlled so that the light amount of the excitation light ⁇ is different between when it is detected and when the first optical sensor 124 detects fluorescence ⁇ in order to detect the substance to be detected.
  • control unit 130 determines the amount of excitation light ⁇ when the second optical sensor 125 detects plasmon scattered light ⁇ than when the first optical sensor 124 detects fluorescence ⁇ .
  • the light source unit 111 is controlled so as to increase.
  • FIG. 3 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the SPFS apparatus 100.
  • step S10 preparation for measurement is performed (step S10).
  • the analysis chip 10 is installed at a predetermined position of the SPFS device 100. Further, when a humectant is present in the flow channel 41 of the analysis chip 10, the humectant is removed by washing the flow channel 41 so that the capturing body can appropriately capture the substance to be detected.
  • the substance to be detected in the sample and the capturing body are reacted (primary reaction, step S20). Specifically, the specimen is injected into the flow path 41, and the specimen and the capturing body are brought into contact with each other. When the substance to be detected is present in the specimen, at least a part of the substance to be detected is captured by the capturing body. Thereafter, the inside of the flow path 41 is washed with a buffer solution or the like to remove substances not captured by the capturing body.
  • the type of specimen is not particularly limited. Examples of the specimen include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, semen, and diluted solutions thereof.
  • the control processing unit 134 controls the light source unit 111 and the angle adjustment unit 112 to irradiate a predetermined position of the metal film 30 (deposition surface 22) with the excitation light ⁇ , while the metal film 30 ( The incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the film forming surface 22) is scanned.
  • the control processing unit 134 controls the second photosensor control unit 133 so that the second photosensor 125 detects the plasmon scattered light ⁇ from the metal film 30 (the surface of the metal film 30 and its vicinity).
  • Plasmon scattered light ⁇ from the metal film 30 (the surface of the metal film 30 and its vicinity) is collimated by the first lens 121 and reaches the excitation light reflection filter 122.
  • the plasmon scattered light ⁇ is reflected by the excitation light reflection filter 122 disposed to be inclined with respect to the central axis of the first lens 121 and is incident on the first lens 121 obliquely. For this reason, the plasmon scattered light ⁇ reaches the second optical sensor 125 without returning to the metal film 30.
  • the second optical sensor 125 detects the intensity of the plasmon scattered light ⁇ reflected by the excitation light reflection filter 122 in this way.
  • the control processing unit 134 obtains data including the relationship between the incident angle of the excitation light ⁇ and the intensity of the plasmon scattered light ⁇ . Then, the control processing unit 134 analyzes the data by fitting such as second order approximation, and determines an incident angle (enhancement angle) at which the intensity of the plasmon scattered light ⁇ is maximized.
  • the enhancement angle is basically determined by the material and shape of the prism 20, the thickness of the metal film 30, the refractive index of the liquid in the channel 41, etc., but the type and amount of the fluorescent substance in the channel 41, It varies slightly due to various factors such as the shape error of the prism 20. For this reason, it is preferable to determine the enhancement angle each time analysis is performed.
  • the enhancement angle is determined on the order of about 0.1 °.
  • the amount of the excitation light ⁇ may be increased as compared with the measurement of the subsequent fluorescence intensity (step S70). As described above, this makes it possible to use an inexpensive optical sensor with inferior detection sensitivity as the second optical sensor 125. At this time, since the fluorescent material does not exist in the flow channel 41, the fading of the fluorescent material is not a problem.
  • the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22) is set to the enhancement angle determined in the previous step (step S40). Specifically, the control processing unit 134 controls the angle adjusting unit 112 to set the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22) as an enhancement angle. In the subsequent steps, the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22) remains the enhancement angle.
  • the excitation light ⁇ is irradiated onto the metal film 30 (deposition surface 22), and the intensity (optical blank value) of light having the same wavelength as the fluorescence ⁇ is measured (step S50).
  • the control processing unit 134 controls the light source control unit 131 to cause the light source unit 111 to emit the excitation light ⁇ .
  • the control processing unit 134 controls the first photosensor control unit 132 so that the first photosensor 124 detects the intensity of light having the same wavelength as the fluorescence ⁇ .
  • the measured value is transmitted to the control processing unit 134 and recorded as an optical blank value.
  • the detected substance captured by the capturing body is labeled with a fluorescent substance (secondary reaction, step S60).
  • a fluorescent labeling solution is injected into the channel 41.
  • the fluorescent labeling solution is, for example, a buffer solution containing an antibody (secondary antibody) labeled with a fluorescent substance.
  • the fluorescent labeling liquid comes into contact with the substance to be detected, and the target substance is labeled with the fluorescent substance. Thereafter, the inside of the flow path 41 is washed with a buffer solution or the like to remove free fluorescent substances.
  • the control processing unit 134 controls the light source control unit 131 to cause the light source unit 111 to emit the excitation light ⁇ .
  • the control processing unit 134 controls the first photosensor control unit 132 so that the first photosensor 124 detects the fluorescence ⁇ emitted from the metal film 30 (the metal film 30 and its vicinity).
  • the control processing unit 134 subtracts the optical blank value from the measured value, and calculates the fluorescence intensity that correlates with the amount of the substance to be detected. The fluorescence intensity is converted into the amount or concentration of the substance to be detected as necessary.
  • the presence of the detected substance or the amount of the detected substance in the specimen can be determined without retracting the excitation light cut filter (excitation light reflection filter 122) from the optical path of the light receiving optical system or inserting it into the optical path. Can be detected.
  • the SPFS device 100 when detecting the detection target substance, the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22) is set to the maximum plasmon scattered light ⁇ . As an enhancement angle, fluorescence ⁇ is detected. Therefore, the SPFS device 100 according to the present embodiment can detect the presence of the substance to be detected or the amount of the substance to be detected with high sensitivity and high accuracy.
  • the excitation light cut filter (excitation light reflection) is also used when determining the optimum incident angle (enhancement angle) of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22). It is not necessary to retract the filter 122) from the optical path of the light receiving optical system. Therefore, the SPFS device 100 according to the present embodiment does not require a mechanism for switching the position of the excitation light cut filter unlike the conventional SPFS device (see Patent Document 2), and realizes downsizing and cost reduction. Can do.
  • the ND filter is used as the optical path of the light receiving optical system when detecting the plasmon scattered light ⁇ . It was necessary to insert in.
  • the SPFS apparatus 100 according to the present embodiment since the detection of the plasmon scattered light ⁇ and the detection of the fluorescence ⁇ are performed using different optical sensors, the excitation light ⁇ for the metal film 22 (deposition surface 22). When determining the optimum incident angle (enhancement angle), it is not necessary to insert an ND filter into the optical path of the light receiving optical system. From this point as well, the SPFS device 100 according to the present embodiment can achieve downsizing and cost reduction.
  • the SPFS device 200 according to the second embodiment includes a chip holder, an excitation optical system unit 110, a light receiving optical system unit 220, and a control unit 130.
  • the SPFS apparatus 200 according to the second embodiment is different from the SPFS apparatus 100 according to the first embodiment only in the configuration of the light receiving optical system unit 220. Therefore, in the present embodiment, only the light receiving optical system unit 220 will be described.
  • FIG. 4 is a partially enlarged schematic diagram of the SPFS apparatus 200 according to the second embodiment.
  • the light receiving optical system unit 220 includes a first lens 121, an excitation light reflection filter 122, a second lens 123, a third lens 226, a first light sensor 124, and a second light sensor 125.
  • the first lens 121, the second lens 123, and the first optical sensor 124 in the light receiving optical system unit 220 according to the second embodiment are the same as the first lens 121 and the second lens 123 in the light receiving optical system unit 120 according to the first embodiment. And the same as the first optical sensor 124.
  • the excitation light reflection filter 122 is disposed with an inclination of 45 ° with respect to the optical axis of the conjugate optical system (light receiving optical system) constituted by the first lens 121 and the second lens 123. Therefore, the plasmon scattered light ⁇ is reflected by the excitation light reflection filter 122 in a direction perpendicular to the optical axis of the conjugate optical system (light receiving optical system).
  • the third lens 226 and the second optical sensor 125 are disposed on the side surface of a lens barrel (not shown) that holds the first lens 121 and the second lens 123.
  • the third lens 226 focuses the plasmon scattered light ⁇ reflected by the excitation light reflection filter 122 on the light receiving surface of the second optical sensor 125. If the intensity of the plasmon scattered light ⁇ is sufficiently high, the third lens 226 need not be arranged. In this case, the second optical sensor 125 detects a part of the plasmon scattered light ⁇ .
  • the SPFS device 200 according to the present embodiment has the same effects as the SPFS device 100 according to the first embodiment.
  • the excitation optical system unit 110 is rotated with respect to the analysis chip 10 when scanning the incident angle.
  • the analysis chip 10 is rotated with respect to the excitation optical system unit 110.
  • the fluorescence image on the metal film 30 is also tilted with the rotation of the analysis chip 10, but the angle is several degrees, and the fluorescent material ⁇ is emitted in all directions equally. The change in can be ignored.
  • the surface plasmon resonance fluorescence analysis apparatus and the surface plasmon resonance fluorescence analysis method according to the present invention can measure a substance to be detected with high reliability, they are useful for clinical examinations, for example.

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Abstract

　表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、分析チップを保持するためのチップホルダーと、励起光を出射する光源と、前記分析チップのプリズムと金属膜との界面に対する前記励起光の入射角を調整する角度調整部と、励起光反射フィルターと、前記分析チップから出射され、前記励起光反射フィルターを透過した蛍光を検出する第１光センサーと、前記分析チップから出射され、前記励起光反射フィルターで反射されたプラズモン散乱光を検出する第２光センサーと、前記角度調整部を制御する制御部とを有する。前記制御部は、前記第２光センサーによるプラズモン散乱光の検出結果に基づいて増強角を決定する。

Description

表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法
　本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）を利用して検体に含まれる被検出物質の検出を行う表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法に関する。
　臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる分析方法および分析装置が求められている。
　被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン共鳴蛍光分析法（表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている（例えば、特許文献１，２参照）。
　特許文献１，２には、ＳＰＦＳを利用する分析方法および分析装置が開示されている。これらの分析方法および分析装置では、誘電体からなるプリズムと、プリズムの１面上に形成された金属膜と、金属膜上に固定された捕捉体（例えば抗体）とを有するセンサチップを使用する。金属膜上に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質が捕捉体により捕捉される（１次反応）。捕捉された被検出物質は、さらに蛍光物質で標識される（２次反応）。この状態で、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光をプリズムを介して金属膜に照射すると、金属膜表面上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が選択的に励起され、蛍光物質から放出された蛍光が観察される。これらの分析方法および分析装置では、蛍光を検出して、被検出物質の存在またはその量を検出する。
　このようなＳＰＦＳを利用する分析方法および分析装置では、微弱な蛍光を定量的に検出するために、光電子増倍管（Photomultiplier：ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などの高感度な光センサーを用いることが必要である。これらの光センサーの前には、励起光を遮り、蛍光を透過させる励起光カットフィルターが設置される。
特開平１０－３０７１４１号公報 国際公開第２０１２／０４２８０５号
　ＳＰＦＳを利用する分析方法および分析装置では、検出感度および検出精度を十分に向上させるために、蛍光強度が最大となるように金属膜に対する励起光の入射角を設定する必要がある。
　この点について、特許文献１には、金属膜からの反射光の強度が最小となるときの入射角（以下「共鳴角」という）で励起光を照射することが記載されている。しかしながら、蛍光の強度が最大となるときの入射角と共鳴角とはわずかに異なるため、特許文献１に記載の分析方法および分析装置には、検出感度および検出精度に改善の余地がある。
　一方、特許文献２に記載の分析方法および分析装置では、表面プラズモン共鳴により発生する散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）の強度が最大となるときの入射角（以下「増強角」という）で励起光を照射している。増強角は、共鳴角よりも蛍光の強度が最大となるときの入射角に近いため、特許文献２に記載の分析方法および分析装置は、特許文献１に記載の分析方法および分析装置に比べて検出感度および検出精度の点で優れている。しかしながら、特許文献２に記載の分析方法および分析装置では、蛍光を検出するための光センサーを用いてプラズモン散乱光も検出するため、増強角を決定する際に受光光学系の光路から励起光カットフィルターを退避させなければならないという問題がある。
　本発明の目的は、励起光カットフィルターを受光光学系の光路から退避させることなく、プラズモン散乱光が最大となる増強角を決定することができる表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法を提供することである。
　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、金属膜を一面に有するプリズムを含む分析チップが装着され、前記プリズムを介して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上の被検出物質を標識する蛍光物質を励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、前記分析チップを着脱可能に保持するチップホルダーと、励起光を出射する光源と、前記プリズムを介して前記金属膜に所定の入射角で励起光を照射するために、前記金属膜に対する励起光の入射角を調整する角度調整部と、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出する第１光センサーと、前記金属膜上から出射された光を前記第１光センサーに導く受光光学系と、前記受光光学系内に配置され、前記金属膜上から出射された光のうち、前記光源から出射された励起光と同じ波長の光を反射させる励起光反射フィルターと、前記励起光反射フィルターで反射された光を検出する第２光センサーと、前記角度調整部を制御する制御部と、を有し、前記制御部は、前記第２光センサーによる光の検出結果に基づいて、前記角度調整部による前記金属膜に対する励起光の入射角を制御する。
　また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、プリズムの一面上に配置された金属膜に対する入射角を変化させながら、前記プリズムを介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射され、かつ励起光反射フィルターで反射されたプラズモン散乱光の強度を検出して、前記プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する工程と、蛍光物質で標識された被検出物質を前記金属膜上に配置する工程と、前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記プリズムを介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記被検出物質を標識する前記蛍光物質から放出され、かつ前記励起光反射フィルターを透過した蛍光の強度を検出する工程と、を含む。
　本発明によれば、ＳＰＦＳを利用する被検出物質の検出において、励起光カットフィルター（励起光反射フィルター）を受光光学系の光路から退避させることなく、プラズモン散乱光が最大となる増強角を決定することができる。したがって、本発明によれば、高感度、高精度かつ高速に被検出物質の存在またはその量を検出することができる。また、本発明によれば、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置の小型化および低コスト化を実現することもできる。
実施の形態１に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置の構成を示す模式図である。 図１に示される装置の部分拡大模式図である。 図１に示される装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 実施の形態２に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置の部分拡大模式図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
　［実施の形態１］
　（測定装置の構成）
　まず、本発明の実施の形態１に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（以下「ＳＰＦＳ装置」ともいう）について説明する。
　ＳＰＦＳ装置は、誘電体からなるプリズムと、プリズムの１面に形成された金属膜とを有する分析チップが装着された状態で使用される。金属膜上に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質が捕捉体により捕捉される。このとき、被検出物質は蛍光物質で標識されていてもよいし、標識されていなくてもよい。捕捉された被検出物質が蛍光物質で標識されていない場合は、捕捉された被検出物質は、さらに蛍光物質で標識される。この状態で、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光を金属膜に照射すると、金属膜の近傍に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が選択的に励起され、蛍光物質から放出された蛍光が観察される。ＳＰＦＳ装置は、蛍光の光量を測定して、被検出物質の存在またはその量を検出する。
　図１は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００の構成を示す模式図である。図２は、図１に示されるＳＰＦＳ装置１００の部分拡大模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、分析チップ１０を着脱可能に保持するためのチップホルダー（図示省略）と、分析チップ１０に励起光αを照射するための励起光学系ユニット１１０と、分析チップ１０から放出された光（プラズモン散乱光βおよび蛍光γ）を検出するための受光光学系ユニット１２０と、これらを制御する制御部１３０とを有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダーに分析チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、分析チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
　図１および図２に示されるように、分析チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。通常、分析チップ１０は、分析のたびに交換される。分析チップ１０は、好ましくは、各片の長さが数ｍｍ～数ｃｍである構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
　プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光学系ユニット１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２の上には、金属膜３０が形成される。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０で反射する。より具体的には、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射する。出射面２３は、金属膜３０で反射した励起光αをプリズム２０の外部に出射させる。プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。入射面２１は、励起光αが励起光学系ユニット１１０に戻らないように形成される。励起光αが励起光源であるレーザーダイオードに戻ると、レーザーダイオードの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまうからである。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。たとえば、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４～１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
　金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に形成されている。金属膜３０を設けることで、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光を生じさせることができる。金属膜３０の素材は、表面プラズモン共鳴を生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の素材の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０～７０ｎｍの範囲内が好ましい。
　また、図１および図２では図示しないが、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定されていてもよい。捕捉体を固定することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。本実施の形態では、金属膜３０上の所定の領域に、捕捉体が均一に固定されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体またはその断片である。
　流路蓋４０は、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面上に、流路４１を挟んで配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、流路４１を挟んで成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、検体や蛍光標識液、洗浄液などの液体が流れる流路４１を形成する。捕捉体は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された注入口および排出口（いずれも図示省略）とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が注入されると、流路４１内において、これらの液体は捕捉体に接触する。流路蓋４０は、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面およびその近傍から放出された光（プラズモン散乱光βおよび蛍光γ）に対して透明な材料からなる。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。これらの光を受光光学系ユニット１２０に導くことができれば、流路蓋４０の一部は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープまたは接着剤による接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。
　図１および図２に示されるように、プリズム２０へ導かれた励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）となるように入射する。界面からの反射光は、出射面２３からプリズム２０外に出射される（図示省略）。一方、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光αが界面に入射することで、金属膜３０およびその近傍からは、プラズモン散乱光βおよび蛍光γが、受光光学系ユニット１２０の方向へ出射される。
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー（図示省略）、励起光学系ユニット１１０、受光光学系ユニット１２０および制御部１３０を有する。
　チップホルダー（図示省略）は、所定の位置で分析チップ１０を保持する。分析チップ１０は、チップホルダーに保持された状態で、励起光学系ユニット１１０からの励起光αを照射される。このとき、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面およびその近傍からは、励起光αと同一波長のプラズモン散乱光βや蛍光物質から放出された蛍光γなどが上方に放出される。また、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面で反射して、プリズム２０の外部に出射される（図示省略）。
　励起光学系ユニット１１０は、励起光αを出射する光源ユニット１１１と、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を調整する角度調整部１１２を有する。
　光源ユニット１１１は、励起光源としてレーザーダイオード（以下「ＬＤ」と略記する）を有し、チップホルダーに保持された分析チップ１０の入射面２１に向けて励起光α（シングルモードレーザー光）を出射する。より具体的には、光源ユニット１１１は、分析チップ１０のプリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に対して励起光αが全反射角度となるように、界面に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。たとえば、光源ユニット１１１は、ＬＤユニット、第１整波器および整形光学系（いずれも図示省略）を有する。
　ＬＤユニットは、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。ＬＤユニットは、励起光源としてのＬＤと、ＬＤから出射された励起光αをコリメートするコリメーターと、励起光αの光量を一定にするための温度調整回路とを有する。ＬＤから出射される励起光αは、コリメートされてもその輪郭形状が扁平である。このため、界面（成膜面２２）における照射スポットの形状が略円形となるように、ＬＤは所定の姿勢で保持されるか、または後述の整形光学系に所定形状のスリットが挿入される。また、ＬＤから出射される励起光αの波長および光量は、温度によって変化する。このため、温度調整回路は、コリメートされた後の励起光αから分岐させた光の光量をフォトダイオードなどにより監視し、励起光αの波長および光量が一定となるようにヒーターやペルチェ素子などを用いてＬＤの温度を調整する。
　第１整波器は、第１バンドパスフィルター（以下「ＢＰＦ１」と略記する）および直線偏光フィルター（以下「ＬＰ」と略記する）を含み、ＬＤユニットから出射された励起光αを整波する。ＬＤユニットからの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているため、ＢＰＦ１は、ＬＤユニットからの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。また、ＬＤユニットからの励起光αは、完全な直線偏光ではないため、ＬＰは、ＬＤユニットからの励起光αを完全な直線偏光の光にする。第１整波器は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する半波長板を含んでいてもよい。
　整形光学系は、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。整形光学系から出射された励起光αは、分析チップ１０のプリズム２０に照射される。整形光学系は、例えばスリットやズーム手段などである。
　なお、光源ユニット１１１に含まれる光源の種類は、特に限定されず、ＬＤでなくてもよい。光源の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
　角度調整部１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））への励起光αの入射角を調整する。角度調整部１１２は、励起光αをプリズム２０を介して金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に所定の入射角で照射するために、励起光αの光軸とチップホルダーとを相対的に回転させる。本実施の形態では、角度調整部１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸を中心として回転させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０（成膜面２２）上での照射位置がほとんど移動しないように、回転軸の位置を設定する。たとえば、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
　受光光学系ユニット１２０は、チップホルダーに保持された分析チップ１０の金属膜３０のプリズム２０と対向しない面に対向するように配置されている。より具体的には、この後説明する第１レンズ１２１、第２レンズ１２３および第１光センサー１２４が、金属膜３０（成膜面２２）における励起光αの照射スポットを通り、かつ金属膜３０表面に垂直な直線上に位置するように、受光光学系ユニット１２０は配置されている。受光光学系ユニット１２０は、金属膜３０上から出射される光（プラズモン散乱光βおよび蛍光γ）を検出する。受光光学系ユニット１２０は、第１レンズ１２１、励起光反射フィルター１２２、第２レンズ１２３、第１光センサー１２４および第２光センサー１２５を有する。
　第１レンズ１２１および第２レンズ１２３は、迷光の影響を受けにくい共役光学系を構成する。第１レンズ１２１と第２レンズ１２３との間を進行する光は、略平行光となる。第１レンズ１２１および第２レンズ１２３は、金属膜３０上から出射される蛍光γを第１光センサー１２４の受光面上に結像させる。また、この後説明するように、第１レンズ１２１は、励起光反射フィルター１２２と共に、金属膜３０上（分析チップ１０）から出射されるプラズモン散乱光βを第２光センサー１２５の受光面に集光させる。
　励起光反射フィルター１２２は、第１レンズ１２１および第２レンズ１２３の間に配置されている。励起光反射フィルター１２２は、励起光αの波長の光（プラズモン散乱光β）を反射させる一方で蛍光γを透過させることで、第１光センサー１２４に蛍光γの波長以外の光が到達することを防ぐ。すなわち、励起光反射フィルター１２２は、第１光センサー１２４に到達する光からノイズ成分を除去し、微弱な蛍光γの検出精度および感度の向上に寄与する「励起光カットフィルター」として機能する。
　励起光反射フィルター１２２としては、例えば、片面または両面が誘電体多層膜でコートされた透明基板を使用することができる。誘電体多層膜は、高屈折率材料からなる層と低屈折率材料からなる層とを交互に繰り返し積層することで形成されうる。このとき、各層の厚みや数を適切に設定することで、所望の透過反射特性のフィルターを得ることができる。高屈折率材料の例には、ＴｉやＮｂ、Ｔａ、Ｌａなどの酸化物（例えば、ＴｉＯ２、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５など）が含まれる。低屈折率材料の例には、ＳｉやＡｌなどの酸化物（例えば、ＳｉＯ２など）が含まれる。たとえば、ガラス基板（ＢＫ７）の表面に、Ｎｂ２Ｏ５層（厚み約１００ｎｍ）とＳｉＯ２層（厚み約１００ｎｍ）とを交互に４０～５０層積層して誘電体多層膜（厚み４０００～５０００ｎｍ）を形成することで、励起光反射フィルター１２２を作製することができる。このようにして得られる励起光反射フィルター１２２では、フィルターへの主光線の入射角が２０°の場合、波長６３５～６４５ｎｍの光の反射率は９９％以上であり、波長６６５～６７５ｎｍの光の反射率は１％以下である。
　図１および図２に示されるように、励起光反射フィルター１２２は、第１レンズ１２１および第２レンズ１２３により構成される共役光学系（受光光学系）の光軸に対して傾斜して配置されている。したがって、励起光反射フィルター１２２により反射されたプラズモン散乱光βは、分析チップ１０には戻らずに、第２光センサー１２５に向かう。
　図２に示される、共役光学系（受光光学系）の光軸に対する励起光反射フィルター１２２の垂線の傾斜角度θ（°）は、下記式（１）を満たすことが好ましい。このようにすることで、プラズモン散乱光βを検出する第２光センサー１２５を、分析チップ１０と干渉しない位置に配置することが可能となる。なお、傾斜角度θが４５°を超えると、蛍光γの透過率が低下してしまうため好ましくない。
 
　１／２ｔａｎ－１（ｂ／ａ）＜θ≦４５　　…（１）
 
　上記式（１）において、ａは、共役光学系（受光光学系）の光軸および励起光反射フィルター１２２の交点Ａと、共役光学系（受光光学系）の光軸およびプリズム２０の成膜面２２の交点Ｂとの距離である。ｂは、交点Ｂからの、共役光学系（受光光学系）の光軸に直交する方向における分析チップ１０の端部までの最短距離である（図２参照）。
　第１光センサー１２４は、金属膜３０上から出射される蛍光γを検出する。たとえば、第１光センサー１２４は、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管である。第１光センサー１２４は、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）などであってもよい。なお、金属膜３０の一方の面（プリズム２０と対向する面）における励起光αの照射スポットの大きさは、金属膜３０の他方の面（第１レンズ１２１と対向する面）における第１光センサー１２４による測定領域の大きさよりも小さくなるように調整される（図１参照）。このようにすることで、プリズム２０の各パラメータの誤差により照射スポットがわずかに位置ずれした場合であっても、照射スポットが測定領域から外れることを防止できる。
　第２光センサー１２５は、金属膜３０上から出射される（金属膜３０表面およびその近傍）からのプラズモン散乱光βを検出する。第２光センサー１２５は、励起光反射フィルター１２２で反射されたプラズモン散乱光βを検出できる位置に配置される。本実施の形態では、第２光センサー１２５は、励起光反射フィルター１２２で反射され、第１レンズ１２１で集光されたプラズモン散乱光βの集光点近傍に配置されている。このように、励起光反射フィルター１２２で反射されたプラズモン散乱光βを第１レンズ１２１で集光することで、第２光センサー１２５として、受光面積が小さい小型の光センサーを使用したり、低感度の光センサーを使用したりすることが可能となる。もちろん、第２光センサー１２５として、高感度の光センサーを使用してもよい。たとえば、第２光センサー１２５は、光電子増倍管やアバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）、一般的なフォトダイオード（ＰＤ）などである。
　制御部１３０は、各駆動部の制御や、第１光センサー１２４および第２光センサー１２５における受光量の定量化などを一元的に行う。本実施の形態では、制御部１３０は、光源ユニット１１１を制御する光源制御部１３１と、第１光センサー１２４を制御する第１光センサー制御部１３２と、第２光センサー１２５を制御する第２光センサー制御部１３３と、制御処理部１３４とを有する。制御処理部１３４は、角度調整部１１２、光源制御部１３１、第１光センサー制御部１３２および第２光センサー制御部１３３を包括的に制御して、ＳＰＦＳ装置１００全体の動作を制御する。制御部１３０は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。後述するように、制御部１３０（制御処理部１３４）は、第２光センサー１２５によるプラズモン散乱光βの測定結果に基づいて、蛍光測定時の金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を制御する。
　また、制御部１３０（制御処理部１３４および光源制御部１３１）は、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を決定するために第２光センサー１２５がプラズモン散乱光βを検出している時と、被検出物質を検出するために第１光センサー１２４が蛍光γを検出している時とで、励起光αの光量が異なるように光源ユニット１１１を制御する。具体的には、制御部１３０は、第１光センサー１２４が蛍光γを検出している時よりも第２光センサー１２５がプラズモン散乱光βを検出している時の方が励起光αの光量が大きくなるように、光源ユニット１１１を制御する。このようにプラズモン散乱光βの検出時（増強角の決定時）における励起光αの光量を増大させることで、第２光センサー１２５として、検出感度に劣る安価な光センサーを使用することが可能となる。なお、蛍光γを検出する時は、蛍光物質の褪色を抑制するために、励起光αの光量を必要以上に増大させないことが好ましい。
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作について説明する。図３は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。
　まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００の所定の位置に分析チップ１０を設置する。また、分析チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被検出物質を捕捉できるように、流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。
　次いで、検体中の被検出物質と捕捉体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。具体的には、流路４１内に検体を注入して、検体と捕捉体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は捕捉体により捕捉される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄して、捕捉体に捕捉されなかった物質を除去する。検体の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。
　次いで、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査して、最適な入射角を決定する（工程Ｓ３０）。具体的には、制御処理部１３４は、光源ユニット１１１および角度調整部１１２を制御して、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査する。同時に、制御処理部１３４は、第２光センサー１２５が金属膜３０上（金属膜３０表面およびその近傍）からのプラズモン散乱光βを検出するように、第２光センサー制御部１３３を制御する。金属膜３０上（金属膜３０表面およびその近傍）からのプラズモン散乱光βは、第１レンズ１２１によりコリメートされ、励起光反射フィルター１２２に到達する。プラズモン散乱光βは、第１レンズ１２１の中心軸に対して傾いて配置されている励起光反射フィルター１２２で反射され、第１レンズ１２１に斜めに入射する。このため、プラズモン散乱光βは、金属膜３０に戻らずに、第２光センサー１２５に到達する。第２光センサー１２５は、このように励起光反射フィルター１２２で反射してきたプラズモン散乱光βの強度を検出する。これにより、制御処理部１３４は、励起光αの入射角とプラズモン散乱光βの強度との関係を含むデータを得る。そして、制御処理部１３４は、データを２次近似などのフィッティングにより解析して、プラズモン散乱光βの強度が最大となる入射角（増強角）を決定する。なお、増強角は、基本的には、プリズム２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４１内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、分析を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０.１°度程度のオーダーで決定される。
　増強角の測定時（工程Ｓ３０）には、後の蛍光強度の測定時（工程Ｓ７０）よりも励起光αの光量を増大させてもよい。前述のとおり、このようにすることで、第２光センサー１２５として、検出感度に劣る安価な光センサーを使用することが可能となる。なお、この時点では、流路４１内に蛍光物質が存在しないため、蛍光物質の褪色は問題とならない。
　次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を、前の工程で決定した増強角に設定する（工程Ｓ４０）。具体的には、制御処理部１３４は、角度調整部１１２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する。以後の工程では、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角は、増強角のままである。
　次いで、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、蛍光γと同じ波長の光の強度（光学ブランク値）を測定する（工程Ｓ５０）。具体的には、制御処理部１３４は、光源制御部１３１を制御して、光源ユニット１１１に励起光αを出射させる。同時に、制御処理部１３４は、第１光センサー１２４が蛍光γと同じ波長の光の強度を検出するように、第１光センサー制御部１３２を制御する。測定値は、制御処理部１３４に送信され、光学ブランク値として記録される。
　次いで、捕捉体に捕捉された被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ６０）。具体的には、流路４１内に蛍光標識液を注入する。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。蛍光標識液が流路４１に注入されると、蛍光標識液が被検出物質に接触し、被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。
　最後に、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、金属膜３０（金属膜３０表面およびその近傍）上から放出される蛍光γの強度を測定する（工程Ｓ７０）。具体的には、制御処理部１３４は、光源制御部１３１を制御して、光源ユニット１１１に励起光αを出射させる。同時に、制御処理部１３４は、第１光センサー１２４が金属膜３０（金属膜３０およびその近傍）上から放出される蛍光γを検出するように、第１光センサー制御部１３２を制御する。制御処理部１３４は、測定値から光学ブランク値を引き、被検出物質の量に相関する蛍光強度を算出する。蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。
　以上の手順により、励起光カットフィルター（励起光反射フィルター１２２）を受光光学系の光路から退避させたり光路に挿入したりすることなく、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。
　以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、被検出物質を検出する際に、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を、プラズモン散乱光βが最大となる増強角として、蛍光γを検出する。したがって、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、被検出物質の存在または被検出物質の量を高感度かつ高精度に検出することができる。
　また、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの最適な入射角（増強角）を決定する際にも、励起光カットフィルター（励起光反射フィルター１２２）を受光光学系の光路から退避させる必要がない。したがって、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、従来のＳＰＦＳ装置（特許文献２参照）のように励起光カットフィルターの位置を切り替える機構が不要であり、小型化および低コスト化を実現することができる。
　また、従来のＳＰＦＳ装置（特許文献２参照）では、プラズモン散乱光βの検出と蛍光γの検出を同じ光センサーを用いて行うため、プラズモン散乱光βの検出時にＮＤフィルターを受光光学系の光路内に挿入することが必要であった。これに対し、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、プラズモン散乱光βの検出と蛍光γの検出をそれぞれ異なる光センサーを用いて行うため、金属膜２２（成膜面２２）に対する励起光αの最適な入射角（増強角）を決定する際に、ＮＤフィルターを受光光学系の光路内に挿入する必要がない。この点からも、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、小型化および低コスト化を実現することができる。
　［実施の形態２］
　実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同様に、チップホルダー、励起光学系ユニット１１０、受光光学系ユニット２２０および制御部１３０を有する。実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００は、受光光学系ユニット２２０の構成のみが実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、本実施の形態では、受光光学系ユニット２２０についてのみ説明する。
　図４は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００の部分拡大模式図である。図４に示されるように、受光光学系ユニット２２０は、第１レンズ１２１、励起光反射フィルター１２２、第２レンズ１２３、第３レンズ２２６、第１光センサー１２４および第２光センサー１２５を有する。実施の形態２に係る受光光学系ユニット２２０における第１レンズ１２１、第２レンズ１２３および第１光センサー１２４は、実施の形態１に係る受光光学系ユニット１２０における第１レンズ１２１、第２レンズ１２３および第１光センサー１２４とそれぞれ同じである。
　本実施の形態では、励起光反射フィルター１２２は、第１レンズ１２１および第２レンズ１２３により構成される共役光学系（受光光学系）の光軸に対して４５°傾斜して配置されている。したがって、プラズモン散乱光βは、励起光反射フィルター１２２により、共役光学系（受光光学系）の光軸に垂直な方向に反射される。
　第３レンズ２２６および第２光センサー１２５は、第１レンズ１２１および第２レンズ１２３を保持する鏡筒（図示省略）の側面に配置されている。第３レンズ２２６は、励起光反射フィルター１２２で反射したプラズモン散乱光βを第２光センサー１２５の受光面に集光させる。なお、プラズモン散乱光βの強度が十分に高い場合は、第３レンズ２２６を配置しなくてもよい。この場合は、第２光センサー１２５は、プラズモン散乱光βの一部を検出することになる。
　本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置２００は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同様の効果を有する。
　なお、上記各実施の形態では、入射角を走査する時に分析チップ１０に対して励起光学系ユニット１１０を回転させる例について説明したが、励起光学系ユニット１１０に対して分析チップ１０を回転させてもよい。この場合、分析チップ１０の回転に伴い金属膜３０上の蛍光像も傾くが、その角度は数度であること、蛍光物質からは全方位に等しく蛍光γが放出されることから、受光する光量の変化は無視することができる。
　本出願は、２０１３年７月１８日出願の特願２０１３－１４９３１１に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
　本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、被検出物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。
　１０　分析チップ
　２０　プリズム
　２１　入射面
　２２　成膜面
　２３　出射面
　３０　金属膜
　４０　流路蓋
　４１　流路
　１００，２００　表面プラズモン共鳴蛍光分析装置
　１１０　励起光学系ユニット
　１１１　光源ユニット
　１１２　角度調整部
　１２０，２２０　受光光学系ユニット
　１２１　第１レンズ
　１２２　励起光反射フィルター
　１２３　第２レンズ
　１２４　第１光センサー
　１２５　第２光センサー
　１３０　制御部
　１３１　光源制御部
　１３２　第１光センサー制御部
　１３３　第２光センサー制御部
　１３４　制御処理部
　２２６　第３レンズ

Claims (6)

  1. 　金属膜を一面に有するプリズムを含む分析チップが装着され、前記プリズムを介して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上の被検出物質を標識する蛍光物質を励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
    　前記分析チップを着脱可能に保持するチップホルダーと、
    　励起光を出射する光源と、
    　前記プリズムを介して前記金属膜に所定の入射角で励起光を照射するために、前記金属膜に対する励起光の入射角を調整する角度調整部と、
    　前記蛍光物質から放出された蛍光を検出する第１光センサーと、
    　前記金属膜上から出射された光を前記第１光センサーに導く受光光学系と、
    　前記受光光学系内に配置され、前記金属膜上から出射された光のうち、前記光源から出射された励起光と同じ波長の光を反射させる励起光反射フィルターと、
    　前記励起光反射フィルターで反射された光を検出する第２光センサーと、
    　前記角度調整部を制御する制御部と、を有し、
    　前記制御部は、前記第２光センサーによる光の検出結果に基づいて、前記角度調整部による前記金属膜に対する励起光の入射角を制御する、
    　表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  2. 　前記励起光反射フィルターは、前記受光光学系の光軸に対して傾斜して配置されている、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  3. 　前記受光光学系の光軸に対する前記励起光反射フィルターの垂線の傾斜角度θ（°）は、下記式（１）を満たす、請求項１または請求項２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
    　１／２ｔａｎ－１（ｂ／ａ）＜θ≦４５　　…（１）
    　［ただし、ａは、前記光軸および前記励起光反射フィルターの交点Ａと、前記光軸および前記プリズムの前記金属膜を有する面の交点Ｂとの距離である。ｂは、前記交点Ｂからの、前記光軸に直交する方向における前記分析チップの端部までの最短距離である。］
  4. 　前記受光光学系は、第１レンズおよび第２レンズを有し、
    　前記第１レンズ、前記励起光反射フィルターおよび前記第２レンズは、前記金属膜側からこの順番で配置され、
    　前記第２光センサーは、前記励起光反射フィルターで反射され、かつ前記第１レンズにより集光された光を検出する、
    　請求項１～３のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  5. 　前記制御部は、さらに、前記金属膜に対する励起光の入射角を決定するために前記第２光センサーが光を検出している時と、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出するために前記第１光センサーが光を検出している時とで、励起光の光量が異なるように前記光源を制御する、請求項１～４のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  6. 　被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
    　プリズムの一面上に配置された金属膜に対する入射角を変化させながら、前記プリズムを介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射され、かつ励起光反射フィルターで反射されたプラズモン散乱光の強度を検出して、前記プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する工程と、
    　蛍光物質で標識された被検出物質を前記金属膜上に配置する工程と、
    　前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記プリズムを介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記被検出物質を標識する前記蛍光物質から放出され、かつ前記励起光反射フィルターを透過した蛍光の強度を検出する工程と、
    　を含む、表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
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