JP3479100B2 - 免疫化学的簡易半定量方法および装置 - Google Patents

免疫化学的簡易半定量方法および装置

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分析対象物を含む試料
を希釈することなく、簡易に半定量を行なうことができ
る免疫化学的方法および装置に関する。
【０００２】
【先行技術】血液、尿等の生体試料中に含まれる微量物
質の定性または定量方法として、その感度の高さから免
疫学的測定方法が汎用されている。その手法の内、クロ
マトグラフィーを用いたいわゆるイムノクロマト法は、
操作が簡単であり、検定に要する時間も短いため、現在
多くの場面、例えば病院における臨床検査、研究室にお
ける検定試験等に広く使われている。
【０００３】イムノクロマト法における目的物の検出方
法としては、検出すべき物質（抗原）に種々の標識を付
した特異的結合物質（抗体）をクロマト材上で反応させ
て検出すべき物質と標識特異的結合物質との複合体（抗
原−抗体複合体）を形成させ、これを種々の手段により
確認（検出）することが行なわれる。標識としては、放
射性同位元素、発色団、蛍光団、酵素等があげられる。
検出手段としては、放射線検出器、分光光度計等、また
は目視が挙げられる。
【０００４】特開昭６４−３２１６９号公報には、クロ
マトグラフ的に可動で、視覚的に検出可能なシグナルを
生じ得るコロイド粒子標識特異的結合物質（抗体）を利
用したイムノクロマト法による定性分析法および装置が
記載されている。本公報には、目視による検出を可能と
するための手段の一種が開示されている。
【０００５】本公報に記載の方法は、試料中の物質（抗
原）の存在の有無または量を測定する方法であって、
(a) 分析すべき物質（抗原）を含む試料をクロマトグラ
フ媒体に接触させ、(b) 該クロマトグラフ媒体上で該コ
ロイド粒子標識物質（標識抗体）を移動させることによ
って該コロイド粒子標識物質（標識抗体）の少なくとも
一部を反応部位に移動させて結合反応させ、ついで(c)
試料中の物質（抗原）の存在の有無および量を表示する
ため反応部位で該コロイド物質により生じた検出可能な
応答を決定することからなる。
【０００６】特表平１−５０３１７４号公報には、クロ
マトグラフ媒体上に湿潤状態において自由に移動し得
る、検出すべき物質（抗原）に特異的に結合する標識さ
れた第１抗体（以下、標識第１抗体という）およびクロ
マトグラフ媒体上に固定された、検出すべき物質（抗
原）に特異的に結合する標識されていない第２抗体（第
２抗体は第１抗体とは異なる抗原結合部位を有する）
（以下、無標識第２抗体という）が配置されており、検
出すべき物質を含む液体試料をクロマトグラフ媒体の一
端に添加し、クロマトグラフ媒体中を移動して標識第１
抗体と反応した後に無標識第２抗体と反応し、クロマト
グラフ媒体上の検出区域において検出すべき物質の存在
の有無を確認できる装置が開示されている。本公報記載
の装置に用いられている原理は、いわゆる（免疫学的）
サンドイッチ法と呼ばれるものである。従来、試料中の
検出すべき物質の量を定量するには、検出すべき物質を
含む試料を適宜希釈して一定感度を有する測定試薬によ
る定性反応を行ない、陽性を示す最高希釈倍率に感度を
乗じて半定量値を求める方法、または検体を希釈するこ
となく測定感度の異なる試薬にて定性反応を行ない、陽
性を示す試薬の感度をもって半定量値としていた。定量
分析の手法としては、試験管やマイクロタイターウエル
のような容器中で行なう液相アッセイ、クロマトグラフ
媒体上で行なう固相アッセイなどがある。上記２件の公
報に記載の方法においても、定量は試料を希釈すること
によって行なっている。
【０００７】最近出願公開された特開平４−３５１９６
２号公報には、試料を希釈せずに半定量を行なうことの
できる特異結合分析方法および装置が開示されている。
本公報記載の方法は、クロマトグラフィーの手法を用
い、試料中の分析対象物を定性または定量するに際し、
測定系に特定物質を存在させ、該特定物質の存在によ
り、分析対象物の指標として測定される標識物質量を小
さくすることにより、結果として分析対象物を含む試料
を希釈したのと同様の結果（以下、希釈効果という）と
するものである。
【０００８】本公報記載の典型的な方法では、試料添加
部に添加された分析対象物(a)は、所定量（濃度）でク
ロマト材上に固定化されることなく存在する特定物質
(b)および所定量でクロマト材上に固定化されることな
く存在するの標識特異結合物質(e)と（特異結合物質存
在部において）接触する。一定量の分析対象物(a)は特
定物質(b)と結合するが、分析対象物(a)が特定物質(b)
より過剰に存在する場合には特定物質(b)と結合し得る
部位が存在したままさらに特異結合物質（特定物質(b)
または分析対象物(a)に対し特定物質(b)と同じ結合部位
と結合し得る物質(g)）がクロマト材上に固定化されて
存在する部位（検出部）へ移動する。検出部において
は、特定物質(b)と結合し得る部位が存在しない、少な
くとも特定物質(b)と結合した分析対象物(a)は、検出部
を通過する。少なくとも特定物質(b)と結合し得る部位
を有する分析対象物(a)−標識特異結合物質(e)結合体
(f)のみが検出部において固定化され、この固定化され
た結合体(f)を種々の検出手段により検出するものであ
る。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従来、試料中の分析対
象物を半定量するためには、一般に試料の希釈を必要と
していた。また、試料の希釈を必要としない測定感度の
異なる試薬による方法は、各測定感度における反応の強
さが異なるため判定が難しい等の欠点が有り、あまり一
般に実用化されていない。
【００１０】試料の希釈操作は、医療、特に臨床検査等
の現場において、試験実施者は被検試料たる血液、尿等
からの試験実施者に対する病原菌の感染の可能性を増加
させている。また、大量の試料を半定量測定する場合
に、希釈操作が必要なければ操作効率を格段に向上させ
られる。そこで、本発明は、試料の希釈を必要としない
免疫化学的簡易半定量方法および装置を提供することを
目的とする。
【００１１】本発明と同様に試料の希釈を必要としない
半定量方法として、上述した特開平４−３５１９６２号
公報記載の発明があるが、本公報の方法では、検体の
「希釈効果」の調整に関与する要因が多く、希釈効果の
調整が困難であり、半定量値幅を狭く設定することがで
きず、測定精度の点で難点があった。本発明は、試料の
「希釈効果」の調整に関与する要因が少ないため、希釈
効果の調整が容易であり、感度良く、即ち半定量値幅を
狭く設定することができる免疫化学的半定量方法および
装置を提供することをも目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するため、鋭意研究を行ない、クロマト法による免
疫化学的簡易アッセイにおいて、分析対象物の定性分析
の前に、所定量で固定化されて存在する分析対象物に対
する抗体により、固定化された抗体量に対応する試料中
の分析対象物の一定量を捕捉し、その後の免疫化学的定
性分析に付される分析対象物濃度を減少させることを特
徴とする免疫化学的簡易半定量方法、および分析対象物
を含む試料を添加するための試料添加部（Ａ）、試料中
の分析対象物の一定量を捕捉する抗体が所定量で固定化
されて存在する抗体固定部（Ｂ）、分析対象物の存在の
有無を検出するための指標となる標識物質がクロマト移
動しうる状態で存在する標識物質存在部（Ｃ）、標識物
質を検出するための検出用物質が固定化されて存在する
検出部（Ｄ）および添加された試料とともに分析対象物
の有無の検出に関与しない標識物質を吸収除去する吸収
部（Ｅ）からなるイムノクロマト法による免疫化学的簡
易半定量装置により、上記目的を達成し得ることを見出
し本発明を完成した。
【００１３】本発明の半定量方法および装置において
は、一連のクロマト分析において、定性分析の前に分析
対象物捕捉用の固定化された抗体で試料中の分析対象物
の一定量を捕捉し、定性分析に付される試料中の分析対
象物量（濃度）を予め減少させることにより、分析対象
物を含む試料を希釈してからイムノクロマト法による定
性分析に付したのと同様の効果（希釈効果）が得られる
ものである。
【００１４】即ち、捕捉用抗体の固定量を段階的に変化
させた（それぞれのユニットにおける試料の希釈の度合
いが異なる）数個のユニットに同一の試料を添加してア
ッセイを行なえば、引続く各ユニットでの共通の感度を
有する定性分析において、その分析結果が陽性から陰性
または陰性から陽性に変化するユニットに設定された捕
捉用抗体の固定量からその試料中の分析対象物の半定量
値を決定することができる。
【００１５】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて分析対象物となり得るものとしては、大きく分け
て完全抗原とハプテン（不完全抗原）とがある。ここに
完全抗原とは、それ自体で抗体産生を誘起する能力（免
疫原性）を有する抗原物質をいい、主として分子量の大
きいペプチドホルモン類等がこれに含まれる。ハプテン
（不完全抗原）とは、抗体と結合できるが、それ自身で
は抗体産生を誘起する能力を有しないものをいい、比較
的分子量の小さい（分子量１０００以下程度）ペプチド
類等がこれに含まれる。なお、ハプテンは、適当な担
体、例えばウシ血清アルブミン等の蛋白に結合させる
と、抗体産生能を獲得する。◎以下にこれらの具体例を
示すが、ここに記載されたものに限定されるわけではな
い。
【００１６】完全抗原の例： (1) ペプチドホルモンの例 1) 成長ホルモン（ＧＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（Ａ
ＣＴＨ）、メラミン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、プロ
ラクチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホ
ルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、オキシ
トシン等の下垂体ホルモン 2) カルシトニン、副甲状腺ホルモン等のカルシウム代
謝調節ホルモン 3) インシュリン、プロインシュリン、膵ホルモン 4) ガストリン、セクレチン等の消化管ホルモン 5) アンギオテンシン、ブラジキニン等の血管に作用す
るホルモン 6) ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤
催乳ホルモン（ｈＰＬ）等の胎盤ホルモン (2) その他の物質の例 1) 前立腺性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、アルカ
リ性フォスファターゼ、トランスアミナーゼ、乳酸脱水
素酵素（ＬＤＨ）、トランスアミナーゼ、トリプシン、
ペプシノーゲン等の酵素 2) α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗原
（ＣＥＡ）等のガン特異物質 3) 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、フィブリン−フィブ
リノーゲン分解産物（ＦＤＰ）、抗トロンビンIII（Ａ
ＴIII）、トランスフェリン等の血清蛋白成分 4) リュウマチ因子、セロトニン、ウロキナーゼ、フェ
リチン、サブスタンスＰ等の物質 その他生体成分およびそれらの代謝産物等の多くの物質
が挙げられる。
【００１７】ハプテン（不完全抗原）の例： (1) ステロイド系ハプテン 1) エストロン、エストラジオール、エストリオール、
エステトロール、エクイリン、エクイレニン等の卵胞ホ
ルモン 2) プロゲステロン、プレグナンジオール、プレグナン
トリオール、１９−ノル−エチステロンおよび酢酸クロ
ルマジノン等の天然または合成黄体ホルモン 3) テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、
ジヒドロテストステロン、アンドロステン、エチオコラ
ノロン等の男性ホルモン 4) コルチゾール、コルチゾン、デオキシコルチコステ
ロン、アルドステロン、テトラヒドロコルチゾール等の
副腎皮質ホルモン 5) ビタミンＤ類、コレステロール、コール酸、デオキ
シコール酸、ケノコール酸等の胆汁酸、強心性ステロイ
ド、サポニン、サポゲニン等のその他のステロイド類 (2) 生理活性アミン類 1) エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、エ
フェドリン等のカテコールアミンおよびそれらの代謝産
物 2) モルヒネ、コデイン、ヘロイン、塩酸モルヒネ、コ
カイン、メスカリン、パパベリン、ナルコチン、ヨヒン
ビン、レセルピン、エルゴタミン、ストリキニーネ等の
生理活性アルカロイド類 3) ＬＳＤ、アンフェタミン、メタンフェタミン、メプ
ロバメート等のアミノ基含有向精神薬類 (3) その他の例 1) ＴＲＨ、ＬＨ−ＲＨ等の抗原性を有しない低分子ペ
プチド類 2) ジヨードサイロニン、トリヨードサイロニン、サイ
ロキシン等の甲状腺ホルモン類 3) プロスタグランジンＥ2、プロスタグランジンＥ3、
プロスタグランジンＦ1α等のプロスタグランジン類 4) ビタミンＡ、ビタミンＢ類（ビタミンＢ1、Ｂ2、
Ｂ6、Ｂ12等）、ビタミンＥ、ビタミンＫ等のビタミン
類 5) ペニシリン、アクチノマイシン、クロロマイセチ
ン、テトラサイクリン等の抗生物質類 6) その他生体内に存在する成分、生体内に投与された
薬物およびその代謝産物等。
【００１８】本発明で試料（検体）となり得るものとし
ては、上記分析対象物を含有するものであれば何でもよ
いが、尿、血清、血漿、血液、唾液、羊水等の生体試料
が主に挙げられる。
【００１９】分析対象物の有無の指標となる標識は、直
接標識または間接標識のいずれであってもよい。直接標
識は、検定結果を目視によって観察でき、追加の処理ま
たは工程を必要としない点で好ましい。間接標識の場合
には、アッセイ終了後に標識を視覚化するための処理、
工程または装置が必要である。
【００２０】直接標識に用いることができる標識物とし
ては、金属ゾル、着色ラテックス粒子、色指示薬、リボ
ゾームに含有されている着色物質、各種染料、各種顔料
等の色素類、炭素ゾルのような非金属ゾル、ルミノール
誘導体、アクリジニウムエステル等の化学発光物質、フ
ルオレセイン、ローダミン等の蛍光物質等が挙げられる
がこれらに限定されるものではない。
【００２１】間接標識に用いることができる標識物とし
ては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ等の各種酵素等が挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。
【００２２】直接標識による場合には、肉眼での色調観
察、色濃度、発光強度、蛍光強度等の測定により、間接
標識の場合には、使用した酵素によりその酵素の基質あ
るいはクロモーゲンの変化によって得られる色濃度、発
光強度等を測定することにより検出を行なう。
【００２３】以下に本発明の半定量方法及び半定量装置
を順次説明する。本発明の半定量方法は、試料中の分析
対象物を定量するに際し、試料中の分析対象物の一定量
を、所定量で固定化されて存在する捕捉用抗体により、
捕捉用抗体の固定量（濃度）に応じて捕捉し、引続いて
行なわれる免疫化学的定性分析に付される（関与する）
分析対象物濃度を減少させることにより、結果的に分析
対象物濃度を予め希釈して用いたのと同じ効果（希釈効
果）が得られ、試料を希釈することなく精度よく半定量
をおこなうことができることを特徴とするものである。
【００２４】ここで、本発明の半定量方法を分析対象物
が完全抗原である場合とハプテンである場合とに分けて
さらに詳細に説明する。
【００２５】Ｉ．分析対象物が完全抗原の場合 図１〜３に基づいて説明する。図１〜３は、アッセイを
経時的に表したものである。
【００２６】試料中の分析対象物が完全抗原の場合に
は、免疫学的サンドイッチ反応を原理とし、構成する反
応系において、検出用物質が抗体（以下、検出用抗体II
Iまたは単に抗体IIIという）であり、標識物質も標識さ
れた抗体（以下、標識抗体IIまたは単に抗体IIという）
である。これらの抗体II及び抗体IIIは、互に同一抗原
（分析対象物）上の異なる抗原決定基を認識する抗体で
なければならない。
【００２７】分析対象物を捕捉する捕捉用抗体（以下、
捕捉用抗体Ｉまたは単に抗体Ｉという）は、抗体IIまた
は抗体IIIと同じ抗原決定基を認識するか、または抗体I
Iおよび抗体IIIとは異なる抗原決定基を認識する抗体で
あればよい。
【００２８】ある濃度の分析対象物を含む試料を試料添
加部（Ａ）に添加し（図１）、クロマト移動により抗体
固定部（Ｂ）まで移動させ、ここに固定化されて存在す
る捕捉用抗体Ｉと反応させて、抗体Ｉの固定化抗体量に
応じて分析対象物の一定量を捕捉した後、捕捉されなか
った分析対象物は、標識物質存在部（Ｃ）にクロマト移
動しうる状態で存在する標識抗体IIと反応して分析対象
物−標識抗体II複合体を形成して（図２）、検出用抗体
IIIが固定化されて存在する検出部（Ｄ）までクロマト
移動し、抗体IIIと反応して抗体III−分析対象物−標識
抗体IIのサンドイッチ複合体を形成して検出部に不溶化
されて留まる。分析対象物と結合していない標識抗体II
および過剰の分析対象物等は、検出部（Ｄ）を通過し吸
収部（Ｅ）まで移動して反応系外へ除去される（図
３）。
【００２９】検出部（Ｄ）に不溶化されて留まった抗体
III−分析対象物−標識抗体IIのサンドイッチ複合体の
標識を指標として分析対象物の有無を確認する。
【００３０】この方法では、検出部（Ｄ）の検出用抗体
IIIの量と標識抗体IIの量により、分析対象物の最少検
出濃度（検出感度）が決定される。試料中の分析対象物
濃度が検出感度より高い場合、抗体固定部（Ｂ）の抗体
Ｉの固定量に応じて一定量の分析対象物が捕捉されるこ
とにより、試料が希釈され、これによって分析対象物濃
度を検出感度まで減少させるのと同様の効果（希釈効
果）が得られ、抗体固定部（Ｂ）の抗体Ｉの量を調整す
ることによって適切な濃度幅で半定量を行なうことがで
きる。
【００３１】ここで、抗体ＩおよびIIIは、ポリクロナ
ール抗体であってもよいし、モノクロナール抗体であっ
てもよいが、測定感度等の点から特異性の高いモノクロ
ナール抗体の方が好ましく、抗体IIは、抗原と反応して
凝集が生じるとクロマト移動に支障を生じるため、抗体
Ｉおよび抗体IIIと同一抗原上の異なる抗原決定基を認
識するモノクロナール抗体でなければならない。ポリク
ロナール抗体およびモノクロナール抗体は、公知の方法
により作製することができる。ポリクロナール抗体であ
れば、常法に従い、抗原（分析対象物）を動物に免疫し
て得た抗血清中から目的とする抗体を分離する。モノク
ロナール抗体であれば、例えば、ケーラーとミルスタイ
ンの一般的方法（Nature 256 (1975) 495-497）に従
い、抗原（分析対象物）で免疫したマウスの脾臓細胞と
骨髄腫細胞を融合させ、目的の抗体を産生する融合細胞
を選択し、この融合細胞から産生されるモノクロナール
抗体を得る。
【００３２】II．分析対象物がハプテンの場合 測定原理により、それぞれ図４〜６および図７〜９に基
づいて説明する。分析対象物がハプテンの場合は、検出
部（Ｄ）に固定化されて存在する検出用物質に対する競
合反応を原理とする。
【００３３】(1) 図４〜６の場合は、検出部（Ｄ）に検
出用物質としてハプテン抗体（以下、検出用抗体Ｖまた
は単に抗体Ｖという）を固定化し、標識物質存在部
（Ｃ）に標識物質として標識されたハプテン−キャリア
蛋白結合物またはハプテン若しくはその化学的変性物を
化学的に結合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオ
レフィン系高分子化合物（以下、標識−ハプテン−キャ
リア結合物という）をクロマト移動しうる状態で保持さ
せ、抗体固定部（Ｂ）にはハプテン抗体（以下、捕捉用
抗体IVまたは単に抗体IVという）を分析対象物捕捉用抗
体として固定する。
【００３４】ハプテン抗体IVおよびＶは分析対象物ハプ
テンに対する結合能を有すれば同一の抗体である必要は
なく、分析対象物ハプテンに対する交叉反応により分析
対象物と結合するものであってもよい。
【００３５】標識物質の構成成分であるハプテンは、分
析対象物であるハプテンそのものであってもよいし、抗
体Ｖに対し分析対象物ハプテンとの交叉反応により結合
できるハプテンであってもよい。
【００３６】ある濃度の分析対象物を含む試料を試料添
加部（Ａ）に添加し（図４）、クロマト移動により抗体
固定部（Ｂ）に移動させ、捕捉用抗体IVと反応させ、捕
捉用抗体IVの固定量に応じて分析対象物の一定量を捕捉
した後（図５）、捕捉されなかった分析対象物および標
識物質存在部（Ｃ）にクロマト移動しうる状態で存在す
る標識−ハプテン−キャリア結合物は、クロマト移動に
より検出部（Ｄ）へ移動し、検出部（Ｄ）に固定化され
て存在する検出用抗体Ｖと競合的に結合する。検出部
（Ｄ）に結合されないものは、吸収部（Ｅ）までクロマ
ト移動して反応系外へ除去される（図６）。
【００３７】この方法では、検出部（Ｄ）の検出用抗体
Ｖの量と標識物質（標識−ハプテン−キャリア結合物）
量により、両者間の結合反応を競合阻止し得る最少の分
析対象物ハプテンの濃度（検出感度）が決定される。
【００３８】試料中の分析対象物ハプテン濃度が検出感
度より高い場合、抗体固定部（Ｂ）の捕捉用抗体IVの固
定量に応じて一定量の分析対象物ハプテンを捕捉するこ
とにより、試料中の分析対象物ハプテン濃度を検出感度
まで減少させ、試料を希釈して用いたのと同じ効果（希
釈効果）が得られ、捕捉用抗体IVの固定量を調整するこ
とにより適切な濃度幅で半定量を行なうことができる。
【００３９】(2) 図７〜９の場合は、検出部（Ｄ）に検
出用物質としてハプテン−キャリア蛋白結合物またはハ
プテン若しくはその化学的変性物を化学的に結合せしめ
たカルボキシル基含有水溶性モノオレフィン系高分子化
合物（以下、検出用ハプテン−キャリア結合物という）
を固定化し、標識物質存在部（Ｃ）に標識物質として標
識ハプテン抗体（以下、標識抗体VIIまたは単に抗体VII
という）をクロマト移動しうる状態で保持させ、抗体固
定部（Ｂ）には、分析対象物ハプテンの捕捉用抗体（以
下、捕捉用抗体VIまたは単に抗体VIという）が固定され
ている。
【００４０】抗体固定部（Ｂ）の捕捉用抗体VIと標識物
質存在部（Ｃ）の標識抗体VIIは分析対象物のハプテン
に対する結合能を有するものであれば同一の抗体である
必要はなく、交叉反応により分析対象物ハプテンと結合
する抗体であってもよい。
【００４１】また、検出部（Ｄ）に不溶化されている検
出用ハプテン−キャリア結合物の構成成分であるハプテ
ンは、分析対象物であるハプテンそのものであってもよ
いし、分析対象物ハプテンとの交叉反応により標識抗体
VIIと結合できるハプテンであってもよい。
【００４２】ある濃度の分析対象物ハプテンを含有する
試料を試料添加部（Ａ）に添加し（図７）、クロマト移
動により抗体固定部（Ｂ）へ移動させ、捕捉用抗体VIと
反応させ、捕捉用抗体の固定量に応じた量の分析対象物
ハプテンを捕捉する。ここで捕捉されなかった分析対象
物ハプテンは、標識物質存在部（Ｃ）へ移動し、クロマ
ト移動しうる状態で保持されている標識抗体VIIと反応
して分析対象物ハプテン−標識抗体VII複合体を形成す
る（図８）。この複合体および未反応の標識抗体VIIは
検出部（Ｄ）へ移動し、ここに固定化されている検出用
ハプテン−キャリア結合物と未反応の標識抗体VIIが結
合する。検出部（Ｄ）に結合されないものは、吸収部
（Ｅ）までクロマト移動して反応系外へ除去される（図
９）。
【００４３】この方法では、検出部（Ｄ）に存在する検
出用ハプテン−キャリア結合物のハプテン量と標識物質
存在部（Ｃ）の標識抗体VII量により、両者による結合
反応を競合阻止し得る最少の分析対象物ハプテン濃度
（検出感度）が決定される。
【００４４】試料中の分析対象物ハプテン濃度が検出感
度より高い場合は、抗体固定部（Ｂ）の捕捉用抗体VI量
に応じて一定量の分析対象物ハプテンを捕捉することに
より、試料中の分析対象物濃度を減少させ、試料を検出
感度まで希釈したのと同様の効果（希釈効果）が得ら
れ、抗体固定部（Ｂ）の捕捉用抗体VI量の調整により、
適切な幅で半定量することができる。
【００４５】ここで、本発明で用いるハプテン抗体類
は、コンベンショナルな抗体であっても、モノクロナー
ル抗体であってもよく、公知の方法により作製すること
ができる。ハプテン（分析対象物）またはその化学的変
性物を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の抗原性を有
する物質と結合させ、これを抗原として常法に従い、動
物を免疫することにより抗血清を得、得られた抗血清中
から、ハプテン（分析対象物）に対してのみ反応性を有
する抗体を分離する。
【００４６】モノクロナール抗体であれば、前記抗原で
免疫したマウスの脾細胞と骨髄腫細胞を融合させ、目的
の抗体を産生する融合細胞を選別し、この融合細胞から
産生されるモノクロナール抗体を得る。
【００４７】また、ハプテン−キャリア蛋白結合物また
は、ハプテン若しくはその化学的変性物を化学的に結合
せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフィン系高
分子化合物の構成成分であるハプテンまたはその化学的
変性物は、競合反応に関与するものであり、キャリア蛋
白またはカルボキシル基含有水溶性モノオレフィン系高
分子化合物は、標識物、クロマト材との結合部位を提供
し、対応するハプテン抗体との反応性を高める等の役割
を果すものである。
【００４８】キャリア蛋白としては、ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、ヤギ
血清アルブミン（ＧＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）など血清由来の蛋白や卵白アルブミン（ＥＡ）等を
用いることができる。なお、これらを使用する場合に
は、ハプテン抗体を作製する際にハプテンに抗原性を持
たせる目的でこれらの蛋白（例えばＢＳＡ）を使用して
いるので、これらの蛋白に対して結合性を有する抗体を
完全に吸収除去しておく必要がある。
【００４９】ハプテンの化学的変性は、カルボキシル基
含有水溶性モノオレフィン系高分子化合物（以下、スペ
ーサーという）の官能基、例えば、カルボキシル基や水
酸基と化学的に結合し得るようにハプテンに化学的修飾
を加えるものである。化学的変性は、用いるハプテンの
化学構造に応じて公知の方法により行なうことができ
る。特に、ハプテンにカルボキシル基、アミノ基、水酸
基を導入する化学的変性方法が好ましい。
【００５０】本発明で使用するスペーサーは、生理的に
不活性であり、一般に抗原性を有しない物質である。ス
ペーサーは、カルボキシル基の他に水酸基を有していて
もよく、これらの官能基は、ハプテンまたはその化学的
変性物との化学的結合に関与するだけでなく、高分子化
合物であるスペーサーに水溶性を付与する役割を有す
る。ここで、スペーサー（カルボキシル基含有水溶性モ
ノオレフィン系高分子化合物）の「水溶性」とは、スペ
ーサーの少なくとも１重量部が１０００重量部の蒸留水
に完全に溶解し、透明な溶液を形成することを意味す
る。
【００５１】スペーサーの平均分子量は、約１０3〜１
０7またはそれ以上であってもよく、通常数万〜数百万
程度のものが好適である。
【００５２】スペーサーの具体例としては、例えば、ア
クリル酸またはメタアクリル酸のホモ−またはコ−ポリ
マー；マレイン酸と酢酸ビニルとの共重合体またはその
ケン化物、マレイン酸と例えばビニルアルコール、低級
アルキルビニルエーテル、アクリル酸またはその低級ア
ルキルエステル、メタアクリル酸またはその低級アルキ
ルエステルとの共重合体またはそれらの加水分解物が挙
げられる。さらにスペーサーは、例えば、アクリル酸ま
たはメタアクリル酸と、例えばアクリル酸のβ−ヒドロ
キシエチルエステルまたはアクリルアミドとの共重合
物、あるいは前記モノマーを構成単位とする三元共重合
体であってもよい。
【００５３】ハプテンまたはその化学的変性物とスペー
サーとの化学的結合は、アミド結合またはエステル結合
によって行なうが、特にアミド結合によるのが好まし
い。アミド結合を形成させる場合は、例えば、公知のカ
ルボジイミド法、カルボニルジイミダゾール法、混合酸
無水物法、活性エステル法、アジド法、酸クロリド法お
よびジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）法等が挙
げられ、特にカルボジイミド法またはＤＰＰＡ法が好ま
しい。上記いずれの方法を用いてもよいが、ハプテンの
有するスペーサーとの化学的結合に関与しない官能基の
存在によっては不安定なものもあるので、あまり過激な
条件を必要とする方法は避けるべきである。エステル結
合の形成には、ハプテンまたはその化学的変性物の反応
性水酸基とスペーサーのカルボキシル基を結合させる場
合とその逆の場合がある。前者の場合には、スペーサー
のカルボキシル基を反応性誘導体、例えば酸クロリドと
してハプテンの水酸基と反応させるか、あるいはスペー
サーが例えば無水マレイン酸を含む共重合体であるなら
ばそのままハプテンと反応させてもよい。後者の場合も
エステル結合の形成方法の原理は前者と同様であるが、
ハプテンによっては、そのカルボキシル基を反応性誘導
体、例えば酸クロリドに変換し得る程の安定性を有しな
いことがあり、この場合にはエステル結合を形成するこ
とは困難である。
【００５４】次に、本発明の半定量装置を図１０、１１
および１２に基づいて説明する。図１０および１１は、
本発明の半定量装置の基本例である。
【００５５】本発明の半定量装置は、試料添加部
（Ａ）、抗体固定部（Ｂ）、標識物質存在部（Ｃ）、検
出部（Ｄ）および吸収部（Ｅ）を順次有するクロマト型
の免疫化学的分析装置である。
【００５６】図１０および１１で示した標識物質存在部
（Ｃ）は、検出部（Ｄ）と同じクロマト材（Ｆ）上に位
置していてもよいし、それぞれ独立した異なる材質のも
のであってもよい。また、抗体固定部（Ｂ）は、標識物
質存在部（Ｃ）および／または検出部（Ｄ）と異なる材
質のものであってもよいし、標識物質存在部（Ｃ）およ
び／または検出部（Ｄ）が設けられたのと同じクロマト
材（Ｆ）上に設置してもよい。
【００５７】図１０(a)は、４段階の濃度での半定量を
行なえる半定量装置を示したものであり、図１１(c)
は、６段階の濃度での半定量を行える半定量装置を示し
たものであるが、濃度の段階数は必要に応じて増減させ
ることができる。例えば、図１０(a)の半定量装置は、
４段階の濃度において共通の試料添加部（Ａ）と、抗体
固定部（Ｂ）、標識物質存在部（Ｃ）、検出部（Ｄ）の
３つの部位からなる独立した４つのユニットおよび共通
の吸収部（Ｅ）から構成されており、各ユニットにおい
て標識物質存在部（Ｃ）および検出部（Ｄ）における標
識物質および検出用物質の量は同一であるが、抗体固定
部（Ｂ）における捕捉用抗体の固定量は、ユニット毎に
異なる。
【００５８】試料添加部（Ａ）を共通にすることは、そ
れぞれのユニットに分析対象物を含む試料を均一にクロ
マトさせるために必須である。そして、試料が各ユニッ
トへより均一に移動するためには図１２(e)および(f)に
示す構成配置が好ましい。この場合には、吸収部（Ｅ）
は各ユニット毎の構成となる。
【００５９】本発明の半定量装置は、プラスチック板、
ガラス板、フィルム等、好ましくは両面粘着テープを貼
ったプラスチック板やガラス板等の支持体（Ｇ）上に
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の各部位を構成する材
料を互に接し添加した試料が毛細管現象により部位
（Ａ）から（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）と均一に移動できる
ように配置するか、図１１(d)のように、検出部（Ｄ）
を含むクロマト材および抗体固定部（Ｂ）が支持体
（Ｇ）に直接触れないように配置する。
【００６０】次に、本発明の半定量装置の各部の構成に
ついて説明する。試料添加部（Ａ） 試料添加部の材質は、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポ
リウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロ
ン、綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、
これらに限定されるものではない。
【００６１】試料添加部は、添加された分析対象物を含
む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を
濾過する機能をも兼ねるので、セルロース濾紙、ガラス
繊維濾紙等の濾過機能をも有する材質のものが好まし
い。
【００６２】試料中の分析対象物が試料添加部の材質に
非特異的に吸着し、半定量の精度を低下させることを防
止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異
的吸着防止処理して用いることが特に好ましい。非特異
的吸着防止処理としては、例えば、不活性蛋白による処
理、界面活性剤による処理等がある。不活性蛋白による
処理は、例えば、材質を０．１〜１０％牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ６〜９）溶
液、０．１〜１０％脱脂粉乳０．１Ｍトリス緩衝液（ｐ
Ｈ６〜９）溶液、および／または０．１〜１０％カゼイ
ン溶液などに浸し、３７℃１時間または４℃一昼夜放置
後、トリス緩衝液で洗浄後乾燥させることからなる。界
面活性剤による処理は、例えば、材質を非イオン性界面
活性剤であるツイーン２０またはトリトンＸ１００の
０．０１〜１％溶液に浸し、そのまま乾燥することから
なる。分析対象物、試料の種類によるが、不活性蛋白に
よる処理と界面活性剤による処理を合わせて行なってか
ら使用するのが好ましい。
【００６３】抗体固定部（Ｂ） 抗体固定部の材質は、均質な特性を有し、捕捉用抗体の
固定量を厳密に規定することができ、さらに大きさ、厚
さ等の加工も容易なものが好ましい。
【００６４】分析対象物の捕捉用抗体の固定量（濃度）
が大きい半定量を目的とする場合には活性化された濾紙
を使用し、これに捕捉用抗体を化学的に結合するのが好
適である。ＣＮＢｒ・活性化セルロースであればＣｅｓ
ｋａ ａｎｄ Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔの方法（［Immunoch
emistry, 9, 1021 (1972)やLehtone and Viljanenらの
方法］、［J. Immunol. Methods, 36, 63 (1980)および
同, 34, 61 (1980)]）、ＤＢＭ・活性化セルロースであ
ればＡｌｗｉｎｅの方法（Methods Enzymol.,68, 220
(1979)）等の公知の方法により容易に活性化セルロース
濾紙の調製を行なうことができる。また、市販の活性化
ナイロン膜（ポールイムノダイン）を用いることもでき
る。
【００６５】上記の様な活性化ペーパーへの捕捉用抗体
の化学結合も公知の方法に準じて行なうことができる
（LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECU
LAR BIOLOGY, Volume 15, Edited by R. H. BURDON and
P. H. VanKNIPPENBERG ELSEVIER AHSTERDAM:NEW YORK,
OXFORD (1985) P.318-322）。また、活性化ペーパーに
第２物質（抗体、蛋白等）を介して捕捉用抗体を結合す
ることもできる。介在する第２物質が抗体（以下、第２
抗体という）の場合は、例えば固定化される捕捉用抗体
がマウス由来のモノクロナール抗体の場合は、抗マウス
γＧ（ガンマグロブリン）異種動物抗体を活性化ペーパ
ーに過剰に結合させた後、捕捉用抗体を適量免疫反応で
結合させて用いることができる。介在する物質が蛋白で
ある場合は、例えば、活性化ペーパーにプロテインＡを
過剰に結合させた後、捕捉用抗体を適量結合させて用い
ることができる。
【００６６】また、分析対象物を捕捉する捕捉用抗体の
固定量（濃度）が少ない半定量を目的とする場合には、
クロマト材の標識物質存在部（Ｃ）より上流部に検出部
（Ｄ）における検出用抗体（物質）の固定化と同様の方
法にて捕捉用抗体を固定化することができる。
【００６７】標識物質存在部（Ｃ） 標識物質存在部は、後述の検出部（Ｄ）に検出用物質を
固定化し、分析対象物、標識物質の非特異的吸着防止処
理をした後、標識物質をクロマト材の検出部（Ｄ）より
上流部に塗付するか、またはセルロース濾紙、ガラス繊
維濾紙、不織布などを非特異的吸着防止処理をした後、
標識物質の一定量を含浸し、乾燥させて作製する。
【００６８】本発明の半定量法において、標識物質の溶
解速度、クロマト移動の均一性が測定感度の制御に影響
を及ぼす場合があるので、前記非特異的吸着防止処理と
共に標識物質のクロマト材への塗付または含浸は、０．
１〜１０％マンニトールまたは０．１〜３０％サッカロ
ース等の糖類の存在下で行なうことが好ましい。
【００６９】検出部（Ｄ） 検出部は、クロマト材の一部に検出用物質を固定化させ
て作製する。検出用物質の固定化方法には、検出用物質
をクロマト材の一部に物理的または化学的結合により直
接固定化させる方法と、検出用物質をラテックス粒子な
どの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒
子を多孔性のクロマト材の一部にトラップさせて固定化
させる間接固定化方法がある。いずれの方法も用いるこ
とができるが、本発明の装置においては、不溶化の均一
性、感度調整の容易さ等から直接固定化の方が好まし
い。
【００７０】検出部を構成する材質（クロマト材）は、
多孔性ニトロセルロース膜、多孔性セルロース膜、ナイ
ロン膜、ガラス繊維、不織布、布等、またはこれらに検
出用物質結合用の活性基の有るものが好ましく、特に多
孔性ニトロセルロース膜および活性化ナイロン膜が好ま
しい。
【００７１】クロマト材への検出用物質の固定化の形状
は、特に限定されるものではなく、いかなる形状であっ
てもよいが、クロマト先端部に対し、標識物質の検出が
均一となるクロマト材を横断した線形が特に好ましい。
【００７２】なお、クロマト材は、検出用物質を固定化
後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処
理をして用いるのが好ましい。
【００７３】吸収部（Ｅ） 吸収部は、添加された試料がクロマト移動により物理的
に吸収されると共に検出部（Ｄ）に不溶化されない未反
応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロース濾
紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が
用いられる。
【００７４】添加された試料のクロマト先端部が吸収部
に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大き
さなどにより異なるので、その選定により分析対象物の
測定に合った速度を設定することができる。
【００７５】以上、本発明の半定量装置の各部位の構成
について説明したが、装置の製造に際し各部の材質、大
きさ、厚さ等のファクターによりクロマト速度（液の流
れ速度）が異なる。従って、分析対象物の種類に応じて
最も好適に半定量が行ない得るようにこれらのファクタ
ーは、自由に選択し設定できる。
【００７６】本装置における測定感度は、主に検出部
（Ｄ）に固定化されている検出用物質量と標識物質存在
部（Ｃ）の標識物質量によって決まる。また、本発明の
半定量におけるいわゆる希釈効果は、原理的には、抗体
固定部（Ｂ）の捕捉用抗体の固定量に依存しているが、
半定量の精度は、試料添加部（Ａ）から検出部（Ｄ）ま
での試料の流れ方向のクロマト材の長さおよび厚さ、即
ち希釈効果を維持した試料の通過液量に依存している。
特に試料添加部（Ａ）から抗体固定部（Ｂ）に浸透した
液量の内、抗体固定部（Ｂ）にて希釈効果を得た状態の
試料液量が標識物質存在部（Ｃ）の標識物質を完全に溶
解して検出部（Ｄ）に移動させるに足る液量であること
が本発明の半定量を精度よく行なう上で最も重要であ
る。
【００７７】即ち、抗体固定部（Ｂ）において捕捉用抗
体の固定量に応じて分析対象物の一定量が捕捉されて希
釈効果を得た状態の試料が、標識物質を検出部（Ｄ）ま
で完全にクロマト移動させることにより、クロマト完了
後に捕捉用抗体が飽和となり、元の分析対象物濃度の試
料が検出部（Ｄ）に流れてきても標識物質のクロマトは
すでに終了しているため、検出部（Ｄ）における反応は
影響を受けず、判定結果が変動することはない。
【００７８】従って、抗体固定部（Ｂ）の大きさ、即ち
抗体固定部（Ｂ）を希釈効果を得た状態で通過する試料
の液量が、標識物質を検出部（Ｄ）まで完全にクロマト
移動させるに充分な液量であることが希釈効果を確実に
するために必須である。
【００７９】なお、標識物質存在部（Ｃ）の構成の説明
中に記載した様に、クロマトに際し、標識物質が容易に
試料に溶解し、移動することも精度向上のために重要な
点である。
【００８０】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。
【００８１】実施例１ ｈＣＧ（ヒト胎盤性性腺刺激ホ
ルモン）の測定 １−ａ）抗ｈＣＧモノクロナール抗体の製造 Ｂａｌｂ／ｃマウスにｈＣＧ（１００００ｉｕ／ｍｇ）
をコンプリートフロインドアジュバントと共に３週間隔
で３回背部皮下投与し、更に３週後ｈＣＧを腹腔内投与
した。最終免疫３日後の脾細胞と骨髄腫細胞（ＮＳ−
１）とを常法により細胞融合を行い、ＨＡＴ選別後、ク
ローニングを繰返してｈＣＧ特異抗体を分泌する融合細
胞株ならびにｈＣＧ、ｈＬＨ、ｈＦＳＨと交差反応する
α−サブユニットを認識するモノクロナール抗体を分泌
する融合細胞株を得た。各細胞株を予めプリスタン投与
したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に投与し、腹水腫瘍を
形成させて腹水を得た。得られた腹水を硫安分画及びア
フイゲル−プロテインＡマプスキットにより精製し、凍
結乾燥して白色粉末のモノクロナール抗体を得た。得ら
れた抗ｈＣＧ特異的モノクロナール抗体は抗体固定部
（Ｂ）及び検出部（Ｄ）の作製に用い、α−サブユニッ
トを認識するモノクロナール抗体は標識抗体作製に用い
た。
【００８２】１−ｂ）着色ラテックス標識抗ｈＣＧ特異
抗体の製造 １−ａ）で得られた抗ｈＣＧ特異的モノクロナール抗体
４ｍｇを２ｍｌのグリシン緩衡液（ｐＨ８．２）に溶解
したのち、攪拌下に赤色ポリスチレンラテックス（固形
分１０％、日本合成ゴム社製、粒径０．３０３μｍ）
１．０ｍｌを滴下混合し、室温で３０分間及び５６℃で
３０分間攪拌を続けた。次いで冷却後、遠心分離した。
得られた沈殿をグリシン緩衡液１０ｍｌに懸濁して遠心
分離する操作を２回繰り返した後、沈殿を１％ＢＳＡ含
有グリシン緩衡液１０ｍｌに懸濁させ、室温で１時間攪
拌した後、遠心分離した。グリシン緩衝液による遠心洗
浄操作を３回繰り返した後、沈殿を５％サッカロース、
２．５％マンニトール、０．１％ＢＳＡ含有グリシン緩
衡液２０ｍｌに懸濁し、抗ｈＣＧ特異的モノクロナール
抗体感作着色ラテックスを製造した。
【００８３】１−ｃ）試料添加部（Ａ）の製造 クロマトグラフィー用濾紙（アドバンテック東洋社製、
Ｎｏ．５８５、厚さ０．８５ｍｍ）をカットして１０×
２１ｍｍの濾紙片を作製し、これを、５％脱脂粉乳（全
国酪農連合会）含有０．１Ｍトリス緩衡液（ｐＨ８．
２）溶液に浸漬して３７℃１時間インキュベーション
後、０．１Ｍトリス緩衡液（ｐＨ８．２）にて１回洗浄
後、５％ＢＳＡ（バイオセル社製）含有０．１Ｍトリス
緩衡液（ｐＨ８．２）溶液に浸漬した。３７℃１時間イ
ンキュベーション後、０．１Ｍトリス緩衡液（ｐＨ８．
２）で１回洗浄、液切り後、０．０５％ツイーン２０含
有０．１Ｍトリス緩衡液に浸した後、液切りして室温に
て乾燥させた。
【００８４】１−ｄ）抗体固定部（Ｂ）の製造 イ）ＣＮＢｒ活性化セルロ−ス濾紙の作製 セルロース濾紙（アドバンテック東洋社製、Ｎｏ．５
０）を１０×２０ｍｍの濾紙片に切断し、この２ｇを２
０ｍｌの精製水に浸して膨潤させた後、６０ｍｌのＣＮ
Ｂｒ溶液（２．０ｇのＣＮＢｒを６０ｍｌの精製水に溶
解）を加え、直ちに攪拌下、１ＮＮａＯＨによりｐＨ１
０．５に調整し、引き続き１ＮＮａＯＨにより３０分間
ｐＨを１０．５に維持した。反応終了後、濾紙片を５０
ｍｌのＮａＨＣＯ3で１２回洗浄後、５０ｍｌの精製水
で２回洗浄後、５０ｍｌの２０％アセトン、５０％アセ
トン、７０％アセトン、アセトンで各２回洗浄し、室温
で乾燥させた。このＣＮＢｒ活性化セルロース濾紙は抗
体の固定まで４℃に保存した。
【００８５】ロ）抗ｈＣＧ特異的モノクロナール抗体固
定セルロース濾紙の作製 １−ａ）で製造した抗ｈＣＧ特異的モノクロナール抗体
をカップリング緩衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ3含有０．
５ＭＮａＣｌ，ｐＨ８．３）にて０、０．１、０．２お
よび０．４ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を調製し、各５ｍｌ
に上記イ）で作製したＣＮＢｒ活性化セルロース濾紙１
０枚ずつを浸漬し、ゆっくり攪拌しながら室温で３時間
反応させた。反応終了後、濾紙片をカップリング緩衝液
にて２回洗浄後、各５ｍｌの１Ｍエタノールアミン溶液
に浸漬し、室温で２時間ゆっくり攪拌して未反応のＣＮ
Ｂｒ活性基をブロックした後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．０）−０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）で３回洗
浄後、室温で乾燥させ、使用時まで４℃に保存した。
【００８６】１−ｅ）検出部（Ｄ）の製造 ニトロセルロース膜（ザルトリウス社製、孔径８μｍ）
を３０×５０ｍｍの大きさに切断し、カマグ・リノマッ
ト（Ｃａｍｍｇ Ｌｉｎｏｍａｔ）ＩＶを用いて中心部
（１５ｍｍ）に１−ａ）で作製した抗ｈＣＧ特異的モノ
クロナール抗体の１ｍｇ／ｍｌ溶液（５０μｇ／ｍｌＢ
ＳＡ含有５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．２））の１０
μｌを線型にスプレイ後、２５℃、湿度８０％の恒温恒
湿器中に２５分間放置し、次いで０．１Ｍトリス緩衝液
（ｐＨ８．２）に５％脱脂粉乳（全国酪農連合会）を溶
解した溶液、５％ＢＳＡ溶液に浸漬してブロッキングし
た後、１％サッカロース、１％マンニトール含有０．１
Ｍトリス緩衝液にて洗浄し、室温に放置して乾燥させ
た。
【００８７】１−ｆ）標識物質存在部（Ｃ）の製造 １−ｅ）で製造した検出部（Ｄ）を含むニトロセルロー
ス膜の線型に固定した検出部に平衡に一端から５ｍｍの
位置にカマグ・リノマットＩＶを用いて１−ｂ）で作製
した着色ラテックス標識抗ｈＣＧ抗体２０μｌを線型に
スプレイし、室温で乾燥させ、使用時まで４℃に保存し
た。
【００８８】１−ｇ）装置の製造 １−ｆ）で製造した検出部（Ｄ）及び標識物質存在部
（Ｃ）を含むニトロセルロースの幅５０ｍｍを４ｍｍず
つに切断して４×３０ｍｍの短冊とし、また、１−ｄ）
で各抗体溶液で作製した抗ｈＣＧ特異的モノクロ−ナル
抗体固定セルロース濾紙についても４×７ｍｍの短冊を
作製した。図１０(b)に示すように、ガラス板上に画面
粘着テープを貼った支持体（Ｇ）上に、上記検出部
（Ｄ）及び標識物質存在部（Ｃ）を含むニトロセルロー
ス膜の短冊を図１０(a)に示すように、１ｍｍ間隔で４
枚、平行に並べて貼り、各々について抗ｈＣＧ特異的モ
ノクロナール抗体固定セルロース濾紙の短冊を右端に１
ｍｍの重なりをもって貼り、さらに右端に１ｍｍの重な
りを持って１−ｃ）で製造した試料添加部（Ａ）を貼っ
た。一方、膜の左端には吸収部（Ｅ）としてクロマトグ
ラフ用セルロース濾紙(アドバンテック東洋社製、Ｎ
ｏ．５８５）の１０×２１ｍｍの濾紙片を１ｍｍの重な
りを持って貼り、各々の連結を確実なものとした。同様
にして本装置を５枚作製した。
【００８９】１−ｈ）測定 ｈＣＧを０、１０、２０、３０および４０ｉｕ／ｌ含有
する尿を試料とし、これらの試料を１−ｇ）で製造した
装置各々の試料添加部（Ａ）に２００μｌずつ添加し
た。試料中のｈＣＧは抗体固定部（Ｂ）において捕捉用
抗体量に応じて一定量捕捉された後、着色ラテックス標
識抗体と結合してクロマト移動し、検出部（Ｄ）におい
て線型に固定化されている抗ｈＣＧ特異的モノクロナー
ル抗体に結合し、未反応標識抗体および試料溶液はクロ
マト移動により吸収部（Ｅ）に移動後、検出部（Ｄ）に
おける標識物由来の呈色を観察した。
【００９０】本装置における検出感度は、検出部（Ｄ）
に固定化された抗ｈＣＧモノクロナール抗体量と、標識
物質存在部（Ｃ）の着色ラテックス標識抗体量により１
０ｉｕ／ｌと設定し、抗体固定部（Ｂ）の捕捉用抗体
量、寸法等により半定量幅を設定した。
【００９１】各試料を添加した装置の検出部（Ｄ）の呈
色は表１(a)に示す通りであった。表１(b)には、赤色の
線型が認められた場合を「＋」、認められなかった場合
を「−」として表示した。
【００９２】
【表１】
【００９３】表１に示す如く、本発明によれば試料中の
ｈＣＧを１０ｉｕ／ｌの濃度幅で精度よく半定量できる
ことが判った。なお、ここでは示さなかったが、ｈＣＧ
未知濃度の試料を精度よく半定量するには、先ず、固定
抗体量の幅を大きく設定して、例えば１０００、２０
０、４０および０ｉｕ／ｌの４段階で半定量を行い、次
いで、例えば、試料中のｈＣＧの濃度が０〜４０ｉｕ／
ｌの範囲であれば、上記実施例１のようにして半定量す
ることが好ましい。また、試料が他の範囲の濃度の場合
には、各々の濃度域に応じて半定量できるユニットを作
製して用いるのが好ましい。
【００９４】実施例２ ｈＬＨ（ヒト黄体形成ホルモ
ン）の測定 ２−ａ）抗ｈＬＨ特異的モノクロナール抗体の製造 ｈＬＨを抗原として、実施例１−ａ）と同様にＢａｌｂ
／ｃマウスに免疫し、その脾細胞を用いて細胞融合を行
い、ｈＬＨ特異的モノクロナール抗体を分泌する融合細
胞株並びにｈＣＧ、ｈＬＨ及びｈＦＳＨと交差反応する
α−サブユニットを認識するモノクロナール抗体を分泌
する融合細胞株を得た。各細胞株を予めプリスタン投与
したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に投与し、腹水腫瘍を
形成させて腹水を得た。得られた腹水を硫安分画及びア
フイゲル−プロテインＡマプスキットにより精製し、凍
結乾燥して白色粉末のモノクロナール抗体を得た。得ら
れた抗ｈＬＨ特異的モノクロナール抗体は、抗体固定部
（Ｂ）及び検出部（Ｄ）の作製に用い、α−サブユニッ
トを認識するモノクロナール抗体は標識抗体の作製に用
いた。
【００９５】２−ｂ）金コロイド標識抗ｈＬＨ特異的モ
ノクロナール抗体の製造 ２−ａ）で作製したｈＣＧα−サブユニット認識モノク
ロナール抗体を１０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液
（ｐＨ７．４）に溶解し２００μｇ／ｍｌを調製した。
コロイド金溶液（金コロイド粒径１０ｎｍ、Ｅ−Ｙラボ
ラトリ−ズ社製）４．０ｍｌにモノクロナール抗体溶液
１．０ｍｌを添加し、室温で１０分間攪拌後、０．０５
％ＰＥＧ２００００、０．１％ＢＳＡ含有１０ｍＭヘペ
ス緩衝液（ｐＨ７．４）を０．２５ｍｌ加え、１時間攪
拌した後、１５０００ｒｐｍ、１０℃、３０分間遠心分
離した。得られた沈殿に、０．０５％ＰＥＧ２０００
０、０．１％ＢＳＡ、０．３ＭＤ−マンニトール含有１
０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）４．０ｍｌを添加し
て均一に懸濁させた後、更に１０℃、１５０００ｒｐ
ｍ、３０分間遠心分離した。得られた沈殿に同緩衝液
１．０ｍｌを加えて金コロイド標識抗ｈＬＨ抗体を得
た。得られた抗体は、使用時まで４℃に保存した。
【００９６】２−ｃ）試料添加部（Ａ）の製造 クロマトグラフ用濾紙（アドバンテック東洋社製、Ｎ
ｏ．５２６）をカットして１０×２５ｍｍの濾紙片を作
製し、実施例１−ｃ）と同様の方法により試料添加部
（Ａ）を製造した。
【００９７】２−ｄ）抗体固定部（Ｂ）の製造 イ）ＣＮＢｒ活性化セルロ−ス濾紙の作製 セルロ−ス濾紙（アドバンテック東洋社製、Ｎｏ．５１
４Ａ）を１０×２０ｍｍに切断し、この２ｇを実施例１
−ｄ）と同様にしてＣＮＢｒ活性化セルロース濾紙を作
製した。
【００９８】ロ）抗ｈＬＨ特異抗体固定セルロース濾紙
の作製 ２−ａ）で作製した抗ｈＬＨ特異的モノクロナール抗体
の０、１０、２５、４０、７０および１２０μｇ／ｍｌ
の溶液をカップリング緩衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ3含
有０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．３）にて調製し、各５ｍ
ｌに上記イ）で作製したＣＮＢｒ活性化セルロ−ス濾紙
片５枚ずつを浸漬し、ゆっくり攪拌しながら室温で約３
時間、ついで４℃で一夜反応させた。反応後、実施例１
−ｄ）と同様に未反応活性基をブロックし、０．１Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０）−０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ
８）で３回洗浄後、室温で乾燥させ、使用時まで４℃に
て保存した。
【００９９】２−ｅ）検出部（Ｄ）の製造 ニトロセルロース膜（ザルトリウス社製、孔径８μｍ）
を３０×５０ｍｍの大きさに切断し、カマグ・リノマッ
トＩＶを用いて中心部（１５ｍｍの位置）に２−ａ）で
作製した抗ｈＬＨ特異的モノクロナール抗体の２００μ
ｇ／ｍｌ溶液（５０μｇ／ｍｌＢＳＡ含有５０ｍＭトリ
ス緩衝液、ｐＨ８．２）の１０μｌを線型にスプレイ
し、実施例１−ｅ）と同様にブロッキング、乾燥を行
い、検出部（Ｄ）を含むニトロセルロース膜を作製し
た。
【０１００】２−ｆ）標識物質存在部（Ｃ）の製造 ２−ｅ）で製造した検出部（Ｄ）を含むニトロセルロー
ス膜の検出部に平行に、一端から７ｍｍの位置に、実施
例１−ｆ）と同様にカマグ・リノマットＩＶを用いて、
２−ｂ）で製造した金コロイド標識抗ｈＬＨ特異的モノ
クロナール抗体を１０％サッカロース溶液で２倍希釈
し、その５０μｌを線型にスプレイし、室温で乾燥さ
せ、使用時まで４℃（デシケータ中）で保存した。
【０１０１】２−ｇ）装置の製造 ２−ｆ）で製造した検出部（Ｄ）および標識物質存在部
（Ｃ）を含むニトロセルロース膜の幅５０ｍｍを３ｍｍ
ずつに切断して３×３０ｍｍの短冊状とし、また、２−
ｄ）で各抗体溶液で作製した抗ｈＬＨ特異的モノクロナ
ール抗体固定セルロース濾紙も３ｍｍずつに切断して３
×１０ｍｍの短冊を作成した。図１１(d)に示すよう
に、イ）〜ホ）の突起を付けたプラスチック板のイ）、
ロ）、ハ）およびホ）に両面粘着テープを貼り、ハ）に
おける粘着テープにより検出部（Ｄ）および標識物質存
在部（Ｃ）を含むニトロセルロース膜の短冊を図１１
(c)に示すように１ｍｍ間隔で６枚平行に並べて貼り、
各々について右端に抗ｈＬＨ特異的モノクロナール抗体
固定セルロース濾紙の上記短冊を１ｍｍの重なりを持っ
て貼り、さらにその右端に１ｍｍの重なりを持って２−
ｃ）で製造した試料添加部（Ａ）を貼った。一方、膜の
左端には吸収部（Ｅ）としてクロマトグラフィー用濾紙
（アドバンテック東洋社製、Ｎｏ．５８５）の１０×２
５ｍｍの濾紙片をホ）の粘着テープで貼り、ニ）部で
は、メンブラン（クロマト材（Ｆ））の上に吸収部
（Ｅ）が２ｍｍ重なって接触するよう配置した。
【０１０２】以上のように、メンブラン（クロマト材
（Ｆ））および抗体固定部（Ｂ）が支持体に直接触れな
いような配置で本装置を７枚作製した。
【０１０３】２−ｈ）測定 ｈＬＨを０、５０、７５、１００、１５０、２００およ
び３００ｍｉｕ／ｍｌ含有する尿を試料として２−ｇ）
で製造した装置各々の試料添加部（Ａ）に２５０μｌ添
加した。試料中のｈＬＨは、抗体固定部（Ｂ）において
捕捉用固定抗体量に応じて一定量が捕捉された後、金コ
ロイド標識抗体と結合してクロマト移動し、検出部
（Ｄ）において線型に固定化されている特異抗体に結合
し、未反応金コロイド標識抗体および試料溶液はクロマ
ト移動により吸収部（Ｅ）に移動後、検出部（Ｄ）にお
ける標識物由来の呈色を観察した。
【０１０４】なお、本装置における検出感度は、検出部
（Ｄ）に固定化された抗ｈＬＨ特異的モノクロナール抗
体量と、標識物質存在部（Ｃ）の金コロイド標識抗体量
により５０ｍｉｕ／ｍｌと設定し、抗体固定部（Ｂ）の
捕捉用抗体量、寸法等により半定量幅を設定した。
【０１０５】各試料を添加した装置の検出部（Ｄ）の呈
色は、表２(a)に示す通りであった。表２(b)は、赤色の
線型が認められた場合を「＋」、認められなかった場合
を「−」と示した。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】実施例３ エストロゲンの測定 ３−ａ）エストリオール−１６−グルクロナイド−ＢＳ
Ａの製造 エストリオール−１６−グルクロナイド４０ｍｇをジメ
チルホルムアミド１．０ｍｌに溶解し、これに４℃以下
でトリ−ｎ−ブチルアミン２０．６μｌを添加したの
ち、イソブチルクロロカーボネート１１．２μｌを加え
３０分間攪拌した。これに予めＢＳＡ（ウシ血清アルブ
ミン）１１７ｍｇを２．８ｍｌの水に溶解したものに１
ＮＮａＯＨ溶液１５０μｌを加えた後、ジメチルホルム
アミド２．０ｍｌを加え、８℃に保たれた液を混合し
た。次いでこれを８℃で攪拌し、１時間後に１ＮＮａＯ
Ｈ溶液１６．６μｌを加え、さらに３．５時間攪拌した
のち、セファデックスＧ−２５で未反応のエストリオー
ル−１６−グルクロナイドおよびトリ−ｎ−ブチルアミ
ン等の低分子試薬を除去した。さらにこれを透析（精製
水に対し）した後、凍結乾燥すると、エストリオール−
１６−グルクロナイド−ＢＳＡが得られた。この抗原の
凍乾末についてのコーベル反応により、ＢＳＡ１モル当
りエストリオール−１６−グルクロナイド２７〜３０モ
ルの結合が確認された。
【０１０８】３−ｂ）抗エストリオール−１６−グルク
ロナイド抗体の製造 上記３−ａ）で製造したエストリオール−１６−グルク
ロナイド−ＢＳＡ２ｍｇを１ｍｌの生理食塩水に溶解
し、同量のコンプリートフロインドアジュバントで乳化
し、成熟家兎の足蹠および皮下に注射した。この注射を
１ヶ月間隔で行い、抗体価の上昇を確認後全採血を行い
抗血清を得た。この抗血清を５６℃３０分間非働化後Ｂ
ＳＡで吸収し、次いで硫酸アンモニウムによる塩析、Ｄ
ＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、セファデック
スＧ２００によるゲル濾過により精製したのち凍結乾燥
し、白色粉末状の抗Ｅ3１６Ｇ抗体を得た。
【０１０９】３−ｃ）エストリオール−１６−グルクロ
ナイド結合ポリアクリル酸（Ｅ3１６Ｇ−ＰＡＡ）の作
製 イ）エストリオール−１６−グルクロナイド−ヘキサメ
チレンジアミン誘導体エストリオール−１６−グルクロ
ナイド９３ｍｇと、Ｎ−ハイドロキシコハク酸イミド２
５ｍｇをＤＭＦ１．５ｍｌに溶かし、氷冷下攪拌しつつ
ＤＣＣ４１ｍｇを加える。３０分後、モノベンジルオキ
シカルボニルヘキサメチレンジアミン塩酸塩５５ｍｇ、
トリエチルアミン０．０３ｍｌをＤＭＦ１ｍｌに溶かし
た溶液を加え、氷冷下で２時間、室温で１２時間攪拌を
続ける。全体を減圧乾固し、残渣をプレパラティブ薄層
クロマトグラフィーに付して目的の標記化合物８２ｍｇ
（対理論収率５５％）を得た。本品はシリカゲル薄層ク
ロマトグラフィーでＲｆ＝０．４２（クロロホルム−メ
タノール５：１）を示した。
【０１１０】ロ）上記イ）で得たエストリオール−１６
−グルクロナイド−ヘキサメチレンジアミン誘導体５０
ｍｇをメタノール３ｍｌに溶かし、パラジウム黒１０ｍ
ｇを加え、常温常圧で水素気流中で攪拌する。２時間で
反応は終了し、触媒を濾去し、濾液を減圧濃縮し、残渣
にエーテルを加え、カルボベンジルオキシ基が脱離した
目的物３５ｍｇを粉末として得た。この生成物１０ｍｇ
をポリアクリル酸１００ｍｇとともにＤＭＦ２ｍｌに溶
かし、ＤＣＣ４ｍｇを加え、室温に５０時間放置する。
反応液を透析し、内液を濾過後凍結乾燥すると、エスト
リオール−１６−グルクロナイド結合ポリアクリル酸
（Ｅ3１６Ｇ−ＰＡＡ）９５ｍｇを白色粉末として得
た。
【０１１１】３−ｄ）着色ラテックス標識Ｅ3１６Ｇ−
ＰＡＡの製造 赤色アミノ化ポリスチレンラテックス（固形分１０％、
日本合成ゴム社製、粒径０．３７μｍ）０．５ｍｌに
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）・精製水
（１：１）で調製した１０％トリエチルアミン溶液１２
ｍｌを加えて懸濁させ、１５分攪拌後、遠心分離した。
沈殿をＤＭＦ・水（１：１）１０ｍｌで２回、精製水１
０ｍｌで１回遠心洗浄後、精製水０．５ｍｌに懸濁さ
せ、３−ａ）で製造したＥ3１６Ｇ−ＰＡＡの溶液（Ｅ3
１６Ｇ−ＰＡＡ２ｍｇを１ｍｌの精製水に溶解）を加え
て混合し、次いで１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩７．５ｍｇを加え、
攪拌下一夜反応を行った。反応終了後、遠心分離して得
た沈殿をグリシン緩衝液１０ｍｌで３回遠心洗浄を繰返
した後、３０％サッカロース、０．１％ＧＳＡ（ヤギ血
清アルブミン）含有グリシン緩衝液１０ｍｌに懸濁し、
Ｅ3１６Ｇ−ＰＡＡ結合着色ラテックスを製造した。
【０１１２】３−ｅ）試料添加部（Ａ）の製造 ガラス繊維濾紙（アドバンテック東洋社製、ＧＡ−１０
０、２．１φｃｍ）を精製水に浸漬して洗浄、水切り
後、これを２％脱脂粉乳２．５％ＢＳＡ含有０．１Ｍト
リス緩衝液（ｐＨ８．２）溶液に浸漬し、４℃にて一昼
夜放置後０．１Ｍトリス緩衝液で洗浄し、液切りして室
温で乾燥させた。
【０１１３】３−ｆ）抗体固定部（Ｂ）の製造 イ）ＣＮＢｒ活性化セルロース濾紙の作製 セルロース濾紙（アドバンテック東洋社製、Ｎｏ．５２
６、厚さ０．７０ｍｍ）を１０×２０ｍｍの濾紙片に切
断し、この２ｇを実施例１−ｄ）と同様にしてＣＮＢｒ
活性化セルロース濾紙を作製した。
【０１１４】ロ）抗Ｅ3１６Ｇ抗体固定セルロース濾紙
の作製 ３−ｂ）で製造した抗Ｅ3１６Ｇ抗体の０、０．２５、
０．５および１．０ｍｇ／ｍｌの溶液をカップリング緩
衝液（０．１ＭＮａＨＣＯ3含有０．５ＭＮａＣｌ、ｐ
Ｈ８．３）にて調製し、各５ｍｌにイ）で作製したＣＮ
Ｂｒ活性化セルロース濾紙片５枚ずつを浸漬し、室温で
２時間ゆっくり攪拌して反応させた後、実施例１−ｄ）
と同様に未反応活性基をブロックし、０．１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ４．０）−０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）で
３回洗浄後、室温で乾燥させ使用時まで４℃で保存し
た。
【０１１５】３−ｇ）検出部（Ｄ）の製造 ニトロセルロース膜（ザルトリウス社製、孔径５μｍ）
を３０×５０ｍｍの大きさに切断し、カマグ・リノマッ
トＩＶを用いて端から１０ｍｍの部分に抗Ｅ3１６Ｇモ
ノクロナール抗体（帝国臓器製薬社製）の０．２５ｍｇ
／ｍｌ（ＢＳＡ５０μｌ／ｍｌ含有５０ｍＭトリス緩衝
液、ｐＨ８．２）の１０μｌを線型にスプレイ後、実施
例１−ｃ）と同様に処理して検出部（Ｄ）を含むニトロ
セルロース膜を作製した。
【０１１６】３−ｈ）標識物質存在部（Ｃ）の製造 ポリエステル不織布（１０×４ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ）
を０．１％可溶化カゼイン溶液に浸漬し、３７℃１時間
放置後、液切りし、３−ｄ）で製造した着色ラテックス
標識Ｅ3１６Ｇ−ＰＡＡ懸濁液を２０μｌ含浸させ、室
温にて乾燥し、使用時までデシケータ中に保存した。
【０１１７】３−ｉ）装置の製造 ３−ｇ）で作製した検出部（Ｄ）を含むニトロセルロー
ス膜の幅５０ｍｍを４ｍｍずつに切断して４×３０ｍｍ
の短冊とし、３−ｆ）で各抗体溶液で作製した抗Ｅ3１
６Ｇ抗体固定セルロース濾紙も４ｍｍずつに切断して４
×１０ｍｍの短冊状とした。図１２(f)に示すように、
ガラス板（支持体（Ｇ））上に両面テープを貼り、その
中央部に３−ｅ）で製造した試料添加部（Ａ）を貼り、
次に上記各溶液で作製した抗Ｅ3１６Ｇ抗体固定セルロ
ース濾紙の短冊を（Ａ）のまわりに等間隔で１ｍｍの重
なりを持って貼り、（水平左側から抗体０、０．２５、
０．５および１．０ｍｇ／ｍｌの順）、その先に３−
ｈ）で製造した標識物質存在部（Ｃ）を２ｍｍの重なり
をもって貼った。最後にクロマトグラフィー用セルロー
ス濾紙（アドバンテック東洋社製、Ｎｏ．５８５）の４
×１０ｍｍの濾紙片を吸収部（Ｅ）として２ｍｍの重な
りをもって貼り、各々の連結を確実なものとした。同様
にして本装置を５枚作製した。
【０１１８】３−ｊ）測定 エストロゲンを０、１、２、４および８μｇ／ｍｌ含有
する尿を試料として３−ｉ）で製造した装置の各々の試
料添加部（Ａ）に３００μｌを添加した。試料中のエス
トロゲンは、抗体固定部（Ｂ）において、捕捉用固定抗
体量に応じて一定量が捕捉された後、捕捉されなかった
エストロゲンは標識物質存在部（Ｃ）の着色ラテックス
標識Ｅ3１６Ｇ−ＰＡＡと共にクロマト移動により検出
部（Ｄ）へ移動し、抗Ｅ3１６Ｇ抗体と競合的に結合
し、未反応標識物質がクロマト移動により吸収部（Ｅ）
に移動後、検出部（Ｄ）における標識物由来の呈色を観
察した。
【０１１９】なお、本装置における検出感度は、検出部
（Ｄ）に固定化された抗Ｅ3１６Ｇモノクロナール抗体
量と、標識物質存在部（Ｃ）の着色ラテックス標識Ｅ3
１６Ｇ−ＰＡＡ量により両者の反応を１μｇ／ｍｌのエ
ストロゲンが阻止できるように設定し、抗体固定部
（Ｂ）の捕捉用抗体量、寸法等により半定量幅を設定し
た。 各試料を添加した装置の検出部（Ｄ）の呈色は、
表３(a)に示す通りであった。表３(b)は、赤色の線型が
認められた場合を「−」、認められなかった場合を
「＋」と表示した。
【０１２０】
【表３】
【０１２１】
【発明の効果】本発明により、試料の希釈を必要とせ
ず、しかも、試料の「希釈効果」の調整に関与する要因
が少ないため、希釈効果の調整が容易であり、感度良
く、即ち半定量値幅を狭く設定することができる簡易な
免疫化学的半定量方法および装置が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、分析対象物が完全抗原である場合の本
発明の半定量方法の原理を示す図である（試料添加
時）。
【図２】図２は、分析対象物が完全抗原である場合の本
発明の半定量方法の原理を示す図である（アッセイ進行
時）。
【図３】図３は、分析対象物が完全抗原である場合の本
発明の半定量方法の原理を示す図である（アッセイ完了
時）。
【図４】図４は、分析対象物がハプテンである場合の本
発明の半定量方法の原理を示す図である（試料添加
時）。
【図５】図５は、分析対象物がハプテンである場合の本
発明の半定量方法の原理を示す図である（アッセイ進行
時）。
【図６】図６は、分析対象物がハプテンである場合の本
発明の半定量方法の原理を示す図である（アッセイ完了
時）。
【図７】図７は、分析対象物がハプテンである場合の本
発明の半定量方法の原理を示す図である（試料添加
時）。
【図８】図８は、分析対象物がハプテンである場合の本
発明の半定量方法の原理を示す図である（アッセイ進行
時）。
【図９】図９は、分析対象物がハプテンである場合の本
発明の半定量方法の原理を示す図である（アッセイ完了
時）。
【図１０】図１０は、本発明の半定量装置の基本的構成
を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の半定量装置の基本的構成
を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明の半定量装置の構成を示す
図である。

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 クロマト法による免疫化学的簡易アッセ
    イにおいて； 複数の免疫アッセイ用ユニットからなる免疫アッセイ用
    装置を用い； 装置を構成する各ユニット上で行われる免疫化学的定性
    分析の前に、 固定化されて存在する分析対象物に対する抗体（以下、
    捕捉用抗体と略す）により、各ユニットに固定化された
    捕捉用抗体の量に対応する量の試料中の分析対象物を捕
    捉して各ユニット上で行われる免疫化学的定性分析に付
    される分析対象物濃度を減少させ、 ここで、捕捉用抗体は、ユニット毎に異なる量で、かつ
    適宜な幅で順次段階的に変化させ た量で固定化されてお
    り； 装置を構成するユニットのうちの少なくとも１つにおい
    ては、試料中の分析対象物が捕捉用抗体によって捕捉さ
    れた結果、その濃度が検出感度未満になり、引き続く免
    疫化学的定性分析において分析対象物が検出されず、かつ、装置を構成するユニットのうちの少なくとも１つ
    においては、試料中の分析対象物 の濃度が検出感度以上
    ある場合には、引き続く免疫化学的定性分析において分
    析対象物が検出され； 分析対象物が検出される限界または検出されなくなる限
    界のユニットにおける捕捉用抗体の量に対応する分析対
    象物の半定量値が決定されることからなる免疫化学的簡
    易半定量方法。
  2. 【請求項２】 分析対象物が完全抗原およびハプテンか
    らなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 分析対象物がｈＣＧ、ｈＬＨまたはエス
    トロゲンである請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方
    法を実施するための、複数の免疫アッセイ用ユニットか
    らなる免疫アッセイ用装置であって； 各ユニットは 試料中の分析対象物の一定量を捕捉する抗体が所定量で
    固定化されて存在する抗体固定部（Ｂ）、 分析対象物の存在の有無を検出するための指標となる標
    識物質がクロマト移動しうる状態で存在する標識物質存
    在部（Ｃ）および 標識物質を検出するための検出用物質が固定化されて存
    在する検出部（Ｄ）からなり； 装置は、上記複数のユニットと 分析対象物を含む試料を添加するための各ユニットにお
    いて共通の試料添加部（Ａ）および 各ユニットで共通であっても、各ユニットで独立してい
    てもよい、添加された試料とともに分析対象物の有無の
    検出に関与しない標識物質を吸収除去する吸収部（Ｅ） からなり； 各ユニットの抗体固定部（Ｂ）に固定される捕捉用抗体
    の量は、ユニット毎に異なり、適宜な幅で順次段階的に
    変化させた量であることを特徴とするイムノクロマト法
    による免疫化学的簡易半定量装置。
  5. 【請求項５】 分析対象物が完全抗原であり、標識物質
    が抗体固定部（Ｂ）に存在する固定化された分析対象物
    捕捉用抗体（以下、捕捉用抗体Ｉと略す）とは異なる分
    析対象物上の抗原決定基を認識する標識された抗体（以
    下、標識抗体ＩＩと略す）であり、検出用物質が少なく
    とも標識抗体ＩＩとは異なる分析対象物上の抗原決定基
    を認識する抗体（以下、検出用抗体ＩＩＩと略す）であ
    る請求項４に記載の装置。
  6. 【請求項６】 分析対象物がハプテンであり、抗体固定
    部（Ｂ）に存在する固定化された分析対象物捕捉用抗体
    がハプテン抗体（以下、捕捉用抗体ＩＶと略す）であ
    り、検出用物質が分析対象物と結合し得るハプテン抗体
    （以下、検出用抗体Ｖと略す）であり、標識物質が分析
    対象物と競合的に検出用抗体Ｖと結合しうる標識された
    物質である請求項４に記載の装置。
  7. 【請求項７】 分析対象物がハプテンであり、抗体固定
    部（Ｂ）に存在する固定化された分析対象物捕捉用抗体
    がハプテン抗体（以下、捕捉用抗体ＶＩと略す）であ
    り、標識物質が分析対象物と結合し得る標識されたハプ
    テン抗体（以下、標識抗体ＶＩＩと略す）であり、検出
    用物質が標識抗体ＶＩＩに対して分析対象物であるハプ
    テンと競合的に結合しうる物質である請求項４に記載の
    装置。
  8. 【請求項８】 分析対象物がｈＣＧまたはｈＬＨである
    請求項５に記載の装置。
  9. 【請求項９】 分析対象物がエストロゲンである請求項
    ６に記載の装置。
  10. 【請求項１０】 各ユニットの吸収部（Ｅ）が共通であ
    る請求項４に記載の装置。
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