WO2020036010A1 - 表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法 - Google Patents

表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法 Download PDF

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WO2020036010A1
WO2020036010A1 PCT/JP2019/026305 JP2019026305W WO2020036010A1 WO 2020036010 A1 WO2020036010 A1 WO 2020036010A1 JP 2019026305 W JP2019026305 W JP 2019026305W WO 2020036010 A1 WO2020036010 A1 WO 2020036010A1
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light
metal film
excitation light
intensity
angle
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Application number
PCT/JP2019/026305
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English (en)
French (fr)
Inventor
晃 国本
Original Assignee
コニカミノルタ株式会社
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the present invention relates to a surface plasmon resonance fluorescence analyzer and a surface plasmon resonance fluorescence analysis method.
  • SPFS Surface plasmon resonance fluorescence analysis
  • Patent Documents 1 and 2 disclose an analysis method and an analyzer using SPFS.
  • a sensor chip having a prism made of a dielectric, a metal film formed on one surface of the prism, and a capturing body (for example, an antibody) fixed on the metal film is used.
  • the substance to be detected is captured by the capturing body (primary reaction).
  • the captured target substance is further labeled with a fluorescent substance (secondary reaction).
  • SPR surface plasmon resonance
  • the localization field light selectively excites the fluorescent substance that labels the substance to be detected captured on the metal film, and observes the fluorescence emitted from the fluorescent substance.
  • the enhancement angle is calculated by an enhancement angle scan performed at each measurement.
  • the enhancement angle scan is a measurement performed to determine the projection angle (enhancement angle) at the time of blank measurement and signal measurement, and scans the projection angle to measure the intensity of plasmon scattered light for each angle, and The angle at which the peak is taken is calculated as the enhancement angle.
  • a bandpass filter BPF
  • the light projection angle about 10 °
  • plasmon scattered light is measured at the stop position (30 points).
  • the peak angle is calculated by function fitting (seven points near the peak are approximated by a quartic function).
  • the measurement time is required to be reduced.
  • the steps of moving, stabilizing, and measuring occur. , It took about 20 to 30 seconds. This occupies a large amount of time as compared with the time for blank measurement and signal measurement (both about 2.5 seconds), which is a factor of prolonged measurement. Therefore, the measurement time can be reduced by reducing the number of measurement points from the conventional 30 points to about 15 points.
  • the requirement is extremely high ( ⁇ 0.1 °).
  • the object of the present invention is to provide a surface plasmon resonance fluorescence analyzer and a surface plasmon resonance fluorescence analysis method capable of improving the measurement accuracy while shortening the measurement time in the enhanced angle scan.
  • An analysis chip including a dielectric having a metal film on one surface is mounted thereon, and the excitation light is applied to the metal film from the light source via the dielectric to thereby emit a fluorescent substance that labels the substance to be detected on the metal film.
  • a surface plasmon resonance fluorescence analyzer that detects the presence or amount of the substance to be detected, While irradiating the metal film with the excitation light through the dielectric, detecting the intensity of the plasmon scattered light emitted from the metal film, the incident angle when the intensity of the plasmon scattered light is maximized
  • An enhancement angle determination unit that determines an enhancement angle that is
  • a fluorescence intensity detection unit that irradiates the excitation light to the metal film through the dielectric and detects the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescent substance so that the incident angle with respect to the metal film is the enhancement angle.
  • a pre-scanning unit that scans the metal film by irradiating the excitation light with a predetermined angular range at a first angular interval and detects the intensity of the plasmon scattered light, and estimates the enhancement angle. Scanning the peripheral range of the enhancement angle estimated by the preceding scanning unit by irradiating the excitation light with the excitation light at a second angular interval smaller than the first angular interval, and detecting the intensity of the plasmon scattered light
  • a main scanning unit for determining the enhancement angle It is characterized by having.
  • the preceding scanning unit is characterized in that the detection time of the intensity of the plasmon scattered light per point is shorter than that of the main scanning unit.
  • the invention according to claim 3 is the surface plasmon resonance fluorescence analyzer according to claim 1 or 2,
  • the preceding scanning unit starts moving the light source from a standby position, scans the predetermined angular range by irradiating the excitation light at the first angular interval,
  • the main scanning unit starts moving the light source from the end point of scanning by the pre-scanning unit toward the standby position, and sets the peripheral range of the enhancement angle estimated by the pre-scanning unit to the second angular interval. And scanning by irradiating the excitation light.
  • the invention according to claim 4 is the surface plasmon resonance fluorescence analyzer according to claim 1 or 2,
  • the preceding scanning unit starts moving the light source from a predetermined position on a side opposite to a moving direction of the light source at a standby position toward the standby position, and sets the excitation to the predetermined angular range at the first angular interval. Scan by irradiating light,
  • the main scanning unit starts moving the light source from the standby position, and scans the peripheral range of the enhancement angle estimated by the preceding scanning unit by irradiating the excitation light with the excitation light at the second angular interval. It is characterized by.
  • the preceding scanning unit may scan the metal film by irradiating the excitation light with the excitation light at the first angular interval on the metal film without stopping the movement of the light source.
  • the invention according to claim 6 is In a surface plasmon resonance fluorescence analysis method in which a fluorescent substance that labels a substance to be detected detects fluorescence emitted by being excited by localized field light based on surface plasmon resonance, and detects the presence or amount of the substance to be detected. So, An arrangement step of arranging the substance to be detected on a metal film arranged on one surface of a dielectric, Irradiating the metal film with excitation light via the dielectric, detecting the intensity of plasmon scattered light emitted from the metal film, and detecting the intensity of the plasmon scattered light at the maximum incident angle.
  • An enhancement angle determination step of determining a certain enhancement angle A fluorescence intensity detecting step of irradiating the metal film with the excitation light via the dielectric so that an incident angle with respect to the metal film is the enhancement angle, and detecting an intensity of fluorescence emitted from the fluorescent substance.
  • the enhancement angle determining step includes: A pre-scanning step of irradiating the metal film with a predetermined angular range by irradiating the excitation light with the first angular interval to scan the metal film, detecting the intensity of the plasmon scattered light, and estimating the enhancement angle, Around the peripheral range of the enhancement angle estimated in the preceding scanning step, the excitation light is irradiated and scanned at a second angular interval smaller than the first angular interval, and the intensity of the plasmon scattered light is detected.
  • a main scanning step of determining the enhancement angle It is characterized by including.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a configuration of an SPFS device according to an embodiment.
  • 4 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the SPFS device according to the embodiment. It is a flowchart which shows an example of the operation
  • FIG. 5 is a diagram illustrating an example of a variation in a peak position according to the first embodiment.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating an example of an error of an average value of peak positions in the first embodiment.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating an example of a total value of errors of peak positions according to the first embodiment.
  • FIG. 13 is a diagram illustrating an example of a variation in a peak position according to the second embodiment.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating an example of an error in an average value of peak positions according to the second embodiment.
  • FIG. 13 is a diagram illustrating an example of a total value of errors of peak positions according to the second embodiment.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating an example of a variation in a peak position according to the third embodiment.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating an example of an error in an average value of peak positions according to the third embodiment.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating an example of a variation in a peak position according to the fourth embodiment.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating an example of an error of an average value of a peak position according to the fourth embodiment.
  • SPFS device a surface plasmon resonance fluorescence analyzer (hereinafter, also referred to as “SPFS device”) according to an embodiment of the present invention will be described.
  • the SPFS apparatus is used in a state where an analysis chip having a dielectric and a metal film formed on one surface of the dielectric is mounted.
  • the substance to be detected is captured by the capturing body.
  • the substance to be detected may or may not be labeled with a fluorescent substance. If the captured target substance is not labeled with a fluorescent substance, the captured target substance is further labeled with a fluorescent substance.
  • the prism having a metal film on the surface is irradiated with excitation light so as to satisfy the condition of total reflection. As a result, interaction between the excitation light and free electrons in the metal film (surface plasmon resonance) occurs, and localized field light is generated.
  • this localized field light is also called “enhanced electric field” or “enhanced evanescent light”, and can measure a physical quantity fluctuation near the surface of the metal film.
  • the localization field light selectively excites the fluorescent substance that labels the substance to be detected captured on the metal film, and observes the fluorescence emitted from the fluorescent substance.
  • the SPFS device measures the amount of fluorescent light to detect the presence or amount of the substance to be detected.
  • the SPFS device 100 includes a chip holder 12 for detachably holding the analysis chip 10, an excitation optical system unit 120 for irradiating the analysis chip 10 with excitation light ⁇ , and an analysis chip 10.
  • the SPFS device 100 is used with the analysis chip 10 mounted on the chip holder 12. Therefore, the analysis chip 10 will be described first, and then each component of the SPFS device 100 will be described.
  • the analysis chip 10 includes a dielectric 20 having an incident surface 21, a deposition surface 22, and an emission surface 23, a metal film 30 formed on the deposition surface 22, and disposed on the deposition surface 22 or the metal film 30. And a channel cover 40. Usually, the analysis chip 10 is replaced every time analysis is performed.
  • the dielectric 20 is made of a member (prism) transparent to the excitation light ⁇ .
  • the dielectric 20 has an incident surface 21, a film forming surface 22, and an emission surface 23.
  • the incident surface 21 allows the excitation light ⁇ from the excitation optical system unit 120 to enter the inside of the dielectric 20.
  • a metal film 30 is formed on the film forming surface 22.
  • the excitation light ⁇ that has entered the inside of the dielectric 20 is reflected by the metal film 30. More specifically, the light is reflected at the interface between the dielectric 20 and the metal film 30 (the film formation surface 22).
  • the emission surface 23 emits the excitation light ⁇ reflected by the metal film 30 to the outside of the dielectric 20.
  • the shape of the dielectric 20 is not particularly limited.
  • the shape of the dielectric 20 is a column having a trapezoidal bottom surface.
  • the surface corresponding to one base of the trapezoid is the film forming surface 22, the surface corresponding to one leg is the incident surface 21, and the surface corresponding to the other leg is the emission surface 23.
  • the trapezoid serving as the bottom surface is an isosceles trapezoid. Accordingly, the incident surface 21 and the exit surface 23 are symmetrical, and the S-wave component of the excitation light ⁇ does not easily stay in the dielectric 20.
  • the entrance surface 21 is formed such that the excitation light ⁇ does not return to the excitation optical system unit 120.
  • the angle of the incident surface 21 is set such that the excitation light ⁇ does not enter the incident surface 21 perpendicularly in the scanning range centered on the ideal enhancement angle.
  • the angle between the incident surface 21 and the film forming surface 22 and the angle between the film forming surface 22 and the light emitting surface 23 are both about 80 °.
  • the material of the dielectric 20 include resin and glass.
  • the material of the dielectric 20 is preferably a resin having a refractive index of 1.4 to 1.6 and a small birefringence.
  • the metal film 30 is formed on the film forming surface 22 of the dielectric 20.
  • an interaction surface plasmon resonance; SPR
  • SPR surface plasmon resonance
  • the material of the metal film 30 is not particularly limited as long as it is a metal that causes surface plasmon resonance.
  • Examples of the material of the metal film 30 include gold, silver, copper, aluminum, and alloys thereof.
  • the metal film 30 is a gold thin film.
  • the method for forming the metal film 30 is not particularly limited. Examples of the method for forming the metal film 30 include sputtering, vapor deposition, and plating.
  • the thickness of the metal film 30 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 70 nm.
  • a capturing body for capturing the substance to be detected may be fixed to a surface of the metal film 30 that does not face the dielectric 20. By fixing the capturing body, it is possible to selectively detect the target substance.
  • a capturing body is uniformly fixed in a predetermined region on the metal film 30.
  • the type of the capturing body is not particularly limited as long as the substance to be detected can be captured.
  • the capture body is an antibody or a fragment thereof specific to the substance to be detected.
  • the channel lid 40 is disposed on the surface of the metal film 30 that does not face the dielectric 20 with the channel 41 interposed therebetween.
  • the channel cover 40 may be arranged on the film forming surface 22 with the channel 41 interposed therebetween.
  • the flow path cover 40 forms a flow path 41 through which a liquid such as a specimen, a fluorescent labeling liquid, and a cleaning liquid flows together with the metal film 30 (and the dielectric 20).
  • the capturing body is exposed inside the flow channel 41. Both ends of the flow channel 41 are connected to an inlet and an outlet (both not shown) formed on the upper surface of the flow channel cover 40, respectively.
  • the channel lid 40 is made of a material that is transparent to light (plasmon scattered light ⁇ and fluorescence ⁇ ) emitted from the surface of the metal film 30 that does not face the dielectric 20 and its vicinity.
  • Examples of the material of the flow path cover 40 include a resin. As long as these lights can be guided to the light receiving optical system unit 140, a part of the channel cover 40 may be formed of an opaque material.
  • the flow path cover 40 is joined to the metal film 30 or the dielectric 20 by, for example, bonding with a double-sided tape or an adhesive, laser welding, ultrasonic welding, pressure bonding using a clamp member, or the like.
  • the excitation light ⁇ guided to the dielectric 20 enters the dielectric 20 from the incident surface 21.
  • the excitation light ⁇ incident on the dielectric 20 is incident on the interface (the deposition surface 22) between the dielectric 20 and the metal film 30 so as to have a total reflection angle (an angle at which surface plasmon resonance occurs).
  • Light reflected from the interface is emitted from the emission surface 23 to the outside of the dielectric 20 (not shown).
  • plasmon scattered light ⁇ and / or fluorescence ⁇ are emitted from the metal film 30 and its vicinity in the direction of the light receiving optical unit 140.
  • the SPFS device 100 includes the chip holder 12, the excitation optical system unit 120, the light receiving optical system unit 140, and the control unit 160.
  • the chip holder 12 holds the analysis chip 10 at a predetermined position.
  • the analysis chip 10 is irradiated with excitation light ⁇ from the excitation optical system unit 120 while being held by the chip holder 12.
  • excitation light ⁇ having the same wavelength as the excitation light ⁇ , fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent substance, and the like are emitted upward from the surface of the metal film 30 not facing the dielectric 20 and the vicinity thereof.
  • the excitation light ⁇ is reflected at the interface between the dielectric 20 and the metal film 30 and is emitted outside the dielectric 20 (not shown).
  • the excitation optical system unit 120 includes a light source unit (light source) 121 that emits the excitation light ⁇ , and an angle adjustment unit that adjusts an incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the interface (the film formation surface 22) between the dielectric 20 and the metal film 30. 122.
  • the light source unit 121 has a laser diode (hereinafter abbreviated as “LD”) as an excitation light source, and emits excitation light ⁇ (single mode laser light) toward the incident surface 21 of the analysis chip 10 held by the chip holder 12. Emit. More specifically, the light source unit 121 generates a P-wave with respect to the interface between the dielectric 20 and the metal film 30 of the analysis chip 10 (the deposition surface 22) so that the excitation light ⁇ has a total reflection angle. Out only toward the incident surface 21.
  • the light source unit 121 includes an LD unit, a wave adjuster, and a shaping optical system (all not shown).
  • the LD unit emits the collimated excitation light ⁇ having a constant wavelength and light amount so that the shape of the irradiation spot at the interface between the dielectric 20 and the metal film 30 (the film formation surface 22) is substantially circular.
  • the LD unit includes an LD as an excitation light source, a collimator for collimating the excitation light ⁇ emitted from the LD, and a temperature adjustment circuit for keeping the amount of the excitation light ⁇ constant.
  • the excitation light ⁇ emitted from the LD has a flat profile even when collimated.
  • the LD is held in a predetermined posture or a slit of a predetermined shape is inserted into a shaping optical system to be described later so that the shape of the irradiation spot on the interface (the film formation surface 22) is substantially circular.
  • the wavelength and the light amount of the excitation light ⁇ emitted from the LD change depending on the temperature.
  • the temperature adjustment circuit monitors the amount of light branched from the collimated excitation light ⁇ by using a photodiode or the like, and operates a heater or a Peltier element so that the wavelength and the amount of excitation light ⁇ are constant. To adjust the temperature of the LD.
  • the wave adjuster includes a band-pass filter (hereinafter abbreviated as “BPF”) and a linear polarization filter (hereinafter abbreviated as “LP”), and tunes the excitation light ⁇ emitted from the LD unit. Since the pumping light ⁇ from the LD unit has a slight wavelength distribution width, the BPF converts the pumping light ⁇ from the LD unit into narrow-band light having only the center wavelength. Further, since the excitation light ⁇ from the LD unit is not completely linearly polarized light, the LP converts the excitation light ⁇ from the LD unit into light of completely linearly polarized light.
  • the wave adjuster may include a half-wave plate that adjusts the polarization direction of the excitation light ⁇ so that the P-wave component enters the metal film 30.
  • the shaping optical system adjusts the beam diameter and the contour shape of the excitation light ⁇ so that the shape of the irradiation spot at the interface between the dielectric 20 and the metal film 30 (the film formation surface 22) is a circle of a predetermined size.
  • the excitation light ⁇ emitted from the shaping optical system is applied to the dielectric 20 of the analysis chip 10.
  • the shaping optical system is, for example, a slit or a zoom unit.
  • the type of the light source included in the light source unit 121 is not particularly limited, and may not be an LD.
  • Examples of light sources include light emitting diodes, mercury lamps, and other laser light sources.
  • the light emitted from the light source is not a beam, the light emitted from the light source is converted into a beam by a lens, a mirror, a slit, or the like.
  • the light emitted from the light source is not monochromatic light, the light emitted from the light source is converted into monochromatic light by a diffraction grating or the like.
  • the light emitted from the light source is not linearly polarized light, the light emitted from the light source is converted into linearly polarized light by a polarizer or the like.
  • the ⁇ angle adjustment unit 122 adjusts the angle of incidence of the excitation light ⁇ on the metal film 30 (the interface between the dielectric 20 and the metal film 30 (the film formation surface 22)).
  • the angle adjusting unit 122 irradiates the excitation light ⁇ with the optical axis of the excitation light ⁇ and the chip holder in order to irradiate the predetermined position of the metal film 30 (the film formation surface 22) via the dielectric 20 at a predetermined incident angle.
  • And 12 are relatively rotated.
  • the angle adjustment unit 122 rotates the light source unit 121 about an axis orthogonal to the optical axis of the excitation light ⁇ .
  • the position of the rotation axis is set so that the irradiation position on the metal film 30 (the film formation surface 22) hardly moves even when the incident angle is scanned.
  • the position of the rotation center near the intersection of the optical axes of the two excitation lights ⁇ at both ends of the scanning range of the incident angle (between the irradiation position on the film forming surface 22 and the incident surface 21)
  • the deviation of the irradiation position can be minimized.
  • the light receiving optical system unit (light receiving optical system) 140 is disposed so as to face the surface of the metal film 30 of the analysis chip 10 held by the chip holder 12 that does not face the dielectric 20.
  • the light receiving optical system unit 140 detects light (plasmon scattered light ⁇ or fluorescence ⁇ ) emitted from the metal film 30.
  • the light receiving optical system unit 140 includes a first lens 141, an aperture 142, a filter holder 143, an excitation light cut filter 144, a second lens 145, an optical sensor 146, and a transmission adjusting unit 147.
  • the first lens 141, the diaphragm 142, the filter holder 143, the excitation light cut filter 144, the second lens 145, and the optical sensor 146 are arranged in this order from the metal film 30 side so as to face the surface of the metal film 30. I have.
  • the first lens 141 and the second lens 145 constitute a conjugate optical system that is not easily affected by stray light. Light traveling between the first lens 141 and the second lens 145 is substantially parallel light. The first lens 141 and the second lens 145 cause the fluorescence ⁇ emitted from the metal film 30 to form an image on the light receiving surface of the optical sensor 146.
  • the diaphragm 142 is disposed between the first lens 141 and the filter holder 143.
  • the diaphragm 142 transmits at least a part of the light (plasmon scattered light ⁇ and / or fluorescence ⁇ ) collimated by the first lens 141 via the diaphragm hole 151.
  • the light transmitted through the stop 142 reaches the fluorescence transmission region 156 of the excitation light cut filter 144.
  • the “fluorescence transmission area” means a partial area of the excitation light cut filter 144 through which the fluorescence ⁇ controlled by the aperture 142 (or the first through hole 152) passes when detecting the fluorescence ⁇ .
  • the shape of the aperture 151 in a plan view is not particularly limited.
  • the planar shape of the fluorescence transmission region 156 is the same as the planar shape of the aperture 151 of the aperture 142.
  • the filter holder 143 holds the excitation light cut filter 144, and is disposed between the stop 142 and the second lens 145.
  • the shape of the filter holder 143 is not particularly limited as long as it can hold the excitation light cut filter 144.
  • the shape of the filter holder 143 includes a shape that holds the excitation light cut filter 144 from below, a shape that grips the outer edge of the excitation light cut filter 144, and the like.
  • the filter holder 143 is formed larger than the excitation light cut filter 144, and holds the excitation light cut filter 144 from below.
  • the filter holder 143 has a first through hole 152 and a second through hole 153.
  • the first through hole 152 is arranged at a central portion of the filter holder 143.
  • the first through hole 152 is formed larger than the aperture 151 of the aperture 142.
  • the first through-hole 152 allows the light (plasmon scattered light ⁇ and / or fluorescence ⁇ ) converged by the diaphragm 142 to pass therethrough.
  • the light transmitted through the first through hole 152 reaches the back surface of the excitation light cut filter 144.
  • the second through hole 153 is disposed in the filter holder 143 so as to avoid the excitation light cut filter 144 (see FIG. 1).
  • the second through-hole 153 is arranged at a position shorter than the diameter of the fluorescence transmission region 156 from the end of the fluorescence transmission region 156.
  • the second through-hole 153 functions as a scattered light transmitting unit that transmits the plasmon scattered light ⁇ , and is used when determining an enhancement angle described later.
  • the light transmitted through the second through hole (scattered light transmitting portion) 153 reaches the optical sensor 146 via the second lens 145.
  • the scattered light transmitting section 153 may transmit the fluorescent light ⁇ as long as the plasmon scattered light ⁇ can be transmitted.
  • the area of the scattered light transmitting portion 153 in plan view is not particularly limited, but is preferably 1/1000 or less of the area of the fluorescence transmitting region 156 in plan view.
  • the “plan view” means a view from the metal film 30.
  • the excitation light cut filter 144 is disposed between the stop 142 and the second lens 145.
  • the excitation light cut filter 144 includes a fluorescence transmission region 156.
  • the fluorescent light transmitting region 156 transmits at least a part of the fluorescent light emitted from the metal film 30 and blocks at least a part of the wavelength of the excitation light.
  • the excitation light cut filter 144 reflects or absorbs light having the wavelength of the excitation light ⁇ (plasmon scattered light ⁇ ) while transmitting the fluorescence ⁇ , so that light other than the wavelength of the fluorescence ⁇ reaches the optical sensor 146. prevent. That is, the excitation light cut filter 144 removes a noise component from the light reaching the optical sensor 146, and contributes to the improvement of the detection accuracy and sensitivity of the weak fluorescence ⁇ .
  • the excitation light cut filter 144 guides only the fluorescent component to the optical sensor 146 and removes the excitation light component (plasmon scattered light ⁇ ) in order to detect the fluorescent component with a high S / N ratio.
  • the excitation light cut filter 144 include an excitation light reflection filter, a short wavelength cut filter, and a band pass filter.
  • the excitation light cut filter 144 is, for example, a filter formed of a multilayer film that removes a predetermined light component by reflecting it, but is a color glass filter that generally removes a predetermined light component by absorbing the light component. Is also good.
  • the optical sensor 146 detects fluorescence ⁇ or plasmon scattered light ⁇ emitted from the metal film 30.
  • the optical sensor 146 is a photomultiplier having a high sensitivity and a high SN ratio.
  • the optical sensor 146 may be an avalanche photodiode (APD) or a photodiode (PD).
  • APD avalanche photodiode
  • PD photodiode
  • the size of the irradiation spot of the excitation light ⁇ on one surface (the surface facing the dielectric 20) of the metal film 30 is determined by the optical sensor on the other surface (the surface facing the first lens 141) of the metal film 30. It is adjusted to be smaller than the size of the measurement area according to 146. In this way, even if the irradiation spot is slightly displaced due to errors in the parameters of the dielectric 20, the irradiation spot can be prevented from deviating from the measurement area.
  • the transmission adjustment unit 147 moves the scattered light transmitting unit 153 onto the optical path in the light receiving optical system unit 140, and when the optical sensor 146 detects the fluorescence ⁇ , At the same time as moving the transmission area 156 into the optical path of the light receiving optical system unit 140, the scattered light transmitting section 153 is moved out of the optical path inside the light receiving optical system unit 140.
  • the transmission adjustment unit 147 includes a stage 154 that supports the filter holder 143, and a motor 155 that serves as a drive source for moving the filter holder 143 (the scattered light transmission unit 153) via the stage 154.
  • the transmission adjustment unit 147 moves the scattered light transmission unit 153 to the inside or outside of the optical path of the light receiving optical system unit 140 without moving the filter holder 143 and the excitation light cut filter 144 significantly.
  • the enhancement angle can be determined.
  • the control unit 160 integrally controls the driving units, quantifies the amount of light received by the optical sensor 146, and the like.
  • the control unit 160 includes a light source control unit 161 that controls the light source unit 121, an optical sensor control unit 162 that controls the optical sensor 146, a motor control unit 163 that controls the motor 155, and a control processing unit. 164.
  • the control processing unit 164 comprehensively controls the light source control unit 161, the light sensor control unit 162, and the motor control unit 163, and controls the operation of the entire SPFS device 100.
  • the control unit 160 is, for example, a computer that executes software.
  • control unit 160 uses the measurement result of the plasmon scattered light ⁇ by the optical sensor 146 to input the excitation light ⁇ to the metal film 30 (the film formation surface 22) during the fluorescence measurement. Control the corner.
  • FIG. 2 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the SPFS device 100.
  • FIG. 3 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure at the time of measuring the enhancement angle.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining detection of plasmon scattered light.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining detection of fluorescence.
  • step S10 preparations for measurement are made. Specifically, the analysis chip 10 is installed at a predetermined position of the SPFS device 100. If a humectant exists in the flow channel 41 of the analysis chip 10, the flow channel 41 is washed and the humectant is removed so that the capturing body can appropriately capture the substance to be detected.
  • the substance to be detected in the sample is reacted with the capturing body (primary reaction, step S20). Specifically, a sample is injected into the flow channel 41, and the sample is brought into contact with the capturing body. When the analyte is present in the sample, at least a part of the analyte is captured by the capturing body. Thereafter, the inside of the flow channel 41 is washed with a buffer solution or the like to remove substances not captured by the capturing body.
  • the type of the specimen is not particularly limited. Examples of the specimen include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, semen, and a diluent thereof.
  • the control processing unit 164 moves the filter holder 143 to arrange the scattered light transmitting unit 153 on the optical path in the light receiving optical system unit 140 (step S30). Then, while irradiating the predetermined position of the metal film 30 (the film formation surface 22) with the excitation light ⁇ , the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (the film formation surface 22) is scanned to determine the optimum incident angle. Determine (Step S40). That is, the control processing unit 164 functions as the enhancement angle determination unit of the present invention.
  • the control processing unit 164 When measuring the enhancement angle in step S40, first, the control processing unit 164 performs a pre-scan for roughly estimating the enhancement angle (the peak angle of the intensity of the plasmon scattered light ⁇ ) (step S41). That is, the control processing unit 164 functions as a pre-scanning unit of the present invention. Specifically, the control processing unit 164 controls the light source unit 121 and the angle adjustment unit 122 to excite a predetermined angle range (10 °) on the metal film 30 (the film formation surface 22) at a first angle interval. The plasmon scattered light ⁇ is detected while scanning by irradiating the light ⁇ , and the intensity is measured.
  • the control processing section 164 starts the movement of the light source unit 121 from the standby position, irradiates the excitation light ⁇ with a predetermined angular range at the first angular interval, and scans the light source unit 121 at the standby position.
  • the predetermined angle range has a range of 10 ° because the enhancement angle is variably determined by the material and shape of the dielectric 20, the thickness of the metal film 30, the refractive index of the liquid in the flow path 41, and the like. Is preferred.
  • step S41 the steps of "stopping” and “waiting for stability” of the light source unit 121 are performed at each of the measurement points divided at the first angular interval before the measurement.
  • “stability waiting” before measurement has two purposes. The first is to wait for the vibration to stop (stabilize) because the mechanism shakes after the mechanism has stopped operating. Second, it takes a while for the measured electrical signal to become a normal signal after the irradiation of the excitation light ⁇ (a waiting time corresponding to the time constant of the noise filter included for noise removal is required). The purpose is to wait.
  • control processing unit 164 controls the optical sensor control unit 162 so that the optical sensor 146 detects plasmon scattered light ⁇ from above the metal film 30 (the surface of the metal film 30 and its vicinity).
  • the plasmon scattered light ⁇ from on the metal film (the surface of the metal film 30 and its vicinity) is collimated by the first lens 141 and reaches the optical sensor 146 via the scattered light transmitting unit 153.
  • the control processing unit 164 obtains data including a relationship between the incident angle of the excitation light ⁇ and the intensity of the plasmon scattered light ⁇ .
  • the control processing unit 164 analyzes the data and estimates an incident angle (enhancement angle) at which the intensity of the plasmon scattered light ⁇ becomes maximum.
  • control processing unit 164 performs a main scan for measuring the periphery of the enhancement angle estimated by the pre-scan at a high density (step S42). That is, the control processing unit 164 functions as a main scanning unit of the present invention. Specifically, the control processing unit 164 controls the light source unit 121 and the angle adjusting unit 122 to set the peripheral range of the enhancement angle estimated in step S41 to the second angular interval smaller than the first angular interval. Is irradiated with the excitation light ⁇ for scanning.
  • the control processing unit 164 starts the movement of the light source unit 121 from the standby position, irradiates the excitation light ⁇ with the excitation light ⁇ at the second angular interval to scan the peripheral range of the estimated enhancement angle, and then scans the light source unit 121. 121 is moved to the standby position.
  • step S42 the steps of "stop” and “stabilization wait” are performed at each of the measurement points divided at the second angular interval before the measurement.
  • the control processing unit 164 controls the optical sensor control unit 162 so that the optical sensor 146 detects plasmon scattered light ⁇ from above the metal film 30 (the surface of the metal film 30 and its vicinity).
  • the plasmon scattered light ⁇ from on the metal film (the surface of the metal film 30 and its vicinity) is collimated by the first lens 141 and reaches the optical sensor 146 via the scattered light transmitting unit 153.
  • the control processing unit 164 obtains data including a relationship between the incident angle of the excitation light ⁇ and the intensity of the plasmon scattered light ⁇ .
  • the control processing unit 164 analyzes the data and determines an incident angle (enhancement angle) at which the intensity of the plasmon scattered light ⁇ becomes maximum.
  • the enhancement angle is basically determined by the material and shape of the dielectric 20, the thickness of the metal film 30, the refractive index of the liquid in the flow path 41, and the like. Slightly fluctuates due to various factors such as a shape error of the dielectric 20. Therefore, it is preferable to determine the enhancement angle every time the analysis is performed.
  • the enhancement angle is determined on the order of about 0.1 °.
  • the detection time of the intensity of the plasmon scattered light ⁇ per measurement point is shorter than in the main scan performed in step S42.
  • the detection time per measurement point is 1 to 100 msec, whereas in the case of the main scan, the detection time per measurement point is 500 msec.
  • the reason why the detection time per measurement point in the main scan is long is to average vibration noise.
  • the vibration noise is not a noise caused by the swing of the mechanism, but a noise caused by a violent electric signal.
  • the maximum noise is about 0.5% of the vibration signal with respect to the maximum signal and does not affect the approximate peak calculation.
  • the measurement time is shortened by shortening the detection time per measurement point.
  • the incident angle of the excitation light ⁇ to the metal film 30 is set to the enhancement angle determined in the previous step (step S50).
  • the control processing unit 164 controls the angle adjustment unit 122 to set the incident angle of the excitation light ⁇ on the metal film 30 (the film formation surface 22) to the enhancement angle.
  • the angle of incidence of the excitation light ⁇ on the metal film 30 remains the enhancement angle.
  • the control processing unit 164 moves the filter holder 143 to arrange the fluorescence transmission region 156 in the optical path of the light receiving optical system unit 140, and sets the scattered light transmission unit 153 to the light receiving optical system. It is arranged outside the optical path in the system unit 140 (step S60). Then, the metal film 30 (the film formation surface 22) is irradiated with the excitation light ⁇ , and the intensity (optical blank value) of light having the same wavelength as the fluorescence ⁇ is measured (step S70). Specifically, the control processing unit 164 controls the light source control unit 161 to cause the light source unit 121 to emit the excitation light ⁇ .
  • control processing unit 164 controls the optical sensor control unit 162 so that the optical sensor 146 detects the intensity of light having the same wavelength as the fluorescence ⁇ .
  • the excitation light cut filter 144 does not transmit the plasmon scattered light ⁇ . Therefore, the optical sensor 146 can accurately measure the intensity of light that becomes noise (optical blank value). The measured value is transmitted to the control processing unit 164 and recorded as an optical blank value.
  • the substance to be detected captured by the capturing body is labeled with a fluorescent substance (secondary reaction, step S80).
  • a fluorescent labeling liquid is injected into the flow channel 41.
  • the fluorescent labeling solution is, for example, a buffer containing an antibody (secondary antibody) labeled with a fluorescent substance.
  • the fluorescent labeling liquid comes into contact with the substance to be detected, and the substance to be detected is labeled with the fluorescent substance. Thereafter, the inside of the flow channel 41 is washed with a buffer or the like to remove free fluorescent substances and the like.
  • control processing unit 164 irradiates the metal film 30 (the film formation surface 22) with the excitation light ⁇ and measures the intensity of the fluorescence ⁇ emitted from the metal film 30 (the surface of the metal film 30 and its vicinity).
  • the control processing unit 164 functions as the fluorescence intensity detection unit of the present invention. Specifically, the control processing unit 164 controls the light source control unit 161 to cause the light source unit 121 to emit the excitation light ⁇ . At the same time, the control processing unit 164 controls the optical sensor control unit 162 so that the optical sensor 146 detects the fluorescence ⁇ emitted from the metal film (the metal film 30 and its vicinity).
  • the control processing unit 164 subtracts the optical blank value from the measured value, and calculates the fluorescence intensity correlated with the amount of the substance to be detected. The fluorescence intensity is converted, if necessary, into the amount or concentration of the substance to be detected.
  • the scattered light transmitting portion 153 for detecting the plasmon scattered light ⁇ is disposed in the filter holder 143 near the excitation light cut filter having the fluorescence transmitting region 156 for detecting the fluorescence ⁇ , It is possible to detect the presence of the target substance or the amount of the target substance in the sample without significantly moving the light cut filter 144.
  • the enhanced angle scan of the SPFS apparatus 100 scans a range of ⁇ 5 ° to find an optimum angle in order to cope with variation in the analysis chip 10 and various items of inspection.
  • the existence range of the peak position (enhancement angle) of the intensity of the plasmon scattered light ⁇ is assumed to be 66 ° ⁇ 3 °. Further, since it is necessary for approximation, it is expanded to both sides of 2 ° (ie, ⁇ 5 °) ) Scan.
  • the measurement points were measured at 30 points (in steps of 0.35 °).
  • the required performance ( ⁇ 0.1 °) of the measurement accuracy can be satisfied, but there is a problem that the measurement time becomes long.
  • the required performance is defined by the final system.
  • the system (SPFS apparatus 100) of the present embodiment has a very severe requirement ( ⁇ 0.1 °) because the purpose is to measure ultra-high sensitivity. ing.
  • ⁇ 0.1 ° because the purpose is to measure ultra-high sensitivity. ing.
  • Parameters relating to the accuracy of peak position calculation are a measurement range (angle) and a measurement density (angle / point) of a measurement point for approximating a higher-order function.
  • the evaluation amount of the peak position calculation accuracy represents an error from the peak position.
  • the error includes a variation ( ⁇ ) and a central value (average value) of the variation, and the evaluation is made by adding them.
  • the measurement of the enhancement angle scan is performed by equally dividing 10 ° ( ⁇ 5 °), which is the scan range of the enhancement angle.
  • the measurement time is proportional to the number of measurement points as shown in FIG. That is, as the number of measurement points increases, the measurement time increases.
  • the noise is 1% of random noise of normal distribution (assuming about twice the maximum noise assumed in the actual machine)
  • the range used for approximation is a range of 5 ° near the peak position, and the variation is obtained.
  • the number of repetitions for the simulation is 1000 times.
  • FIG. 7A and 7B are image diagrams of function approximation at the time of calculating the peak position of plasmon scattered light.
  • FIG. 7A shows 15 measurement points
  • FIG. 7B shows 20 measurement points
  • FIG. 7C shows 25 measurement points
  • the target value of the calculated peak position variation ( ⁇ ) is within 0.1 °. However, considering the margin, the variation ( ⁇ ) is set to 0.08 ° or less. In some cases, the approximation range may be as narrow as 2 ° on one side.
  • the measurement pitches are: 0.345 ° / point (measurement points: 30 points), 0.417 ° / point (measurement points: 25 points), 0.526 ° / point (measurement points: 20 points), 0.714 ° / Point (the number of measurement points is 15).
  • each embodiment is a simulation in which the measurement pitch (the number of measurement points) and the measurement range used for approximation are varied. Noise is evaluated by adding random noise having a normal distribution of 1%, and using the variation and the average value of 1000 measurements.
  • Example 1 a configuration for performing a fourth-order function approximation of the SPFS device 100 according to the present embodiment.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating an example of the variation ( ⁇ ) of the peak position in the first embodiment.
  • FIG. 9 is a diagram illustrating an example of an error in the average value (average angle) of the peak positions according to the first embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating an example of the total value of the errors at the peak positions (the sum of the variation (see FIG. 8) and the average error (see FIG. 9)) according to the first embodiment.
  • the reference numeral L1 in the figure is a measurement value when the number of measurement points is 15
  • the reference number L2 is a measurement value when the number of measurement points is 20
  • the reference number L3 is a measurement value when the number of measurement points is 25
  • the reference number L4 is The measurement value when the number of measurement points is 30 is shown.
  • the configuration of Example 1 satisfies the required performance of measurement accuracy when the number of measurement points is 25 or more.
  • Example 2 Next, with reference to FIG. 11 to FIG. 13, a description will be given of Example 2 of the SPFS device 100 according to the present embodiment (configuration for performing fifth-order function approximation).
  • FIG. 11 is a diagram illustrating an example of the variation ( ⁇ ) of the peak position according to the second embodiment.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating an example of an error in the average value (average angle) of the peak positions according to the second embodiment.
  • FIG. 13 is a diagram illustrating an example of the total value of the peak position errors (the sum of the variation (see FIG. 11) and the average error (see FIG. 12)) according to the second embodiment.
  • the number of measurement points is 15 (measurement pitch is 0.714 ° / point), and 20 points (measurement pitch is In the case of 0.526 ° / point) and 25 points (measurement pitch is 0.417 ° / point), the estimated error of the calculated peak position is a value exceeding 0.08 °.
  • the number of measurement points is 30 (measurement pitch is 0.345 ° / point)
  • the estimated error of the calculated peak position is 0.08 ° or less. Therefore, it can be seen that the configuration of Example 2 satisfies the required performance of measurement accuracy when the number of measurement points is 30 or more.
  • Example 3 a configuration for performing quadratic function approximation of the SPFS device 100 according to the present embodiment.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating an example of the variation ( ⁇ ) of the peak position according to the third embodiment.
  • FIG. 15 is a diagram illustrating an example of an error in the average value (average angle) of the peak positions according to the third embodiment.
  • Example 4 of the SPFS device 100 according to the present embodiment (a configuration for performing a quadratic function approximation, but adding 3% noise) will be described.
  • FIG. 16 is a diagram illustrating an example of the variation ( ⁇ ) of the peak position according to the fourth embodiment.
  • FIG. 17 is a diagram illustrating an example of an error in the average value (average angle) of the peak positions according to the fourth embodiment.
  • Example 1 satisfies the required performance of measurement accuracy when the number of measurement points is 25 or more.
  • the configuration of Example 2 satisfies the required performance of measurement accuracy when the number of measurement points is 30 or more.
  • the configurations of Example 3 and Example 4 do not satisfy the required performance of the measurement accuracy regardless of the number of measurement points. Since the measurement time is proportional to the number of measurement points, it is preferable to select a configuration having a small number of measurement points in order to reduce the measurement time.
  • the number of measurement points in Example 1 is 25 points (the measurement pitch is 0.417 ° / point). Is preferably selected.
  • a configuration in which the fourth-order function approximation is performed using the measurement points (13 points) in a range of about 5 ° at a pitch of 0.417 ° / point (25 measurement points) is optimal. It turned out to be.
  • a rough peak position can be obtained by performing a pre-scan (step S41) during the enhancement angle scan. This makes it possible to reduce the number of measurement points during the main scan (step S42) while measuring only the vicinity of the peak position at a high density. Therefore, the measurement time of the approximate point can be reduced.
  • the measurement time of the 13 measurement points in the main scan is 9.65. Seconds.
  • the measurement pitch is 0.417 ° / point
  • measurement at 25 points is required, so that a time of 18.05 seconds is required. Therefore, by adopting the configuration of the first embodiment (configuration for performing a fourth-order function approximation) with 25 measurement points (measurement pitch is 0.417 ° / point), it is possible to realize a significant time reduction. .
  • the noise amount is expected to be about three times. For example, when five points are measured at 10 °, the error is about 0.5 ° (three times the noise and a second-order approximation). Since the time required for the measurement of the five points during the pre-scan is about 1.8 seconds, the time required for the enhancement angle scan is 11.5 seconds in combination with 9.65 seconds for the main scan. In any case, a significant time reduction can be realized as compared with the conventional 18.05 seconds.
  • the surface plasmon resonance fluorescence spectrometer (SPFS device) 100 irradiates the excitation light ⁇ to the metal film 30 via the dielectric 20 and simultaneously emits the plasmon emitted from the metal film 30.
  • An enhancement angle determination unit (control processing unit 164) that detects the intensity of the scattered light ⁇ and determines an enhancement angle that is an incident angle when the intensity of the plasmon scattered light ⁇ is maximum;
  • a fluorescence intensity detection unit control processing unit 164) that irradiates the metal film 30 with the excitation light ⁇ via the dielectric 20 and detects the intensity of the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent substance so that the enhancement angle is obtained. Is provided.
  • the enhancement angle determining unit irradiates the metal film 30 with the excitation light ⁇ at a first angular interval and scans the metal film 30 at the first angular interval, and detects the intensity of the plasmon scattered light ⁇ to estimate the enhancement angle.
  • the leading scanning unit (control processing unit 164) and the surrounding area of the enhancement angle estimated by the leading scanning unit are scanned by irradiating the excitation light ⁇ at a second angular interval smaller than the first angular interval, A main scanning unit (control processing unit 164) that detects the intensity of the plasmon scattered light ⁇ and determines the enhancement angle. Therefore, according to the SPFS apparatus 100 according to the present embodiment, since the number of measurement points near the peak position can be increased while reducing the number of measurement points as a whole, the measurement time in the enhancement angle scan is shortened and the measurement accuracy is improved. Can be done.
  • the detection time of the intensity of the plasmon scattered light ⁇ per point is shorter in the preceding scanning unit than in the main scanning unit. Therefore, according to the SPFS apparatus 100 according to the present embodiment, the detection time per measurement point at the time of pre-scan can be shortened without adversely affecting the approximate peak calculation, thereby ensuring measurement accuracy. , Measurement time can be shortened.
  • the movement of the light source unit 121 is started from the standby position and scanning is performed. It is not something to be done.
  • the movement of the light source unit 121 is started from the standby position and scanning is performed.
  • the light source unit 121 is moved from the end point of the scan by the pre-scan toward the standby position. The movement may be started to scan.
  • the preceding scanning unit starts moving the light source unit 121 from the standby position, scans the predetermined angle range by irradiating the excitation light ⁇ at the first angular interval, and performs the main scanning unit.
  • the light source unit 121 starts moving from a predetermined position on the opposite side to the moving direction of the light source unit 121 in the standby position toward the standby position and performs scanning.
  • the scanning may be performed by starting the movement of the light source unit 121 from the standby position.
  • the movement to the predetermined position in advance (before the pre-scan) is performed during the idle time of the measurement.
  • the preceding scanning unit starts moving the light source unit 121 from the predetermined position on the opposite side to the movement direction of the light source unit 121 at the standby position toward the standby position, and moves the predetermined angle range at the first angular interval.
  • the main scanning unit starts moving the light source unit 121 from the standby position and scans the excitation light ⁇ at a second angular interval in a peripheral range of the enhancement angle estimated by the preceding scanning unit.
  • the light source unit 121 can be moved in the same movement direction (standby position ⁇ measurement position) as in steps S70 and S90 performed thereafter. Therefore, since the positioning accuracy of the light source unit 121 can be improved, the measurement accuracy can be improved.
  • the steps of “stop” and “wait for stabilization” of the light source unit 121 are performed before the measurement at each measurement point.
  • the scanning may be performed by irradiating the excitation light ⁇ without stopping the movement of the light source unit 121.
  • scanning may be performed by irradiating the excitation light ⁇ without waiting for the light source unit 121 to stabilize.
  • the scanning may be performed by irradiating the excitation light ⁇ without stopping the movement of the light source unit 121 and without waiting for stability.
  • the pre-scanning section irradiates the metal film 30 with the excitation light ⁇ at the first angular interval to scan the metal film 30 at the first angular interval without stopping the movement of the light source unit 121, thereby performing pre-scanning. Since the number of steps can be reduced, the measurement time can be reduced.
  • the number of measurement points in the pre-scan performed in step S41 be smaller than that in the main scan performed in step S42, from the viewpoint of reducing the measurement time.
  • the above configuration is not essential, and the number of measurement points may be the same as that of the main scan, or the number of measurement points may be larger than that of the main scan.
  • the excitation light cut filter 144 has a fluorescence transmission region 156 that transmits at least a part of the fluorescence ⁇ and blocks at least a part of the wavelength of the excitation light ⁇ , but blocks at least a part of the excitation light ⁇ . Means that a part of the excitation light ⁇ may be transmitted.
  • the excitation light ⁇ is a plasmon, and the plasmon scattered light ⁇ is also transmitted. This means that, in principle, the measurement for detecting the enhancement angle peak can be performed even when the excitation light cut filter 144 is provided. However, in reality, the excitation light ⁇ transmitted through the excitation light cut filter 144 is very small (0.01% or less), so that measurement is difficult.
  • the enhancement angle peak is calculated using the intensity of the plasmon scattered light ⁇ , but the invention is not limited to this.
  • the incident angle (light projection angle) when the intensity of the measurement light becomes the maximum is the enhancement angle. Therefore, it is most preferable if the enhancement angle peak can be calculated using the fluorescence ⁇ .
  • the fluorescent signal fades (the amount of fluorescent light decreases) when the excitation light ⁇ is continuously applied, so that there is a problem that the fluorescent light ⁇ decreases when measuring the fluorescent signal. Therefore, in this embodiment, in order to avoid discoloration, the enhancement angle peak is calculated using the plasmon scattered light ⁇ before being fluorescently labeled.
  • the present invention can be used for a surface plasmon resonance fluorescence analyzer and a surface plasmon resonance fluorescence analysis method.

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Abstract

増強角スキャンにおける測定時間を短縮しつつ、測定精度を向上させることが可能な表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法を提供する。金属膜３０に励起光を照射するとともに、金属膜３０上から出射されたプラズモン散乱光の強度を検出して増強角を決定する増強角決定部（制御処理部１６４）と、入射角が増強角となるように励起光を照射するとともに、蛍光物質から放出された蛍光の強度を検出する蛍光強度検出部（制御処理部１６４）と、を備える。増強角決定部は、所定の角度範囲を第１の角度間隔で走査するとともに、プラズモン散乱光の強度を検出して増強角を推定する先行走査部（制御処理部１６４）と、推定された増強角の周辺範囲を第１の角度間隔よりも狭い第２の角度間隔で走査するとともに、プラズモン散乱光の強度を検出して増強角を決定する本走査部（制御処理部１６４）と、を備える。

Description

表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法
　本発明は、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法に関する。
　臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる分析方法及び分析装置が求められている。
　被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン共鳴蛍光分析（表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。
　特許文献１、２には、ＳＰＦＳを利用する分析方法及び分析装置が開示されている。これらの分析方法及び分析装置では、誘電体からなるプリズムと、プリズムの一面上に形成された金属膜と、金属膜上に固定された捕捉体（例えば抗体）と、を有するセンサーチップを使用する。金属膜上に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質が捕捉体により捕捉される（１次反応）。捕捉された被検出物質は、さらに蛍光物質で標識される（２次反応）。この状態で、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）が生じる角度で励起光を、プリズムを介して金属膜に照射すると、金属膜表面上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が選択的に励起され、蛍光物質から放出された蛍光が観察される。これらの分析方法及び分析装置では、蛍光を検出して、被検出物質の存在又はその量を検出する。
　ＳＰＦＳを利用する分析方法及び分析装置では、検出感度及び検出精度を十分に向上させるために、蛍光強度が最大となるように金属膜に対する励起光の入射角を設定する必要がある。
　特許文献１、２に記載の分析方法及び分析装置では、励起光と同じ波長を有し、ＳＰＲにより発生する散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）の強度が最大となるときの入射角（以下「増強角」という）で励起光を照射している。
　増強角は、測定の度に行われる増強角スキャンにより算出される。増強角スキャンは、ブランク測定及びシグナル測定時の投光角度（増強角）を決定するために行う測定であり、投光角度を走査して角度ごとのプラズモン散乱光の強度を測定し、強度のピークを取る角度を増強角として算出する。具体的には、まず、バンドパスフィルター（ＢＰＦ）を切り替えて、プラズモン散乱光の測定を可能とする。次に、投光角度（約１０°）を等間隔に移動させ、停止位置（３０点）でプラズモン散乱光を測定する。そして、関数フィッティング（ピーク付近の７点を４次関数近似）により、ピーク角度を算出する。
ＷＯ２０１１／１５２０６４号 ＷＯ２０１５／１１９１５４号
　しかしながら、従来技術のような多処理装置では、測定時間の短縮が要求されるが、増強角スキャンにおける各測定点（３０点）において、それぞれ移動、安定待ち、測定の工程が生じるうえ、復路駆動にも時間を要するため、およそ２０～３０秒の時間が掛かっていた。これは、ブランク測定やシグナル測定の時間（ともに約２．５秒）と比べても、大きな時間を占めており、測定が長時間となる要因となっていた。
　そこで、測定点数を従来の３０点から１５点程度に減らすことで、測定時間を短縮することはできる。しかしながら、増強角スキャンによるピーク角度の算出精度は、検体検査用の本測定の測定精度に影響するため、非常に要求が高い（±０．１°）という課題がある。測定時間の短縮を目的として、測定点数を従来の３０点から１５点程度に減らした場合、要求される測定精度を満たすことができないという課題がある。
　本発明は、増強角スキャンにおける測定時間を短縮しつつ、測定精度を向上させることが可能な表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法を提供することを目的とする。
　請求項１に記載の発明は、上記目的を達成するためになされたものであり、
　金属膜を一面に有する誘電体を含む分析チップが装着され、光源から前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上の被検出物質を標識する蛍光物質を励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、前記被検出物質の存在又はその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
　前記誘電体を介して前記金属膜に前記励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射されたプラズモン散乱光の強度を検出して、前記プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する増強角決定部と、
　前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記誘電体を介して前記金属膜に前記励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出された蛍光の強度を検出する蛍光強度検出部と、
　を備え、
　前記増強角決定部は、
　前記金属膜に所定の角度範囲を第１の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を推定する先行走査部と、
　前記先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を、前記第１の角度間隔よりも狭い第２の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を決定する本走査部と、
　を備えることを特徴とする。
　請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において、
　前記先行走査部は、前記本走査部よりも１点当たりの前記プラズモン散乱光の強度の検出時間が短いことを特徴とする。
　請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において、
　前記先行走査部は、待機位置から前記光源の移動を開始して、前記所定の角度範囲を前記第１の角度間隔で前記励起光を照射して走査し、
　前記本走査部は、前記先行走査部による走査の終点から前記待機位置に向けて前記光源の移動を開始して、前記先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を前記第２の角度間隔で前記励起光を照射して走査することを特徴とする。
　請求項４に記載の発明は、請求項１又は２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において、
　前記先行走査部は、待機位置の前記光源の移動方向反対側の所定位置から前記待機位置に向けて前記光源の移動を開始して、前記所定の角度範囲を前記第１の角度間隔で前記励起光を照射して走査し、
　前記本走査部は、前記待機位置から前記光源の移動を開始して、前記先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を前記第２の角度間隔で前記励起光を照射して走査することを特徴とする。
　請求項５に記載の発明は、請求項１～４のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において、
　前記先行走査部は、前記光源の移動を停止することなく、前記金属膜に前記所定の角度範囲を前記第１の角度間隔で前記励起光を照射して走査することを特徴とする。
　請求項６に記載の発明は、
　被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在又はその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
　前記被検出物質を、誘電体の一面上に配置された金属膜上に配置する配置工程と、
　前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射されたプラズモン散乱光の強度を検出して、前記プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する増強角決定工程と、
　前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記誘電体を介して前記金属膜に前記励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出された蛍光の強度を検出する蛍光強度検出工程と、
　を含み、
　前記増強角決定工程は、
　前記金属膜に所定の角度範囲を第１の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を推定する先行走査工程と、
　前記先行走査工程で推定された増強角の周辺範囲を、前記第１の角度間隔よりも狭い第２の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を決定する本走査工程と、
　を含むことを特徴とする。
　本発明によれば、増強角スキャンにおける測定時間を短縮しつつ、測定精度を向上させることができる。
本実施形態に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。 本実施形態に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 増強角の測定時の動作手順の一例を示すフローチャートである。 プラズモン散乱光の検出を説明するための図である。 蛍光の検出を説明するための図である。 測定時間と測定点数の関係を示す図である。 測定点数が１５点の場合のプラズモン散乱光のピーク位置算出時の関数近似のイメージ図である。 測定点数が２０点の場合のプラズモン散乱光のピーク位置算出時の関数近似のイメージ図である。 測定点数が２５点の場合のプラズモン散乱光のピーク位置算出時の関数近似のイメージ図である。 測定点数が３０点の場合のプラズモン散乱光のピーク位置算出時の関数近似のイメージ図である。 実施例１におけるピーク位置のばらつきの一例を示す図である。 実施例１におけるピーク位置の平均値の誤差の一例を示す図である。 実施例１におけるピーク位置の誤差の合計値の一例を示す図である。 実施例２におけるピーク位置のばらつきの一例を示す図である。 実施例２におけるピーク位置の平均値の誤差の一例を示す図である。 実施例２におけるピーク位置の誤差の合計値の一例を示す図である。 実施例３におけるピーク位置のばらつきの一例を示す図である。 実施例３におけるピーク位置の平均値の誤差の一例を示す図である。 実施例４におけるピーク位置のばらつきの一例を示す図である。 実施例４におけるピーク位置の平均値の誤差の一例を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
（ＳＰＦＳ装置の構成）
　まず、本発明の実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（以下「ＳＰＦＳ装置」ともいう）について説明する。
　ＳＰＦＳ装置は、誘電体と、誘電体の一面に形成された金属膜と、を有する分析チップが装着された状態で使用される。金属膜上に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質が捕捉体により捕捉される。このとき、被検出物質は蛍光物質で標識されていてもよいし、標識されていなくてもよい。捕捉された被検出物質が蛍光物質で標識されていない場合は、捕捉された被検出物質は、さらに蛍光物質で標識される。この状態で、表面に金属膜を有するプリズムに対して全反射条件となるように励起光を照射する。これにより、励起光及び金属膜中の自由電子の相互作用（表面プラズモン共鳴）が生じ、局在場光が発生する。一般にこの局在場光は、「増強電場」又は「増強されたエバネッセント光」とも呼ばれ、金属膜の表面近傍の物理量変動を測定することが可能である。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が選択的に励起され、蛍光物質から放出された蛍光が観察される。ＳＰＦＳ装置は、蛍光の光量を測定して、被検出物質の存在又はその量を検出する。
　ＳＰＦＳ装置１００は、図１に示すように、分析チップ１０を着脱可能に保持するためのチップホルダー１２と、分析チップ１０に励起光αを照射するための励起光学系ユニット１２０と、分析チップ１０から放出された光（プラズモン散乱光β及び蛍光γ）を検出するための受光光学系ユニット１４０と、これらを制御する制御部１６０と、を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１２に分析チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、分析チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
　分析チップ１０は、入射面２１、成膜面２２及び出射面２３を有する誘電体２０と、成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２又は金属膜３０上に配置された流路蓋４０と、を有する。通常、分析チップ１０は、分析のたびに交換される。
　誘電体２０は、励起光αに対して透明な部材（プリズム）からなる。誘電体２０は、入射面２１、成膜面２２及び出射面２３を有する。入射面２１は、励起光学系ユニット１２０からの励起光αを誘電体２０の内部に入射させる。成膜面２２の上には、金属膜３０が形成される。誘電体２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０で反射する。より具体的には、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射する。出射面２３は、金属膜３０で反射した励起光αを誘電体２０の外部に出射させる。誘電体２０の形状は、特に限定されない。本実施形態では、誘電体２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分が誘電体２０内に滞留しにくくなる。入射面２１は、励起光αが励起光学系ユニット１２０に戻らないように形成される。励起光αが励起光源であるレーザーダイオードに戻ると、レーザーダイオードの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまうからである。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。例えば、入射面２１と成膜面２２との角度及び成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。誘電体２０の材料の例には、樹脂及びガラスが含まれる。誘電体２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４～１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
　金属膜３０は、誘電体２０の成膜面２２上に形成されている。金属膜３０を設けることで、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴；ＳＰＲ）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光を生じさせることができる。金属膜３０の素材は、表面プラズモン共鳴を生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の素材の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０～７０ｎｍの範囲内が好ましい。
　また、特に図示しないが、金属膜３０の誘電体２０と対向しない面には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定されていてもよい。捕捉体を固定することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。本実施の形態では、金属膜３０上の所定の領域に、捕捉体が均一に固定されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。例えば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体又はその断片である。
　流路蓋４０は、金属膜３０の誘電体２０と対向しない面上に、流路４１を挟んで配置されている。金属膜３０が誘電体２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、流路４１を挟んで成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０は、金属膜３０（及び誘電体２０）とともに、検体や蛍光標識液、洗浄液などの液体が流れる流路４１を形成する。捕捉体は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された注入口及び排出口（いずれも図示省略）とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が注入されると、流路４１内において、これらの液体は捕捉体に接触する。流路蓋４０は、金属膜３０の誘電体２０と対向しない面及びその近傍から放出された光（プラズモン散乱光β及び蛍光γ）に対して透明な材料からなる。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。これらの光を受光光学系ユニット１４０に導くことができれば、流路蓋４０の一部は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープ又は接着剤による接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０又は誘電体２０に接合されている。
　図１に示されるように、誘電体２０へ導かれた励起光αは、入射面２１から誘電体２０内に入射する。誘電体２０内に入射した励起光αは、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）となるように入射する。界面からの反射光は、出射面２３から誘電体２０外に出射される（図示省略）。一方、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光αが界面に入射することで、金属膜３０及びその近傍からは、プラズモン散乱光β及び／又は蛍光γが、受光光学系ユニット１４０の方向へ出射される。
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１２、励起光学系ユニット１２０、受光光学系ユニット１４０及び制御部１６０を有する。
　チップホルダー１２は、所定の位置で分析チップ１０を保持する。分析チップ１０は、チップホルダー１２に保持された状態で、励起光学系ユニット１２０からの励起光αを照射される。このとき、金属膜３０の誘電体２０と対向しない面及びその近傍からは、励起光αと同一波長のプラズモン散乱光βや蛍光物質から放出された蛍光γなどが上方に放出される。また、励起光αは、誘電体２０と金属膜３０との界面で反射して、誘電体２０の外部に出射される（図示省略）。
　励起光学系ユニット１２０は、励起光αを出射する光源ユニット（光源）１２１と、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を調整する角度調整部１２２と、を有する。
　光源ユニット１２１は、励起光源としてレーザーダイオード（以下「ＬＤ」と略記する）を有し、チップホルダー１２に保持された分析チップ１０の入射面２１に向けて励起光α（シングルモードレーザー光）を出射する。より具体的には、光源ユニット１２１は、分析チップ１０の誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に対して励起光αが全反射角度となるように、界面に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。例えば、光源ユニット１２１は、ＬＤユニット、整波器及び整形光学系（いずれも図示省略）を有する。
　ＬＤユニットは、コリメートされ、かつ波長及び光量が一定の励起光αを、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。ＬＤユニットは、励起光源としてのＬＤと、ＬＤから出射された励起光αをコリメートするコリメーターと、励起光αの光量を一定にするための温度調整回路と、を有する。ＬＤから出射される励起光αは、コリメートされてもその輪郭形状が扁平である。このため、界面（成膜面２２）における照射スポットの形状が略円形となるように、ＬＤは所定の姿勢で保持されるか、又は後述の整形光学系に所定形状のスリットが挿入される。また、ＬＤから出射される励起光αの波長及び光量は、温度によって変化する。このため、温度調整回路は、コリメートされた後の励起光αから分岐させた光の光量をフォトダイオードなどにより監視し、励起光αの波長及び光量が一定となるようにヒーターやペルチェ素子などを用いてＬＤの温度を調整する。
　整波器は、バンドパスフィルター（以下「ＢＰＦ」と略記する）及び直線偏光フィルター（以下「ＬＰ」と略記する）を含み、ＬＤユニットから出射された励起光αを整波する。ＬＤユニットからの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているため、ＢＰＦは、ＬＤユニットからの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。また、ＬＤユニットからの励起光αは、完全な直線偏光ではないため、ＬＰは、ＬＤユニットからの励起光αを完全な直線偏光の光にする。整波器は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する半波長板を含んでいてもよい。
　整形光学系は、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。整形光学系から出射された励起光αは、分析チップ１０の誘電体２０に照射される。整形光学系は、例えばスリットやズーム手段などである。
　なお、光源ユニット１２１に含まれる光源の種類は、特に限定されず、ＬＤでなくてもよい。光源の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
　角度調整部１２２は、金属膜３０（誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））への励起光αの入射角を調整する。角度調整部１２２は、励起光αを、誘電体２０を介して金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に所定の入射角で照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１２とを相対的に回転させる。本実施の形態では、角度調整部１２２は、光源ユニット１２１を励起光αの光軸と直交する軸を中心として回転させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０（成膜面２２）上での照射位置がほとんど移動しないように、回転軸の位置を設定する。例えば、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
　受光光学系ユニット（受光光学系）１４０は、チップホルダー１２に保持された分析チップ１０の金属膜３０の誘電体２０と対向しない面に対向するように配置されている。受光光学系ユニット１４０は、金属膜３０上から出射される光（プラズモン散乱光β又は蛍光γ）を検出する。受光光学系ユニット１４０は、第１レンズ１４１、絞り１４２、フィルターホルダー１４３、励起光カットフィルター１４４、第２レンズ１４５、光センサー１４６及び透過調整部１４７を有する。第１レンズ１４１、絞り１４２、フィルターホルダー１４３、励起光カットフィルター１４４、第２レンズ１４５及び光センサー１４６は、金属膜３０の表面と対向するように、金属膜３０側からこの順番で配置されている。
　第１レンズ１４１及び第２レンズ１４５は、迷光の影響を受けにくい共役光学系を構成する。第１レンズ１４１と第２レンズ１４５との間を進行する光は、略平行光となる。第１レンズ１４１及び第２レンズ１４５は、金属膜３０上から放出される蛍光γを光センサー１４６の受光面上に結像させる。
　絞り１４２は、第１レンズ１４１及びフィルターホルダー１４３の間に配置されている。絞り１４２は、絞り孔１５１を介して、第１レンズ１４１によりコリメートされた光（プラズモン散乱光β及び／又は蛍光γ）の少なくとも一部を透過させる。絞り１４２を透過した光は、励起光カットフィルター１４４の蛍光透過領域１５６に到達する。ここで、「蛍光透過領域」とは、蛍光γの検出時において、絞り１４２（又は第１貫通孔１５２）によって制御された蛍光γが透過する励起光カットフィルター１４４の一部の領域を意味する。絞り孔１５１の平面視形状は、特に限定されない。蛍光透過領域１５６の平面視形状は、絞り１４２の絞り孔１５１の平面視形状と同じである。
　フィルターホルダー１４３は、励起光カットフィルター１４４を保持しており、絞り１４２及び第２レンズ１４５の間に配置されている。フィルターホルダー１４３の形状は、励起光カットフィルター１４４を保持することができれば、特に限定されない。フィルターホルダー１４３の形状には、励起光カットフィルター１４４を下側から保持する形状、励起光カットフィルター１４４の外縁部を把持する形状などが含まれる。本実施の形態では、フィルターホルダー１４３は、励起光カットフィルター１４４より大きく形成されており、励起光カットフィルター１４４を下側から保持する。
　フィルターホルダー１４３は、第１貫通孔１５２及び第２貫通孔１５３を有する。第１貫通孔１５２は、フィルターホルダー１４３の中央部分に配置されている。本実施の形態では、第１貫通孔１５２は、絞り１４２の絞り孔１５１より大きく形成されている。第１貫通孔１５２は、絞り１４２で絞られた光（プラズモン散乱光β及び／又は蛍光γ）を透過させる。第１貫通孔１５２を透過した光は、励起光カットフィルター１４４の裏面に到達する。第２貫通孔１５３は、励起光カットフィルター１４４を避けるようにフィルターホルダー１４３に配置されている（図１参照）。詳細は後述するが、第２貫通孔１５３は、蛍光透過領域１５６の端部から蛍光透過領域１５６の直径より短い位置に配置されている。第２貫通孔１５３は、プラズモン散乱光βを透過させる散乱光透過部として機能し、後述の増強角の決定時に用いられる。第２貫通孔（散乱光透過部）１５３を透過した光は、第２レンズ１４５を介して光センサー１４６に到達する。なお、散乱光透過部１５３は、プラズモン散乱光βを透過させることができれば、蛍光γを透過させてもよい。散乱光透過部１５３を平面視したときの面積は、特に限定されないが、蛍光透過領域１５６を平面視したときの面積の１／１０００以下であることが好ましい。ここで、「平面視」とは、金属膜３０から見た場合のことを意味する。
　励起光カットフィルター１４４は、絞り１４２及び第２レンズ１４５の間に配置されている。励起光カットフィルター１４４は、蛍光透過領域１５６を含む。蛍光透過領域１５６は、金属膜３０上から出射された蛍光の少なくとも一部を透過させ、励起光の少なくとも一部の波長の光を遮断する。励起光カットフィルター１４４は、励起光αの波長の光（プラズモン散乱光β）を反射又は吸収する一方で蛍光γを透過させることで、光センサー１４６に蛍光γの波長以外の光が到達することを防ぐ。すなわち、励起光カットフィルター１４４は、光センサー１４６に到達する光からノイズ成分を除去し、微弱な蛍光γの検出精度及び感度の向上に寄与する。
　励起光カットフィルター１４４は、蛍光成分のみを光センサー１４６に導き、高いＳ／Ｎ比で当該蛍光成分を検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光β）を除去する。励起光カットフィルター１４４の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルター及びバンドパスフィルターが含まれる。励起光カットフィルター１４４は、例えば、所定の光成分を反射することで除去する多層膜からなるフィルターであるが、所定の光成分を一般的には吸収することで除去する色ガラスフィルターであってもよい。
　光センサー１４６は、金属膜３０上から出射される蛍光γ又はプラズモン散乱光βを検出する。例えば、光センサー１４６は、感度及びＳＮ比が高い光電子増倍管である。光センサー１４６は、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）又はフォトダイオード（ＰＤ）などであってもよい。なお、金属膜３０の一方の面（誘電体２０と対向する面）における励起光αの照射スポットの大きさは、金属膜３０の他方の面（第１レンズ１４１と対向する面）における光センサー１４６による測定領域の大きさよりも小さくなるように調整される。このようにすることで、誘電体２０の各パラメータの誤差により照射スポットがわずかに位置ずれした場合であっても、照射スポットが測定領域から外れることを防止できる。
　透過調整部１４７は、光センサー１４６がプラズモン散乱光βを検出する時には、散乱光透過部１５３を受光光学系ユニット１４０内の光路上に移動させ、光センサー１４６が蛍光γを検出する時には、蛍光透過領域１５６を受光光学系ユニット１４０の光路内に移動させると同時に、散乱光透過部１５３を受光光学系ユニット１４０内の光路外に移動させる。透過調整部１４７は、フィルターホルダー１４３を支持するステージ１５４と、ステージ１５４を介してフィルターホルダー１４３（散乱光透過部１５３）を移動させる駆動源となるモーター１５５と、を有する。詳細は後述するが、透過調整部１４７は、散乱光透過部１５３を受光光学系ユニット１４０の光路の内部又は外部に移動させることで、フィルターホルダー１４３及び励起光カットフィルター１４４を大きく移動させることなく、増強角を求めることができる。
　制御部１６０は、各駆動部の制御や、光センサー１４６における受光量の定量化などを一元的に行う。本実施の形態では、制御部１６０は、光源ユニット１２１を制御する光源制御部１６１と、光センサー１４６を制御する光センサー制御部１６２と、モーター１５５を制御するモーター制御部１６３と、制御処理部１６４と、を有する。制御処理部１６４は、光源制御部１６１、光センサー制御部１６２及びモーター制御部１６３を包括的に制御して、ＳＰＦＳ装置１００全体の動作を制御する。制御部１６０は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。後述するように、制御部１６０（制御処理部１６４）は、光センサー１４６によるプラズモン散乱光βの測定結果に基づいて、蛍光測定時の金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を制御する。
（ＳＰＦＳ装置の動作）
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作について説明する。図２は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。図３は、増強角の測定時の動作手順の一例を示すフローチャートである。図４は、プラズモン散乱光の検出を説明するための図である。図５は、蛍光の検出を説明するための図である。
　まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００の所定の位置に分析チップ１０を設置する。また、分析チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被検出物質を捕捉できるように、流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。
　次いで、検体中の被検出物質と捕捉体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。具体的には、流路４１内に検体を注入して、検体と捕捉体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は捕捉体により捕捉される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄して、捕捉体に捕捉されなかった物質を除去する。検体の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液及びその希釈液が含まれる。
　次いで、図４に示されるように、制御処理部１６４は、フィルターホルダー１４３を移動させて、散乱光透過部１５３を受光光学系ユニット１４０内の光路上に配置する（工程Ｓ３０）。そして、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査して、最適な入射角を決定する（工程Ｓ４０）。すなわち、制御処理部１６４は、本発明の増強角決定部として機能する。
　工程Ｓ４０において増強角の測定を行う際、まず、制御処理部１６４は、大まかに増強角（プラズモン散乱光βの強度のピーク角度）を推定するためのプレスキャンを行う（工程Ｓ４１）。すなわち、制御処理部１６４は、本発明の先行走査部として機能する。具体的には、制御処理部１６４は、光源ユニット１２１及び角度調整部１２２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に所定の角度範囲（１０°）を第１の角度間隔で励起光αを照射して走査しながらプラズモン散乱光βを検出し、強度を測定する。以下、走査しながらプラズモン散乱光の検出を行うことを、単に「プラズモン散乱光の検出」と略記することがある。このとき、制御処理部１６４は、待機位置から光源ユニット１２１の移動を開始して、所定の角度範囲を第１の角度間隔で励起光αを照射して走査した後、光源ユニット１２１を待機位置に移動する。ここで、所定の角度範囲は、増強角が誘電体２０の素材及び形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより変動的に決まることから、１０°の範囲を確保することが好ましい。なお、工程Ｓ４１では、第１の角度間隔で分割された各測定点において、測定前に光源ユニット１２１の「停止」及び「安定待ち」の工程が行われる。ここで、測定前の「安定待ち」には、２つの目的がある。１つ目は、メカが動作して停止した後にメカが揺れるため、その揺れが収まる（安定する）のを待つという目的である。２つ目は、測定した電気信号が、励起光αの照射後に正規の信号となるまでしばらく時間がかかる（ノイズ除去のために入っているノイズフィルターの時定数に応じた待ち時間が必要である）ため、待つという目的である。また、制御処理部１６４は、光センサー１４６が金属膜３０上（金属膜３０表面及びその近傍）からのプラズモン散乱光βを検出するように、光センサー制御部１６２を制御する。金属膜上（金属膜３０表面及びその近傍）からのプラズモン散乱光βは、第１レンズ１４１によりコリメートされ、散乱光透過部１５３を介して光センサー１４６に到達する。これにより、制御処理部１６４は、励起光αの入射角とプラズモン散乱光βの強度との関係を含むデータを得る。そして、制御処理部１６４は、データを解析して、プラズモン散乱光βの強度が最大となる入射角（増強角）を推定する。
　次に、制御処理部１６４は、プレスキャンにより推定された増強角の周辺を高密度に測定するための本スキャンを行う（工程Ｓ４２）。すなわち、制御処理部１６４は、本発明の本走査部として機能する。具体的には、制御処理部１６４は、光源ユニット１２１及び角度調整部１２２を制御して、工程Ｓ４１で推定された増強角の周辺範囲を、第１の角度間隔よりも狭い第２の角度間隔で励起光αを照射して走査する。このとき、制御処理部１６４は、待機位置から光源ユニット１２１の移動を開始して、推定された増強角の周辺範囲を第２の角度間隔で励起光αを照射して走査した後、光源ユニット１２１を待機位置に移動する。なお、工程Ｓ４２では、第２の角度間隔で分割された各測定点において、測定前に「停止」及び「安定待ち」の工程が行われる。また、制御処理部１６４は、光センサー１４６が金属膜３０上（金属膜３０表面及びその近傍）からのプラズモン散乱光βを検出するように、光センサー制御部１６２を制御する。金属膜上（金属膜３０表面及びその近傍）からのプラズモン散乱光βは、第１レンズ１４１によりコリメートされ、散乱光透過部１５３を介して光センサー１４６に到達する。これにより、制御処理部１６４は、励起光αの入射角とプラズモン散乱光βの強度との関係を含むデータを得る。そして、制御処理部１６４は、データを解析して、プラズモン散乱光βの強度が最大となる入射角（増強角）を決定する。なお、増強角は、基本的には、誘電体２０の素材及び形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４１内の蛍光物質の種類及び量、誘電体２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、分析を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０.１°程度のオーダーで決定される。
　工程Ｓ４１で行われるプレスキャンは、工程Ｓ４２で行われる本スキャンよりも測定点１点当たりのプラズモン散乱光βの強度の検出時間を短くするようにしている。例えば、プレスキャンの場合、測定点１点当たりの検出時間が１～１００ｍｓｅｃであるのに対し、本スキャンの場合、測定点１点当たりの検出時間が５００ｍｓｅｃとなっている。ここで、本スキャンにおける測定点１点当たりの検出時間を長くとっているのは、振動ノイズの平均化を目的としているからである。ここで、振動ノイズとは、メカが揺れることによるノイズのことではなく、電気信号が暴れることによるノイズのことである。しかしながら、測定点１点当たりの検出時間を１ｍｓｅｃ程度に短くしたとしても、最大ノイズは最大シグナルに対して０．５％程度の振動ノイズであり、概算のピーク算出には影響しないため、プレスキャンにおいては測定点１点当たりの検出時間を短くすることで、測定時間の短縮を図っている。
　次いで、図２に戻り、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を、前の工程で決定した増強角に設定する（工程Ｓ５０）。具体的には、制御処理部１６４は、角度調整部１２２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する。以後の工程では、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角は、増強角のままである。
　次いで、図５に示されるように、制御処理部１６４は、フィルターホルダー１４３を移動させて、蛍光透過領域１５６を受光光学系ユニット１４０の光路内に配置するとともに、散乱光透過部１５３を受光光学系ユニット１４０内の光路外に配置する（工程Ｓ６０）。そして、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、蛍光γと同じ波長の光の強度（光学ブランク値）を測定する（工程Ｓ７０）。具体的には、制御処理部１６４は、光源制御部１６１を制御して、光源ユニット１２１に励起光αを出射させる。同時に、制御処理部１６４は、光センサー１４６が蛍光γと同じ波長の光の強度を検出するように、光センサー制御部１６２を制御する。このとき、励起光カットフィルター１４４は、プラズモン散乱光βを透過させない。よって、光センサー１４６は、正確にノイズとなる光の強度（光学ブランク値）を測定することができる。測定値は、制御処理部１６４に送信され、光学ブランク値として記録される。
　次いで、捕捉体に捕捉された被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ８０）。具体的には、流路４１内に蛍光標識液を注入する。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。蛍光標識液が流路４１に注入されると、蛍光標識液が被検出物質に接触し、被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。
　最後に、制御処理部１６４は、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、金属膜３０（金属膜３０表面及びその近傍）上から放出される蛍光γの強度を測定する（工程Ｓ９０）。すなわち、制御処理部１６４は、本発明の蛍光強度検出部として機能する。具体的には、制御処理部１６４は、光源制御部１６１を制御して、光源ユニット１２１に励起光αを出射させる。同時に、制御処理部１６４は、光センサー１４６が金属膜（金属膜３０及びその近傍）上から放出される蛍光γを検出するように、光センサー制御部１６２を制御する。このとき、励起光カットフィルター１４４はプラズモン散乱光βを透過させないため、蛍光γのみが光センサー１４６に検出される。制御処理部１６４は、測定値から光学ブランク値を引き、被検出物質の量に相関する蛍光強度を算出する。蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。
　以上の手順により、蛍光γを検出用の蛍光透過領域１５６を有する励起光カットフィルターの近傍のフィルターホルダー１４３に、プラズモン散乱光βを検出用の散乱光透過部１５３が配置されているため、励起光カットフィルター１４４を大きく移動させることなく、検体中の被検出物質の存在又は被検出物質の量を検出することができる。
　次に、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００の種々の実施例（実施例１～４）について説明する。
　ＳＰＦＳ装置１００の増強角スキャンは、分析チップ１０の依存のばらつきや検査の多項目に対応するため、±５°の範囲を走査して最適角度を求めている。本実施形態では、プラズモン散乱光βの強度のピーク位置（増強角）の存在範囲を６６°±３°と想定し、さらに、近似に必要なため、２°両側に広げて（すなわち±５°）走査する。
　従来技術では、測定点を３０点（０．３５°刻み）で測定していた。この場合、測定精度の要求性能（±０．１°）を満たすことはできるが、測定時間が長くなるという課題がある。なお、要求性能は最終的なシステムによって定義されるが、本実施形態のシステム（ＳＰＦＳ装置１００）では、超高感度の測定を目的としているため、かなり厳しい要求（±０．１°）となっている。
　一方、測定点を１５点（０．７１°刻み）で測定した場合、測定精度の要求性能（±０．１°）に対して、十分なノイズマージンが得られないという課題がある。そこで、測定時間を延ばさずに、要求性能を改善することが求められる。
　ピーク位置算出の精度に関わるパラメータは、高次関数の近似を行うための測定点の測定範囲（角度）及び測定密度（角度／点）である。
　また、ピーク位置算出精度の評価量は、ピーク位置からの誤差を表している。誤差には、ばらつき（σ）とばらつきの中心値（平均値）とがあり、それらを足した値で評価される。
　増強角スキャンの測定は、増強角の走査範囲である１０°（±５°）を、等分割して行われる。測定時間は、図６に示すように、測定点数に比例する。すなわち、測定点数が増えれば増えるほど、測定時間は長くなる。
　また、１％の正規分布ノイズを付加した上で、測定点数を振ってみると、算出したピーク位置のばらつき（σ）は、測定ピッチに相関して変化する。ここでは、ノイズは正規分布のランダムノイズ１％（実機で想定される最大ノイズの２倍程度を想定）、近似（４次式）に使う範囲はピーク位置付近の５°の範囲、ばらつきを求めるための繰り返し回数は１０００回でシミュレーションを行っている。図７は、プラズモン散乱光のピーク位置算出時の関数近似のイメージ図であり、図７Ａは測定点数が１５点、図７Ｂは測定点数が２０点、図７Ｃは測定点数が２５点、図７Ｄは測定点数が３０点の場合を示している。
　算出したピーク位置のばらつき（σ）の目標値は、０．１°以内とする。ただし、マージンを見て、ばらつき（σ）＝０．０８°以下を目標とする。近似範囲が片側２°と狭くなるケースがあるが、そのときでもばらつきが０．１°以内であることを目標とする。
　測定ピッチは、０．３４５°／点（測定点数が３０点）、０．４１７°／点（測定点数が２５点）、０．５２６°／点（測定点数が２０点）、０．７１４°／点（測定点数が１５点）とする。
　なお、近似の多項式の次数を高くすると、ばらつき、平均誤差は減少する傾向にあるが、正確な近似に必要な測定点数も多く必要になる傾向があるため、測定時間が長くなる傾向がある。
　以下、本実施の形態のＳＰＦＳ装置１００の種々の構成例（実施例１～４）について説明する。各実施例は、測定ピッチ（測定点数）と近似に使う測定範囲を振ったシミュレーションである。ノイズは、正規分布１％のランダムノイズを付加し、１０００回測定のばらつきと平均値で評価する。
［実施例１］
　まず、図８～図１０を参照して、本実施の形態におけるＳＰＦＳ装置１００の実施例１（４次の関数近似を行う構成）を説明する。図８は、実施例１におけるピーク位置のばらつき（σ）の一例を示す図である。図９は、実施例１におけるピーク位置の平均値（平均角度）の誤差の一例を示す図である。図１０は、実施例１におけるピーク位置の誤差の合計値（ばらつき（図８参照）と平均誤差（図９参照）の加算値）の一例を示す図である。以降、図中の符号Ｌ１は測定点数が１５点の場合の測定値、符号Ｌ２は測定点数が２０点の場合の測定値、符号Ｌ３は測定点数が２５点の場合の測定値、符号Ｌ４は測定点数が３０点の場合の測定値を示すものとする。
　図１０に示すように、実施例１の構成では、近似に使用する角度範囲が５°の場合において、測定点数が１５点（測定ピッチが０．７１４°／点）及び２０点（測定ピッチが０．５２６°／点）の場合に、算出したピーク位置の想定誤差が０．０８°を超える値となっている。一方、測定点数が２５点（測定ピッチが０．４１７°／点）及び３０点（測定ピッチが０．３４５°／点）の場合に、算出したピーク位置の想定誤差が０．０８°以下となっている。したがって、実施例１の構成では、測定点数が２５点以上の場合に、測定精度の要求性能を満たすことがわかる。
［実施例２］
　次に、図１１～図１３を参照して、本実施の形態におけるＳＰＦＳ装置１００の実施例２（５次の関数近似を行う構成）を説明する。図１１は、実施例２におけるピーク位置のばらつき（σ）の一例を示す図である。図１２は、実施例２におけるピーク位置の平均値（平均角度）の誤差の一例を示す図である。図１３は、実施例２におけるピーク位置の誤差の合計値（ばらつき（図１１参照）と平均誤差（図１２参照）の加算値）の一例を示す図である。
　図１３に示すように、実施例２の構成では、近似に使用する角度範囲が５°の場合において、測定点数が１５点（測定ピッチが０．７１４°／点）、２０点（測定ピッチが０．５２６°／点）及び２５点（測定ピッチが０．４１７°／点）の場合に、算出したピーク位置の想定誤差が０．０８°を超える値となっている。一方、測定点数が３０点（測定ピッチが０．３４５°／点）の場合に、算出したピーク位置の想定誤差が０．０８°以下となっている。したがって、実施例２の構成では、測定点数が３０点以上の場合に、測定精度の要求性能を満たすことがわかる。
［実施例３］
　次に、図１４及び図１５を参照して、本実施の形態におけるＳＰＦＳ装置１００の実施例３（２次の関数近似を行う構成）を説明する。図１４は、実施例３におけるピーク位置のばらつき（σ）の一例を示す図である。図１５は、実施例３におけるピーク位置の平均値（平均角度）の誤差の一例を示す図である。
　図１５に示すように、実施例３の構成では、近似に使用する角度範囲が５°の場合において、測定点数にかかわらず、算出したピーク位置の平均値（平均角度）の誤差が０．１°を超える値となっている。したがって、実施例３の構成では、いずれの測定点数においても、測定精度の要求性能を満たさないことがわかる。
［実施例４］
　次に、図１６及び図１７を参照して、本実施の形態におけるＳＰＦＳ装置１００の実施例４（２次の関数近似を行う構成、ただし、３％のノイズを付加）を説明する。図１６は、実施例４におけるピーク位置のばらつき（σ）の一例を示す図である。図１７は、実施例４におけるピーク位置の平均値（平均角度）の誤差の一例を示す図である。
　図１７に示すように、実施例４の構成では、近似に使用する角度範囲が５°の場合において、測定点数にかかわらず、算出したピーク位置の平均値（平均角度）の誤差が０．１°を超える値となっている。したがって、実施例４の構成では、いずれの測定点数においても、測定精度の要求性能を満たさないことがわかる。
　実施例１～実施例４を比較した結果、実施例１の構成では、測定点数が２５点以上の場合に、測定精度の要求性能を満たすことがわかる。また、実施例２の構成では、測定点数が３０点以上の場合に、測定精度の要求性能を満たすことがわかる。一方、実施例３及び実施例４の構成では、測定点数にかかわらず、測定精度の要求性能を満たさないことがわかる。
　測定時間は測定点数に比例するため、測定時間を短縮するためには測定点数が少ない構成を選択することが好ましい。したがって、測定精度の要求性能を満たしつつ、測定時間を短縮するためには、実施例１（４次の関数近似を行う構成）の測定点数が２５点（測定ピッチが０．４１７°／点）の構成を選択することが好ましい。
　以上より、本実施形態では、０．４１７°／点のピッチ（測定点数２５点）で、約５°の範囲の測定点（１３点）を用いて４次の関数近似を行う構成が、最適であることがわかった。
　一般に、システム（ＳＰＦＳ装置１００）に応じて要求される性能は異なるが、測定精度の誤差性能と測定時間とはトレードオフの関係となる。
　本実施形態では、増強角スキャン時に、プレスキャン（工程Ｓ４１）を行うことで、大まかなピーク位置を求めることができる。これにより、ピーク位置周辺のみを高密度で測定しつつ、本スキャン（工程Ｓ４２）時の測定点数を減らすことができる。よって、近似点の測定時間を短縮することができる。
　例えば、実施例１（４次の関数近似を行う構成）の測定点数が２５点（測定ピッチが０．４１７°／点）の構成では、本スキャンにおける測定点１３点の測定時間が９．６５秒である。一方、従来のように、測定ピッチが０．４１７°／点で１０°を走査すると、２５点の測定が必要となるため、１８．０５秒の時間が必要となる。よって、実施例１（４次の関数近似を行う構成）の測定点数が２５点（測定ピッチが０．４１７°／点）の構成を採用することで、大幅な時間削減を実現することができる。
　また、プレスキャンの際に、各測定点の測定時間を短くした場合、ノイズ量は３倍程度となることが想定される。例えば、１０°に対して５点測定した場合、誤差は０．５°程度となる（ノイズ３倍で、２次近似のケース）。プレスキャン時の５点の測定に掛かる時間は、約１．８秒であるため、増強角スキャンに掛かる時間は、本スキャンの９．６５秒と合わせて、１１．５秒となる。いずれにしても、従来の１８．０５秒と比べ、大幅な時間削減を実現することができる。
　以上のように、本実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）１００は、誘電体２０を介して金属膜３０に励起光αを照射するとともに、金属膜３０上から出射されたプラズモン散乱光βの強度を検出して、プラズモン散乱光βの強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する増強角決定部（制御処理部１６４）と、金属膜３０に対する入射角が増強角となるように、誘電体２０を介して金属膜３０に励起光αを照射するとともに、蛍光物質から放出された蛍光γの強度を検出する蛍光強度検出部（制御処理部１６４）と、を備える。また、増強角決定部は、金属膜３０に所定の角度範囲を第１の角度間隔で励起光αを照射して走査するとともに、プラズモン散乱光βの強度を検出して、増強角を推定する先行走査部（制御処理部１６４）と、先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を、第１の角度間隔よりも狭い第２の角度間隔で励起光αを照射して走査するとともに、プラズモン散乱光βの強度を検出して、増強角を決定する本走査部（制御処理部１６４）と、を備える。
　したがって、本実施形態に係るＳＰＦＳ装置１００によれば、全体の測定点数を減らしつつ、ピーク位置付近の測定点数を増やすことができるので、増強角スキャンにおける測定時間を短縮しつつ、測定精度を向上させることできる。
　また、本実施形態に係るＳＰＦＳ装置１００によれば、先行走査部は、本走査部よりも１点当たりのプラズモン散乱光βの強度の検出時間が短い。
　したがって、本実施形態に係るＳＰＦＳ装置１００によれば、概算のピーク算出に悪影響を及ぼすことなくプレスキャン時の測定点１点当たりの検出時間を短くすることができるので、測定精度を確保しつつ、測定時間を短縮することができる。
　以上、本発明に係る実施形態に基づいて具体的に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で変更可能である。
　例えば、上記実施形態では、工程Ｓ４１で行われるプレスキャン及び工程Ｓ４２で行われる本スキャンのいずれにおいても、待機位置から光源ユニット１２１の移動を開始して走査するようにしているが、これに限定されるものではない。例えば、プレスキャンにおいては、実施形態と同様、待機位置から光源ユニット１２１の移動を開始して走査するようにし、本スキャンにおいては、プレスキャンによる走査の終点から待機位置に向けて光源ユニット１２１の移動を開始して走査するようにしてもよい。
　このように、先行走査部が、待機位置から光源ユニット１２１の移動を開始して、所定の角度範囲を第１の角度間隔で励起光αを照射して走査し、本走査部が、先行走査部による走査の終点から待機位置に向けて光源ユニット１２１の移動を開始して、先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を第２の角度間隔で励起光αを照射して走査することで、プレスキャン後に待機位置まで戻る操作を利用して本スキャンを実施することができるので、測定時間を短縮することができる。
　また、プレスキャンにおいては、待機位置の光源ユニット１２１の移動方向反対側の所定位置から待機位置に向けて光源ユニット１２１の移動を開始して走査するようにし、本スキャンにおいては、実施形態と同様、待機位置から光源ユニット１２１の移動を開始して走査するようにしてもよい。なお、予めの（プレスキャン前の）上記所定位置への移動は、測定の空き時間で行われる。
　このように、先行走査部が、待機位置の光源ユニット１２１の移動方向反対側の所定位置から待機位置に向けて光源ユニット１２１の移動を開始して、所定の角度範囲を第１の角度間隔で励起光αを照射して走査し、本走査部が、待機位置から光源ユニット１２１の移動を開始して、先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を第２の角度間隔で励起光αを照射して走査することで、本スキャンにおいて、以降に行われる工程Ｓ７０及び工程Ｓ９０と同じ移動方向（待機位置→測定位置）で光源ユニット１２１を移動させることができる。したがって、光源ユニット１２１の位置決め精度を向上させることができるので、測定精度を向上させることができる。
　また、上記実施形態では、工程Ｓ４１で行われるプレスキャンにおいて、各測定点における測定前に光源ユニット１２１の「停止」及び「安定待ち」の工程を行うようにしているが、これに限定されるものではない。例えば、光源ユニット１２１の移動を停止することなく、励起光αを照射して走査するようにしてもよい。また、光源ユニット１２１の安定待ちをすることなく、励起光αを照射して走査するようにしてもよい。また、光源ユニット１２１の移動を停止することなく、かつ、安定待ちをすることなく、励起光αを照射して走査するようにしてもよい。
　このように、先行走査部が、光源ユニット１２１の移動を停止することなく、金属膜３０に所定の角度範囲を第１の角度間隔で励起光αを照射して走査することで、プレスキャン時の工程を減らすことができるので、測定時間を短縮することができる。
　また、工程Ｓ４１で行われるプレスキャンは、測定時間短縮の観点から、工程Ｓ４２で行われる本スキャンよりも測定点数が少なくなることが好ましい。しかしながら、上記の構成は必須ではなく、本スキャンと測定点数が同数であってもよいし、本スキャンよりも測定点数が多くなってもよい。
　また、励起光カットフィルター１４４は、蛍光γの少なくとも一部を透過させ、励起光αの少なくとも一部の波長の光を遮断する蛍光透過領域１５６を有するが、励起光αの少なくとも一部を遮断するということは、励起光αの一部が透過することがあることを意味する。励起光αはプラズモンであり、プラズモン散乱光βも透過してくるということは、原理的には、励起光カットフィルター１４４がある状態でも増強角ピーク検出のための測定を行うことができる。ただし、現実的には、励起光カットフィルター１４４を透過する励起光αはごくわずか（０．０１％以下）であるので、測定は困難である。
　また、上記実施形態では、プラズモン散乱光βの強度を用いて増強角ピークを算出するようにしているが、これに限定されるものではない。例えば、プラズモン散乱光βの代わりに、蛍光γを用いて増強角ピークを算出することも可能である。本質的には、測定光の強度が最大となるときの入射角（投光角度）が増強角であるため、蛍光γを用いて増強角ピークを算出することが可能であれば、最も好ましい。ただし、現実的には、蛍光信号は、励起光αを当て続けると退色して（蛍光量が減って）しまうため、蛍光シグナルを測定するときに、蛍光γが減ってしまうという課題がある。したがって、本実施形態では、退色を避けるために、蛍光標識される前のプラズモン散乱光βを用いて増強角ピークを算出するようにしている。
　その他、ＳＰＦＳ装置を構成する各装置の細部構成及び各装置の細部動作に関しても、本発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
　本発明は、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法に利用することができる。
１０　分析チップ
１２　チップホルダー
２０　誘電体
２１　入射面
２２　成膜面
２３　出射面
３０　金属膜
４０　流路蓋
４１　流路
１００　表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）
１２０　励起光学系ユニット
１２１　光源ユニット（光源）
１２２　角度調整部
１４０　受光光学系ユニット
１４１　第１レンズ
１４２　絞り
１４３　フィルターホルダー
１４４　励起光カットフィルター
１４５　第２レンズ
１４６　光センサー
１４７　透過調整部
１５１　絞り孔
１５２　第１貫通孔
１５３　第２貫通孔（散乱光透過部）
１５４　ステージ
１５５　モーター
１５６　蛍光透過領域
１６０　制御部
１６１　光源制御部
１６２　光センサー制御部
１６３　モーター制御部
１６４　制御処理部（増強角決定部、先行走査部、本走査部、蛍光強度検出部）
α　励起光
β　プラズモン散乱光
γ　蛍光

Claims (6)

  1. 　金属膜を一面に有する誘電体を含む分析チップが装着され、光源から前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上の被検出物質を標識する蛍光物質を励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、前記被検出物質の存在又はその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
    　前記誘電体を介して前記金属膜に前記励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射されたプラズモン散乱光の強度を検出して、前記プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する増強角決定部と、
    　前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記誘電体を介して前記金属膜に前記励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出された蛍光の強度を検出する蛍光強度検出部と、
    　を備え、
    　前記増強角決定部は、
    　前記金属膜に所定の角度範囲を第１の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を推定する先行走査部と、
    　前記先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を、前記第１の角度間隔よりも狭い第２の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を決定する本走査部と、
    　を備える表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  2. 　前記先行走査部は、前記本走査部よりも１点当たりの前記プラズモン散乱光の強度の検出時間が短い請求項１に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  3. 　前記先行走査部は、待機位置から前記光源の移動を開始して、前記所定の角度範囲を前記第１の角度間隔で前記励起光を照射して走査し、
    　前記本走査部は、前記先行走査部による走査の終点から前記待機位置に向けて前記光源の移動を開始して、前記先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を前記第２の角度間隔で前記励起光を照射して走査する請求項１又は２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  4. 　前記先行走査部は、待機位置の前記光源の移動方向反対側の所定位置から前記待機位置に向けて前記光源の移動を開始して、前記所定の角度範囲を前記第１の角度間隔で前記励起光を照射して走査し、
    　前記本走査部は、前記待機位置から前記光源の移動を開始して、前記先行走査部により推定された増強角の周辺範囲を前記第２の角度間隔で前記励起光を照射して走査する請求項１又は２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  5. 　前記先行走査部は、前記光源の移動を停止することなく、前記金属膜に前記所定の角度範囲を前記第１の角度間隔で前記励起光を照射して走査する請求項１～４のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  6. 　被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在又はその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
    　前記被検出物質を、誘電体の一面上に配置された金属膜上に配置する配置工程と、
    　前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射されたプラズモン散乱光の強度を検出して、前記プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する増強角決定工程と、
    　前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記誘電体を介して前記金属膜に前記励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出された蛍光の強度を検出する蛍光強度検出工程と、
    　を含み、
    　前記増強角決定工程は、
    　前記金属膜に所定の角度範囲を第１の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を推定する先行走査工程と、
    　前記先行走査工程で推定された増強角の周辺範囲を、前記第１の角度間隔よりも狭い第２の角度間隔で前記励起光を照射して走査するとともに、前記プラズモン散乱光の強度を検出して、前記増強角を決定する本走査工程と、
    　を含む表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
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