JPS5940166A

JPS5940166A - 免疫学的測定方法及び試薬

Info

Publication number: JPS5940166A
Application number: JP15038682A
Authority: JP
Inventors: Takashi Kudo; 隆工藤; Toshiyuki Sugawara; 菅原　敏行; Hiroshi Sato; 浩佐藤; Suguru Mochida; 持田　英
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-08-30
Filing date: 1982-08-30
Publication date: 1984-03-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は免疫学的測定法の原理を用いて、一つの被検液
中に存在するそれぞｔｔ！１４なる２種類以上の物質を
同時にかつ総合的に測定する方法近年の臨床医学の進歩
から、各種の疾患において、多数の検査項目ケ測定し、
その結才を総合的に判断し、必要な措置かとらｉるよう
になった。ところが、現在の免疫学的測定試薬いては、
１項目の検査に１〜４日を費し、多数の項目を、検査す
ると、たいへんな日数を映してしまい、患者に刻して必
要な措置が迅速に行なえないため、必要な検査項目のう
ちのいくつかは省略さねてしまり。このような情況では
、患者に対する措置が適切に行なえない場合が起こる可
能性もある。

例えば、近年の死亡原因の上位にある癌の早期診断、病
勢の把握、治療効果の判定、再発の有無の判定等に、各
種の腫瘍マーカーの測定が有用とさハている。この場合
、多数の腫瘍マーカーの測定を行ない、その測定値から
総合的に判断する方がより効果的でまちがいのない方法
である。しかし、多数のＩＩ！！！瘍マーカーを測犀す
るためＫは、前記に説明したように、長い日数が必要と
なってくる。更に、必要な検体（主に血清、血漿等ンが
多量となり、患者の苦痛も増大する。

このような現状に鑑み、本発明省らは研究を重ねた結果
、腫瘍マーカーの測定による癌の早期診＆には多数の腫
瘍マーカーについて、どのような種類の腫瘍マーカーが
どの位の岨存在するかを個別に測定するのが最も好ま（
、いが、実質的には、後述する実施例２および７から明
らかなように、腫瘍マーカーの総垣によって診ｔθ「す
ることが可能であることを見出した。そしてこの結果に
基づいて、１つの被検液中に存在する２８ｉ類以上の測
定物質を１同の側冗操作で同時に総和として測定する方
法を見出すべく研究を重ねた結果、免疫学的測定方法の
原理を、応用し、それぞ４異なる２種類以上の６（１ｊ
定抗原に対応する抗体をそれぞれ別個の不溶性担体に結
合させて得た２８１類以上の不溶化抗体を混合して使用
することにより、それぞれの測定抗原とその抗体との反
応性に変化を生ずることなしに２種類以上の測定物質量
の総和を１回の測定操作によって測定することができる
ことを見出し本発明を完成した。

本発明の測定方法の基礎となる免疫学的測定方法シ゛工
、近年、血清、尿などの生体試料中に含まれる微量の生
理活性物質、例えはペプチＰホルモン類、ステロイド類
、蛋白η類などの濃度や、生体に投与した薬剤等の濃度
の測定手段として、広く用いｌ−Ｔ才＋ている。なかで
も、赤血球凝集反応法、ラテックス凝集反応法は、測定
操作がＨ＋Ｊ便で測定に要、する時９間が蝮かいなどの
利点により、又、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、螢
光免疫１ｔｉ１１足法は感度が高く、定量性に優れてい
るがどの利点により好んで用いろ４る。

こｔ′１らの測定法の原理を簡単に説、明すれば次のと
おりである。

（１）凝集反応法；赤血球や高分子ラテックスなとの倣
粒子状の相体（以下、固相という）Ｋ結合させた抗体に
幻して、未知量の測定抗原を反応させると、その存在Ｊ
ｉｌ比例して抗原は固相に結合させた抗体に結合し、同
相が凝集する。その凝集の程度を測定し、濃度既知の物
質を同様の操作で測定した時の凝集の程度と比較して未
知量の抗原量を測定する。

（２）？ン１？イタチ法；未知の量の非標識抗原（測定
抗原）と同相に結合させた抗体とン反応させる（館１反
応）と、測定抗原と抗体は結合して抗原抗体仲台体を形
成する。

こｔｌＫ、一定量の標識抗体を反応させる（第２反応）
と、標識抗体は前記却合体に結合するが、複合体の結合
能ン越えた分の標識抗体は、結合せず遊離の状態でイＪ
：圧する。次Ｋ。

同相と液相ケ分離し、固相又は液相の標識剤の活性？測
定し、同時Ｖｃ飽度既ス（１の非標識抗原を用いて同様
に操作して作成１．た標準曲線により、未知の址の非標
識抗原量を測定する。

（３）　　競合反応法；未ガの量の非標識抗原（測定抗
原］と標識抗原の一定量とを固相に結合さセた抗体に対
して競合的に反応さセると、非標識抗原と標識抗原と汀
それぞれの存在量に反比例して抗体をで結合する柳識抗
原の６；°が増減する。次に同相と液相ン分離し、固相
又は液相の標識剤の活性を測定し、同１１７？ｉζ県度
既知の非標識物質を用いて同様Ｋ　Ｈ’作して作成した
標準白＃ｉｌＫより未知の悴の抗原」゛を測定する。

（４）　　イムノメトリック法；未知の量の非８￥１識
抗原（測定抗原）と固相に結＠させた抗原とを一定量の
標腔抗体に対してＭＤ＠的に反応さセると、非標識抗原
と固相に結合さセた抗原に＆１、それぞれのイギ在駿に
比例して標識抗体が結合し、非標識抗原の増減に反比例
して同相に結合する標識抗体の幸が増減する。次に固相
と液相を分離し、固相又は液相の（を隔剤の活性を測定
し、同時に濃度既知の非標識抗原を用いて同様に操作し
て作成した柚準曲線により、未知の量の非標識抗原量を
測定する。

本発明は上記免疫学的測定方法の原理を利用して一つの
被検液中に存在する２秤か以上の測定物質量の総和を一
度に測定する方法及び試薬を提供するものである。

本発明の測定方法は、従来の不溶性担体に抗体を結合さ
せて行なう免疫学的測定方法のすべて、例えば凝集反応
法、凝集閉止反応法、競合反応法、サン１？イツテ法、
イム、ツメトリック法等に適用できる。以下、凝集反応
法及びサントイツナ法を例として、本発明の方法を模式
的に説明する。

（１）凝集反応法；被検液中ＫＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄの４種類
の物質の存在が予測される測定を行う場合、抗Ａ抗体を
結合させた不溶性１層粒予相体、抗Ｂ抗体を結合させた
不溶性微粒子担体、抗Ｃ抗体を結合させた不溶性微粒子
相体および抗り抗体を結合させた不溶性微粒子担体を調
製し、この４種類の抗体結合不溶性微粒子担体を退的な
割合で混合して不溶化抗体懸濁液と１゛る。この懸濁液
に被検液を反応させるとＡ、　Ｂ、　Ｃ，Ｄの各測定物
質は濃度に応じてそれぞれ対応する抗体と結合し、微粒
子相体の凝集を生ずる。この凝集の程度を測定すること
により、１つの被検液中に含まれる２種類月上の測定物
質量の総和を一度に測定することかできる。

（２）　　サンドイッチ法；被検液中にＡ、１３、Ｃ％
Ｄの４種類の物質の存在が予測される測定を行う場合、
抗Ａ抗体を結合さセた不溶性担体、抗Ｂ抗体を結合させ
た不溶性担体、抗Ｃ抗体を結合させた不溶性担体および
抗り抗体を結合させた不溶性担体を調製し、この４稗仰
の不溶性担体を混合して被検液を反応させるとＡ。

Ｂ、Ｃ１Ｄの各」り定物質はそれぞれの対応する抗体と
結合する。必要であれば同相を分離した彼、抗Ａ抗体、
抗Ｂ抗体、抗Ｃ抗体および抗り抗体の各々に標識剤ケ結
合させた標識抗体を反応させると、各標識抗体はチオ１
ぞｔｌの対応する測定物質と結合する。次いで、１占」
相を分離した抜、固相に結合している標怖剤の活性の合
計を測定する。このようにして１つの被検液中に含ま才
する２種類以上の測定物質量の総和を一度に測定するこ
とが出来る。

本発明の凝集反応法において１史用する不溶性微粒子４
５体としては従来使用していたものと同様のものを使用
することができる。即ち、細菌や赤血球等の細胞等、ポ
リスチレンラテックス、カルボキシル基を導入したポリ
スチレンラテックス、スチレン−ジビニルベンゼンコポ
リマーラテックス、水酸基又はカルボキシル基を４人シ
タスチレンージビニルベンゼンコボリマーラテックス、
ポリビニルアルコールラテックス、ポリアクリル酸エス
テルラテックス、酢酸ビニル−アクリルコポリマーラテ
ックス等の有機筒分子ラテックス、シリカ、カーボンブ
ラック、アルミナ等の無機物質を使用することができる
。

又、上記の担体な組み合わせて使用することができる。

本発明のサンドイツチ法、競合反応法およびイムノメト
リック法の不溶性４１．１体の材質としては、ポリスチ
レン、ポリエチレン、ポリアクリル、テフロン、紙、ガ
ラス、アガロース等、従来の免疫学的測定において使用
されているものはすべて使用しつる。又、上記の担体を
組み合わセて使用することができる。父、その形状は太
鼓状、球状、棒状、盤状あるいは容器状、例えは光学セ
ル、試験管等のものが使用しつるが、他の形状であって
もよい。

本発明の測定方法において便用する抗体は通常の多クロ
ーン性抗体でもよいが、単クローン性抗体の使用は更に
好ましい結果を与える。例えば、測定感度及び粘度の向
」二、反応時間の短縮、荷異性の向上、測定操作の簡易
化、１ｌｉ４ｆ異反応の除去、血清や尿などの生体成分
による反応阻害の除去などである。但し、凝集反応法に
単りローン性抗体′？使用する場合には凝集を生起さセ
るｋめに１つの測定物質に対する２種類以上の単クロー
ン性抗体を混合して使用する必要がある。

不溶性押体に抗体又は抗原を結合させる方法は、にＪｉ
ｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、　４８：　１５
　（１９７３）；Ｊｏｕｒｎａｌ　　　ｏｆ　　ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ、１１６：　　１５５４　　（１９７６
）；３ｃｊｅｎｃｅ、　１５８：１５７０　（１９６７
ンに記述さねた方法と同様である。

例えば抗ＡＦＰ抗体、抗ＨＣＧ　抗体および抗ＣＥＡ　
抗体をそれぞれ不溶性担体に結合させる場合は、抗ＡＦ
Ｐ抗体を（Ｌ　５　ｔｎ？／ｌｅｌ、抗ＨＣＧ抗体Ｙ　
ａ　１　ｍＶ／１ｔｉｌ　、抗ＣＥＡ　抗体ヲａ２５ｍ
ｙ／ＫＪ　（７）濃度ＫＯ，０５Ｍリン酸緩衝生理食塩
水ｐＨ６，４（以下ＰＢＳ　　と略す）Ｋ溶解し、それ
ぞれ別個の不溶性相体と接触させ３７℃２時間反応させ
る。これを生理食塩水で洗浄して各抗体結合担体を製造
する。こわらの不溶化抗体を混合する割合は不溶性担体
に結合させる抗体の伯、抗体の力価によって異なるが、
概ね１〜１０二１〜１ｏ；１〜１０の範囲から選ばれ、
望ましくは１：１：１が適当である。また、測定を実施
するにあたって使用する検体の命、不溶性相体に結合さ
セる抗体又は抗原量及び比率、標識抗体又は４！１！識
抗原の量及び比率反応時間及び温度などの条件は測定す
る物質の種類、使用する抗体の力価、標識剤の種類など
によって異なるので各測定において最も適当な条件を実
験的に定める。

本発明の方法を競合反応に基づいて行なう場合、便用す
る偉職抗原は溜１足物質と競合反応によって不活イに抗
体に結合さセるものであるから、その抗原部分は原則的
には測定物質と同一′物質を用いる。しか（２、生理活
性？ｌ質は生体内に存在する場＠　６’！他の生体成分
と結合したり、一部代謝を受けたりして、生体外に存在
する場合と異なる場合があるので、ダ１．疫学的反応性
の観点から実質的π同一とみなし得るｌ物質は測定物質
と同一性を有する（物質と（２て同様に便用しうろ。

又、サン１１イツテ法、競合反応法、イム７ノメトリツ
ク法では２種類以上の抗体又は抗原をそｉぞれ別個の不
溶性相体に結合させて得た２種類以上の不溶化抗体の混
＠物と対応する標識抗体な用いて２種類以上の測定物質
針の総和を一度に測定できる１、又、２ｓ類以上の不溶
化抗体を使用した場合でも１種頭の標識抗体を用いれば
、被検液中にイｒイ［する２種類以上の物質の中から１
種類の物ηのみの単独の測定もｕＪ能である。

標識剤としては、酵素（例えｒｔ、ｆ　、ペルオキシダ
ーゼ、β−ガラクトシダー−１ピ、アルカリフォスファ
ターゼ、グルコースオキシダービ）、放射性同位元素（
例えば、＋２５　ｔ　３１１　）、螢光物質（例えば、
フルオレッセインイソテオシアネート、テトラメチルロ
ーダミンイソジオシアネート）などが用いられる。

本発明の測定方法は従来の免疫学的測定方法によって測
定し得た物質はすべて測定可能である。特に重要な測定
物質としては腫瘍の早期診断、治療効果の判断等に重要
な意義を有する腫瘍マーカーを挙げることができる。

例を挙げれば、癌胎児性抗原（以下ＣＥＡと略すン、α
−フェトプロティン（Ｌソ下ＡＦ’Ｐと略す２、絨毛性
性腺刺激ホルモン（以下ＨＣＧと略す）、β、−ミクロ
グロブリン（β２〜ｍ）、ベインツクフェトプロティン
（ＢＦＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰン、γ
−グルタミルトランスペプチダーゼ（ｒ　−ＧＴＰ）　
、妊娠関連β、−クリコブロチイン（ｓｐ、）、妊娠関
連α、−グリコプロティン（ＳＰｓ）、免疫１′１１制
酸性蛋白（ＩＡＰ）、免疫抑制性α２−マクロクログリ
ン、姶児件フＬリチン、フィフＩＩ　、／　−／／’ン
、ハフトクロヒン、ノノルシトニン、ステロ−（１’ホ
ルモン、ｖｎ、ホリｆｉンＮｉ、ＤＮＡ結合性蛋白、ｄ
ビアンナトリプシン、膵癌胎児性抗原ＣＰ　ＯＡ）％　
カラクトシルトランスフェラーゼＩＩ　（ＧＴ−１１）
　　などであり、ヤの１１３１．、現任研究の進められ
ているものもｆ６数ある。又拳血時の肝炎ウィルス感染
によって起こる肝炎の診断、予防に意義のある物列とし
てＢ型肝炎ウィルス抗原（ＨＢ　ｓ、　ＨＢ　ｃ、ＨＢ
　ｅ）　、非Ａ非Ｂｕ肝炎ウィルス抗原がおけられる。

異なる２棹類以上の測定成分の絹み台わセの例としては
■ＡＦＰ、ＣＥＡ％）ＩｃＧ；　　■ＳＰ３、フィブリ
ノーゲン；　（３）　ＡＩｉ’Ｐ、　ＣＥＡ、）ＩＣＧ
、　Ｓ）’、　、フィブリノ−ケン；■フィブリノーゲ
ン、・・ブトクロピン、フェリチン；■ハプトクロビン
、β、−ｍ、免疫抑制免疫抑制性αローマクログロブリ
ンアンチトリフシン；■ＡＬＰ、ｒ　−ＧＴＰ、　ＧＴ
−Ｉｆ　；■ポリアミン、ステロイドホルモン■Ｈ１３
Ｓ。

ＨＢｃ、Ｊ（Ｂｅなどを挙けることができる。

本発明の完成により、従来多む１の抗原を測定する場＠
にけ１つ１つの抗原を個々に測定していたため測定に長
時間を要していたが著しく測定時間を短縮すること毅；
出来た。又、必要とする被検液の槍も少量で済むようＫ
なった。

以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する
。

実施例１　フィブリノーゲン、ハプトグロビン及びフェ
リチンの総和の測定ａ）抗フィブリノーゲン抗体結合ラテックスの製造抗フィフ”リノーゲン抗体（Ｌ）　Ａ　Ｉ＜　ＯｒＬ）
　　を５−ｆ／ｍｌの濃度ｔ／ｃなるようにＰＢＳで希
釈し、その２ｍ／に１０％ポリスチレンラテックス（平
均粒子径０．４８μ、ダウケミカル）０．５ｍｌを加え
て攪拌し３７℃２時間反応させた１１反応終了後氷冷し
、遠心してＰＢＳで洗浄を？ｊ斤い、洗浄後１％牛血清
アルブミン（以下ＵＳＡと略す）を含むＰＬＳＳに懸濁
し、抗フィフ幸すハーゲン抗体結合ラテックスを製造し
た。

ｂ）抗ハフ’トグロビン抗体結合ラテックスの製造抗ハプトグロビン抗体（ＤＡＫＯ社ンの尚度をｔ　８　
ｔｎｙ／　ｔｕｌＫ　Ｐ　Ｂ　Ｓで希釈し、これと前ｉ
ｉｅ　ａ）と同様にボリヌチレンラテックスを用いて抗
ハプトグロビン抗体結合ラテックスを製造した。

Ｃ）抗フェリチン抗体結合ラテックスの製造抗フェリチ
ン抗体（ＤＡＫＯ社）の濃度を１．２ｍｙ／　ｍｌ　Ｋ
　希釈し、これとカルボキシル基を導入した１０％ポリ
スチレンラテックス（平均粒子径１２５μ、ダウヶだカ
ル）ヲ用いて＠記ａ）と同様に抗フェリチン抗体結合ラ
テックスを製造した。

ｄ）抗体結合ラテックス試薬の製造前：にａ）、ｂ）、Ｃ）で’Ａ造した抗りィプリノーグ
ン抗＃結合ラテックス、抗ハプトグロビン抗体結合ラテ
ックス及び抗フェリチン抗体結合ラテックスを２：５：
１の比率で混合し、抗体結合ラデックス試薬を製造した
。

ｅ）柳準溶液の調製フィブリ７ノーゲン（シグマＬ１）、ｌ・ブトグロビン
（シグマ社）、フェリチン（シグマｔＪ−）。

を各々１％ＢＳＡを含むＰＢＳで各々１２ｔｌ、６ｆｌ
。

３０、ｉ　５＋　Ｏｆｉ？／ｍｅ　＋　１２．６＋　３
＋　１−５ｗ　ＯＮｙ／　ｅ　；０・８・０．４．０．
２．α１，０μり／屑ＩＫｐＩｌ製した。

ｆ）　フィブリノーゲン、ノルブトグロビン及びフェリ
チンの測定前記Ｃ）で製造したフィブリノーゲン、・・ブトグロビ
ン、フェリチンの＠−濃度の溶液を２０μｌ　ずつカラ
ススライド上に取り、次（・で１％１３ＳＡな含むＰＢ
Ｓン５０μ！及び前記ゆで製造した抗体結合ラテックス
試薬を２０μｇ加えた。

この混合液列５分間攪拌しながら反応させ、凝集の程度
を肉眼で判定した。凝集のみらねないものを陰性；−１
凝集のみらねたものを陽性とし、その程度によって＋、
　　Ｉｌ−、＋ｔ＋の合計４段階で判定した。フィブリ
ノーゲン、ノーブトグロビン、フェリチンに対する感度
はそれぞれ１５　ｔｔ？／ｍｌ、　　１．５　ｍｆ／　
ｍｅ、０．１　ｔｉｆ！／ａｌ実施例２．　患者血清の
測定肝癌患者１５１’／Ｉ＋、胃癌゛患者２０例、大腸癌患
者１７例、肺癌患１１２例、各種良性疾患患者２５例、
健常人２Ｄ例の各々の血清を用いて、本発明による測定
４′行った。操作方法は実施例１　ｆ）と同様に行った
。測定の結果を第１表に示した。

第１表肝　　　癌　　　　１５　　　１　　　２　　　７　　
　５胃　　　　癌　　　　２０　　　　　５　　　４８
５大腸癌　１７　２　２　６　７肺　　　癌　　　１２　　　１　　　２　　　６　　　
３良性疾患　　２５　２０　　４　　１　　０健常人　
２０　１９　１　０　　Ｇ実施例＆　精製ＡＦＬ）及び抗ＡＦＰ抗体の製造ａ）精
製ＡＦＰの製造肝癌患者腹水５１から硫酸アンモニウムによる塩析法（
４５％上消、７０％沈殿）ＶＣより、ＡＦＰ粗抽出物１
＆２Ｉを得た。これを、兎抗ＡＦＰ抗体結合セファロー
ス４　Ｂ　（１ｍｙ／ｌＡ’セファロース）５０ｍｌを
用いたアフィニティークロマトクラフィーによりｒＲ製
して、精製ＡＰＩ’　９２４　ｍ？　ヲ得ｔ、：。

ｂ）単りローン性抗ＡＦＰ抗体の＄８！遣前記ａ）で製
造した精製ＡＦＰ　５０　ｔｔｙを完全フロイントアジ
−パント（ＦＣＡ）と共に雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮
下に投与した。１週毎に４回投与し、最終投与後４日目
に牌臓を摘出して牌細胞を採取した。ＤＬＩ　ｌ　ｂｅ
　ｃｃｎ　’　ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄＭＥＭ培地（以’
Ｆ　Ｄ　−ＭＥＭと略す）にて洗浄した区ｌＸ１０’個
乞計測して、１×１０７　個のマウスミエローマ細胞（
）’５−Ｎ５Ｉ／１−ＡＳ＋４−１）と混ぜ％３７℃で
４２．５％ポリエチレンクリコール１５４０および１５
％ジメチルスルフオキシＩＪを含むＤ−ＭＥＭＩ　ｔｔ
ｔｌ中で１分間融合させた。

この細胞Ｋ　ＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテ
リン、チミジン、１０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１
６４０培地）を２０ｍ７！になシ）ように加えて、９６
ウエル　マイクロプレートにα２ｙｎｌずつ分注して２
週間培養した後、増殖したウェル中の培養上清の抗体活
性を測定した。

次に活性の認めら才またウェルの細胞をＢＡＬＢ／Ｃマ
ウス胸腺細胞を含む１０％牛脂児血清加ＲＰＭＩ−１６
４０培地４０ｍｅ中Ｋ　ｍ　７ＪＤ　Ｌ　？、：。

この細胞浮遊液を９６ウエル　マイクロプレート２枚に
分注し、１週間培養して９株の抗ＡＦＰ抗俳産生性ノー
イブリＩＪ−マを得た。こわらを大量に培養し、そｔ’
ｔイｔ１得られた培養上清１１を精製ＡＦＰを結合した
セファロース４Ｂ　、　（０，５ＭＬｔ　ＡＦＰ／　ｔ
ｉｔセフ　７　ロース）５ｏ＋＋ｔ６を用（・たアフィ
ニティークロマトクラフイーによ’７　ｆｔ’ｆ製ヲ行
イ、ソｔｔソｔ１４．２〜１１６　ｍ９）１％クローン
性抗体ケ得た。各抗体の１．ｎｔ島を１〜９とした。

Ｃ）抗原認識部位の同定１）抗ＡＦＰ抗体結合試験管の製造Ｌｏｔ＆１〜９の単りローン性抗ＡＦＰ抗体ａ　５　ｍ
ｙｌｔ　ソｔｔぞれ含むＰＢｓ　１　ｖｔｌ　ｆ予メｆ
’ＢＳで洗浄した別々のポリスチレン製Ｋ　＠　Ｔ？　
Ｋ加え、３７℃３時間反応を行った＋ｚｐＢｓで洗浄し
て、それぞれの単クローン性抗体を結合させた試験管を
製造した。

１１）酵素標識抗ＡＦＰ抗体の製ｊｉｌｉ西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社クレー１
１；以稜ＨＲＰ　Ｏと略す）５イを０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩
衝Ｑ　１．　Ｏｙｎｌ　Ｋ溶解し、これＫ　Ｏ，１ｒｒ
ｔｌの１％１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンエ
タノール溶液を加え、１時間反応させた。さらに、１．
０−の０．０６Ｍ過ヨウ素酸す）　ＩＩウム溶液を加え
て３０分間反応させ、次に、１．０ｍｌの０．１６Ｍエ
チレングリコール溶液を加えて１時間反応させた俊、０
．０１Ｍ炭酸ナトリウム溶液ｐＨ９５ＶＣ対して透析し
た。この溶液に、前記ｂ）において製造した９種の抗Ａ
ＦＰ抗体５　ｍｆをそれぞれ加え、室温で３時間反応さ
せた後Ｋ　５　ｍｆの水素化硼累ナトリウムを加えて１
晩反応させた。さらに、０．ｏＩ　ＭＰＢＳ　ｐＨ７，
２Ｋ対して透析してＨＲＰＯ標識抗ＡＦＰ抗体を得た。

ｉｎ）　　抗原認識部ｆ１ｒの同定前記Ｃ−１）で製造した各抗ＡＦＰ抗体結合試験管に、
前記ａ）で製造したＡＦＰを１００ｎｐ／　ｔｔｔｌと
なる」こう１３ＢＳで希釈した標準液α１１Ｋｌおよび
前Ｎｒ：　ＩＩ）で製造したＨＲＰＯ伸識抗ＡＦＰ抗体
１００倍希釈溶液０．４　ｍｌを加え、５０分間反応な
行った。反応終了後、洗浄液で洗浄し、２０　ｍｙ　／
　ｄｌの０−７エニレンジアミンおよび６ｒｎＭ過酸化
水素を含む酵素基質溶液ａ　５　Ｉｌｌを加え３０分間
反応を行った。

１規定ｔｍ　ｒｌｌ　２　ｔｐｔｌを加えて酵素反応を
停止し゛た後、４９２ｎｍ［おける吸光度を測定し、反
応の得らむた組合せを＋、得られなかった組合せを−と
して第２表に示した。

第２表抗原認識部位の差より前記ｂ）で得られた９株の単りロ
ーン性抗ＡＦＰ抗体はＬｏｔＡｌ。

２、３．５．７の５株とＬｏｔ　Ａ　６０１株と、Ｌｏ
ｔ　Ａ　４．８．９の３株さの３種類に分別することが
でき、それぞれ抗ＡＦＰ抗体［Ａ］、ＣＢ）及び〔Ｃ〕
とした。このなかで不溶化抗体として〔Ａ〕、標識抗体
として〔ｃ〕を用いる。

実施例４．　精製（ＪＡ及び抗ＣＥＡ抗体の製造ａ）精
製ＣＥＡの製造大腸癌組織４０．９を細切し、これに１００ｍＡ’の蒸
留水を加えホモジナイザーを用いて破砕した。この液に
、同量の１．２Ｍ過塩素酸を加えて、攪拌下に３０分間
抽出を行った。遠心分離によシ上消を得、これを蒸留水
に対して透析してＣＥＡ粗抽出物を得た。

との粗抽出物を１０ｍ１！に濃縮して、あらかじめ生理
食塩水にて平衡化しておいた５ｅｐｈ−ａｒｏｓｅ　４
３３を用いてゲルＰａを行い、Ｐ、１分画を得た。これ
を同様に平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２００にて再
びゲル濾過を行い、第２分画を採取して２＃！／に濃縮
して精製ＣＥＡ１５５μＩを得た。

ｂ）単クローン性抗ＣＥＡ抗体の製造前記ａ）で製造したＮ製ＣＥＡを用いて実施例６−ｂ）
と同じ操作で抗ＣＥＡ産生性ハイプリドーマ８株を得た
。。

なお、マウスの免疫は各投与共に精ＮＣＥＡ５０μｙを
用いた。あらかじめ、Ｎ！腔に□、５ｍ／のプリメタン
（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン；和
光紬薬）を投与した雌性ＢＡＬＢ／ｅマウスの腹腔に、
ｌＸ１０’個の各ハイブリドーマを接種して、２週間後
に腹水を採取した。各腹水を０．０１Ｍリン酸緩価液ｐ
Ｈ７０で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースによりクロマ
トグラフィーを行ない、未吸着針１ｉ１１ｉを学クロー
ン性抗ＣＥＡ抗体として得た。実施例６−Ｃ）に準じた
抗原認識部位の同定試験の結果、各抗体は６種類にわけ
られ、各々５１．ｏｔ、２Ｌｏｔ、Ｉ　Ｌｏｔ、であシ
、それぞれ抗ＣＥＡ抗体〔Ａ〕、ＣＢ）及び〔Ｃ〕とし
た。このうちで、不溶化抗体として、〔Ａ〕、標識抗体
として〔Ｂ〕を用いる。

実施例５．　　ＨＣＧ−β及び抗ＨＣＧ−β抗体の作製
ａ）　　ＨＣＧ−βサブユニットの製造ＨＣＧ、　（２
０００ｉｕ／■）　１ｇを２−の００２５Ｍリン酸緩衝
液ＰＨ５，６に溶解し、あらかじめ同じ緩衝液にて平衡
化したＤＥＡＥ　−５ｅｐｈａｄｅｘＡ−５０５，９を
用いてクロマトグラフィーを行った。０．０５Ｍ！Ｊン
酸緩衝液ｐ、ｆ（５，６溶出分画を採取し蒸留水に対し
て透析して精製ＨＣＧ６０８■を得、これを凍結乾燥し
た。、このうち、３００■を１０Ｍ尿素（１）Ｈ４，５
）　１ｏ　ｍｌに溶解し、４０℃、１時間反応させた。

あらかじめ００６Ｍグリシンおよび１０Ｍ尿素を含む溶
液で平衡化したＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０
２９を用いてクロマトグラフィーを行い、０．２　Ｍグ
リシン、ＩＭＮａ（Ｊおよび８Ｍ尿素を含む溶液で溶出
して得た分画を生理食塩水に対して透析してＨＣＧ−β
サブユニツト１４７■を得た。

ｂ）抗ＨＣＧ−β抗体の製造前記ａ）で製造したＨＣＧ−βサブユニットを用いて実
施例３−ｂ）と同じ操作で抗ＨＣＧ−β産生性ハイプリ
ドーマ１１株を得た。これらの株よシ得られた抗体につ
いて実施例６−Ｃ）の方法に準じて抗原認識部位の同定
を行ない、それぞれ８　Ｌｏｔ、及び５　Ｌｏｔ、を包
含する２種類に分別し、それぞれ抗ＨＣＧ−β抗体［Ａ
］及びＣＢ）とした。このなかで、不溶化抗体とじて〔
Ａ〕、標識抗体として〔Ｂ〕を用いる。上記の組み合わ
せで、黄体形成ホルモン（ＬＨ）との交叉反応を調べた
ところ、ＨＣＧを１００％とすると、ＬＨは１％以下と
なった。

実施例６　　ＡＦＰ、ＣＥＡ及びＨＣＧの総和の測定ａ
）ポリスチレンビーズに抗体を結合した試薬の製造実施例３．４及び５で製造した単りローン性抗ＡＦＰ抗
体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＣＥ抗体を各々ｔＯ，０，８，ｏ
、５Ｔｎ９／ｍ／の濃度に希釈し、ポリスチレンビーズ
（直径２．５龍）を浸し、６７°Ｇ３時間反応させた。

反応終了後ＰＢＳで洗浄して、各抗体結合ポリスチレン
ビーズを作製し、各々１個ずつ３個を１組としてポリス
チレンビーズに抗体を結合させた試薬を製造した。

ｂ）標準溶液の調製実施例３−ａ）で製造したＡＦＰ、実施例４−ａ）で製
造したＣＥＡ及びＨＣＧ　（ＨＣＧモｆ　タ：持田製薬
）を１チＢＳＡを含むＰＢＳで各々８０゜４０、２０．
１０．５．　Ｏｎｆｉ／ｒｎｌ、　８０．４０．２０゜
１０、５．　Ｏｎｇ／ｒｎｌ、　　８０．４０．２０．
１０．５．０ｍ１ｕ／ｍｌに調製した。

Ｃ）　　ＡＦＰ、　ＣＥＡ及びトｔｃＧｏ測定ガラス試
験管（内径１０間、高さ６ｏ１ｎｍ）に前記ｂ）で調製
した各濃度（７）　ＡＦＰ、　ｃＥｈ、　Ｉ（ＣＧ標準
溶液ｏ１ｍｌを入ｈ、１％ＢＳＡを含むＰ１３Ｓ溶液を
０．４　ｍｌ加え、前記ａ）で製造したポリスチレンビ
ーズに抗体を結合させた試薬を１組づつ加えた。攪拌稜
、室温で２時間反応させた。反応終了後、ポリスチレン
ビーズを蒸留水で洗浄後、実Ｍｌｉ例３，４及び５で製
造した神職抗体を１％ＢＳＡを含むＰＢＳで抗ＡＦＰ標
識抗体２５００倍、抗ＣＥＡ標識抗体１ｏｏｏ倍、抗Ｈ
ＣＧ標識抗体６５０倍に希釈混合し、その０．５ｍｌを
加え室温で２時間反応させた。反応終了後ポリスチレン
ビーズを蒸留水で洗浄し、０．５４の基質溶液（６ｒｎ
Ｍ／ｌの過酸化水素、２０　ｍＭ／ｉｔのＯ−フェニレ
ンジアミンを含有スるＰＢＳ　）を加え、室温で遮光し
ながら３０分間反応させた。さらに１規定の塩酸２　ｍ
ｌを加え反応を停止し、４９２ｎｍの波長で吸光度を測
定した。比較のため、標識抗体を混合せずにそれぞれ１
種類ずつ反応させた場合についても測定した。結果を第
１図〜第４１シ１に示した。

なお、各図において使用した不溶化抗体と標識抗体の組
合せは第３表の通りである。

第５表この結果から、ＡＦＰ、　ＣＥＡ及びｆ（ＣＧはその間
に交叉反応がないから、これらの物質が混在していても
個別の標識抗体を使用すればそれぞれ個別に測定すると
とができ、又、標識抗体が混合物の場合であってもそれ
ぞれ対応する抗原と抗体のみが反応し、他の物質の存在
によって反応性が影響されないことがわかる。

実施例Ｚ　患者血清の測定肝癌患者１０例、胃癌患者１０例、大腸癌患者１０例、
各種良性疾想恵者１０例及びイ・小常人１０例の各血清
についてＡＦＰ、　ＩＡ及びＨＣＧの総量を測定した。

測定は標準溶液又は被検血清をｏ、　１　ｍｌ使用し、
実施例６−Ｃ）と同様に行なった。測定値は４９２　ｎ
ｍの吸光度をそのま＼及びその吸光度をＣＥＡの４１１
．Ｉｉ準準線線あてはめてＩＡ換算した値で表わした。

々お比較のため同一検体についてＡＦＰ、　ＣＪｔＡ及
びＨＣＧをそれぞれ個別にも測定した。結果を第４表に
示した。

第４表第４表つづき癌の発生を疑うべき診断基準値をそれぞれＡＦＰ　１０
　ｎｇ／ｍｌ、ＣＥＡ　５　ｎ９／ｍ１．　ＨＣＧ　５
　ｍｉｕ　／　ｍ１以上と仮定した場合の単項目測定で
の陽性率及び本発明の方法によってこれらの三種の物質
を総量として測定したときの４９２　ｎｍの吸光度が０
、３５０以上又はその吸光度をＣＥＡＪ外Ｆｌ：　Ｌだ
場合、８、５　ｎ９／ｒｒｔ１以上を癌陽性としたとき
の、上記第４表の測定における疾患側陽性率を第５表に
示した。

第５表３種類の腫瘍マーカーについて個別に測定した値の１種
類以上が基準値を越えた患者を癌陽性とすると、６ｓ類
の腫瘍マーカーを総量として測定した場合の癌陽性率と
同じであった。このことは癌の診断にあたって、実質上
、腫瘍マーカーを個別に測定する会衆はなく、総１６志
して測定した値から診断することが可能であることを示
すものである。

実施例８　フィブリノーゲン及びＳＰ３の総和の測定ａ）セファロース４Ｂに抗体を結合した試薬の製造抗フィブリノーゲン抗体（１）ＡＫＯ社）および抗ＳＰ
３抗体（ＤＡＫＯ社）をそれぞれ５および３■／ｍｌの
濃度に０．１Ｍ炭炭酸水ナナトリウム緩衝液ｐＨ８，３
で希釈し、各５　ｍｌにＣＮＢｒ活性化セファロース４
Ｂ（ファルマシア社）５ｉ／ヲ加え室温で２時間反応さ
せる。反応終了後、０．５Ｍ食塩を含む０．１Ｍ酢酸緩
衝液で洗浄後、ＰＢＳで洗浄し、抗フィブリノーゲン抗
朱詰合セファロース４Ｂおよび抗Ｓ　Ｐｓ抗体結合セフ
ァロース４Ｂを作製した。これを１＝１の割合で混合し
、セファロース４Ｂに抗体を結合させた試薬を製造した
。

ｂ）フィブリノーゲン標準溶液の調製フィブリノーゲン（シグマ社）を１％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓで８０．４０．２０．１０．５．０１１９７’ｍｌに
調製した。

Ｃ）　　ＳＰ３標準溶液の調製Ｈａｎｓ　Ｂｏｈｎらの方法（Ｂｌｕｔ　Ｂａｎｄ　５
ｓ　：　５７７〜５７８．１９７６）に従い、胎盤５　
ｋｇを生理食塩水で抽出して、リパノールと硫安で分画
後、抗ｓｐｓ抗体結合セファロース４　Ｂ　（１〜／ｍ
ｌセファロース）５０ｍＡ！を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーで精製し、精製Ｓｌ）、３．７ｍ９を
得た。この精製ＳＰ３を１チＢＳＡを含むＰＢＳテ８０
．４０．２０．１０．５．　Ｏｆｉｇ／Ｍに調製した。

ｄ）酵素標識抗フィブリノーゲン抗体及び酵素標識抗Ｓ
Ｐ３抗体の製造抗フィブリノーゲン抗体及び抗ＳＰＡ抗体を用いて実施
例５−ｃ）−ｉｉ）と同様に操作して酵素標識抗フィブ
リノーゲン抗体及び酵素標識抗ＳＰ３抗体を製造した。

ｅ）フィブリノーゲン及びＳＰ、の測定前記ｂ）および
Ｃ）で製造した各濃度のフィブリノーゲン及びＳＰ３標
準溶液ｏ、　１　ｍｌづつを別々のガラス試験管に入れ
、１１ＢＳＡを含む））ＢＳ溶液を０．４　ｔｎｌ加え
、前記ａ）で製造したセファロース４Ｂに抗体を結合し
た試薬０．２　ｍｌを加え、攪拌後、室温で１時間反応
させた。

反応後遠心し、蒸留水で洗浄後、前記ｄ）で製造した抗
フィブリノーゲン標識抗体を１５００倍、抗ＳＰ３標識
抗体を１０００倍に希釈混合した液を０．５　ａｔ加え
、室温で１時間反応させた。

反応終了後、遠心して蒸留水で洗浄し、０．５ｍｌの基
質溶液（６ｍＭ／Ｉｔの過酸化水素、２０ｍＭ／Ａ’ｏ
ｏ−フェニレンジアミンを含有するＰＢＳ　）を加え、
室温で遮光しながら５０分間反応させた。さらに１規定
の塩酸２　ｍｌを加え反応を停止し、４９２ｎｍの波長
で吸光度を測定した。

結果を第５図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第４図は実施例６におｉする標準曲線を表
わすグラフでちゃ、第５図は実施例８における標準曲線を表わすグラフであ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）　　測定物質に対する抗体又は抗原を結合させた
不溶性担体に、測定物質を含む被検液を反応させること
によって生体中に存在する物質を測定する免疫学的測定
方法において、不溶化抗体又は不溶化抗原がそれぞれ異
なる２８！類以上の測定物質に対する抗体又は抗原をそ
れぞれ別個の不済性担体匠結合させて得た２種類以上の
不溶化抗体又は不溶化抗原の混合物からなることを特徴
とするそれぞれ異なる２種類以上の測定物質量の総和を
一度に測定する免疫学的測定方法。
（２）　　免疫学的測定方法が凝集反応又は凝集阻止反
応である特許請求の範囲第１項記載の測定方法。
（３）　　抗原又は抗体を結合さセる不溶性担体が赤血
球、高分子ラテックス又はカーボンブラックである特許
請求の範囲第２項記載の測定方法。
（４）　　免疫学的測定方法が酵累免疫測定法、放射免
疫測定法又は螢光免疫測定法である特許請求の範囲第１
功記載の測定方法。
（５）　　抗体が腫瘍マーカーに対する抗体である特許
請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項記載の測
定方法。
（６）　　抗体が単クローン性抗体である特許請求の範
囲第１頂ないし第５項のいずれか１項記載の測定方法。
（７）　　測定物質に対する抗体又は抗原を結合さセた
不溶性担体に、測定物質を含む被検液を反応さセること
によって生体中に存在する物質を測定する免疫学的測定
試薬において、不溶化抗体又は不溶化抗原がそれぞ７１
１％なる２種類以上の測定物質に５１’１する抗体又は
抗原をそれぞね別個の不溶性担体に結合させて得た２種
類以上の不溶化抗体又は不溶化抗原の混合物からなるこ
とを特徴とするそれぞれ異なる２種類以上の測定物質量
の総和を一度に測定する免疫学的測定試薬。
（８）　　凝集反応又は凝集阻止反応を利用した特許請
求の範囲第７項記載の測定試薬。
（９）不溶性担体が赤血球、高分子ラテックス又はカー
ボンブラックである特許ＮｆＩ求の範囲第８項記載の測
定試薬。ＧＯ酵素免疫測定法、放射免疫測定法又は螢光免疫測定
法を利用した特許請求の範囲第７項記載の測定試薬。Ｏｐ　　抗体が腫瘍マーカーに対する抗体である特許請
求の範囲第７項ないし第１０項のいずれか１項記載の測
定試薬。０４　　抗体が単クローン性抗体である特許請求の範囲
第７項ないし第１１項のいずれか１項記載の測定試薬。