MX2011003927A - Metodo de medicion de insulina. - Google Patents

Abstract

Se describe un método de medición y un reactivo de medición, ambos son específicos para insulina y hacen posible la medición precisa solamente de insulina con alta sensibilidad sin la influencia de proinsulina o algún compuesto similar a insulina. Específicamente se describe un método de medición y un reactivo, ambos hacen posible la medición específica de insulina mediante la utilización de un anticuerpo incapaz de reaccionar con insulina que no está unida a un anticuerpo antiinsulina, pero capaz de reaccionar con insulina que está unida a un anticuerpo antiinsulina.

Description

MÉTODO DE MEDICIÓN DE INSULINA CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a un ensayo de insulina y al reactivo de ensayo de insulina que utiliza una reacción inmunitaria. En particular, esta invención implica un anticuerpo que reacciona con la insulina unida a otro anticuerpo antiinsulina, pero no reacciona con insulina no unida al anticuerpo antiinsulina.

La insulina es una hormona peptídica (peso molecular: aproximadamente 5800) que se produce a través de un precursor, la proinsulina, en las células beta en los islotes pancreáticos de Langerhans. La insulina está involucrada en el metabolismo del azúcar, los aminoácidos y las grasas y es fisiológicamente importante en el efecto hipoglucemiante . La diabetes es causada por una secreción insuficiente de insulina debido a la disminución o el deterioro funcional de las células beta o debido, a la insuficiente acción de la insulina en los tejidos periféricos. Por lo tanto, la medición de la concentración de insulina en sangre que refleja la función secretora de insulina de las células beta es un índice útil para el diagnóstico y la comprensión de la condición clínica de la diabetes y la determinación de la causa de la tolerancia anormal a la glucosa.

•Se conocen las siguientes técnicas de ensayos de insulina que usan anticuerpos monoclonales.

El Documento de Patente 1 describe un método de cuantificación de la insulina de acuerdo con un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) . Este ensayo utiliza un anticuerpo monoclonal unido a un portador insoluble y un anticuerpo monoclonal que no compite con el anticuerpo para un epitope que está marcado con una enzima.

El Documento de Patente 2 describe un método de cuantificación de la insulina de acuerdo con un inmunoensayo de aglutinación de partículas. Este ensayo utiliza dos anticuerpos monoclonales que tienen sitios diferentes de reconocimiento y están unidos a los portadores insolubles.

Aunque ambos documentos describen métodos de ensayo de insulina que utilizan una pluralidad de anticuerpos monoclonales que tienen sitios diferentes de reconocimiento para la insulina, no se hace descripción con respecto a la reactividad cruzada con proinsulina o análogos de insulina, tales como formulaciones análogas de insulina. Por lo tanto, no se sabe si la insulina se puede medir de manera específica y sensible.

DOCUMENTOS DE LA TÉCNICA ANTERIOR DOCUMENTOS DE PATENTES Documento de Patente 1:¦ Publicación de Patente Abierta al Público No. H01- 148962 Documento de Patente 2: Publicación de Patente Abierta al Público No. H03- 118472 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN PROBLEMA A RESOLVER POR LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un ensayo especifico de insulina y un reactivo de ensayo capaz de analizar de manera sensible y especifica la insulina sin ser afectado por la proinsulina y los análogos de insulina.

MEDIOS PARA RESOLVER EL PROBLEMA Como resultado de una extensa investigación, los inventores sorprendentemente descubrieron que la insulina puede ser analizada de manera sensible y especifica sin ser afectada por la proinsulina y los análogos de insulina mediante la combinación de un primer reactivo de anticuerpo monoclonal con la insulina con un segundo reactivo de anticuerpo monoclonal con insulina unida al primer anticuerpo monoclonal pero no con insulina no unida al primer anticuerpo monoclonal. A través de investigación adicional, los inventores descubrieron que las diversas formas de este ensayo de insulina se pueden establecer utilizando anticuerpos que reaccionan con insulina unida a anticuerpos antiinsulina (complejos de anticuerpos-insulina-antiinsulina, en lo sucesivo, a veces denominados "complejo de insulina-anticuerpo") , completando asi la presente invención. Por lo tanto, la presente invención incluye los elementos constitutivos siguientes: [1] Un ensayo de insulina ' que utiliza un anticuerpo que reacciona con insulina unida a un anticuerpo antiinsulina, pero que no reacciona con insulina no unida a un anticuerpo antiinsulina. [2] El ensayo de insulina del [1] , que utiliza dos tipos de anticuerpos, en donde 1) un primer anticuerpo reacciona con insulina, y 2) un segundo anticuerpo reacciona con insulina unida al primer anticuerpo, pero no reacciona con insulina no unida al primer anticuerpo. [3] El ensayo de insulina del [2] , en donde tanto el primero como el segundo anticuerpos son anticuerpos monoclonales . [4] El ensayo de insulina del [2], en donde el primer anticuerpo es un anticuerpo policlonal y el segundo anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. [5] El ensayo de insulina del [3], en donde el primer anticuerpo monoclonal consiste de dos o más anticuerpos monoclonales que tienen sitios diferentes de reconocimiento. [6] Ensayo de insulina según cualquiera del [3] al [5] , en donde por lo menos uno de los anticuerpos monoclonales es un anticuerpo que no es reactivo con proinsulina o análogos de insulina. [7] Ensayo de insulina según cualquiera del [3] al [6], en donde el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que no es reactivo con proinsulina o análogos de insulina . [8] Ensayo de insulina según cualquiera del [3], [5], [6] y [7], en donde el primer y el segundo anticuerpos monoclonales se inmovilizan a látex y la insulina se analiza mediante un ensayo de inmunoaglutinación de látex. [9] Ensayo de insulina según cualquiera del [3], [5], [6] y [7], en donde el primer anticuerpo monoclonal se inmoviliza a una fase sólida, el segundo anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación y la insulina se analiza mediante ELISA. [10] Ensayo de insulina según cualquiera del [3], [5], [6] y [7], en donde el primer anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación, el segundo anticuerpo monoclonal se inmoviliza a una fase sólida y la insulina se analiza mediante ELISA o inmunocromatografia . [11] Un reactivo de ensayo de insulina que comprende un anticuerpo capaz de reaccionar con insulina unida a un anticuerpo antiinsulina, mientras que no reacciona con insulina no unida a un anticuerpo antiinsulina. [12] El reactivo de ensayo de insulina [11], que comprende dos tipos de anticuerpos, en donde 1) el primer anticuerpo tiene la propiedad de reaccionar con insulina, y 2) el segundo anticuerpo tiene la propiedad de reaccionar con insulina unida al primer anticuerpo, pero no reacciona con insulina no unida al primer anticuerpo. [13] El reactivo de ensayo de insulina del [12], en donde tanto el primero como el segundo anticuerpos son anticuerpos monoclonales . [14] El reactivo de ensayo de insulina del [12] , en donde el primer anticuerpo es un anticuerpo policlonal y el segundo anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. [15] El reactivo de ensayo de insulina del [13], en donde el primer anticuerpo monoclonal consiste de dos o más anticuerpos monoclonales que tienen sitios de reconocimiento diferentes entre si. [16] El reactivo de ensayo de insulina de cualquiera del [13] al [15], en donde por lo menos uno de los anticuerpos monoclonales es un anticuerpo que no es reactivo con proinsulina o análogos de insulina. [17] El reactivo de ensayo de insulina de cualquiera del [13] al [16], en donde el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que no es reactivo con proinsulina o análogos de insulina. [18] El reactivo de ensayo de insulina de cualquiera del [13], [15], [16] y [17], en donde el primero y segundo anticue'rpos monoclonales se inmovilizan en látex y la insulina se analiza mediante ensayo de inmunoaglutinación con látex. [19] El reactivo de ensayo de insulina de cualquiera del [13], [15], [16] y [17], en donde el primer anticuerpo monoclonal se inmoviliza a una fase sólida, el segundo anticuerpo monoclonal está marcado con un material de marcación y la insulina se analiza mediante ELISA. [20] El reactivo de ensayo de insulina de cualquiera del [13] [15], [16] y [17], en donde el primer anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación, el segundo anticuerpo monoclonal se inmoviliza a una fase sólida y la insulina se analiza mediante ELISA o inmunocromatografia . [21] Un anticuerpo monoclonal que tiene las siguientes propiedades: 1) no reacciona con insulina que no está unida a un anticuerpo antiinsulina, y 2) reacciona con insulina que se une a un anticuerpo antiinsulina. [22] El anticuerpo monoclo.nal del [21], además tiene la propiedad de no reaccionar con proinsulina o análogos de insulina. [23] Un método de selección de anticuerpos monoclonales que comprende los siguientes pasos: 1) seleccionar un anticuerpo reactivo con insulina, y 2) seleccionar un anticuerpo monoclonal reactivo con insulina que se une al anticuerpo seleccionado en el paso 1) pero que no es reactivo con insulina que no está unida al anticuerpo.

EFECTO DE LA INVENCIÓN Con la presente invención, la insulina puede ser analizada de manera sensible y especifica sin ser afectada por proinsulina y análogos de insulina. Dado que la secreción de insulina proveniente de las células beta puede ser monitoreada con precisión por la presente invención, la presente invención también puede utilizarse para proporcionar una imagen de la condición clínica de la diabetes y por lo tanto sería muy útil.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un esquema de una secuencia de aminoácidos de la insulina. En la Figura 1, (a) a (e) son indicativos de las variaciones en la secuencia de aminoácidos de varias formulaciones análogas de insulina en el examen de la reactividad con anticuerpos de la presente invención. Los caracteres alfabéticos en los circuios de la Figura 1 denotan aminoácidos representados por un carácter. Insulina lispro: (a) y (b) son "K-P" en lugar de "P-K". Insulina aspart: (a) es "D" en lugar de "P." Insulina glargina: (d) es "G" en lugar de "N" y "RR" se agrega a "T" de (c) . Insulina detemir: (c) no es "T" y ácido miristico (C14H28O2) se agrega a "K" de (b) . Insulina glulisina: (b) es "E" en lugar de "K" y (e) es "K" en lugar de "N".

La figura 2 es un diagrama de los resultados de una prueba utilizando Biacore (marca registrada) T100 para examinar la reactividad de un anticuerpo 66221 con insulina.

La Figura 3 es un diagrama de los resultados de una prueba utilizando Biacore (marca registrada) T100 para examinar la reactividad de un anticuerpo 66226 con insulina .

La Figura 4a es un diagrama de los resultados de una prueba utilizando Biacore (marca registrada) T100 para examinar la reactividad del anticuerpo 66221 con proinsulina y varias formulaciones análogas de insulina, (a) , (b) y (c) son los resultados para proinsulina, insulina lispro e insulina aspart, respectivamente.

La · Figura 4b es la misma que la anterior, (d) y (e) son los resultados de insulina glargina e insulina detemir, respectivamente.

La Figura 5a es un diagrama de los resultados de una prueba utilizando Biacore (marca registrada) T100 para examinar la reactividad del anticuerpo 66226 con proinsulina y varias formulaciones análogas de insulina, (a) , (b) y (c) son los resultados para proinsulina, insulina lispro e insulina aspart, respectivamente.

La Figura 5b es la misma que la anterior, (d) y (e) son los resultados para insulina glargina e insulina detemir, respectivamente.

La figura 6 es un diagrama que representa los resultados de una prueba de ELISA para examinar la reactividad con insulina, proinsulina y varias formulaciones análogas de insulina mediante el uso del anticuerpo 66221 y el anticuerpo 66226 como los anticuerpos primario y secundario, respectivamente, con el anticuerpo primario en fase sólida en una placa.

La Figura 7 es un diagrama de un resultado de una prueba de ELISA para examinar la reactividad con insulina, proinsulina y varias formulaciones análogas de insulina utilizando el anticuerpo 66226 y anticuerpo 66221 como los anticuerpos primario y secundario, respectivamente, con el anticuerpo en fase sólida en una placa.

La .Figura 8 es un diagrama de un resultado de una prueba utilizando Biacore (marca registrada) T100 para examinar la reactividad del anticuerpo 66221 (a) y el anticuerpo 66226 (b) con una formulación de análogo de insulina, la insulina glulisina.

La figura 9 es un diagrama de un resultado de una prueba de ELISA para examinar la reactividad con insulina, proinsulina y una formulación de análogo de insulina, insulina glulisina, utilizando el anticuerpo 66221 y el anticuerpo 66226 como los anticuerpos primario y secundario, respectivamente, con el anticuerpo primario en fase sólida en una placa.

La figura 10 es un diagrama de un resultado de una prueba de ELISA para examinar la reactividad con insulina, proinsulina y una formulación de análogo de insulina, la insulina glulisina, utilizando el anticuerpo 66226 y el anticuerpo 66221 como los anticuerpos primario y secundario, respectivamente, con el anticuerpo primario en fase sólida en una placa.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Ahora se describirán las modalidades de la presente invención al considerar el aspecto [3] descrito a continuación como un ejemplo, que es representativo de la presente invención. El aspecto [3] se describe específicamente de la siguiente manera: "un ensayo de insulina que utiliza dos tipos de anticuerpos monoclonales, en donde (1) el primer anticuerpo monoclonal reacciona con insulina, y (2) El segundo anticuerpo monoclonal reacciona con insulina unida al primer anticuerpo monoclonal y no con insulina no unida al primer anticuerpo monoclonal".

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen el primero y el segundo anticuerpos monoclonales y estos anticuerpos se utilizan en combinación para analizar insulina. El primer anticuerpo monoclonal puede ser cualquier anticuerpo monoclonal, siempre y cuando sea reactivo con insulina y no puede ser solamente una molécula de anticuerpo completo, sino también un fragmento funcional que es reactivo con insulina, tal como la porción Fab' del anticuerpo.

El segundo anticuerpo monoclonal puede ser cualquier anticuerpo monoclonal, siempre y cuando tenga las propiedades de 1) y 2) de la siguiente manera: 1) el segundo anticuerpo monoclonal no es reactivo con insulina no unida al primer anticuerpo monoclonal, y 2) el segundo anticuerpo monoclonal es reactivo con insulina unida al primer anticuerpo monoclonal.

Si "el segundo anticuerpo monoclonal reacciona con insulina unida al primer anticuerpo monoclonal" como se describió anteriormente, es conveniente que un sitio de reacción (sitio de reconocimiento) del segundo anticuerpo monoclonal reconozca un cambio en la estructura de la insulina generada por la unión al primer anticuerpo monoclonal y reaccione con la insulina que tiene la estructura cambiada. En este caso, "un cambio en la estructura de la insulina" representa un cambio en la estructura, generado de forma independiente en una molécula de insulina misma, debido a la formación de un complejo de insulina-anticuerpo o una estructura que comprende un anticuerpo y molécula de insulina cooperativamente en la insulina unida al anticuerpo.

Puesto que es conveniente que el ensayo de la presente invención no se vea afectado por la proinsulina o análogos de insulina, es conveniente que por lo menos un anticuerpo monoclonal no reaccione con proinsulina o análogos de insulina. Los análogos de la insulina incluyen específicamente formulaciones análogas de insulina tales como insulina lispro, aspart insulina, insulina glargina, insulina detemir e insulina glulisina.

Una forma del segundo anticuerpo monoclonal de la invención puede ser un anticuerpo que no tiene reacción cruzada con ninguno de estos compuestos y si tal anticuerpo se utiliza en el ensayo de insulina, la insulina puede ser medida específicamente, incluso en presencia de los compuestos en una muestra. Si uno de los anticuerpos monoclonales no reacciona con proinsulina y análogos de insulina, el otro anticuerpo monoclonal puede ser reactivo o no reactivo con estos análogos.

Aunque las expresiones "reacciona con" insulina, "reconocimiento" de insulina, "unión a" insulina y "presenta reactividad cruzada con/reacción cruzada con" insulina, se utilizan como sinónimos en esta descripción, éstas deben interpretarse en el sentido más amplio, sin limitarse a estas ej emplificaciones . Si un anticuerpo "reacciona con" un antígeno (compuesto) tal como la insulina, se puede determinar por ELISA de antígeno en fase sólida, ELISA de competencia y ELISA en emparedado que se describe más adelante y también se puede identificar por un método que utiliza el principio de resonancia de plasmones superficiales (método de SPR) . El método de SPR se puede realizar utilizando dispositivos, sensores y reactivos disponibles en el mercado bajo el nombre de Biacore (marca registrada) .

Afirmar que un anticuerpo de la invención "no reacciona con" un compuesto sugiere que el anticuerpo de la presente invención no reacciona sustancialmente con el compuesto, mientras que la afirmación "no reacciona sustancialmente" sugiere que no se reconoce una mayor reactividad del anticuerpo de la presente invención cuando se utiliza Biacore (marca registrada) T100 para inmovilizar y analizar el anticuerpo de la presente invención con base, por ejemplo, en el método de SPR. En particular, esto significa que la reactividad entre un anticuerpo y un compuesto no es significativamente diferente de la reactividad en el experimento de control (sin compuesto agregado) . Es innecesario decir, que se puede confirmar que un anticuerpo "no reacciona sustancialmente" con un compuesto por un método bien conocido por los expertos en la técnica, además del método de SPR.

Un anticuerpo de la presente invención puede reconocer toda la molécula de insulina o una porción como un antigeno.

Un anticuerpo monoclonal (anticuerpo 66221) producido por un hibridoma (FERM BP-11233) específicamente puede ser citado como el "primer anticuerpo monoclonal" y otro anticuerpo monoclonal (anticuerpo 66226) producido por un hibridoma (FERM BP-11234) puede ser citado como el "segundo anticuerpo monoclonal".

Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir fácilmente mediante disolución de la insulina como un antígeno (inmunógeno) en solvente, tal como solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y la administración de esta solución para inmunizar a un animal. La inmunización se puede realizar utilizando una emulsión después de agregar un adyuvante adecuado a la solución según sea necesario. El adyuvante puede ser un adyuvante ampliamente utilizado, tal como emulsión agua en aceite, emulsión agua en aceite en agua, emulsión áceite en agua, liposoma, o gel de hidróxido de aluminio, asi como una proteina o sustancia peptidica derivada de componentes biogénicos. Por ejemplo, adyuvante incompleto o completo de Freund se puede utilizar de forma preferida. Aunque no se limita particularmente, se desea que la ruta de administración, la dosis administrada y el tiempo de administración del adyuvante se seleccionen adecuadamente de tal manera que una respuesta inmunitaria deseada se pueda mejorar en un animal que va a ser inmunizado con el antigeno .

Aunque la elección del animal utilizado para la inmunización no se limita particularmente, es preferible un mamífero y puede ser un ratón, rata, bovino, conejo, cabra y oveja, aunque un ratón es más preferido. Los animales pueden ser inmunizados de acuerdo con una técnica común, por ejemplo, la inmunización puede lograrse por vía subcutánea, intracutánea, intravenosa o inyección por vía intraperitoneal , inyectando al animal con una solución de un antígeno, de preferencia una. mezcla con el adyuvante. Ya que una respuesta inmunitaria generalmente es diferente dependiendo del tipo y la cepa de un animal que se va a inmunizar, es conveniente que el calendario de inmunización se establezca correctamente en función del animal a ser utilizado. De preferencia, la administración del antigeno se repite varias veces después de la inmunización inicial.

Un método de producción de un anticuerpo monoclonal mismo se puede llevar a cabo de conformidad con un método descrito, por ejemplo, en Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las siguientes operaciones se realizan posteriormente a la adquisición de un anticuerpo monoclonal, pero estas operaciones no son limitaciones.

Después de la inmunización final., el hibridoma se puede producir mediante la extracción de las células del bazo o del nodo linfático, que son células productoras de anticuerpos, de un animal inmunizado y mediante la fusión de estas células con células de mieloma proliferativo . Se prefiere que las células tengan alta capacidad productora (cuantitativa y cualitativa) de anticuerpos se utilicen para la fusión de células y que las células de mieloma sean compatibles con el animal del que se deriven las células productoras de anticuerpos a fusionar. La fusión celular puede ser realizada de acuerdo con un método conocido en la técnica y se puede emplear un método de polietilenglicol, un método que utilice el virus de Sendai, o un método que utilice corriente eléctrica. El hibridoma adquirido puede ser proliferado, de acuerdo con un método conocido y el hibridoma deseado puede ser seleccionado mientras se identifique la propiedad del anticuerpo producido. El hibridoma puede ser clonado mediante un método conocido tal como un método de dilución limitante o agar blando.

Se describirá la selección del hibridoma que produce el primer anticuerpo monoclonal.

El hibridoma se puede seleccionar eficientemente en la etapa de selección, teniendo en cuenta las condiciones en las que el anticuerpo producido se utiliza realmente en el ensayo. Por ejemplo, el hibridoma se puede adquirir mediante la selección de un hibridoma que produce un anticuerpo reactivo con insulina a través de ELISA o RIA. En particular, en primer lugar, el ELISA de antigeno en fase sólida, la reacción de un anticuerpo monoclonal en el sobrenadante de cultivo con insulina en fase sólida y posteriormente la reacción de anticuerpos anti-IgG marcados con insulina en fase sólida, se utiliza para seleccionar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que es altamente reactivo con insulina.

Un anticuerpo monoclonal que tiene una propiedad deseada puede ser producido mediante el cultivo masivo del hibridoma seleccionado de esta manera. Un método de cultivo 1 masivo no estᦠlimitado particularmente y puede incluir, por ejemplo, un método para producir el anticuerpo monoclonal en medios de cultivo mediante el cultivo del hibridoma. en medios de cultivo adecuados y un método para producir el anticuerpo en la hidropesía abdominal mediante la inyección del hibridoma en la cavidad abdominal de un mamífero para la proliferación. El anticuerpo monoclonal puede ser purificado mediante la combinación adecuada de cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de afinidad, el método de fraccionamiento de sulfato de amonio, el método de fraccionamiento de PEG y el método de f accionamiento de etanol.

El hibridoma que produce el segundo anticuerpo monoclonal se puede seleccionar mediante la combinación adecuada de los siguientes métodos: un método de selección que utiliza insulina unida al primer anticuerpo monoclonal en lugar de la insulina en fase sólida utilizada en caso de selección del hibridoma que produce el primer anticuerpo monoclonal (un método en el cual la insulina se une al primer anticuerpo monoclonal en fase sólida para observar la formación de emparedado con un candidato del segundo anticuerpo monoclonal) , un método de selección en el que el candidato del segundo anticuerpo monoclonal está en fase sólida para observar la reactividad con un complejo de insulina-anticuerpo formado mediante la incubación del primer anticuerpo monoclonal e insulina, por anticipado, o un método en el que los anticuerpos que no presentan reactividad con la insulina se seleccionan usando Biacore (marca registrada) T100 para su identificación.

Los anticuerpos relacionados con la presente invención pueden ser moléculas de anticuerp'os completos, asi como fragmentos funcionales que tienen actividad de reacción de antigeno-anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser los adquiridos mediante la inmunización de animales, mediante una técnica de recombinación de genes, o anticuerpos quiméricos. Los fragmentos funcionales de anticuerpos incluyen F(ab')2 y Fab' y estos fragmentos funcionales pueden ser producidos mediante el procesamiento de los anticuerpos adquiridos como se describe anteriormente con una enzima proteolitica (por ejemplo, pepsina o papaina) .

Uno o ambos del primero y segundo anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden ser inmovilizados en un portador insoluble o marcados con un material de marcación bien conocido y utilizado comúnmente, que describiremos más adelante. Podemos referirnos a ellos como "anticuerpos inmovilizados (en fase sólida)" y anticuerpos marcados, respectivamente. Tales anticuerpos inmovilizados o marcados están incluidos en el alcance de la presente invención. Por ejemplo, un anticuerpo 1 inmovilizado puede ser producido al causar que un portador insoluble adsorba físicamente o se una químicamente a un anticuerpo monoclonal (un espaciador adecuado puede existir entre ellos) . El portador insoluble puede ser elaborado de un material de base polimérica, tal como una resina de poliestireno, un material de base inorgánica tal como el vidrio y un material de base polisacárida tal como la celulosa y agarosa y la forma no está limitada particularmente y se puede seleccionar arbitrariamente. Por ejemplo, el portador insoluble puede ser en forma de una placa (por ejemplo, microplaca y membrana), esferas, partículas (por ejemplo, partículas de látex y partículas de oro coloidal) , o un cilindro (por ejemplo, tubo de ensayo) .

La cantidad de insulina en una muestra se puede determinar utilizando un anticuerpo marcado, tal como una proteína marcada A o G, que puede enlazarse al segundo anticuerpo monoclonal de la presente invención. Materiales de marcación para los anticuerpos incluyen enzimas, materiales fluorescentes, materiales quimioluminiscentes, biotina, avidina, radioisótopos, las partículas de oro coloidal y látex de color. Los materiales de marcación se pueden unir a los anticuerpos por métodos convencionales, tales como glutaraldehído, maleimida, disulfuro de piridilo, o método de ácido periódico. Sin embargo, los tipos de anticuerpos inmovilizados o marcados y los métodos de producción no se limitan a los descritos anteriormente. Por ejemplo, cuando una enzima como la peroxidasa o fosfatasa alcalina se utiliza como un material de marcación, la actividad enzimática se puede analizar usando un sustrato especifico de la enzima, por ejemplo, o-fenilendiamina (OPD) o 3, 3' , 5, 5' -tetrametilbencidina para la peroxidasa de rábano (HRP) y fosfato de p-nitrofenilo para ALP. Cuando la biotina se utiliza como el material de marcación, normalmente se utiliza en la reacción por lo menos avidina o avidina modificada con enzima.

En esta descripción, un "portador insoluble" puede ser representado como una "fase sólida" y soporte física o químicamente de un antígeno o anticuerpo con un portador insoluble o el estado de soporte puede ser representado como "inmovilización", "inmovilizado", "fase sólida", "sensibilización", o "adsorción ". El término "detección" o "medición" debe interpretarse en el sentido más amplio, incluyendo la prueba de la existencia y/o cuantificación de la insulina.

Las "muestras", que contienen el analito a detectar en un ensayo utilizando los anticuerpos de la presente invención, pueden ser principalmente fluidos corporales derivados de un cuerpo vivo (organismo) . Los fluidos corporales específicamente pueden incluir, sin restricción, la .sangre (sangre completa), suero, plasma, orina, saliva, flema, extracto de páncreas, fluido lagrimal, otorrea y fluido prostético.

La forma de un reactivo de ensayo (kit) proporcionado por la presente invención no se ve particularmente limitada, siempre y cuando el reactivo sea capaz de analizar la insulina. Los inmunoensayos de marcación, representativos, es decir, ELISA e inraunocromatografia y un inmunoensayo de aglutinación de partículas, representativo, es decir, el ensayo de inmunoaglutinación de látex (LITA) , más adelante se considerarán como ejemplos y se describirán.

Inmunoensayo ligado a marcación: ELISA La forma del reactivo de ensayo (kit) para detectar la insulina presente en una muestra puede incluir los siguientes elementos: (a) una fase sólida (tal como una placa) con el primer anticuerpo monoclonal inmovilizado, y (b) el segundo anticuerpo monoclonal marcado con un material de marcación.

La fase sólida (tal como una placa) con el primer anticuerpo monoclonal inmovilizado captura la insulina en una muestra para formar un complejo de insulina-anticuerpo. El segundo anticuerpo monoclonal marcado con el material de marcación reacciona con el complejo de insulina-anticuerpo para formar un emparedado y la insulina en la muestra se puede analizar a través de la medición de una cantidad del material de marcación por un método adecuado para el material de marcación. Con respecto a métodos específicos para configurar el reactivo de ensayo (kit) , 'tal como un método para inmovilizar el primer anticuerpo monoclonal a la fase sólida y un método para marcar el segundo anticuerpo monoclonal con el material de marcación, se pueden utilizar sin limitación técnicas bien conocidas, además de las descritas aquí. Aunque esta configuración se puede formar como un sistema de ensayo homogéneo, se prefiere que la configuración se forme como un sistema de ensayo heterogéneo.

El aspecto [19] se puede recomendar como una forma particularmente preferida (el reactivo de ensayo de insulina de cualquiera de los aspectos [13], [15], [16] y [17], en donde el primer anticuerpo monoclonal se inmoviliza a una fase sólida, el segundo anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación y la insulina se analiza mediante ELISA) .

Teniendo en cuenta la sensibilidad y la especificidad del reactivo de ensayo, la configuración inversa de lo anterior se puede emplear de la siguiente manera: (a) el primer anticuerpo monoclonal marcado con un material de marcación, y (b) una fase sólida (tal como una placa) con el segundo anticuerpo monoclonal inmovilizado.

En el caso de esta configuración, la muestra de prueba se mezcla de preferencia con una solución que contiene el primer anticuerpo monoclonal marcado con un material de marcación para formar el complejo insulina-anticuerpo en la solución por anticipado, y el complejo de insulina-anticuerpo se agrega a la fase sólida con el segundo anticuerpo monoclonal inmovilizado. En esta configuración, con el objetivo de mejorar la sensibilidad, se pueden utilizar dos o más anticuerpos monoclonales que tengan diferentes sitios de reconocimiento de una manera preferida como el primer anticuerpo monoclonal marcado con un material de marcación, es decir, el aspecto [15] (el reactivo de ensayo de insulina del aspecto [13]·, en donde el primer anticuerpo monoclonal consiste de dos o más anticuerpos monoclonales que tienen diferentes sitios de reconocimiento) .

El aspecto [20] se puede recomendar como una forma particularmente preferida (el reactivo de ensayo de insulina de cualquiera de los aspectos [13], [15], [16] y [17], en donde el primer anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación, el segundo anticuerpo monoclonal se inmoviliza a una fase sólida y la insulina se analiza mediante ELISA) .

Inmunoensayo ligado a marcación: Inmunocromatografía La inmunocromatografia típica se configura de tal manera que en orden de distancia desde el borde en la dirección longitudinal sobre un soporte en fase sólida en forma de hoja, tal como una membrana, una solución de muestra de prueba se mueve continuamente debido a la capilaridad (fenómeno de capilaridad) a través de: "1. un sitio de carga de la muestra", "2. un sitio de reactivo marcado que retiene, de una manera dispersa en la membrana, un reactivo marcado que contiene el primer anticuerpo monoclonal (el primer anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación, como partículas de oro coloidal)", y "3. un sitio de reactivo de captura con el segundo anticuerpo monoclonal inmovilizado para capturar el complejo del primer anticuerpo monoclonal marcado con el material de marcación e insulina".

En particular, cuando una cantidad predeterminada de una muestra de prueba que contiene insulina se agrega al sitio de carga de la muestra, la muestra se infiltra en el sitio del reactivo marcado en el curso de la dispersión y se mueve en el soporte de fase sólida y la insulina se une al reactivo marcado (que contiene el primer anticuerpo monoclonal) para formar un complejo de reactivo marcado-insulina (un complejo de insulina-reactivo marcado) . El complejo de reactivo marcado-insulina continúa dispersándose y en movimiento sobre la membrana, y cuando se infiltra en el sitio del reactivo de captura en la membrana, que contiene él segundo anticuerpo monoclonal, el complejo es capturado por el reactivo de captura inmovilizado en el soporte en fase sólida para formar un complejo de reactivo de captura (segundo anticuerpo monoclonal) -insulina-reactivo marcado (primer anticuerpo monoclonal) en el sitio. La presencia del analito se puede determinar mediante la detección del reactivo marcado por un método de su elección, por ejemplo, detectar la aparición de aglutinación (aglutinación imagen/foto) en el caso de partículas visibles de oro coloidal y detectar la reacción cromogénica a causa de la adición de un sustrato en el caso de enzima.

Aunque existen descripciones separadas para "1. el sitio de carga de la muestra" y "2. un sitio de reactivo marcado que retiene, de una manera dispersa en la membrana, un reactivo marcado que contiene el primer anticuerpo monoclonal (el primer anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación, como partículas de oro coloidal)" en el orden de la dirección del movimiento de la muestra de prueba para facilitar la comprensión, los expertos en la materia obviamente pueden entender que se pueden emplear formas/configuraciones muy conocidas, tales como una estructura apilada en el orden de "1" y "2" desde la parte superior .

En inmunocromatografia, un complejo de insulina-anticuerpo se forma en el momento del paso de la muestra a través de "2. un sitio de reactivo marcado que retiene, de una manera dispersa en la membrana, un reactivo marcado que contiene el primer anticuerpo monoclonal (el primer anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación, como partículas de oro coloidal) " y por lo tanto, con el fin de mejorar la sensibilidad, como en el caso de ELISA, se pueden utilizar dos o más anticuerpos monoclonales que tienen diferentes sitios de reconocimiento de una manera preferida como el primer anticuerpo monoclonal marcado con el material de marcación, es decir, el aspecto [15] (el reactivo de ensayo de insulina del aspecto [13], en donde el primer anticuerpo monoclonal consiste de dos o más anticuerpos monoclonales que tienen diferentes sitios de reconocimiento) .

El aspecto [20] se puede recomendar para una forma particularmente preferida (el reactivo de ensayo de insulina de cualquiera de los aspectos [13], [15], [16] y [17], en donde el primer anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación, el segundo anticuerpo monoclonal se inmoviliza a una fase sólida y la insulina se analiza por inmunocromatografia) .

Inmunoensayo turbidimétrico : LTIA Cuatro modalidades, A a D, de un reactivo de ensayo (kit) para la detección de la insulina presente en una muestra pueden comprender lo siguiente: A. (a) partículas de látex con el primer anticuerpo monoclonal inmovilizado y (b) partículas de látex con el segundo anticuerpo monoclonal inmovilizado; B. (a) partículas de látex con el primer anticuerpo monoclonal inmovilizado y (b) el segundo anticuerpo monoclonal; C. (a) el primer anticuerpo monoclonal y (b) partículas de látex con el segundo anticuerpo monoclonal inmovilizado; y D. (a) partículas de látex tanto con el primero como con el segundo anticuerpos monoclonales inmovilizados.

Estos reactivos de ensayo (kits) se pueden utilizar en LTIA de una manera preferida. Las partículas de látex utilizadas en los puntos A al D se pueden seleccionar correctamente en términos del diámetro de partícula y el tipo con el fin de adquirir la capacidad deseada, tal como una mayor sensibilidad. Las partículas de látex pueden ser las adecuadas para portar un antígeno o anticuerpo. Por ejemplo, las partículas de látex pueden ser de poliestireno, copolímero de ácido estiren-sulfónico (sulfonato) , copolímero de ácido estiren-metacrílico, copolímero de acrilonitrilo-butadieno-estireno, copolímero de cloruro de vinilo-éster acrílico, o copolímero de acetato de vinilo-éster del ácido acrílico. Aunque la forma de las partículas de látex no está particularmente limitada, es preferible que un diámetro promedio de partícula se defina de tal manera que el agregado producido, como resultado de la reacción de aglutinación entre el anticuerpo (o antígeno) en la superficie de las partículas de látex y el analito, tenga un tamaño suficiente para ser detectado visiblemente u ópticamente. El diámetro promedio de partícula es de preferencia de 0.02 a 1.6 mieras y, en particular desde 0.03 hasta 0.5 mieras. Las partículas hechas de coloide metálico, gelatina, liposoma, microcápsula, sílice, alúmina, negro de carbono, compuesto metálico, metal, cerámica o material magnético, se pueden utilizar en lugar de las partículas de látex.

Por ejemplo, el reactivo de LTIA utilizado en los exámenes clínicos se proporciona .usualmente en la forma de la primera y segunda soluciones de reactivos, que se mezclan secuencialmente con la muestra en uso. Uno o ambos (a) y (b) en cada una de las formas A a la D se puede incluir en la primera o segunda solución del reactivo. Los métodos de inclusión de (a) y (b) se pueden seleccionar adecuadamente en función de los datos del dispositivo de medición para el examen clínico y el diseño del reactivo del ensayo (como, capacidad y facilidad de uso) . Aunque, de preferencia, tanto (a) como (b) de la forma A se incluyen en el segundo reactivo, ' (a) y (b) de la forma A también pueden incluirse en el primero y segundo reactivos, respectivamente, de una manera preferida.

El aspecto [18] se puede recomendar como una forma particularmente preferida (el reactivo de ensayo de insulina de cualquiera de los aspectos [13], [15], [16] y [17], en donde el primero y el segundo anticuerpos monoclonales se inmovilizan al látex y la insulina se analiza mediante un ensayo de inmunoaglutinación de látex) .

Aunque las modalidades de la presente invención han sido descritas por considerar el aspecto [3], que es una forma representativa de la presente invención, como un ejemplo, los expertos en la técnica obviamente pueden entender que la presente invención se puede implementar en diversas formas, por ejemplo, utilizando un anticuerpo policlonal para el primer anticuerpo, como en el aspecto [4] y dos o más anticuerpos monoclonales que tengan diferentes sitios de reconocimiento para el primer anticuerpo, 'como en el aspecto [5], a condición de que se utilice un anticuerpo para el "complejo de insulina- anticuerpo".

Aunque la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos, la presente invención no se limita a estos ejemplos.

EJEMPLOS Primer Ejemplo de Prueba. Método de Producción de Anticuerpo Monoclonal de la Presente Invención 1. Preparación de Antigeno Inmunizante Después de que la insulina humana (Fitzgerald Industries International, 30-AI51) se mezcló 1:1 con adyuvante completo de Freund ( ako Puré Chemical Industries, Ltd.), se utilizaron jeringas conectadas para producir la emulsión que se utilizaría como el antígeno inmunizante . 2. Producción de Hibridoma El antígeno inmunizante se inyectó subcutáneamente en las regiones dorsales de ratones BALB/c hembras (de 20 a 50 µg por ratón) . La inmunización se repitió dos veces por semana. Después de tres semanas desde el inicio de la inmunización, se extrajo el bazo de un ratón que tenía un título alto de anticuerpos en la muestra de sangre, y la fusión celular se realizó mediante un procedimiento de rutina utilizando 50% de PEG 1450 (Sigma) .

Se utilizaron células de mieloma SP2/0. Las células fusionadas adquiridas se suspendieron a 2.5 x 106/ml (como las células del bazo) en medio P I 1640 que contenia HAT, 15% de suero bovino fetal y 10% de BM-Suplemento de Clonación de Hibridoma Condimed Hl (Roche Diagnostics K.K.) se distribuyeron en una placa de cultivo de 96 pozos en alícuotas de 0.2 mi. Las células fusionadas se cultivaron a 37 °C en un incubador con CO¿ al 5%. 3. Selección de Hibridoma que Produce el Primer Anticuerpo Monoclonal Después de siete días a partir de la fusión celular, se utilizó el sobrenadante de cultivo para la realización del ELISA con antígeno en fase sólida, descrito más adelante como selección primaria para seleccionar los pozos que presenten una alta reactividad a la insulina como pozos positivos primarios. Las células en los pozos positivos primarios se pasaron en serie en una placa de 24 pozos. Después de dos días de cultivo en serie, se utilizó el sobrenadante de cultivo para realizar el ELISA competitivo descrito más adelante como una selección secundaria para seleccionar los pozos que presenten una alta reactividad a la insulina como pozos positivos secundarios. 3-1. Producción de la Placa de ELISA con Antígeno en Fase Sólida La insulina preparada en una concentración de 1 g/ml con PBS 10 mM (pH 7.2) que contenia cloruro de sodio 150 mM estaba en fase sólida como un antigeno de selección en una placa de 96 pozos a 50 µ?/???? y se dejó reposar toda la noche a 4°C. Después de lavar tres veces con 400 µ?/???? de solución de PBS que contenia 0.05% de Tween (marca registrada) 20 y 0.1% de ProClin 300 (Supelco; PBST) , se distribuyó PBST que contenia 1% de BSA (BSA-PBST) en 100 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente para bloquear con el fin de producir una placa de ELISA. La placa de ELISA se lavó tres veces con PBST y se utilizó para las pruebas de ELISA descritas en los ejemplos mediante la adición de reactivos. 3-2. ELISA con Antigeno en fase sólida (i) Antisuero de ratón o sobrenadante de cultivo de las células fusionadas diluidas gradualmente con BSA-PBST se distribuyó en una placa de ELISA con antigeno en fase sólida a 50 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente. (ii) Después de lavar tres veces con PBST, una solución de HRP-Gt F(ab')2 Igs de Anti-Ratón (BioSource, AMI4404) diluido 5000 veces con BSA-PBST se distribuyó a 50 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente. (iii) Después de lavar tres veces con PBST, se disolvió OPD (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) a 2 mg/ml en solución amortiguadora de citrato 0.2 M que contenia 0.02% de peróxido de hidrógeno/agua (en lo sucesivo, la solución de disolución de sustrato) , se agregó a 50 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente. (iv) Además, se agregó ácido sulfúrico 1.5 N que contenia EDTA 1 mM (en lo sucesivo, liquido de detención de la reacción) a 50 µ?/???? y la absorbancia se midió a una longitud de onda de 492 nm utilizando Titertek (marca registrada) Multiskan Plus MK II (Flow Laboratories Inc) . 3-3. ELISA competitivo (i) Soluciones de insulina humana (Fitzgerald Industries International, 30-AI51) diluidas en BSA-PBST en 0, 2.5, 5 y 10 g/ml se distribuyeron en una placa de ELISA con antigeno en fase sólida a 25 µ?/????. (ii) El sobrenadante de cultivo de las células fusionadas diluido a 5 y 25 veces con BSA-PBST o una solución sin diluir del mismo después se distribuyó a 25 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente. (iii) Las operaciones posteriores se realizaron en la misma forma que los pasos (ii) a (iv) de "3-2. ELISA con Antigeno en Fase Sólida" descrito anteriormente. 4. Selección de Hibridoma que Produce el segundo Anticuerpo Monoclonal Después de siete días a partir de la fusión celular, el sobrenadante de cultivo se utilizó para realizar ELISA en emparedado, descrito más adelante para seleccionar los pozos que presentaron una alta reactividad a la insulina unida al primer anticuerpo monoclona'l F(ab')2 recolectado por anticipado mediante la clonación y la recolección de anticuerpo monoclonal que se describen más adelante. 4-1. ELISA en emparedado (i) El primer anticuerpo monoclonal (en este caso, anticuerpo 66221) se trató para preparar F(ab')2 utilizando el Equipo de Preparación de F(ab')2 Immuno Puré (marca registrada) (Pierce, producto # 44888). (ii) El primer anticuerpo monoclonal F(ab')2 preparado a una concentración de 2 ug/ml con solución de PBS se puso en fase sólida en una placa de 96 pozos a 50 µ?/???? y se dejó reposar toda la noche a 4°C . Después de lavar tres veces con 400 µ?/???? de PBST, se distribuyó BSA-PBST a 100 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente para bloquear con el fin de producir una placa de ELISA. (iii) Solución de insulina humana (Fitzgerald Industries International, 30-AI51) diluida en BSA-PBST a 0.5 µ?/p?? se distribuyó en la placa de ELISA a 50 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente. (iv) Después de lavar tres veces con PBST, el sobrenadante de cultivo de las células fusionadas diluidas gradualmente con BSA-PBST se distribuyó a 50 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente. (v) Después de lavar tres veces con PBST, una solución de IgG-Fc HRP-Gt-Anti-Ratón (Bethyl Laboratories, A90-131P) diluida 10000 veces con BSA-PBST se distribuyó a 50 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente. (vi) Después de lavar tres veces con PBST, se disolvió OPD (Tokyo Chemical Industry) en 2 mg/ml en la solución de disolución de sustrato, se agregó a 50 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente. (vii) Se agregó liquido para detener la reacción a 50 µ?/???? y la absorbancia se midió a 492 nm utilizando Titertek (marca registrada) Multiskan Plus MK II (Flow Laboratories) . 5. Clonación y Recolección de Anticuerpo Monoclonal Hibridomas seleccionados mediante la selección de los puntos 3. y 4. descritos anteriormente se clonaron por un método de dilución limitante para adquirir hibridomas 66221 y 66226 , respectivamente. Para recolectar los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas, los hibridomas se administraron intraperitonealmente, en una cantidad correspondiente a 0 . 5 ? 106 células, a un ratón BALB/c hembra de 12 semanas de edad inyectado intraperitonealmente con 0 . 5 mi de pristano dos semanas antes. Las ascitis se recolectaron después de 14 días y los sobrenadantes se adquirieron mediante centrifugación. Los sobrenadantes se mezclaron con la misma cantidad de solución amortiguadora de adsorción ( 3 mol/L de NaCl, 1 . 5 mol/L de solución amortiguadora de glicina-NaOH, pH 8 . 5 ) y luego se filtraron. Los filtrados se pasaron a través de una columna de proteína A-sefarosa equilibrada con solución amortiguadora de adsorción para adsorber los anticuerpos en los filtrados utilizando la columna, y los anticuerpos se eluyeron con 0 . 1 mol/L de solución amortiguadora de citrato (pH 3 . 0 ) . Después de neutralizar el eluido con 1 mol/L de solución amortiguadora de Tris-HCl (pH 8 . 0 ) , la diálisis se realizó con PBS para recolectar los anticuerpos.

Los anticuerpos, conocidos como el anticuerpo 66221 y anticuerpo 66226 , se utilizaron posteriormente en las pruebas.

Los hibridomas productores del anticuerpo 66221 y anticuerpo 66226 se depositaron en el Organismo Internacional de Patentes Depositario, el Instituto Nacional de Ciencia. Industrial Avanzada y Tecnología (Dirección: Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón) el 8 de abril de 2009 bajo los números de acceso FERM P-21800 y FERM P-21801, respectivamente. Posteriormente, fueron transferidos al Tratado de Budapest el 17 de febrero de 2010, con base en el depósito original, bajo los números de acceso FERM BP-11233 y FERM BP-11234, respectivamente .

Segundo Ejemplo de Prueba - Reactividad Cruzada del Anticuerpo Monoclonal de la Presente Invención con Proinsulina y análogos de Insulina Se realizó una prueba utilizando Biacore (marca registrada) T100 para reactividad cruzada del anticuerpo 66221 y el anticuerpo 66226 con proinsulina y análogos de insulina. Para los análogos de insulina, se utilizaron las formulaciones análogas de insulina tales como la insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina e insulina detemir. 1. Reactivos e Instrumentos 1-1. Anticuerpos Monoclonales (i) Anticuerpo 66221: 2.30 mg/ml (ii) Anticuerpo 66226: 3.99 mg/ml 1-2. Analitos (i) Insulina humana recombinante : Fitzgerald Industries International, 30 AI51 (ii) Proinsulina: proinsulina IRR, .Humana, para Inmunoensayo; código NIBSC: 84/611 (iii) Formulaciones análogas de insulina (1) Insulina lispro, 100 unidades/ml: Eli Lilly Japan K.K. (2) Insulina aspart, 100 unidades/ml': Novo Nordisk Pharma Ltd. (3) Insulina glargina, 100 unidades/ml: Sanofi-Aventis K.K. (4) Insulina detemir, 100 unidades/ml: Novo Nordisk Pharma Ltd. 1-3. Dispositivos Biacore (marca registrada) y un conjunto de reactivos dedicados (Biacore: en la actualidad, GE Healthcare; aunque los incisos (i) a (viii) descritos a continuación son productos y números de catálogo de la entonces Biacore, estos están disponibles actualmente de GE Healthcare . ) (i) Biacore (marca registrada) T100: Biacore, JJ- 1037-02 (ii) Chip Sensor Serie S CM5: Biacore, BR-1005-30 (iii) Equipo de Acoplamiento de Amina: Biacore, BR-1000-50 (iv) Acetato 5.0: Biacore, BR-1003/51 (v) Inmunoglobulinas a de ratón: Biacore, BR- 1005-14 (vi) Glicina 1.5: Biacore, BR-1003-54 (vii) Glicina 2.0: Biacore, BR-1003-55 (viii) HBS-EP + 10* (Amortiguador de Corrida) : Biacore, BR-1006-69 (preparado a pH 8.5 con NaOH y diluido 10 veces con agua purificada para el uso) 2. Método de Prueba El anticuerpo 66221 o el anticuerpo 66226 se capturaron por las inraunoglobulinas OÍ de ratón inmovilizadas en un chip sensor y se agregaron insulina, proinsulina y varias formulaciones análogas de insulina como analitos para evaluar la reactividad con ella. El procedimiento operacional especifico utilizado es como sigue. (i) Inmunoglobulinas a de ratón se inmovilizaron en Chip Sensor CM5 (de acuerdo con el manual de instrucciones anexo) . (ii) El anticuerpo 66221 o el anticuerpo 66226 se diluyeron con HBS-EP + (pH 8.5) a 5 g/ml y se agregaron a una velocidad de flujo de 30 µ?/min durante 300 segundos. (iii) Varios antigenos se diluyeron con HBS-EP+ (pH 8.5) a 10 ng/ml y se agregaron en dos concentraciones de 0 y 10 ng/ml durante 120 segundos cada uno. En este caso se estableció un tiempo para la disociación de corrida libre de 120 segundos. (iv) Glicina 1.5 y Glicina 2.0 se mezclaron 1:1 para formar una solución de regeneración, y se realizó tratamiento de regeneración durante 180 segundos. 3. Resultados 3-1. Resultados de la Reacción con Insulina Para el anticuerpo 66221 y el anticuerpo 66226, la reactividad con insulina se comprobó utilizando Biacore (marca registrada) T100. Los resultados se representan en las Figuras 2 y 3. El anticuerpo 66221 mostró una reactividad de 8.5 RU en una concentración de insulina de 10 ng/ml (Figura 2). En contraste, no se detectó reactividad para el anticuerpo 66226 (Figura 3) . El eje vertical (RU) indica una unidad única para el sistema de ensayo Biacore (marca registrada) y representa un cambio de masa debido a la reacción en la superficie del sensor. 3-2. Resultados de la Reacción con Proinsulina y Formulaciones Análogas de Insulina Para el anticuerpo 66221 y el anticuerpo 66226, la reactividad con proinsulina o varias formulaciones análogas de insulina (insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina e insulina detemir) se comprobó mediante Biacore (marca registrada) T100. El resultado se muestra en las Figuras 4-1, 4-2, 5-1 y 5-2. En cada caso, a una concentración de antígeno de 10 ng/ml se- detectaron respuestas de 5.5 a 13 RU para el anticuerpo 66221. En contraste, no se detectó reactividad para el anticuerpo 66226.

Ejemplo 1 - Ensayo' de Insulina Usando Combinación de Anticuerpos Monoclonales de la Presente Invención 1 1. Producción de Partículas de Látex Un recipiente de reacción de vidrio (capacidad: 2 litros) equipado con una máquina agitadora, condensador de reflujo, dispositivo de detección térmica, tubo de introducción de nitrógeno y forro se llenó con 1100 g de agua destilada, 200 g de estireno, 0.2 g de estiren-sulfonato de sodio y solución acuosa de 1.5 g de peroxodisulfato de potasio disuelto en 50 g de agua destilada y después el interior del recipiente se sustituyó con gas nitrógeno, la polimerización se llevó a cabo durante 48 horas mientras se agitaba a 70°C.

Después del final de la polimerización, la solución se filtró con un papel filtro para extraer partículas de látex. Un aparato de microscopio electrónico de transmisión (JEOL Ltd., modelo "JEM-1010") se utilizó para obtener imágenes de las partículas de látex con un aumento de 10000 veces y diámetros de análisis de al menos 100 partículas de látex adquiridas para determinar el diámetro promedio de partícula. El diámetro promedio de partícula obtenido fue de 0.3 pm . 2. Preparación de las Partículas de Látex Sensibilizadas con Anticuerpos Antiinsulina 2-1. Producción de Solución de Partículas de Látex Sensibilizadas con Anticuerpo 66221 A la solución de látex al 1.0% que tenía un diámetro promedio de partícula de 0.3 µ?? [en solución amortiguadora de Tris 5 mM (en lo sucesivo, Tris-HCl) , pH 8.5], se agregó solución de anticuerpo 66221, diluida hasta 0.60 mg/ml con el mismo volumen de Tris-HCl¦ 5 mM (pH 8.5), se agitó a 4°C durante dos horas. Posteriormente se agregó el mismo volumen de Tris-HCl 5 mM (pH 8.5) que contenía 0.5% de BSA y se agitó a 4°C durante una hora. Después, la solución se centrifugó y el sobrenadante se retiró, el precipitado se resuspendió en Tris-HCl 5 mM (pH 8.5) para producir una solución de partículas de látex sensibilizadas con anticuerpo 66221. 2-2. Producción de Solución de Partículas de Látex Sensibilizadas con Anticuerpo 66226 El látex que tenía un diámetro promedio de partícula de 0.3 mieras se utilizó para producir una solución de partículas de látex sensibilizadas con anticuerpo 66226 de la misma manera que el punto anterior. 3. Preparación de Reactivos 3-1. Preparación del Primer Reactivo Tris-HCl cinco (5) milimolar (pH 8.5) que contenia 500 mM de cloruro de sodio y 0.2% de BSA se utilizó como el primer reactivo. 3-2. Preparación del Segundo Reactivo Los mismos volúmenes de las soluciones de partículas de látex sensibilizadas con anticuerpo 66221 y anticuerpo 66226 se mezclaron y se diluyeron con Tris-HCl 5 mM (pH 8.5) de forma que la absorbancia de 5.0 Abs se logró en una longitud de onda de 600 nm para preparar el segundo reactivo. 4. Ensayo El primer y segundo reactivos se combinaron y la formación dependiente de la concentración de insulina de agregado de partículas se identificó utilizando un Analizador Automático Hitachi 7170. En particular, 150 µ? del primer reactivo se agregó a 10 µ? de soluciones de insulina en concentraciones de 0, 5, 25, 50, 100 y 200 yU/ml y se calentó a 37°C durante 5 minutos. Posteriormente, se agregó 50 µ? del segundo reactivo, seguido de agitación. Después de cinco minutos, se midieron los cambios en la absorbencia, asociados con la formación de aglutinación a 570 nm y sublongitud de onda de 800 nm.

Tabla 1 5. Resultado del Ensayo La Tabla 1 muestra que la sensibilidad se incrementa en función de la concentración de insulina y que puede ser cuantificada .

Ejemplo 2 Ensayo de Insulina Usando Combinación de Anticuerpos Monoclonales de la Presente Invención 2 O bien el anticuerpo 66221 o el anticuerpo 66226 se puso en fase sólida y el resto se utilizó como un anticuerpo secundario para probar la reactividad con proinsulina y análogos de insulina mediante ELISA. 1. Anticuerpos y Antigenos Usados (1) Anticuerpos Monoclonales Anticuerpo 66221: 2.30 mg/ml Anticuerpo 66226: 3.99 mg/ml (2) Antigenos La insulina, proinsulina y formulaciones análogas de insulina (insulina lispro, insulina aspart, la insulina glargina e insulina detemir) utilizadas fueron las mismas que el ejemplo de la segunda prueba. 2. Método de ELISA (i) La solución del anticuerpo 66221 o el anticuerpo 66226 diluida a 2 pg/ml con PBS se puso en fase sólida en una placa de 96 pozos a 50 µ?/???? y se dejó reposar dos horas a temperatura ambiente. (ii) Después de lavar tres veces con 400 µ?/???? de PBST, se distribuyó BSA-PBST a 100 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente para el bloqueo con el fin de producir una placa de ELISA. (iii) La solución de cada una de insulina humana, proinsulina y formulaciones análogas de insulina, diluida con BSA-PBST a 0, 1, 5 y 10 ng/ml se distribuyó en la placa de ELISA a 50 µ?/???? y se dejó reposa una hora a temperatura ambiente. (iv) Después de lavar tres veces con PBST, una solución de un anticuerpo 66226 o anticuerpo 662.21 marcado con biotina, diluida a 1 pg/ml con BSA-PBST se distribuyó a 50 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente . (v) Después de lavar tres veces con PBST, una solución de estreptavidina Immuno Puré (marca registrada) , conjugado de HRP (PIERCE, Prod # 21126) diluida 5000 veces con BSA-PBST se distribuyó a 50 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente. (vi) Después de lavar tres veces con PBST, se disolvió OPD (Tokyo Chemical Industry) en 2 mg/ml en la solución de disolución de sustrato, se agregó a 50 µ?/???? y se dejó reposar una hora a temperatura ambiente. (vii) La solución de detención de la reacción se agregó a 50 µ?/???? y la absorbencia se midió a 492 nm utilizando Titertek (marca registrada) Multiskan Plus MK II (Flow Laboratories) . 3. Resultado 3-1. Resultados del Ensayo 66221 de Placa de Anticuerpo en Fase Sólida Los resultados se presentan en la Tabla 2 y la Figura 6.

Cuando el anticuerpo 66221 se utilizó como anticuerpo primario y el anticuerpo 66226 se utilizó como anticuerpo secundario, se observó un aumento en la absorbancia dependiente de la concentración para la insulina, mientras que no se observó ningún aumento en la absorbancia dependiente de la concentración para la proinsulina y las formulaciones análogas de insulina (insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina e insulina detemir) .

Tabla 2 3-2. Resultados del Ensayo de Placa de Anticuerpo 66226 en Fase Sólida Los resultados se presentan en la Tabla 3 y la Figura 7.

Cuando el anticuerpo 66226 se utilizó como el anticuerpo primario y el anticuerpo 66221 se utilizó como el anticuerpo secundario, no se observó aumento en la absorbancia dependiente de la concentración en cualquiera de insulina, proinsulina y formulaciones análogas de insulina (insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina e insulina detemir) .

Tabla 3 4. Discusión De los resultados anteriores, se concluye que la insulina puede ser cuantificada sin la influencia de formulaciones de proinsulina y análogas de insulina, porque no se observó reactividad cruzada cuando el anticuerpo 66221 y el anticuerpo 66226 se utilizaron como el anticuerpo primario y secundario, respectivamente. La insulina no pudo ser analizada cuando el anticuerpo 66226 y el anticuerpo 66221 se utilizaron como el anticuerpo primario y secundario, respectivamente y por lo tanto, se observó que el anticuerpo .66226 no presenta reactividad con la insulina, pero reacciona con la insulina unida al anticuerpo 66221. Nótese que en el resultado de la prueba de reactividad cruzada de los anticuerpos monoclonales de la presente invención utilizando Biacore (marca registrada) T100 (el segundo ejemplo de prueba) , el anticuerpo 66221 reacciona con insulina, proinsulina y todas las formulaciones análogas de insulina, mientras que el anticuerpo 66226 no reacciona con ninguna de ellas.

Por lo tanto, como el mecanismo de reacción de este sistema de ensayo, se especula que se produce algún cambio estructural en la insulina cuando el primer anticuerpo 66221 se une a la insulina y que el anticuerpo 66226 reconoce específicamente el sitio cambiado estructuralmente para formar un emparedado.

Tercer Ejemplo de Prueba - Reactividad Cruzada de Anticuerpos Monoclonales de la Presente Invención con Análogos de Insulina La prueba se realizó utilizando Biacore (marca registrada) T100 para la reactividad cruzada del anticuerpo 66221 y el anticuerpo 66226 con análogos de insulina. Una formulación análoga de insulina, es decir, la insulina glulisina, se utilizó como el análogo de insulina. 1. Reactivos e Instrumentos 1-1. Anticuerpos Monoclonales (i) Anticuerpo 66221: 2.30 mg/ml (ii) Anticuerpo 66226: 3.99 mg/ml 1-2. Analitos Formulación Análoga de Insulina (i) Insulina glulisina, 100 unidades/ml: Sanófi-Aventis K.K. 1-3. Dispositivos Biacore (Marca Registrada) y Conjunto de Reactivos Dedicados Los dispositivos Biacore (Marca Registrada) y Conjunto de Reactivos Dedicados utilizados fueron los mismos que en el segundo ejemplo de prueba. 2. Método de Prueba La prueba se realizó en la misma forma que el segundo ejemplo de prueba, excepto que la insulina glulisina, una formulación análoga de insulina, se utilizó como un analito. 3. Resultado 3-1. Resultado de la Reacción con Formulación Análoga de Insulina Tanto para el anticuerpo 66221 como para el anticuerpo 66226, la reactividad con la formulación análoga de insulina, insulina glulisina se comprobó utilizando Biacore (marca registrada) T100. El resultado se muestra en la Figura 8. Ni el anticuerpo 66221 ni el anticuerpo 66226 mostraron reactividad. El eje vertical (RU) indica una unidad única para el sistema de ensayo Biacore (marca registrada) y representa un cambio de masa debido a la reacción en la superficie del sensor.

Ejemplo 3 - Ensayo de Insulina Usando una Combinación de Anticuerpos Monoclonales de la Presente Invención 3 0 bien el anticuerpo 66221 o el anticuerpo 66226 se puso en fase sólida, mientras que el otro anticuerpo se combinó como un anticuerpo secundario para probar la reactividad con insulina, proinsulina y un análogo de insulina mediante ELISA. 1. Anticuerpos y Tipos de Antigenos Usados (1) Anticuerpos Monoclonales Anticuerpo 66221: 2.30 mg/ml Anticuerpo 66226: 3.99 mg/ml (2) Antigenos: insulina, proinsulina y una formulación análoga de insulina (insulina glulisina) 2. Método de ELISA Se efectuó el mismo método que en el ejemplo 2, excepto que la insulina glulisina se utilizó como la formulación análoga de insulina. 3. Resultado 3-1. Resultados del Ensayo de Placa del Anticuerpo 66221 en Fase Sólida Los resultados se presentan en la Tabla 4 y la Figura 9.

Como fue el caso con el Ejemplo 2, cuando el anticuerpo 66221 se utilizó como el anticuerpo primario y el anticuerpo 66226 se utilizó como el anticuerpo secundario, se detectó un aumento en la absorbancia dependiente de la concentración para la insulina, mientras que no se detectó ningún aumento en la absorbancia dependiente de la concentración para la proinsulina y la formulación análoga de insulina (insulina glulisina) .

Tabla 4 3-2. Resultados del Ensayo de Placa Anticuerpo 66226 en Fase Sólida Los resultados se presentan en la Tabla 5 y la Figura 10.

Como fue el caso con el Ejemplo 2, cuando el anticuerpo 66226 fue el anticuerpo primario y el anticuerpo 66221 fue el anticuerpo secundario, no se detectó aumento en la absorbancia dependiente de la concentración para la insulina, proinsulina, o la formulación análoga de insulina (insulina glulisina) .

Tabla 5 4. Discusión Los resultados anteriores muestran que no se presenta reactividad cruzada con la formulación análoga de insulina, la insulina glulisina, cuando el anticuerpo 66221 y el anticuerpo 66226 se utilizaron como el anticuerpo primario y secundario, respectivamente y cuando el anticuerpo 66226 y el anticuerpo 66221 se utilizaron como el anticuerpo primario y secundario, respectivamente.

DISPONIBILIDAD INDUSTRIAL Con los anticuerpos monoclonales de la presente invención, la insulina puede ser analizada de manera sensible y especifica sin ser afectada por la proinsulina o análogos de insulina. Dado que la secreción de insulina por las células beta puede ser monitoreada con precisión por la presente invención, la presente invención también puede ser utilizada para visualizar una condición clínica de la diabetes y por lo tanto es muy útil.

NUMERO DE ACCESO (1) FERM BP-11233 (2) FERM BP-11234 [Referencia a Material Biológico Depositado] (1) El hibridoma 66221 produce el anticuerpo 66221 i) Nombre y dirección de la institución depositaría en la que se depositaron los materiales biológicos .

Organismo Internacional de Patentes Depositario, el Instituto Nacional de Ciencia Industrial Avanzada y Tecnología Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japón ii) Fecha de depósito del material biológico en la institución depositaría en el inciso i) . 8 de abril de 2009 (fecha de depósito original) 17 de febrero de 2010 (fecha de transferencia al Tratado de Budapest del depósito original iii) Número de acceso para el depósito asignado por la institución depositaría en el inciso i).

FERM BP-11233 (2) El hibridoma 66226 produce el anticuerpo 66226 i) Nombre y dirección de la institución depositaría en la que se depositaron los materiales biológicos.

Organismo Internacional de Patentes Depositario, el Instituto Nacional de Ciencia Industrial Avanzada y Tecnología, Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japón ii) Fecha de depósito del material biológico en la institución depositaría en el inciso i) . 8 de abril de 2009 (fecha de depósito original) 17 de febrero de 2010 (fecha de transferencia al Tratado de Budapest del depósito original iii) Número de acceso para el depósito asignado titución depositaría en el inciso i) . FERM BP-11234

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un ensayo de insulina usando un anticuerpo que reacciona con la insulina unida a un anticuerpo antiinsulina, pero no reacciona con la insulina no unida a un anticuerpo antiinsulina.

2. Un ensayo de' insulina según la reivindicación 1, utilizando dos tipos de anticuerpos, en donde 1) el primer anticuerpo tiene una propiedad de reaccionar con la insulina y 2) el segundo anticuerpo reacciona con la insulina unida al primer anticuerpo, pero no con la insulina no unida al primer anticuerpo.

3. Un ensayo de insulina según la reivindicación 2, en donde tanto el primero como el segundo anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

4. Un ensayo de insulina según la reivindicación 2, en donde el primer anticuerpo es un anticuerpo policlonal y el segundo anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

5. Ensayo de insulina según la reivindicación 3, en donde el primer anticuerpo monoclonal consiste de dos o más anticuerpos monoclonales que tienen diferentes sitios de reconocimiento.

6. Un ensayo de insulina según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, n donde por lo menos uno de los anticuerpos monoclonales es un anticuerpo no reactivo con proinsulina y análogos de insulina.

7. Un ensayo de insulina según cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en donde el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo no reactivo con proinsulina y análogos de insulina.

8. Un ensayo de insulina según cualquiera de las reivindicaciones 3, 5, 6 y 7, en donde el primero y el segundo anticuerpos monoclonales se inmovilizan al látex y la insulina se analiza mediante un ensayo de inmunoaglutinación de látex.

9. Un ensayo de insulina según cualquiera de las reivindicaciones 3, 5, 6 y 7, en donde el primer anticuerpo monoclonal se inmoviliza a una fase sólida, el segundo anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación y la insulina se analiza mediante ELISA.

10. Un ensayo de insulina según cualquiera de las reivindicaciones 3, 5, 6 y 7, en donde el primer anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación, el segundo anticuerpo monoclonal se inmoviliza a una fase sólida y la insulina se analiza mediante ELISA o inmunocromatografia .

11. Un reactivo de ensayo de insulina que comprende un anticuerpo que reacciona con la insulina unida a un anticuerpo antiinsulina, pero no con la insulina no unida a un anticuerpo antiinsulina.

12. Un reactivo de ensayo de insulina según la reivindicación 11, que comprende dos tipos de anticuerpos, en donde 1) un primer anticuerpo tiene una propiedad de reaccionar con la insulina y 2) un segundo anticuerpo tiene una propiedad de reaccionar con la insulina unida al primer anticuerpo, mientras que no reacciona con la insulina no unida al primer anticuerpo.

13. Un reactivo de ensayo de insulina según la reivindicación 12, en donde tanto el primero como el segundo anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

14. Un reactivo de ensayo de insulina según la reivindicación 12, en donde el primer anticuerpo es un anticuerpo policlonal y el segundo anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

15. Un reactivo de ensayo de insulina según la reivindicación 13, en donde el primer anticuerpo monoclonal consiste de dos o más anticuerpos monoclonales que tienen diferentes sitios de reconocimiento.

16. Un reactivo de ensayo de insulina según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde por lo menos un tipo de los anticuerpos monoclonales es un anticuerpo no reactivo con proinsulina y análogos de insulina .

17. Un reactivo de ensayo de insulina según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en donde el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo no reactivo con proinsulina y análogos de insulina.

18. Un reactivo de ensayo de insulina según cualquiera de las reivindicaciones 13, 15, 16 y 17, en donde el primero y el segundo anticuerpos monoclonales se inmovilizan a látex y la insulina se analiza mediante un ensayo de inmunoaglutinación de látex.

19. Un reactivo de ensayo de insulina según cualquiera de las reivindicaciones 13, 15, 16 y 17, en donde el primer anticuerpo monoclonal se inmoviliza a una fase sólida, el segundo anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación y la insulina se analiza mediante ELISA.

20. Un reactivo de ensayo de insulina según cualquiera de las reivindicaciones 13, 15, 16 y 17, en donde el primer anticuerpo monoclonal se marca con un material de marcación, el segundo anticuerpo monoclonal se inmoviliza a una fase sólida y la insulina se analiza mediante ELISA o inmunocromatografia .

21. Un anticuerpo monoclonal que tiene las siguientes propiedades: 1) no reacciona con insulina no unida a un anticuerpo antiinsulina y 2) reacciona con insulina unida a un anticuerpo antiinsulina.

22. Un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 21, que tiene además una propiedad de no reaccionar con proinsulina y .análogos de insulina.

23. Un método de selección de anticuerpos monoclonales que comprende los siguientes pasos: 1) seleccionar un anticuerpo reactivo con insulina, y 2) seleccionar un anticuerpo monoclonal reactivo con insulina unida al anticuerpo seleccionado' en el paso 1) pero no reactivo con insulina no unida al anticuerpo.