JP7292285B2 - 表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法 - Google Patents
表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法 Download PDFInfo
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Description
そこで、測定点数を従来の30点から15点程度に減らすことで、測定時間を短縮することはできる。しかしながら、増強角スキャンによるピーク角度の算出精度は、検体検査用の本測定の測定精度に影響するため、非常に要求が高い(±0.1°)という課題がある。測定時間の短縮を目的として、測定点数を従来の30点から15点程度に減らした場合、要求される測定精度を満たすことができないという課題がある。
金属膜を一面に有する誘電体を含む分析チップが装着され、光源から前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上の被検出物質を標識する蛍光物質を励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、前記被検出物質の存在又はその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
前記誘電体を介して前記金属膜に前記励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射されたプラズモン散乱光の強度を検出して、前記プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する増強角決定部と、
前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記誘電体を介して前記金属膜に前記励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出された蛍光の強度を検出する蛍光強度検出部と、
を備え、
前記増強角決定部は、
前記金属膜に所定の角度範囲を第1の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を推定する先行走査部と、
前記先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を、前記第1の角度間隔よりも狭い第2の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を決定する本走査部と、
を備え、
前記プラズモン散乱光の強度の1点当たりの検出時間は、前記本走査部よりも前記先行走査部の方が短いことを特徴とする。
前記先行走査部は、待機位置から前記光源の移動を開始して、前記所定の角度範囲を前記第1の角度間隔で前記励起光を照射して走査し、
前記本走査部は、前記先行走査部による走査の終点から前記待機位置に向けて前記光源の移動を開始して、前記先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を前記第2の角度間隔で前記励起光を照射して走査することを特徴とする。
前記先行走査部は、待機位置の前記光源の移動方向反対側の所定位置から前記待機位置に向けて前記光源の移動を開始して、前記所定の角度範囲を前記第1の角度間隔で前記励起光を照射して走査し、
前記本走査部は、前記待機位置から前記光源の移動を開始して、前記先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を前記第2の角度間隔で前記励起光を照射して走査することを特徴とする。
前記先行走査部は、前記光源の移動を停止することなく、前記金属膜に前記所定の角度範囲を前記第1の角度間隔で前記励起光を照射して走査することを特徴とする。
被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在又はその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
前記被検出物質を、誘電体の一面上に配置された金属膜上に配置する配置工程と、
前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射されたプラズモン散乱光の強度を検出して、前記プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する増強角決定工程と、
前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記誘電体を介して前記金属膜に前記励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出された蛍光の強度を検出する蛍光強度検出工程と、
を含み、
前記増強角決定工程は、
前記金属膜に所定の角度範囲を第1の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を推定する先行走査工程と、
前記先行走査工程で推定された増強角の周辺範囲を、前記第1の角度間隔よりも狭い第2の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を決定する本走査工程と、
を含み、
前記プラズモン散乱光の強度の1点当たりの検出時間は、前記本走査工程よりも前記先行走査工程の方が短いことを特徴とする。
まず、本発明の実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置(以下「SPFS装置」ともいう)について説明する。
次に、SPFS装置100の検出動作について説明する。図2は、SPFS装置100の動作手順の一例を示すフローチャートである。図3は、増強角の測定時の動作手順の一例を示すフローチャートである。図4は、プラズモン散乱光の検出を説明するための図である。図5は、蛍光の検出を説明するための図である。
SPFS装置100の増強角スキャンは、分析チップ10の依存のばらつきや検査の多項目に対応するため、±5°の範囲を走査して最適角度を求めている。本実施形態では、プラズモン散乱光βの強度のピーク位置(増強角)の存在範囲を66°±3°と想定し、さらに、近似に必要なため、2°両側に広げて(すなわち±5°)走査する。
一方、測定点を15点(0.71°刻み)で測定した場合、測定精度の要求性能(±0.1°)に対して、十分なノイズマージンが得られないという課題がある。そこで、測定時間を延ばさずに、要求性能を改善することが求められる。
また、ピーク位置算出精度の評価量は、ピーク位置からの誤差を表している。誤差には、ばらつき(σ)とばらつきの中心値(平均値)とがあり、それらを足した値で評価される。
また、1%の正規分布ノイズを付加した上で、測定点数を振ってみると、算出したピーク位置のばらつき(σ)は、測定ピッチに相関して変化する。ここでは、ノイズは正規分布のランダムノイズ1%(実機で想定される最大ノイズの2倍程度を想定)、近似(4次式)に使う範囲はピーク位置付近の5°の範囲、ばらつきを求めるための繰り返し回数は1000回でシミュレーションを行っている。図7は、プラズモン散乱光のピーク位置算出時の関数近似のイメージ図であり、図7Aは測定点数が15点、図7Bは測定点数が20点、図7Cは測定点数が25点、図7Dは測定点数が30点の場合を示している。
測定ピッチは、0.345°/点(測定点数が30点)、0.417°/点(測定点数が25点)、0.526°/点(測定点数が20点)、0.714°/点(測定点数が15点)とする。
なお、近似の多項式の次数を高くすると、ばらつき、平均誤差は減少する傾向にあるが、正確な近似に必要な測定点数も多く必要になる傾向があるため、測定時間が長くなる傾向がある。
まず、図8~図10を参照して、本実施の形態におけるSPFS装置100の実施例1(4次の関数近似を行う構成)を説明する。図8は、実施例1におけるピーク位置のばらつき(σ)の一例を示す図である。図9は、実施例1におけるピーク位置の平均値(平均角度)の誤差の一例を示す図である。図10は、実施例1におけるピーク位置の誤差の合計値(ばらつき(図8参照)と平均誤差(図9参照)の加算値)の一例を示す図である。以降、図中の符号L1は測定点数が15点の場合の測定値、符号L2は測定点数が20点の場合の測定値、符号L3は測定点数が25点の場合の測定値、符号L4は測定点数が30点の場合の測定値を示すものとする。
次に、図11~図13を参照して、本実施の形態におけるSPFS装置100の実施例2(5次の関数近似を行う構成)を説明する。図11は、実施例2におけるピーク位置のばらつき(σ)の一例を示す図である。図12は、実施例2におけるピーク位置の平均値(平均角度)の誤差の一例を示す図である。図13は、実施例2におけるピーク位置の誤差の合計値(ばらつき(図11参照)と平均誤差(図12参照)の加算値)の一例を示す図である。
次に、図14及び図15を参照して、本実施の形態におけるSPFS装置100の実施例3(2次の関数近似を行う構成)を説明する。図14は、実施例3におけるピーク位置のばらつき(σ)の一例を示す図である。図15は、実施例3におけるピーク位置の平均値(平均角度)の誤差の一例を示す図である。
次に、図16及び図17を参照して、本実施の形態におけるSPFS装置100の実施例4(2次の関数近似を行う構成、ただし、3%のノイズを付加)を説明する。図16は、実施例4におけるピーク位置のばらつき(σ)の一例を示す図である。図17は、実施例4におけるピーク位置の平均値(平均角度)の誤差の一例を示す図である。
測定時間は測定点数に比例するため、測定時間を短縮するためには測定点数が少ない構成を選択することが好ましい。したがって、測定精度の要求性能を満たしつつ、測定時間を短縮するためには、実施例1(4次の関数近似を行う構成)の測定点数が25点(測定ピッチが0.417°/点)の構成を選択することが好ましい。
以上より、本実施形態では、0.417°/点のピッチ(測定点数25点)で、約5°の範囲の測定点(13点)を用いて4次の関数近似を行う構成が、最適であることがわかった。
本実施形態では、増強角スキャン時に、プレスキャン(工程S41)を行うことで、大まかなピーク位置を求めることができる。これにより、ピーク位置周辺のみを高密度で測定しつつ、本スキャン(工程S42)時の測定点数を減らすことができる。よって、近似点の測定時間を短縮することができる。
また、プレスキャンの際に、各測定点の測定時間を短くした場合、ノイズ量は3倍程度となることが想定される。例えば、10°に対して5点測定した場合、誤差は0.5°程度となる(ノイズ3倍で、2次近似のケース)。プレスキャン時の5点の測定に掛かる時間は、約1.8秒であるため、増強角スキャンに掛かる時間は、本スキャンの9.65秒と合わせて、11.5秒となる。いずれにしても、従来の18.05秒と比べ、大幅な時間削減を実現することができる。
したがって、本実施形態に係るSPFS装置100によれば、全体の測定点数を減らしつつ、ピーク位置付近の測定点数を増やすことができるので、増強角スキャンにおける測定時間を短縮しつつ、測定精度を向上させることできる。
したがって、本実施形態に係るSPFS装置100によれば、概算のピーク算出に悪影響を及ぼすことなくプレスキャン時の測定点1点当たりの検出時間を短くすることができるので、測定精度を確保しつつ、測定時間を短縮することができる。
このように、先行走査部が、待機位置から光源ユニット121の移動を開始して、所定の角度範囲を第1の角度間隔で励起光αを照射して走査し、本走査部が、先行走査部による走査の終点から待機位置に向けて光源ユニット121の移動を開始して、先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を第2の角度間隔で励起光αを照射して走査することで、プレスキャン後に待機位置まで戻る操作を利用して本スキャンを実施することができるので、測定時間を短縮することができる。
このように、先行走査部が、待機位置の光源ユニット121の移動方向反対側の所定位置から待機位置に向けて光源ユニット121の移動を開始して、所定の角度範囲を第1の角度間隔で励起光αを照射して走査し、本走査部が、待機位置から光源ユニット121の移動を開始して、先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を第2の角度間隔で励起光αを照射して走査することで、本スキャンにおいて、以降に行われる工程S70及び工程S90と同じ移動方向(待機位置→測定位置)で光源ユニット121を移動させることができる。したがって、光源ユニット121の位置決め精度を向上させることができるので、測定精度を向上させることができる。
このように、先行走査部が、光源ユニット121の移動を停止することなく、金属膜30に所定の角度範囲を第1の角度間隔で励起光αを照射して走査することで、プレスキャン時の工程を減らすことができるので、測定時間を短縮することができる。
12 チップホルダー
20 誘電体
21 入射面
22 成膜面
23 出射面
30 金属膜
40 流路蓋
41 流路
100 表面プラズモン共鳴蛍光分析装置(SPFS装置)
120 励起光学系ユニット
121 光源ユニット(光源)
122 角度調整部
140 受光光学系ユニット
141 第1レンズ
142 絞り
143 フィルターホルダー
144 励起光カットフィルター
145 第2レンズ
146 光センサー
147 透過調整部
151 絞り孔
152 第1貫通孔
153 第2貫通孔(散乱光透過部)
154 ステージ
155 モーター
156 蛍光透過領域
160 制御部
161 光源制御部
162 光センサー制御部
163 モーター制御部
164 制御処理部(増強角決定部、先行走査部、本走査部、蛍光強度検出部)
α 励起光
β プラズモン散乱光
γ 蛍光
Claims (5)
- 金属膜を一面に有する誘電体を含む分析チップが装着され、光源から前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上の被検出物質を標識する蛍光物質を励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、前記被検出物質の存在又はその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
前記誘電体を介して前記金属膜に前記励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射されたプラズモン散乱光の強度を検出して、前記プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する増強角決定部と、
前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記誘電体を介して前記金属膜に前記励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出された蛍光の強度を検出する蛍光強度検出部と、
を備え、
前記増強角決定部は、
前記金属膜に所定の角度範囲を第1の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を推定する先行走査部と、
前記先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を、前記第1の角度間隔よりも狭い第2の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を決定する本走査部と、
を備え、
前記プラズモン散乱光の強度の1点当たりの検出時間は、前記本走査部よりも前記先行走査部の方が短い表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。 - 前記先行走査部は、待機位置から前記光源の移動を開始して、前記所定の角度範囲を前記第1の角度間隔で前記励起光を照射して走査し、
前記本走査部は、前記先行走査部による走査の終点から前記待機位置に向けて前記光源の移動を開始して、前記先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を前記第2の角度間隔で前記励起光を照射して走査する請求項1に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。 - 前記先行走査部は、待機位置の前記光源の移動方向反対側の所定位置から前記待機位置に向けて前記光源の移動を開始して、前記所定の角度範囲を前記第1の角度間隔で前記励起光を照射して走査し、
前記本走査部は、前記待機位置から前記光源の移動を開始して、前記先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を前記第2の角度間隔で前記励起光を照射して走査する請求項1に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。 - 前記先行走査部は、前記光源の移動を停止することなく、前記金属膜に前記所定の角度範囲を前記第1の角度間隔で前記励起光を照射して走査する請求項1~3のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
- 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在又はその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
前記被検出物質を、誘電体の一面上に配置された金属膜上に配置する配置工程と、
前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射されたプラズモン散乱光の強度を検出して、前記プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する増強角決定工程と、
前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記誘電体を介して前記金属膜に前記励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出された蛍光の強度を検出する蛍光強度検出工程と、
を含み、
前記増強角決定工程は、
前記金属膜に所定の角度範囲を第1の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を推定する先行走査工程と、
前記先行走査工程で推定された増強角の周辺範囲を、前記第1の角度間隔よりも狭い第2の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を決定する本走査工程と、
を含み、
前記プラズモン散乱光の強度の1点当たりの検出時間は、前記本走査工程よりも前記先行走査工程の方が短い表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
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