BRPI1005176B1 - ensaio de insulina e reagente de ensaio de insulina - Google Patents
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Abstract
ENSAIO DE INSULINA, REAGENTE DE ENSAIO DE INSULINA, ANTICORPO MONOCLONAL, E, MÉTODO DE TRIAR ANTICORPOS MONOCLONAIS. A presente invenção provê um ensaio específico de insulina e um reagente de ensaio capaz de testar de modo sensível e específico insulina usando um anticorpo tendo uma propriedade de reagir com insulina ligada a um anticorpo anti-insulina enquanto não reagindo com insulina não ligada a um anticorpo anti-insulina, sem se afetado por análogos de insulina e proinsulina.
Description
A presente invenção refere-se a um ensaio de insulina e a um reagente de ensaio de insulina utilizando uma reação imune. Em particular, esta invenção envolve um anticorpo que reage com insulina ligada a outro anticorpo anti-insulina, mas não reage com insulina não ligada ao anticorpo anti-insulina.
A insulina é um hormônio peptídico (peso molecular: aproximadamente 5800) que é produzida via um precursor, a proinsulina, nas células beta de ilhotas pancreáticas de Langerhans. Insulina está envolvida em metabolismo de açúcar, aminoácido e gordura, e é fisiologicamente importante no efeito hipoglicêmico. A diabete é causada por secreção de insulina insuficiente devido à diminuição em ou na deterioração funcional das células beta ou devido a uma insuficiente ação de insulina nos tecidos periféricos. Assim, a medição da concentração de insulina no sangue refletindo a função secretória de insulina de células beta é um índice utilizável para o diagnóstico e compreensão da condição clínica de diabete e a determinação da causa de tolerância à glicose anormal. As seguintes técnicas são ensaios de insulina conhecidos usando anticorpos monoclonais.
Documento de patente 1 descreve um método de quantificar insulina de acordo com um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA). Este ensaio usa um anticorpo monoclonal ligado a um veículo insolúvel e um anticorpo monoclonal não competindo com o referido anticorpo para um epítopo que é marcado com uma enzima.
Documento de patente 2 descreve um método de quantificar insulina de acordo com um imunoensaio de aglutinação de partículas. Este ensaio usa dois anticorpos monoclonais que tem diferentes sítios de reconhecimento e são ligados a veículos insolúveis.
Apesar de ambos os documentos descreverem métodos de testar insulina usando uma pluralidade de anticorpos monoclonais que tem diferentes sítios de reconhecimento para insulina, nenhuma descrição é feita com relação à reatividade cruzada com análogos de insulina ou proinsulina, como formulações de análogo de insulina. Assim, não é conhecido se a insulina pode ser medida de modo específico e sensível.
DOCUMENTOS DA TÉCNICA ANTERIOR DOCUMENTOS DE PATENTE Documento de patente 1: Publicação de patente japonesa acessível ao público No. H01-148962 Documento de patente 2: Publicação de patente japonesa acessível ao público No. H03-118472
A presente invenção provê ensaio específico para insulina e um reagente de ensaio capaz de testar de modo sensível e específico insulina sem ser afetado por análogos de insulina e proinsulina.
Como um resultado de pesquisa extensiva, os inventores verificaram de modo surpreendente que a insulina pode ser testada de modo sensível e específico sem ser afetada por análogos de insulina e proinsulina por combinação de um primeiro anticorpo monoclonal reativo com insulina com um segundo anticorpo monoclonal reativo com insulina ligada ao primeiro anticorpo monoclonal, mas não com insulina não ligada ao primeiro anticorpo monoclonal. Através de pesquisa posterior, os inventores verificaram que várias formas deste ensaio de insulina podem ser estabelecidas usando anticorpos reativos com insulina ligada a anticorpos anti-insulina (complexos insulina-anticorpo anti-insulina, a seguir às vezes referido como “complexo insulina-anticorpo”), assim completando a presente invenção. Assim, a presente invenção inclui os seguintes elementos constituintes: [1] Um ensaio de insulina usando um anticorpo que reage com insulina ligada a um anticorpo anti-insulina, mas não reage com insulina não ligada a um anticorpo anti-insulina. [2] O ensaio de insulina de [1], usando dois tipos de anticorpos, em que [1] um primeiro anticorpo reage com insulina, e [2] um segundo anticorpo reage com insulina ligada ao primeiro anticorpo, mas não reage com insulina não ligada ao primeiro anticorpo. [3] O ensaio de insulina de [2], em que tanto o primeiro como o segundo anticorpos são anticorpos monoclonais. [4] O ensaio de insulina de [2], em que o primeiro anticorpo é um anticorpo policlonal e o segundo anticorpo é um anticorpo monoclonal. [5] O ensaio de insulina de [3], em que o primeiro anticorpo monoclonal consiste de dois ou mais anticorpos monoclonais tendo diferentes sítios de reconhecimento. [6] O ensaio de insulina de qualquer um de [3] a [5], em que pelo menos um dos anticorpos monoclonais é um anticorpo que não é reativo com proinsulina ou análogos de insulina. [7] O ensaio de insulina de qualquer um de [3] a [6], em que o segundo anticorpo monoclonal é um anticorpo que não é reativo com proinsulina ou análogos de insulina. [8] O ensaio de insulina de qualquer um de [3], [5], [6], e [7], em que o primeiro e o segundo anticorpos monoclonais são imobilizados em látex e insulina é testada por um ensaio de imunoaglutinação de látex. [9] O ensaio de insulina de qualquer um de [3], [5], [6], e [7], em que o primeiro anticorpo monoclonal é imobilizado em uma fase sólida, o segundo anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação, e insulina é testada por ELISA. [10] O ensaio de insulina de qualquer um de [3], [5], [6], e [7], em que o primeiro anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação, o segundo anticorpo monoclonal é imobilizado em uma fase sólida, e insulina é testada por ELISA ou imunocromatografia. [11] Um reagente de ensaio de insulina compreendendo um anticorpo capaz de reagir com insulina ligada a um anticorpo anti-insulina enquanto não reagindo com insulina não ligada a um anticorpo anti-insulina. [12] O reagente de ensaio de insulina de [11], compreendendo dois tipos de anticorpo, em que 1) o primeiro anticorpo tem a propriedade de reagir com insulina, e 2) o segundo anticorpo tem a propriedade de reagir com insulina ligada ao primeiro anticorpo, mas não reage com insulina não ligada ao primeiro anticorpo. [13] O reagente de ensaio de insulina de [12], em que tanto o primeiro como o segundo anticorpos são anticorpos monoclonais. [14] O reagente de ensaio de insulina de [12], em que o primeiro anticorpo é anticorpo policlonal e o segundo anticorpo é anticorpo monoclonal. [15] O reagente de ensaio de insulina de [13], em que o primeiro anticorpo monoclonal consiste de dois ou mais anticorpos monoclonais tendo sítios de reconhecimento diferentes um de cada outro. [16] O reagente de ensaio de insulina de qualquer um de [13] a [15], em que pelo menos um dos anticorpos monoclonais é um anticorpo que não é reativo com proinsulina ou análogos de insulina. [17] O reagente de ensaio de insulina de qualquer um de [13] a [16], em que o segundo anticorpo monoclonal é um anticorpo que não é reativo com proinsulina ou análogos de insulina. [18] O reagente de ensaio de insulina de qualquer um de [13], [15], [16], e [17], em que o primeiro e o segundo anticorpos monoclonais são imobilizados no látex e insulina é testada por ensaio de imunoaglutinação em látex. [19] O reagente de ensaio de insulina de qualquer um de [13], [15], [16], e [17], em que o primeiro anticorpo monoclonal é imobilizado em uma fase sólida, o segundo anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação, e insulina é testada por ELISA. [20] O reagente de ensaio de insulina de qualquer um de [13], [15], [16], e [17], em que o primeiro anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação, o segundo anticorpo monoclonal é imobilizado em uma fase sólida, e insulina é testada por ELISA ou imunocromatografia. [21] Um anticorpo monoclonal tendo as seguintes propriedades: 1) não reagir com insulina que não é ligada a um anticorpo anti- insulina, e 2) reagir com insulina que é ligada a um anticorpo anti-insulina. [22] O anticorpo monoclonal de [21], tendo ainda a propriedade de não reagir com análogos de insulina ou proinsulina. [23] Um método de triar anticorpos monoclonais compreendendo as seguintes etapas: 1) selecionar um anticorpo reativo com insulina, e 2) selecionar um anticorpo monoclonal reativo com insulina que é ligada ao anticorpo selecionado na etapa 1) mas não é reativo com insulina que não é ligada ao referido anticorpo.
Mais particularmente, a presente invenção se refere a ensaios de insulina para testar especificamente insulina sem serem afetados por análogos de insulina e proinsulina, nos quais são usados dois tipos de anticorpos monoclonais, em que 1) o primeiro anticorpo monoclonal tem a propriedade de reagir com insulina, e 2) o segundo anticorpo monoclonal reage com insulina ligada ao primeiro anticorpo, mas não reage com insulina não ligada ao primeiro anticorpo e nem com análogos de insulina e proinsulina. Os ensaios de insulina abrangidos no escopo da presente invenção podem ser selecionados dentre um dos seguintes procedimentos, cujas etapas estão a seguir especificadas: (i) um procedimento que compreende as seguintes etapas: contactar o primeiro anticorpo monoclonal imobilizado em uma fase sólida com insulina em fluidos corporais derivados de um corpo vivo e, dessa forma, capturar insulina para formar um complexo de insulina-primeiro anticorpo monoclonal, contactar o segundo anticorpo monoclonal marcado com um material de marcação com o complexo de insulina-primeiro anticorpo monoclonal para formar um complexo em sanduíche do segundo anticorpo monoclonal-insulina-primeiro anticorpo monoclonal, e detectar o complexo em sanduíche do segundo anticorpo monoclonal-insulina-primeiro anticorpo monoclonal pela medição de uma quantidade do material de marcação por ELISA, (ii) um procedimento que compreende as seguintes etapas: misturar uma solução contendo o primeiro anticorpo monoclonal marcado com um material de marcação com insulina em fluidos corporais derivados de um corpo vivo para formar um complexo de insulina-primeiro anticorpo monoclonal na solução, adicionar o complexo de insulina-primeiro anticorpo monoclonal ao segundo anticorpo monoclonal imobilizado em uma fase sólida para formar um complexo em sanduíche do segundo anticorpo monoclonal-insulina- primeiro anticorpo monoclonal, e detectar o complexo em sanduíche do segundo anticorpo monoclonal-insulina-primeiro anticorpo monoclonal pela medição de uma quantidade do material de marcação por ELISA, (iii) um procedimento que compreende as seguintes etapas: adicionar insulina em fluidos corporais derivados de um ser vivo a um sítio de carga de amostra de um suporte em fase sólida, em forma de folha, ligar a insulina a um primeiro anticorpo monoclonal marcado com um material de marcação, o qual é suportado, de um modo espalhável, sobre o suporte em fase sólida, em forma de folha, para formar um complexo de insulina-primeiro anticorpo monoclonal, capturar o complexo de insulina-primeiro anticorpo monoclonal por um segundo anticorpo monoclonal imobilizado ao suporte em fase sólida, em forma de folha, para formar um complexo do segundo anticorpo monoclonal-insulina-primeiro anticorpo monoclonal, e detectar o complexo do segundo anticorpo monoclonal-insulina- primeiro anticorpo monoclonal pela medição de uma quantidade do material de marcação por imunocromatografia, (iv) um procedimento que compreende as seguintes etapas: misturar o primeiro anticorpo monoclonal imobilizado em uma primeira partícula de látex com insulina em fluidos corporais derivados de um corpo vivo para formar um complexo de insulina-primeiro anticorpo monoclonal-látex, misturar o segundo anticorpo monoclonal imobilizado em uma segunda partícula de látex com o complexo de insulina-primeiro anticorpo monoclonal-látex para formar um agregado de látex-segundo anticorpo monoclonal-insulina-primeiro anticorpo monoclonal-látex, e detectar o agregado de látex-segundo anticorpo monoclonal- insulina-primeiro anticorpo monoclonal-látex por ensaio de imunoaglutinação em látex LTIA, (v) um procedimento que compreende as seguintes etapas: misturar o primeiro anticorpo monoclonal imobilizado em uma partícula de látex com insulina em fluidos corporais derivados de um corpo vivo para formar um complexo de insulina-primeiro anticorpo monoclonal- látex, misturar o segundo anticorpo monoclonal não imobilizado em partículas de látex com o complexo de insulina-primeiro anticorpo monoclonal- látex para formar um agregado do segundo anticorpo monoclonal-insulina- primeiro anticorpo monoclonal-látex, e detectar o agregado do segundo anticorpo monoclonal-insulina- primeiro anticorpo monoclonal-látex por LTIA, ou (vi) um procedimento que compreende as seguintes etapas: misturar o primeiro anticorpo monoclonal não imobilizado em partículas de látex com insulina em fluidos corporais derivados de um corpo vivo para formar um complexo de insulina-primeiro anticorpo monoclonal, contactar o segundo anticorpo monoclonal imobilizado em uma partícula de látex com o complexo de insulina-primeiro anticorpo monoclonal para formar um agregado de látex-segundo anticorpo monoclonal-insulina- primeiro anticorpo monoclonal, e detectar o agregado de látex-segundo anticorpo monoclonal- insulina-primeiro anticorpo monoclonal por LTIA.
Com a presente invenção, insulina pode ser testada de modo sensível e específico sem ser afetada por análogos de insulina e proinsulina. Porque a secreção de insulina a partir das células beta pode ser monitorada com precisão pela invenção, a presente invenção também pode ser usada para prover um quadro da condição clínica de diabete e pode assim ser muito utilizável.
[FIG. 1] Figura 1 é um esquema de uma sequência de aminoácido de insulina. Na Fig. 1, (a) até (e) são indicativos das variações na sequência de aminoácido a partir das várias formulações de análogo de insulina em consideração de reatividade com anticorpos da presente invenção. Os caracteres alfabéticos nos círculos da Fig. 1 denotam aminoácidos representados por um caractere. Insulina lispro: (a) e (b) são “K-P” em vez de “P-K.” Insulina aspart: (a) é “D” em vez de “P.” Insulina glargina: (d) é “G” em vez de “N” e “RR” é adicionado a “T” de (c). Insulina detemir: (c) não é “T” e ácido mirístico (C14H28O2) é adicionado um “K” de (b). Insulina glulisina: (b) é “E” em vez de “K” e (e) é “K” em vez de “N.”
[FIG. 2] Figura 2 é um diagrama dos resultados de um teste usando Biacore (marca registrada) T100 para examinar reatividade de um anticorpo 66221 com insulina.
[FIG. 3] Figura 3 é um diagrama dos resultados de um teste usando Biacore (marca registrada) T100 para examinar reatividade de um anticorpo 66226 com insulina.
[FIG. 4-1] Figura 4-1 é um diagrama dos resultados de um teste usando Biacore (marca registrada) T100 para examinar reatividade do anticorpo 66221 com proinsulina e várias formulações de análogo de insulina. (a), (b), e (c) são os resultados para proinsulina, insulina lispro, e insulina aspart, respectivamente.
[FIG. 4-2] Figura 4-2 é igual como acima. (d) e (e) são resultados para insulina glargina e insulina detemir, respectivamente.
[FIG. 5-1] Figura 5-1 é um diagrama dos resultados de um teste usando Biacore (marca registrada) T100 para examinar reatividade do anticorpo 66226- com proinsulina e várias formulações de análogo de insulina. (a), (b), e (c) são resultados para proinsulina, insulina lispro, e insulina aspart, respectivamente.
[FIG. 5-2] Figura 5-2 é igual como acima. (d) e (e) são os resultados para insulina glargina e insulina detemir, respectivamente.
[FIG. 6] Figura 6 é um diagrama representando os resultados de um teste ELISA para examinar reatividade com insulina, proinsulina, e várias formulações de análogo de insulina por usando o anticorpo 66221 e anticorpo 66226 como os anticorpos primários e secundários, respectivamente, com o anticorpo primário colocado em fase sólida sobre uma placa.
[FIG. 7] Figura 7 é um diagrama de um resultado de um teste ELISA para examinar reatividade com insulina, proinsulina, e várias formulações de análogo de insulina usando o anticorpo 66226 e anticorpo 66221 como os anticorpos primários e secundários, respectivamente, com o anticorpo primário colocado em fase sólida sobre uma placa.
[FIG. 8] Figura 8 é um diagrama de um resultado de um teste usando Biacore (marca registrada) T100 para examinar reatividade do anticorpo 66221 (a) e anticorpo 66226 (b) com uma formulação de análogo de insulina, insulina glulisina.
[FIG. 9] Figura 9 é um diagrama de um resultado de um teste ELISA para examinar reatividade com insulina, proinsulina, e uma formulação de análogo de insulina, insulina glulisina, usando o anticorpo 66221 e anticorpo 66226 como os anticorpos primários e secundários, respectivamente, com o anticorpo primário colocado em fase sólida sobre uma placa.
[FIG. 10] Figura 10 é um diagrama de um resultado de um teste ELISA para examinar reatividade com insulina, proinsulina, e uma formulação de análogo de insulina, insulina glulisina, usando o anticorpo 66226 e anticorpo 66221 como os anticorpos primários e secundários, respectivamente, com o anticorpo primário colocado em fase sólida sobre uma placa.
Formas de realização da presente invenção serão agora descritas ao considerar o aspecto [3] descrito abaixo como um exemplo, que é representativo da presente invenção. Aspecto [3] é especificamente descrito como a seguir: “um ensaio de insulina usando dois tipos de anticorpos monoclonais, em que (1) o primeiro anticorpo monoclonal reage com insulina, e (2) o segundo anticorpo monoclonal reage com insulina ligada ao primeiro anticorpo monoclonal e não com insulina não ligada ao primeiro anticorpo monoclonal.”
Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem o primeiro e o segundo anticorpos monoclonais, e estes anticorpos são usados em combinação para testar insulina. O primeiro anticorpo monoclonal pode ser qualquer anticorpo monoclonal desde que ele seja reativo com insulina, e não pode ser apenas uma molécula de anticorpo completa, mas também um fragmento funcional que é reativo com insulina, como a porção Fab’ do anticorpo.
O segundo anticorpo monoclonal pode ser qualquer anticorpo monoclonal desde que ele tenha as propriedades de 1) e 2) como a seguir: 1) o segundo anticorpo monoclonal não é reativo com insulina não ligada ao primeiro anticorpo monoclonal, e 2) o segundo anticorpo monoclonal é reativo com insulina ligada ao primeiro anticorpo monoclonal.
Se “o segundo anticorpo monoclonal reage com insulina ligada ao primeiro anticorpo monoclonal” como descrito acima, é desejável que o sítio de reação (sítio de reconhecimento) do segundo anticorpo monoclonal reconheça uma mudança na estrutura da insulina gerada por ligação ao primeiro anticorpo monoclonal e reaja com a insulina tendo a estrutura mudada. Neste caso, “uma mudança na estrutura da insulina” representa uma mudança na estrutura gerada independentemente em uma molécula de insulina sozinha devido à formação de um complexo insulina-anticorpo ou uma estrutura compreendendo um anticorpo e molécula de insulina cooperativamente em insulina ligada ao anticorpo.
Como é desejável que o ensaio da presente invenção não seja afetado por análogos de insulina e proinsulina, pelo menos um anticorpo monoclonal é desejavelmente não reativo com análogos de insulina e proinsulina. Os análogos de insulina especificamente incluem formulações de análogo de insulina como insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina, insulina detemir, e insulina glulisina.
Uma forma do segundo anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser um anticorpo que não reage cruzado com qualquer um destes compostos, e se este anticorpo é usado no ensaio de insulina, insulina pode ser especificamente medida mesmo na presença dos compostos em uma amostra. Se um dos anticorpos monoclonais não reage com análogos de insulina e proinsulina, o outro anticorpo monoclonal pode ser reativo ou não reativo com estes análogos.
Apesar das expressões “reage com” insulina, “reconhecendo” insulina, “ligando a” insulina, e “exibindo reatividade cruzada com/reação cruzada com” insulina serem usadas como sinônimas nas descrições, elas devem ser construídas no sentido mais amplo sem serem limitadas a estas exemplificações. Caso um anticorpo “reage com” um antígeno (composto) esta insulina pode ser determinada por Placa ELISA de antígeno em fase sólida, ELISA competitivo, e ELISA sanduíche descritos abaixo e também pode ser identificada por um método utilizando o princípio de ressonância plasmon de superfície (método SPR). O método SPR pode ser realizado usando dispositivos, sensores e reagentes comercialmente disponíveis sob o nome de Biacore (marca registrada).
Afirmando que um anticorpo da presente invenção “não reage com” um composto sugere que o anticorpo da presente invenção não reage substancialmente com o composto, enquanto afirmando que “não está reagindo substancialmente” sugere que melhorada reatividade do anticorpo da presente invenção não é reconhecida quando Biacore (marca registrada) T100 é usado para imobilizar e testar o anticorpo da presente invenção com base, por exemplo, no método SPR. Em particular, isto significa que a reatividade entre um anticorpo e um composto não é significativamente diferente da reatividade no experimento de controle (sem composto adicionado). Desnecessário dizer que se pode confirmar que um anticorpo “não está reagindo substancialmente” com um composto por um método bem conhecido do versado na técnica, além do método SPR.
Um anticorpo da presente invenção pode reconhecer a molécula completa de insulina ou uma porção como um antígeno.
Um anticorpo monoclonal (anticorpo 66221) produzido por um hibridoma (FERM BP-11233) pode ser citado especificamente como o “primeiro anticorpo monoclonal” e outro anticorpo monoclonal (anticorpo 66226) produzido por um hibridoma (FERM BP-11234) pode ser citado como o “segundo anticorpo monoclonal.”
Os anticorpos da presente invenção podem ser facilmente produzidos dissolvendo insulina como um antígeno (imunogene) em solvente, como solução salina tamponada com fosfato (PBS), e administrando esta solução para imunizar um animal. A imunização pode ser realizada usando uma emulsão após adicionar um adjuvante apropriado a uma solução como requerido. O adjuvante pode ser um adjuvante amplamente usado, como emulsão água-em-óleo, emulsão água-em-óleo-em-água, emulsão óleo-em- água, lipossoma, ou gel de hidróxido de alumínio, assim como uma proteína ou substância peptídica derivada de componentes biogênicos. Por exemplo, adjuvante incompleto ou completo de Freund pode ser usado em um modo preferido. Apesar de não particularmente limitado, é desejado que a via de administração, dose administrada, e tempo de administração do adjuvante sejam selecionados de forma apropriada de modo que uma resposta imune desejada possa ser melhorada em um animal a ser imunizado para o antígeno.
Apesar da escolha do animal usado para a imunização não ser particularmente limitada, ela é preferivelmente de um mamífero e pode ser um camundongo, rato, bovino, coelho, cabra e ovelha, apesar de um camundongo ser mais preferido. O animal pode ser imunizado de acordo com uma técnica comum, por exemplo, a imunização pode ser obtida injetando subcutaneamente, intracutaneamente, intravenosamente, ou intraperitonealmente o animal com uma solução de um antígeno, preferivelmente uma mistura com o adjuvante. Porque uma resposta imune é geralmente diferente dependendo do tipo e da cepa de um animal a ser imunizado, é desejável que um esquema de imunização seja apropriadamente seguido dependendo do animal a ser usado. Preferivelmente, a administração do antígeno é repetida várias vezes após a imunização inicial.
Um método de produzir um anticorpo monoclonal sozinho pode ser realizado em conformidade com um método descrito, por exemplo, em Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). As seguintes operações são subsequentemente realizadas para adquirir um anticorpo monoclonal, mas estas operações não são limitações.
Após a imunização final, o hibridoma pode ser produzido por extração das células no linfonodo ou do baço, que são células produzindo anticorpos, a partir de um animal imunizado e fusionando estas células com células mieloma proliferativas. É preferido que células tendo uma elevada capacidade de produzir anticorpos (quantitativa e qualitativa) sejam usados para a fusão das células e que as células mieloma sejam compatíveis com o animal a partir do qual as células produzindo anticorpos a serem fusionados são derivadas. A fusão de células pode ser realizada de acordo com um método conhecido na arte, e um método polietileno glicol, um método usando vírus Sendai ou um método utilizando corrente elétrica podem ser empregados. O hibridoma adquirido pode ser proliferado de acordo com um método conhecido, e o hibridoma desejado pode ser selecionado enquanto identificando a propriedade do anticorpo produzido. O hibridoma pode ser clonado por um método conhecido como um método de diluição de limitação ou agar macio.
A seleção do hibridoma produzindo o primeiro anticorpo monoclonal será descrita. O hibridoma pode ser selecionado de modo eficiente no estágio de seleção, considerando a condição sob a qual o anticorpo produzido é realmente usado no ensaio. Por exemplo, o hibridoma pode ser adquirido selecionando um hibridoma que produz um anticorpo reativo com insulina através de ELISA ou RIA. Em particular, primeiro, Placa ELISA de antígeno em fase sólida, reagindo um anticorpo monoclonal no sobrenadante de cultura com insulina colocada em fase sólida e subsequentemente reagindo com anticorpos anti-IgG marcados com insulina colocada em fase sólida, é usado para selecionar um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que é altamente reativo com insulina.
Um anticorpo monoclonal tendo uma propriedade desejada pode ser produzido por cultivo em massa do hibridoma selecionado deste modo. Um método de cultivo em massa não é particularmente limitado e pode incluir, por exemplo, um método de produzir o anticorpo monoclonal no meio de cultura por cultivo do hibridoma em meio de cultura apropriado e um método de produzir o anticorpo em dropsia abdominal por injeção do hibridoma na cavidade abdominal de um mamífero para proliferação. O anticorpo monoclonal pode ser purificado combinando de modo apropriado cromatografia de troca aniônica, cromatografia de afinidade, o método de fracionamento de sulfato de amônio, o método de fracionamento de PEG e o método de fracionamento de etanol.
Hibridoma produzindo o segundo anticorpo monoclonal pode ser selecionado por combinação de modo apropriado dos seguintes métodos: um método de seleção usando insulina ligada ao primeiro anticorpo monoclonal em vez de insulina colocada em fase sólida usada no caso de seleção do hibridoma produzindo o primeiro anticorpo monoclonal (um método em que insulina é ligada ao primeiro anticorpo monoclonal colocado em fase sólida para observar a formação do sanduíche com um candidato do segundo anticorpo monoclonal), um método de seleção em que o candidato do segundo anticorpo monoclonal é colocado em fase sólida para observar a reatividade com um complexo insulina-anticorpo formado por incubação do primeiro anticorpo monoclonal e insulina antes, ou um método em que anticorpos não demonstrando reatividade com insulina são selecionados usando Biacore (marca registrada) T100 for identificação.
Os anticorpos relacionados com a presente invenção podem ser moléculas completas de anticorpo assim como fragmentos funcionais tendo atividade de reação antígeno-anticorpo. Os anticorpos podem ser os adquiridos através de imunização de animais, por uma técnica de recombinação de genes, ou anticorpos quiméricos. Os fragmentos funcionais de anticorpos incluem F(ab‘)2 e Fab’, e estes fragmentos funcionais podem ser produzidos por processamento dos anticorpos adquiridos como descrito acima com uma enzima proteolítica (por exemplo, pepsina ou papaína).
Um ou ambos dentre o primeiro e o segundo anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser imobilizados em um veículo insolúvel ou marcados com um material de marcação bem conhecido e comumente usado, que serão descritos abaixo. Os requerentes podem fazer referência aos mesmos como “anticorpos imobilizados (fase sólida)” e anticorpos marcados, respectivamente. Estes anticorpos imobilizados ou marcados são incluídos no escopo da presente invenção. Por exemplo, um anticorpo imobilizado pode ser produzido levando um veículo insolúvel a fisicamente adsorver ou quimicamente ligar a um anticorpo monoclonal (um espaçador apropriado pode existir entre os mesmos). O veículo insolúvel pode ser feito de um material à base de polímero, como uma resina poliestireno, um material de base inorgânica, como vidro e um material de base de polissacarídeo, como celulose e agarose, e o formato não é particularmente limitado e pode ser selecionado arbitrariamente. Por exemplo, o veículo insolúvel pode estar na forma de uma placa e (por exemplo, microplaca e membrana), pérolas, partículas (por exemplo, partículas de látex e partículas de ouro coloidal), ou um cilindro (por exemplo, tubo de teste).
A quantidade de insulina em uma amostra pode ser determinada usando um anticorpo marcado, como uma proteína rotulada A ou G, que pode ligar ao segundo anticorpo monoclonal da presente invenção. Materiais de marcação para anticorpos incluem enzimas, materiais fluorescentes, materiais quimiluminescentes, biotina, avidina, radioisótopos, partículas de ouro coloidal e látex colorido. Materiais de marcação podem ser ligados aos anticorpos por métodos convencionais, como glutaraldeído, maleimida, dissulfeto de piridila, ou método de ácido periódico. No entanto, os tipos de anticorpos imobilizados ou marcados e os métodos de produção não são limitados aos descritos acima. Por exemplo, quando uma enzima como peroxidase ou fosfatase alcalina é usada como um material de marcação, a atividade enzimática pode ser testada usando um substrato específico da enzima, por exemplo, o-fenilenodiamina (OPD) ou 3,3‘,5,5‘-tetrametilbenzidina para peroxidase de raiz-forte (HRP), e p-nitrofenil fosfato para ALP. Quando se usa biotina como material de marcação, pelo menos avidina ou modificada por enzima é normalmente usada na reação.
Nesta descrição, um “veículo insolúvel” pode ser representado como uma “fase sólida,” e fisicamente ou quimicamente suportando um antígeno ou anticorpo com um veículo insolúvel ou o estado de suporte pode ser representado como “imobilizando,” “imobilizado,” “fase sólida,” “sensibilização,” ou “adsorção.” O termo “detecção” ou “medição” deve ser construído no sentido mais amplo, incluindo a prova de existência e/ou quantificação de insulina. “Amostras,” que contém o análito a ser detectado em um ensaio usando os anticorpos da presente invenção, podem ser principalmente fluidos corporais derivados de um corpo vivo (organismo). Os fluidos corporais podem especificamente incluir, mas não são limitados a sangue (sangue total), soro, plasma, urina, saliva, flegma, extrato do pâncreas, fluido lacrimal, otorréia, e fluido prostático.
A forma de um reagente de ensaio (kit) provido pela presente invenção não é particularmente limitada desde que o reagente seja capaz de testar insulina. Os imunoensaios representativos de marca, isto é, ELISA e imunocromatografia, e um imunoensaio de aglutinação de partículas representativo, isto é, ensaio de imunoaglutinação de látex (LITA), serão a seguir considerados como exemplos e descritos.
Imunoensaio ligado à marca: ELISA A forma do reagente de ensaio (kit) para detectar insulina presente em uma amostra pode incluir os seguintes elementos: (a) uma fase sólida (como uma placa) com o primeiro anticorpo monoclonal imobilizado, e (b) o segundo anticorpo monoclonal marcado com um material de marcação.
A fase sólida (como uma placa) com o primeiro anticorpo monoclonal imobilizado captura insulina em uma amostra para formar um complexo insulina-anticorpo. O segundo anticorpo monoclonal marcado com o material de marcação reage com o complexo insulina-anticorpo para formar um sanduíche, e a insulina na amostra pode ser testada por medição de uma quantidade do material de marcação por um método apropriado para o material de marcação. Com relação a métodos específicos para configurar o reagente de ensaio (kit), como um método para imobilizar o primeiro anticorpo monoclonal na fase sólida e um método para rotular o segundo anticorpo monoclonal com o material de marcação, técnicas bem conhecidas podem ser usadas sem limitação, além das descritas aqui. Apesar de esta configuração poder ser formada como um sistema de ensaio homogêneo, é preferido que a configuração seja formada como um sistema de ensaio heterogêneo.
Aspecto [19] pode ser recomendado como uma forma particularmente preferida (o reagente de ensaio de insulina de qualquer um dos aspectos [13], [15], [16], e [17], em que o primeiro anticorpo monoclonal é imobilizado em uma fase sólida, o segundo anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação, e insulina é testada por ELISA).
Considerando a sensibilidade e a especificidade do reagente de ensaio, a configuração revertida do acima pode ser empregada como a seguir: (a) o primeiro anticorpo monoclonal marcado com um material de marcação, e (b) uma fase sólida (como uma placa) com o segundo anticorpo monoclonal imobilizado.
No caso desta configuração, a amostra de teste é preferivelmente misturada com uma solução contendo o primeiro anticorpo monoclonal marcado com um material de marcação para formar o complexo insulina- anticorpo em uma solução antes, e o complexo insulina-anticorpo é adicionado à fase sólida com o segundo anticorpo monoclonal imobilizado. Nesta configuração, com o objetivo de melhorar a sensibilidade, dois ou mais anticorpos monoclonais tendo diferentes sítios de reconhecimento podem ser usados em um modo preferido como o primeiro anticorpo monoclonal marcado com um material de marcação, isto é, aspecto [15] (o reagente de ensaio de insulina de aspecto [13], em que o primeiro anticorpo monoclonal consiste de dois ou mais anticorpos monoclonais tendo diferentes sítios de reconhecimento).
Aspecto [20] pode ser recomendado como uma forma particularmente preferida (o reagente de ensaio de insulina de qualquer um dos aspectos [13], [15], [16], e [17], em que o primeiro anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação, o segundo anticorpo monoclonal é imobilizado em uma fase sólida, e insulina é testada por ELISA). Imunoensaio ligado a marca: Imunocromatografia A imunocromatografia típica é configurada de modo que a ordem de distância a partir da borda na direção longitudinal em um suporte em fase sólida, em forma de folha, como uma membrana, uma solução de amostra de teste se movimenta continuamente devido à capilaridade (fenômeno capilar) através de: “1. um sítio de carga de amostra,” “2. Um sítio de reagente marcado que suporta, em um modo espalhável sobre a membrana, um reagente marcado contendo o primeiro anticorpo monoclonal (o primeiro anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação como partículas de ouro coloidal),” e “3. Um sítio de reagente de captura com o segundo anticorpo monoclonal imobilizado para capturar o complexo do primeiro anticorpo monoclonal marcado com o material de marcação e insulina.”
Em particular, quando uma quantidade pré-determinada de uma amostra de teste contendo insulina é adicionada ao sítio de carga de amostra, a amostra infiltra no sítio de reagente marcado no curso do espalhamento e se movimenta sobre o suporte em fase sólida, e a insulina liga ao reagente marcado (contendo o primeiro anticorpo monoclonal) para formar um complexo reagente marcado-insulina (um complexo insulina-reagente marcado). O complexo reagente marcado-insulina continua a se espalhar e se movimentar sobre a membrana, e quando infiltrando no sítio do reagente de captura sobre a membrana, que contém o segundo anticorpo monoclonal, o complexo é capturado pelo reagente de captura imobilizado sobre o suporte em fase sólida para formar um complexo reagente de captura (segundo anticorpo monoclonal)-insulina-reagente marcado (primeiro anticorpo monoclonal) no sítio. A presença do análito pode ser determinada por detecção do reagente marcado por um método de sua escolha, por exemplo, detectando o aparecimento de aglutinação (imagem / foto de aglutinação) no caso de partículas visíveis de ouro coloidal e detectando a reação cromogênica devido à adição de um substrato no caso de enzima.
Apesar de existirem descrições separadas para “1. o sítio de carga de amostra” e “2. um sítio de reagente marcado que suporta, em um modo espalhável sobre a membrana, um reagente marcado contendo o primeiro anticorpo monoclonal (o primeiro anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação como partículas de ouro coloidal)” em ordem da direção de movimento da amostra de teste para facilitar a compreensão, os versados na arte podem obviamente compreender que formas/configurações bem conhecidas podem ser empregadas, como uma estrutura empilhada na ordem de “1” e “2” a partir do topo.
Em imunocromatografia, um complexo insulina-anticorpo é formado no momento da passagem da amostra de teste através de “2. um sítio de reagente marcado que suporta, em um modo espalhável sobre a membrana, um reagente marcado contendo o primeiro anticorpo monoclonal (o primeiro anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação como partículas de ouro coloidal),” e assim, tendo em vista melhora a sensibilidade, como no caso de ELISA, dois ou mais anticorpos monoclonais tendo diferentes sítios de reconhecimento podem ser usados em um modo preferido como o primeiro anticorpo monoclonal marcado com o material de marcação, isto é, aspecto [15] (o reagente de ensaio de insulina de aspecto [13], em que o primeiro anticorpo monoclonal consiste de dois ou mais anticorpos monoclonais tendo diferentes sítios de reconhecimento).
Aspecto [20] pode ser recomendado como uma forma particularmente preferida (o reagente de ensaio de insulina de qualquer um dos aspectos [13], [15], [16], e [17], em que o primeiro anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação, o segundo anticorpo monoclonal é imobilizado em uma fase sólida, e insulina é testada por imunocromatografia). Imunoensaio Turbidimétrico: LTIA
Quatro formas de realização, A a D, de um reagente de ensaio (kit) para detectar insulina presente em uma amostra podem compreender as seguintes: A. (a) partículas de látex com o primeiro anticorpo monoclonal imobilizado e (b) partículas de látex com o segundo anticorpo monoclonal imobilizado; B. (a) partículas de látex com o primeiro anticorpo monoclonal imobilizado e (b) o segundo anticorpo monoclonal; C. (a) o primeiro anticorpo monoclonal e (b) partículas de látex com o segundo anticorpo monoclonal imobilizado; e D. (a) partículas de látex com ambos o primeiro e o segundo anticorpos monoclonais imobilizados.
Estes reagentes de ensaio (kits) podem ser usados em LTIA em um modo preferido. As partículas de látex usadas em A a D podem ser selecionadas de modo apropriado em termos de diâmetro de partícula e tipo a fim de adquirir a desejada capacidade, como melhorada sensibilidade. As partículas de látex podem ser as apropriadas para transportar um antígeno ou anticorpo. Por exemplo, as partículas de látex podem ser de poliestireno, copolimero estireno- ácido sulfônico (sulfonato), copolimero estireno-ácido metacrílico, copolimero acrilonitrila-butadieno-estireno, copolimero cloreto de vinil-éster acrilico, ou copolimero acetato de vinil-éster de ácido acrilico. Apesar da forma das particulas de látex não ser particularmente limitada, é preferivel que um diâmetro de particula médio seja definido de modo que o agregado produzido, como um resultado da reação de aglutinação entre o anticorpo (ou antigeno) sobre a superficie da particula de látex e o análito, tenha um tamanho suficiente para ser detectado de modo visivel ou óptico. O diâmetro de particula médio é preferivelmente 0,02 a 1,6 μm e particularmente 0,03 a 0,5 μm. As particulas feitas de colóide metálico, gelatina, lipossoma, microcápsulas, silica, alumina, negro de fumo, composto metálico, metal, cerâmica, ou material magnético podem ser usadas em vez das particulas de látex.
Por exemplo, o reagente de LTIA usado em exames clinicos é geralmente provido na forma de uma primeira e uma segunda soluções de reagente, que são sequencialmente misturadas com a amostra de teste em uso. Uma ou ambas (a) e (b) em cada uma das formas A a D pode ser incluida na primeira ou segunda solução de reagente. Os métodos de incluir (a) e (b) podem ser selecionados de modo apropriado dependendo dos aspectos particulares do dispositivo para o exame clinico e o projeto do reagente de ensaio (como capacidade e utilidade). Apesar de, preferivelmente, ambos (a) e (b) da forma A serem incluido no segundo reagente (a) e (b) da forma A eles também podem ser incluidos no primeiro e segundo reagentes, respectivamente, em um modo preferido.
Aspecto [18] pode ser recomendado como uma forma particularmente preferida (o reagente de ensaio de insulina de qualquer um dos aspectos [13], [15], [16], e [17], em que o primeiro e o segundo anticorpos monoclonais são imobilizados no látex e insulina é testada por ensaio de imunoaglutinação em látex).
Apesar das formas de realização da presente invenção terem sido descritas considerando o aspecto [3], que é uma forma representativa da presente invenção, como um exemplo, os versados na arte podem obviamente entender que a presente invenção pode ser implementada em várias formas, por exemplo, usando um anticorpo policlonal para o primeiro anticorpo, como em aspecto [4], e dois ou mais anticorpos monoclonais tendo diferentes sítios de reconhecimento para o primeiro anticorpo, como em aspecto [5], com a condição que um anticorpo para o “complexo insulina-anticorpo” seja usado.
Apesar de a presente invenção ser descrita em maiores detalhes com referência aos exemplos, a presente invenção não é limitada da estes exemplos.
1. Preparação de antígeno de imunização Depois de insulina humana (Fitzgerald Industries International, 30- AI51) ser misturada 1:1 com adjuvante completo de Freund (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), seringas conectadas foram usadas para produzir uma emulsão a ser usada como o antígeno de imunização.
2. Produção de Hibridoma O antígeno de imunização foi injetado subcutaneamente nas regiões dorsais de camundongos fêmeas BALB/c (20 a 50 μg por camundongo). Imunização foi repetida duas vezes por semana. Após 3 semanas, desde o início da imunização, o baço foi extraído de um camundongo tendo um título elevado de anticorpos na amostra de sangue, e a fusão das células foi realizada por um procedimento de rotina usando 50% PEG 1450 (Sigma). As células mieloma SP2/O foram usadas. As células fusionadas adquiridas foram colocadas em suspensão a 2,5 x 106/mL (como células do baço) em meio RPMI 1640 que continha HAT, 15% soro bovino fetal, e 10% BM-Condimed H1 suplementos de clonagem de hibridoma (Roche Diagnostics K.K.) foram distribuídos em uma placa de cultura de 96 cavidades em alíquotas de 0,2-mL. As células fusionadas foram cultivadas a 37°C em um incubador a 5% de CO2.
3. Triagem de hibridoma produzindo o primeiro anticorpo monoclonal Após sete dias a partir da fusão da célula, o sobrenadante de cultura foi usado para realizar ELISA de antígeno em fase sólida descrito depois como a triagem primária para selecionar cavidades que demonstram uma elevada reatividade para insulina como cavidades positivas primárias. As células nas cavidades positivas primárias foram passadas em série em uma placa de 24 cavidades. Após dois dias de cultivo em série, o sobrenadante de cultura foi usado para realizar ELISA competitivo descrito depois como uma triagem secundária para selecionar cavidades que demonstraram uma elevada reatividade para insulina como cavidades positivas secundárias.
3-1. Produção da placa ELISA de antígeno em fase sólida Insulina preparada a uma concentração de 1 μg/mL com 10 mM PBS (pH 7,2) contendo 150 mM cloreto de sódio foi colocada em fase sólida como um antígeno de triagem sobre uma placa de 96 cavidades a 50 μL/cavidade e foi deixada permanecer durante a noite a 4°C. Após lavar três vezes com 400 μL/cavidade de solução de PBS contendo 0,05% Tween (marca registrada) 20 e 0,1% ProClin 300 (Supelco; PBST), PBST contendo 1% BSA (BSA-PBST) foi distribuído a 100 μL/cavidade e deixado permanecer uma hora em temperatura ambiente para aderência para produzir uma placa ELISA. A placa ELISA foi lavada três vezes com PBST e usada para testes ELISA descritos nos exemplos por adição de reagentes.
3-2. Placa ELISA de antígeno em fase sólida (i) Antissoro de camundongo ou sobrenadante de cultura das células fusionadas diluído em etapas com BSA-PBST foi distribuído sobre uma placa ELISA de antígeno em fase sólida a 50 μL/cavidade e deixado permanecer uma hora em temperatura ambiente. (ii) Após lavar três vezes com PBST, uma solução de HRP-Gt F(ab‘)2- Ig's anti-Camundongo (BioSource, AMI4404) diluído 5000 vezes com BSA-PBST foi distribuída a 50 μL/cavidade e deixada permanecer uma hora em temperatura ambiente. (iii) Após lavar três vezes com PBST, OPD (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) foi dissolvido a 2 mg/mL em 0,2 M solução tampão citrato contendo 0,02% peróxido de hidrogênio/água (a seguir, solução dissolvendo substrato), adicionado a 50 μL/cavidade, e deixado permanecer uma hora em temperatura ambiente. (iv) Além disso, 1,5 N ácido sulfúrico contendo 1 mM EDTA (a seguir, líquido de parada de reação) foi adicionado a 50 μL/cavidade, e absorbância foi medida a um comprimento de onda de 492 nm usando Titertek (marca registrada) Multiskan Plus MK II (Flow Laboratories Inc).
3-3. ELISA Competitivo (v) Soluções de insulina humana (Fitzgerald Industries International, 30-AI51) diluídas com BSA-PBST a 0, 2,5, 5, e 10 μg/mL foram distribuídas sobre a placa ELISA de antígeno em fase sólida a 25 μL/cavidade. (vi) Sobrenadante de cultura das células fusionadas diluídas a 5 e 25 vezes com BSA-PBST ou solução não diluída das mesmas foi então distribuído a 25 μL/cavidade e deixado permanecer uma hora em temperatura ambiente. (vii) As operações subsequentes foram realizadas do mesmo modo como etapas (ii) a (iv) de “3-2. ELISA de antígeno em fase sólida” descrito acima.
4. Triagem de hibridoma produzindo o segundo anticorpo monoclonal Após sete dias da fusão das células, o sobrenadante de cultura foi usado para realizar o ELISA sanduíche descrito depois para selecionar cavidades demonstrando uma elevada reatividade para insulina ligada ao primeiro F(ab‘)2 anticorpo monoclonal coletado antes por clonagem e a coleção de anticorpo monoclonal descrita depois.
4-1. ELISA sanduíche (i) O primeiro anticorpo monoclonal (neste caso, anticorpo 66221) foi tratado para preparar F(ab‘)2 usando kit de preparação Imuno Pure (marca registrada) F(ab‘)2 (Pierce, prod# 44888). (ii) O primeiro F(ab‘)2 anticorpo monoclonal preparado a uma concentração de 2 μg/mL com solução PBS foi colocado em fase sólida sobre uma placa de 96 cavidades a 50 μL/cavidade e foi deixado permanecer durante a noite a 4°C. Após lavar três vezes com 400 μL/cavidade de PBST, BSA- PBST foi distribuído a 100 μL/cavidade e deixado permanecer uma hora em temperatura ambiente para aderência a fim de produzir uma placa ELISA. (iii) Solução de insulina humana (Fitzgerald Industries International, 30-AI51) diluída com BSA-PBST a 0,5 μg/mL foi distribuída sobre a placa ELISA a 50 μL/cavidade e deixada permanecer uma hora em temperatura ambiente. (iv) Após lavar três vezes com PBST, o sobrenadante de cultura das células fusionadas diluídas em etapas com BSA-PBST foi distribuído a 50 μL/cavidade e deixado permanecer uma hora em temperatura ambiente. (v) Após lavar três vezes com PBST, uma solução de HRP-Gt- IgG-Fc anti-camundongo (Bethyl Laboratories, A90-131P) diluída 10000 vezes com BSA-PBST foi distribuída a 50 μL/cavidade e deixada permanecer uma hora em temperatura ambiente. (vi) Após lavar três vezes com PBST, OPD (Tokyo Chemical Industry) foi dissolvido a 2 mg/mL na solução de dissolução de substrato, adicionado a 50 μL/cavidade, e deixado permanecer uma hora em temperatura ambiente. (vii) O líquido de parada de reação foi adicionado a 50 μL/cavidade, e absorbância foi medida a 492 nm usando Titertek (marca registrada) Multiskan Plus MK II (Flow Laboratories).
5. Clonagem e coleta de anticorpo monoclonal Hibridomas selecionados para as triagens de 3. e 4. descritas acima foram clonados por método de diluição por limitação para adquirir hibridomas 66221 e 66226, respectivamente. Para coletar os anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas, os hibridomas foram intraperitonealmente administrados, em uma quantidade correspondendo a 0,5 x 106 células, a um camundongo BALB/c fêmea, com 12 semanas de idade, intraperitonealmente injetado com 0,5 mL de pristano duas semanas antes. Os ascitos foram coletados após 14 dias, e os sobrenadantes foram adquiridos por centrifugação. Os sobrenadantes foram misturados com a mesma quantidade de solução de tampão de adsorção (3 mol/L NaCl, 1,5 mol/L de solução de tampão Glicina- NaOH, pH 8,5) e então filtrados. Os filtrados foram passados através de uma coluna sepharose de proteína A equilibrada com tampão de solução de adsorção para adsorver os anticorpos nos filtrados usando a coluna, e os anticorpos foram eluídos com 0,1 mol/L de solução de tampão citrato (pH 3,0). Após neutralizar o eluado com 1 mol/L solução de tampão Tris-HCl (pH 8,0), diálise foi realizada com PBS para coletar os anticorpos. Os anticorpos, referidos como o anticorpo 66221 e anticorpo 66226, foram subsequentemente usados em testes. Hibridomas produzindo o anticorpo 66221 e anticorpo 66226 foram depositados junto ao International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (endereço: Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão) em 8 de abril de 2009 sob os números de acesso FERM P-21800 e FERM P-21801, respectivamente. Subsequentemente, eles foram transferidos para o Tratado de Budapeste em 17 de fevereiro de 2010, com base no depósito original, sob os números de acesso FERM BP-11233 e FERM BP-11234, respectivamente. [Segundo Exemplo de Teste] Reatividade cruzada de anticorpo monoclonal da presente invenção com análogos de insulina e proinsulina
Um teste foi realizado usando Biacore (marca registrada) T100 para reatividade cruzada do anticorpo 66221 e do anticorpo 66226 com análogos de insulina e proinsulina. Para os análogos de insulina, formulações de análogo de insulina como insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina, e insulina detemir foram usadas.
1. Reagentes e Instrumentos 1-1. Anticorpos monoclonais (i) anticorpo 66221: 2,30 mg/mL (ii) anticorpo 66226: 3,99 mg/mL 1-2. Análitos (i) insulina humana recombinante: Fitzgerald Industries International, 30-AI51 (ii) proinsulina: IRR Proinsuline, Humana, para Imunoensaio; código NIBSC: 84/611 (iii) formulações de análogo de insulina (1) insulina lispro, 100 unidades/mL: Eli Lilly Japan K.K. (2) insulina aspart, 100 unidades/mL: Novo Nordisk Pharma Ltd. (3) insulina glargina, 100 unidades/mL: Sanofi-Aventis K.K. (4) insulina detemir, 100 unidades/mL: Novo Nordisk Pharma Ltd. 1-3. dispositivos Biacore (marca registrada) e um conjunto de reagentes dedicado (Biacore: atualmente, GE Healthcare; apesar de (i) a (viii) descritos abaixo serem produtos e números de catálogo do então Biacore, estes são atualmente disponíveis a partir de GE Healthcare.) (i) Biacore (marca registrada) T100: Biacore, JJ-1037-02 (ii) Chip Sensor CM5 Série S: Biacore, BR-1005-30 (iii) Kit de copulação de amina: Biacore, BR-1000-50 (iv) Acetato 5,0: Biacore, BR-1003-51 (v) α-Imunoglobulinas de camundongo: Biacore, BR-1005-14 (vi) Glicina 1,5: Biacore, BR-1003-54 (vii) Glicina 2,0: Biacore, BR-1003-55 (viii) HBS-EP+ 10x (tampão de ciclo): Biacore, BR-1006-69 (preparado a pH 8,5 com NaOH e diluído 10 vezes com água purificada em uso) 2. Método de Teste O anticorpo 66221 ou anticorpo 66226 foi capturado por α- imunoglobulinas de camundongo imobilizadas em um chip sensor, e insulina, proinsulina, e várias formulações de análogos de insulina foram adicionadas como análitos para avaliar a reatividade entre as mesmas. O procedimento operacional específico usado é como a seguir. (i) α- Imunoglobulinas de camundongo foram imobilizadas em um chip sensor CM5 (de acordo com o manual de instruções anexo). (ii) o anticorpo 66221 ou o anticorpo 66226 foi diluído com HBS- EP+ (pH 8,5) a 5 μg/mL e adicionado a uma taxa de fluxo de 30 μL/min durante 300 segundos. (iii) Vários antígenos foram diluídos com HBS-EP+ (pH 8,5) a 10 ng/mL e adicionados a duas concentrações de 0 e 10 ng/mL durante 120 segundos cada. Um tempo para uma dissociação de ciclo livre foi fixado a 120 segundos em cada caso. (iv) Glicina 1,5 e Glicina 2,0 foram misturadas 1:1 para formar uma solução de regeneração e o tratamento de regeneração foi realizado durante 180 segundos. 3. Resultados 4. 1. Resultados de reação com insulina Para o anticorpo 66221 e anticorpo 66226, a reatividade com insulina foi verificada usando Biacore (marca registrada) T100. Os resultados são mostrados nas Figuras 2 e 3. O anticorpo 66221 mostrou uma reatividade de 8,5 RU a uma concentração de insulina de 10 ng/mL (Fig. 2). Em contraste, não foi detectada reatividade para o anticorpo 66226 (Fig. 3). O eixo vertical (RU) indica uma unidade singular para o sistema de ensaio Biacore (marca registrada) e representa uma mudança de massa devido à reação sobre a superfície do sensor. 5. 2. Resultados de reação com proinsulina e formulações de análogo de insulina
Para o anticorpo 66221 e o anticorpo 66226, a reatividade com proinsulina ou várias formulações de análogo de insulina (insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina, e insulina detemir) foi verificada usando Biacore (marca registrada) T100. O resultado é mostrado em Figuras 4-1, 4-2, 5-1, e 5-2. Em cada caso, a uma concentração de antígeno de 10 ng/mL, respostas de 5,5 a 13 RU foram detectadas para o anticorpo 66221. Em contraste, não foi detectada reatividade para o anticorpo 66226. [Exemplo 1] Ensaio de insulina usando uma combinação de anticorpos monoclonais da presente invenção 1
1. Produção de partículas de látex Um recipiente de reação de vidro (capacidade: 2 L) equipado com uma máquina de agitação, condensador de refluxo, dispositivo sensor térmico, tubo de introdução de nitrogênio e camisa foi cheio com 1100 g de água destilada, 200 g de estireno, 0,2 g de estireno sulfonato de sódio, e solução aquosa de 1,5 g de peroxodissulfato de potássio dissolvido em 50 g de água destilada, e depois o interior do recipiente foi substituído com gás nitrogênio, polimerização foi realizada durante 48 horas enquanto agitando a 70°C. Após o final da polimerização, a solução foi filtrada com um papel de filtro para extrair as partículas de látex. Um aparelho de microscópio eletrônico de transmissão (JEOL Ltd., modelo “JEM-1010”) foi usado para formar a imagem das partículas de látex a uma ampliação de 10000 vezes e analisando os diâmetros de pelo menos 100 partículas de látex adquiridas para determinar o diâmetro de partícula médio. O diâmetro de partícula médio obtido foi 0,3 μm.
2. Preparação das partículas de látex sensibilizadas com anticorpo anti-insulina 2-1. Produção de solução de partículas de látex sensibilizadas com anticorpo 66221 A uma solução de látex a 1,0% tendo um diâmetro de partícula médio de 0,3 μm [em 5 mM solução de tampão Tris (a seguir, Tris-HCl), pH 8,5], solução de anticorpo 66221, diluída a 0,60 mg/mL com o mesmo volume de 5 mM Tris-HCl (pH 8,5), foi adicionada e agitada a 4°C durante duas horas. O mesmo volume de 5 mM Tris-HCl (pH 8,5) contendo 0,5% BSA foi subsequentemente adicionado e agitado a 4°C durante uma hora. Depois a solução foi centrifugada e sobrenadante removido, o precipitado foi recolocado em suspensão em 5 mM Tris-HCl (pH 8,5) para produzir uma solução de partículas de látex sensibilizadas com anticorpo 662212-2. Produção de solução de partículas de látex sensibilizadas com anticorpo 66226 O látex tendo um diâmetro de partícula médio de 0,3 μm foi usado para produzir uma solução de partículas de látex sensibilizadas com anticorpo 66226 do mesmo modo como acima.
3. Preparação de Reagentes 3-1. Preparação do primeiro reagente Tris-HCl (pH 8,5) cinco (5) milimolar contendo 500 mM de cloreto de sódio e 0,2% BSA foi usado como o primeiro reagente. 3-2. Preparação do segundo reagente Os mesmos volumes das soluções de partículas de látex sensibilizadas com anticorpo 66221 e anticorpo 66226 foram misturados e diluídos com 5 mM Tris-HCl (pH 8,5) de modo que absorbância de 5,0 Abs foi alcançada a um comprimento de onda de 600 nm para preparar o segundo reagente.
4. Ensaio O primeiro e o segundo reagentes foram combinados, e a formação dependente da concentração de insulina de agregados de partícula foi identificada usando um analisador automatizado Hitachi 7170. Em particular, 150 μL do primeiro reagente foram adicionados a 10 μL de soluções de insulina em concentrações de 0, 5, 25, 50, 100, e 200 μU/mL e aquecidos a 37°C durante 5 minutos. Subsequentemente, 50 μL do segundo reagente foram adicionados, seguido por agitação. Após cinco minutos, mudanças em absorbância associadas com a formação de aglutinação foram medidas a 570 nm e comprimento de sub-onda de 800 nm. [Tabela 1]
5. Resultado do ensaio Tabela 1 mostra que a sensibilidade aumenta dependendo da concentração de insulina e pode ser quantificada. [Exemplo 2] Ensaio de insulina usando a combinação de anticorpos monoclonais da presente invenção 2
Ou o anticorpo 66221 ou o anticorpo 66226 foi colocado em fase sólida, e o resto foi usado como um anticorpo secundário para testar a reatividade com análogos de insulina e proinsulina por ELISA.
1. Anticorpos e antígenos usados (1) Anticorpos monoclonais anticorpo 66221: 2,30 mg/mL anticorpo 66226: 3,99 mg/mL (2) Antígenos Insulina, proinsulina, e formulações de análogo de insulina (insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina, e insulina detemir) usadas foram as mesmas como no segundo exemplo de teste.
2. Método ELISA (i) Uma solução do anticorpo 66221 ou anticorpo 66226 diluído a 2 μg/mL com PBS foi colocada em fase sólida em uma placa de 96 cavidades a 50 μU/cavidade e deixada permanecer duas horas em temperatura ambiente. (ii) Após lavar três vezes com 400 μU/cavidade de PBST, BSA- PBST foi distribuído a 100 μL/cavidade e deixado permanecer uma hora em temperatura ambiente para aderência a fim de produzir uma placa ELISA. (iii) A solução de cada de insulina humana, proinsulina, e formulações de análogo de insulina diluída com BSA-PBST a 0, 1, 5, e 10 ng/mL foi distribuída sobre a placa ELISA a 50 μL/cavidade e deixada permanecer uma hora em temperatura ambiente. (iv) Após lavar três vezes com PBST, uma solução de anticorpo 66221 ou anticorpo 66226 marcado com biotina diluído a 1 μg/mL com BSA- PBST foi distribuída a 50 μL/cavidade e deixada permanecer uma hora em temperatura ambiente. (v) Após lavar três vezes com PBST, uma solução de Streptavidina Imuno Pure (marca registrada), HRP-Conjugated (PIERCE, Prod# 21126) diluído 5000 vezes com BSA-PBST foi distribuído a 50 μL/cavidade e deixada permanecer uma hora em temperatura ambiente. (vi) Após lavar três vezes com PBST, OPD (Tokyo Chemical Industry) foi dissolvido a 2 mg/mL na solução de dissolução de substrato, adicionado a 50 μL/cavidade, e deixado permanecer uma hora em temperatura ambiente. (vii) A solução de parada de reação foi adicionada a 50 μL/cavidade, e absorbância foi medida a 492 nm usando Titertek (marca registrada) Multiskan Plus MK II (Flow Laboratories).
3. Resultado 3-1. 66221 Resultados de ensaio de placa de anticorpo em fase sólida
4. resultados de teste são mostrados em Tabela 2 e Fig. 6. Quando o anticorpo 66221 foi usado como o anticorpo primário e o anticorpo 66226 foi usado como o anticorpo secundário, um aumento dependente da concentração em absorbância foi observado para insulina, enquanto nenhum aumento dependente da concentração em absorbância foi observado para proinsulina e as formulações de análogo de insulina (insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina, e insulina detemir). [Tabela 2]
3-2. 66226 Resultados de ensaio de placa de anticorpo em fase sólida Os resultados de teste são mostrados em Tabela 3 e Fig. 7. Quando o anticorpo 66226 foi usado como o anticorpo primário e 5 o anticorpo 66221 foi usado como o anticorpo secundário, nenhum aumento dependente da concentração em absorbância foi observado em qualquer uma dentre insulina, proinsulina, e formulações de análogo de insulina (insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina, e insulina detemir). [Tabela 3]
A partir dos resultados acima, conclui-se que a insulina pode ser quantificada sem a influência de e formulações de análogo de insulina e de proinsulina porque nenhuma reatividade cruzada foi observada quando o anticorpo 66221 e anticorpo 66226 foram usados como os anticorpos primários e secundários, respectivamente. Insulina não pode ser testada quando o anticorpo 66226 e anticorpo 66221 foram usados como os anticorpos primários e secundários, respectivamente, e é assim notado que o anticorpo 66226 não exibe reatividade com insulina, mas reage com insulina ligada ao anticorpo 66221. Note-se que no resultado de teste de reatividade cruzada dos anticorpos monoclonais da presente invenção usando Biacore (marca registrada) T100 (o segundo exemplo de teste), o anticorpo 66221 reagiu com insulina, proinsulina, e todas as formulações de análogo de insulina, enquanto o anticorpo 66226 não reagiu com nenhuma das mesmas.
Assim, de acordo com o mecanismo de reação deste sistema de ensaio, entende-se que alguma mudança estrutural ocorre na insulina quando o anticorpo 66221 se liga primeiro à insulina e que o anticorpo 66226 especificamente reconhece o sítio estruturalmente mudado para formar um sanduíche. [Terceiro Exemplo de teste] Reatividade cruzada de anticorpos monoclonais da presente invenção com análogos de insulina
O teste foi realizado usando Biacore (marca registrada) T100 para reatividade cruzada do anticorpo 66221 e anticorpo 66226 com análogos de insulina. Uma formulação de análogo de insulina, isto é, insulina glulisina, foi usada como o análogo de insulina. 1. Reagentes e Instrumentos 1-1. Anticorpos monoclonais (i) anticorpo 66221: 2.30 mg/mL (ii) anticorpo 66226: 3,99 mg/mL 1-2. Análitos Formulação de análogo de insulina (iii) insulina glulisina, 100 unidades/mL: sanofi-aventis K.K. 1-3. Dispositivos Biacore (marca registrada) e conjunto de reagentes dedicados Os dispositivos Biacore (marca registrada) e conjunto de reagentes dedicados usados foram os mesmos como no segundo exemplo de teste. 2. Método de teste O teste foi realizado do mesmo modo como o segundo exemplo de teste, exceto que insulina glulisina, uma formulação de análogo de insulina, foi usada como um análito. 3. Resultado 4. 1. Resultado de reação com formulação de análogo de insulina Para tanto o anticorpo 66221 como o anticorpo 66226, a reatividade com a formulação de análogo de insulina, insulina glulisina, foi verificada usando Biacore (marca registrada) T100. O resultado é mostrado em Fig. 8. Nem o anticorpo 66221 nem o anticorpo 66226 mostraram reatividade. O eixo vertical (RU) indica uma unidade singular para o sistema de ensaio Biacore (marca registrada) e representa uma mudança de massa devido à reação sobre a superfície do sensor.
Quer o anticorpo 66221 ou o anticorpo 66226 estava em fase sólida, enquanto o outro anticorpo foi combinado como um anticorpo secundário para testar a reatividade com insulina, proinsulina, e um análogo de insulina por ELISA. 1. Anticorpos e Tipos de Antígenos Usados (1) Anticorpos monoclonais anticorpo 66221: 2,30 mg/mL anticorpo 66226: 3,99 mg/mL (2) Antígenos: insulina, proinsulina, e uma formulação de análogo de insulina (insulina glulisina) 2. Método ELISA O mesmo método como no Exemplo 2 é realizado, exceto que insulina glulisina foi usada como a formulação de análogo de insulina. 3. Resultado 3-1. Resultados de ensaio de placa de anticorpo 66221 em fase sólida Os resultados de teste são mostrados em Tabela 4 e Fig. 9. Como foi o caso com Exemplo 2, quando o anticorpo 66221 foi usado como o anticorpo primário e o anticorpo 66226 foi usado como o anticorpo secundário, um aumento dependente da concentração em absorbância foi detectado para insulina enquanto nenhum aumento dependente da concentração em absorbância foi detectado para proinsulina e a formulação de análogo de insulina (insulina glulisina). [Tabela 4]3-2. Resultados de ensaio de placa de anticorpo 66226 em fase sólida Os resultados de teste são mostrados em Tabela 5 e Fig. 10. Como foi o caso com Exemplo 2, quando o anticorpo 66226 foi o anticorpo primário e o anticorpo 66221 foi o anticorpo secundário, nenhum aumento dependente da concentração em absorbância foi detectado para insulina, proinsulina, ou a formulação de análogo de insulina (insulina glulisina). [Tabela 5]
4. Discussão Os resultados acima mostram que nenhuma reatividade cruzada é exibida com a formulação de análogo de insulina, insulina glulisina, quando o anticorpo 66221 e anticorpo 66226 foram usados como os anticorpos primários e secundários, respectivamente, e quando o anticorpo 66226 e anticorpo 66221 foram usados como os anticorpos primários e secundários, respectivamente.
Com os anticorpos monoclonais da presente invenção, insulina pode ser testada de modo sensível e específico sem ser afetada por análogos de insulina e proinsulina. Porque a secreção de insulina a partir das células beta pode ser monitorada com precisão pela presente invenção, a presente invenção também pode ser usada para visualizar uma condição clínica de diabete, sendo assim muito utilizável.
NÚMEROS DE ACESSO (1) FERM BP-11233 (2) FERM BP-11234 [Referência ao Material Biológico Depositado] (1) Hibridoma 66221 produzindo o anticorpo 66221 i) Nome e endereço da instituição depositária em que os materiais biológicos foram depositados.
International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology - Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japão ii) Data do depósito do material biológico na instituição depositária em i). 8 de abril de 2009 (data do depósito original) 17 de fevereiro de 2010 (data de transferência para o Tratado de Budapeste a partir do depósito original) iii) Número de acesso para o depósito designado pela instituição depositária em i).
FERM BP-11233 (2) Hibridoma 66226 produzindo o anticorpo 66226 i) Nome e endereço da instituição depositária em que os materiais biológicos foram depositados. International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology - Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japão ii) Data do depósito do material biológico na instituição depositária em i). 8 de abril de 2009 (data do depósito original) 17 de fevereiro de 2010 (data de transferência para o Tratado de Budapeste a partir do depósito original) iii) Número de acesso para o depósito designado pela instituição depositária em i). FERM BP-11234
Claims (8)
1. Ensaio de insulina para especificamente testar insulina sem ser afetado por proinsulina ou análogos de insulina, o referido ensaio caracterizado pelo fato de usar dois tipos de anticorpos monoclonais, em que 1) o primeiro anticorpo monoclonal tem uma propriedade de reagir com insulina, e 2) o segundo anticorpo monoclonal reage com insulina ligada ao primeiro anticorpo, mas não com insulina não ligada ao primeiro anticorpo e não com proinsulina ou análogos de insulina, em que o primeiro anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal 66221, que é produzido por um hibridoma que possui um número de acesso depositário de FERM BP-11233, e em que o segundo anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal 66226, que é produzido por um hibridoma que possui um número de acesso depositário de FERM BP-11234.
2. Ensaio de insulina, de acordo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo anticorpos monoclonais são imobilizados em látex e insulina é testada por ensaio de imunoaglutinação em látex.
3. Ensaio de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo monoclonal é imobilizado em uma fase sólida, o segundo anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação, e insulina é testada por ELISA.
4. Ensaio de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação, o segundo anticorpo monoclonal é imobilizado em uma fase sólida, e insulina é testada por ELISA ou imunocromatografia.
5. Reagente de ensaio de insulina caracterizado pelo fato de compreender 1) um primeiro anticorpo monoclonal tendo uma propriedade de reagir com insulina, e 2) um segundo anticorpo monoclonal tendo uma propriedade de reagir com insulina ligada ao primeiro anticorpo enquanto não reagindo com insulina não ligada ao primeiro anticorpo e não com proinsulina e análogos de insulina, em que o primeiro anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal 66221, que é produzido por um hibridoma que possui um número de acesso depositário de FERM BP-11233, e em que o segundo anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal 66226, que é produzido por um hibridoma que possui um número de acesso depositário de FERM BP-11234.
6. Reagente de ensaio de insulina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo anticorpos monoclonais são imobilizados em látex.
7. Reagente de ensaio de insulina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo monoclonal é imobilizado em uma fase sólida e o segundo anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação.
8. Reagente de ensaio de insulina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo monoclonal é marcado com um material de marcação e o segundo anticorpo monoclonal é imobilizado em uma fase sólida.
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