JPS62201364A - 高分子量 癌胎児性抗原の免疫検定法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は免疫化学の分野に属する。

背景の技術および問題点 癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は結腸に腫瘍を持つ患者に通常
存在する腫瘍関連抗原の１つである。ゴールドおよびフ
リーマンはＣＥＡを結腸ガンの一成分として最初に説明
した。

Ｇｏｌｄ、Ｐ・等Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　１２１４３
９−４６２゜ＣＥＡはそれ以後他のタイプの癌の変種と
して研究されてきた。Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ　Ｄ、　Ｍ
、等ｒＡｎｎ。

Ｉｎｔｅｒｎ、Ｍｅｄ、Ｊ　　９４．４０７−４０９（
１９８１）；　Ｇｏ、Ｖ、ＬＷおよびＺａｍｃｈｅｃｋ
　Ｎ、、　ｒｃａｎｃｅｒＪ　５０２６１８−２６２３
（１９８２）。

ＣＥＡ検定はポリクローナル抗体および低分子量のＣＥ
Ａ成分に対するモノクローナル抗体を用いて行われてき
た。しかしながら、これらの検定には次のような欠点が
あった。

（１）潜伏性の癌を信頼性を持って検出するには感受性
が不十分である。

（２）　　この検定では、良性および悪性腫瘍をしばし
ば区別できない。

（３）ポリクローナル抗体に基く検定では異なる分子量
を持つある範囲のＣＥＡに対して交叉反応を典型的に示
す。（この現象に伴う問題は、正常交叉反応性抗原（Ｎ
ＣＡ）およびその他の低分子量物質に対する交叉反応性
にある。ＨｅｒｌｙｎＭ６等ｒ）ｈｂｒｉｄｏｍａＪ　
２３３２９−３３９（１９８３）；５ｈｉｖｅｌ）’　
Ｊ、Ｅ等（Ｓｔｅｗａｒｔ　５ｅｌ１編）　ｒＨｕｍａ
ｎａＰｒｅｓｓＪ　Ｃ１１ｆｔｏｎ　Ｎ、Ｊ、　（１９
８０））。

これらの欠点により、ＣＥＡ検定は「健康（すなわち、
結腸ガンを持たない）」に見えるヒトについての癌の診
断には使うことができない。現在、利用できるＣＥＡ検
定は結腸直腸癌患者の再発を予測するのに主として使わ
れている。より感受性が高く、特異性のあるＣＥＡ検定
が、現在の臨床用途を改善し、健康に見えるヒトのガン
の診断のためにＣＥＡ検定を使用するためには必要とさ
れる。

問題点を解決するための手段 本発明は高分子１（１８０ＫＤ）癌胎児性抗原を定量的
に測定するための改良された固相免疫検定、およびその
検定を行うための試薬を含む診断試験キットに関する。

この検定はサンドイッチまたは「二重抗体」型のもので
あり、高分子量ＣＥＡに対スる２つのモノクローナル抗
体、１１１６ＮＳ−３ｄ（６ｄ６抗体）およびＣＯＬ−
１抗体の独特の組合せを用いる。これら抗体の１つ（好
ましくは３ｄ６）の１つを使用じて固相吸着剤を形成し
、他の抗体（好ましくはＣＯＬ−１）を標識化抗体とし
て用いる。

３ｄ６およびＣＯＬ−１を用いるサンドイッチ免疫検定
はフォワード、リバースまたは同時タイプのもので良い
。フォワード型では、試験されるべきサンプルをＣＯＬ
−１または３ｄ６抗体を含む固相吸着剤と反応させる。

インキュベーションの間、サンプル中のＣＥＡは固相に
結合される。その後、標識化された抗体であるＣＯＬ−
１（免疫吸着剤を生成するのに３ｄ６が用いられる場合
）、または６ｄ６（免疫吸着剤を生成するためにＣＯＬ
−１が使用される場合）を吸着されたＣＥＡと反応させ
て、標識化抗体−ＣＥＡ−吸着された抗体から成る三重
複合体を生成する。固相に結合する標識はサンプル中の
ＣＥＡＯ量に直接比例する。

リバース型においては、標識化抗体をサンプルとインキ
ュベートし、可溶性ＣＥＡ−抗Ａ−合体を生成する。次
の段階において、固相を用いて標識化複合体を吸着し、
そして結合程度について固相を分析する。

同時法においては、固相免疫吸着剤、標識化抗体お・よ
びサンプルをいっしょにインキュベートする。−回のイ
ンキュベーションの後、結合した標識について固相を分
析する。

この検定を実施するための試薬を含む商業用キットは、
３ｄ６またはＣＯＬ−１抗体のいずれかを含む固相免疫
吸着剤、標識化３ｄ６またはＣＯＬ−１抗体の溶液、お
よび必要によりＣＥＡスタンダードを含めることができ
る。

本発明のＣＥＡの検定では２つの抗ＣＥＡモノクローナ
ル抗体の独特の組合せを用いる。第一の抗体はコブロフ
スキー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　）等の米国特許第４，３
４９，５２８　号に記述サレテイル３ｄ６（１１１６Ｎ
ｓ−６ｄ）抗体である。この米国特許の記述は、本明細
書に含まれるものとする。この抗体は１８０．ＯＱＩダ
ルトン（１１０ＫＤ）の分子量の形態であるＣＥＡに特
異的である。

第二の抗体はＣＯＬ−１抗体であり、ナショナルキャン
サーインスチチュート／ＮＩＨ１ベセスダ、メリーラン
ド（米国）のシェフエリ−シュロムによって以下に説明
するように調製された。

ＣＯＬ−１はＧサブクラス２αのムリン抗体であり、１
８０ＫＤのＣＥＡに特異的である。ＣＯＬ−１抗体およ
びＣＯＬ−１ハイプリドーマはＡＴＣＣに／１６　Ｓ　
Ｄ　８５７　　として寄託されている。この明細書で使
用するｒＣＥＡＪ　という用語は１８０ＫＤ　　の分子
を意味する。

本発明の検定はサンドイッチまたは「二重抗体」免疫検
定であり、ここで抗原（ＣＥＡ）はそれを過剰の標識化
抗体と反応させることによって直接測定される。この検
定では、ＣＥＡに特異的に結合する固相免疫吸着剤上に
ＣＥＡを固定する。検定の態様により、ＣＥＡは標識化
抗ＣＥＡ抗体との反応前または反応後に固定化される。

免疫吸着剤は適当な固相支持体にろｄ６またはＣＯＬ−
１（好マシクハ、６ｄ６）モノクローナル抗体を固定ス
ることによって作られる。標識化抗体はＣＯＬ−１抗体
または３ｄ６抗体（好ましくは、ＣＯＬ−１抗体）のい
ずれかで良い。固相に結合した標識はサンプル中のＣＥ
Ａの量に直接比例する。

サンドイッチ免疫検定はフォワード、リバースまたは同
時法で行うことができる。フォワード法においては、３
ｄ６およびＣＯＬ−１モノクローナル抗体により、１８
０ＫＤ　ＣＥＡに対して特別に特異的かつ高感度のサン
ドイッチ免疫検定が行われる。好ましい態様では、３ｄ
６抗体が免疫吸着剤を生成するために用いられ、ＣＯＬ
−１抗体が標識化抗体（トレーサー）として作用させ、
以下に概説するように検定を行う。これらの２つの抗体
により、検定は高分子量ＣＥＡに特異的であり、かつ高
感度である。すなわち、血漿または血清サンプル中の０
．２５　ｎｇ／ｍｌのＣＥＡ濃度も検出できる。

このことは現在性われているＣＥＡ検定の少くとも２倍
の感度の増加を示す。

ＣＥＡ検定のフォワードサンドイッチ法においては、３
ｄ６またはＣＯＬ−１抗体な固相に固定し、ＣＥＡに特
異な免疫吸着剤を作る。ＣＥＡについて試験されるべき
液体サンプルは免疫吸着剤と共にインキュベートされる
。インキュベーションは、液体サンプル中のＣＥＡが固
相免疫吸着剤に結合するのに十分な期間維持される。イ
ンキュベーションの後、固相免疫吸着剤はインキュベー
ション混合物から分離される。免疫吸着剤を洗浄して非
結＝ｃＥｈ、および液体サンプル中に存在し得る非特異
的結合蛋白質のような干渉物質を除去することもできる
。固定化抗体に結合したＣＥＡを含有する免疫吸着剤は
その後、標識化３ｄ６またはＣＯＬ−１抗体と共にイン
キュベートされる。再び、免疫吸着剤に結合したＣＥＡ
に対して標識化抗体が確実に結合するのに十分な期間、
インキュベーションヲ行つ。第二のインキュベーション
の後、更に洗浄して固相免疫吸着剤から未結合の標識化
抗体を除去できる。固相免疫吸着剤に結合した標脆化抗
体を次いで測定し、検出された標識化抗体の量は液体サ
ンプル中のＣＥＡ濃度の指数として用いる。

リバース法においては、インキュベーション溶液は被検
液体サンプルと可饅性標識化３ｄ６またはＣＯＬ−１と
から構成される。適当なインキュベーション後、こ゛の
浴液を３ｄ６またはＣＯＬ−１抗体を含有する固相免疫
剤着剤と接触させる。更にインキュベーションした後、
免疫吸着剤をインキュベーション混合物から分離し、次
いで一般的には洗浄し、かつ免疫吸着剤に結合した標識
を液体被験サンプル中のＣＥＡＯ量の指数として採用す
る。

同時法においては、液体サンプル、標識化抗ＣＥＡ抗体
および固相免疫吸着剤によってインキュベーション混合
物を作る。異なる抗原決定基と反応する抗体を用いる場
合、それらは結合について競合しない。適当なインキュ
ベーションの後、固相免疫吸着剤を混合物から分離し、
免疫吸着剤に結合した標識を測定して、被検液体サンプ
ル中のＣＥＡＯ量の指数とする。

種々の態様の検定における各インキュベーション工程に
ついて、インキュベーションの時間および条件は固定化
抗体および標識化抗体に対するＣＥＡの結合を最高にす
るように選ばれる。２回のインキュベーション工程が要
求されるフォワード法の検定においては、固定化ＣＥＡ
抗体を含有する固相免疫吸着剤は液体サンプルと、最大
の結合を得るために、室温ないし４５°Ｃで約１〜４時
間インキュベートする。全体の検定は約２時間で行うこ
とができる。最大の結合を与える条件およびパラメータ
ーは、通常の実験だけで他の態様の検定について決定す
ることができる。

本発明の種々の固相検定法において、免疫吸着剤は液体
サンブノペ標識化抗体またはその両者を含むインキュベ
ーション混合物から分離される。

分離は沈降または遠心分離のようなどの慣用的分離法に
よっても実°施できる。好ましくは、必ずしも必要では
ないが、免疫吸着剤は、第二のインキュベーション媒体
との混合（必要とされる場合）前に、および免疫吸着剤
に結合する標識の量を測定する前に洗浄される。一般に
、洗浄は水で６回行う。この洗浄により、検定の精度お
よび感度に影響を与えることがある非特異性干渉物質ま
たは過剰の標識化抗体が除去される。

本発明の免疫検定は液体サンプル中のＣＥＡを検出し、
定量するために使用される。液体サンプルとは実質上、
全ての生物学的流体、例えば、血液、血漿または血清の
ような血液成分、尿、リンパ液等である。

本発明の検定で使用される固相免疫吸着剤は、抗ＣＥＡ
抗体を固相支持体にカップリングすることによって作ら
れる。多くの種類の固相支持体が使用できる。良く知ら
れている固相支持体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプ
ロピレン、デキストランおよびその他の材料から作られ
るビーズ；上記材料から作られるかまたは上記材料で被
覆された管状体等である。抗体は固相支持体に、アミド
またはエステル結合による共有結合、または吸着のよう
な手法で共有または非共有結合できる。当業者であれば
、その他の多（の適切な固相体、およびその固相体上へ
の抗体の固定化法を知っているであろうし、また、通常
の実験だけでその使用を確実にすることができる。

ＣＯＬ−１または３ｄ６モノクローナル抗体は検定に使
用するためにいくつかの方法によって標識化できる。抗
体は放射性物質、例えば１１２５　；螢光材料のような
光学的標識；西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、
塩基性ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ等の酵素；ま
たはその他の技術により標識化できる。抗体はビオチニ
ル化することもでき、標識化アビジンを使用して免疫吸
着剤への結合を調べることができる。

抗ＣＥＡ抗体を１１２５で標識化する方法としてはクロ
ラミンＴ法およびポルトン−ハンター法がある。抗体は
酵素との直接または間接的結合により酵素標識化できる
。

別の態様の検定においては、第二の可溶性抗体を標識な
しで用いることもできる。第二の抗体に対する標識化抗
体は免疫吸着剤への結合を確認するのにも使用できる。

例えば、標識化抗（ムリンＩｇＧ）抗体を使用して、免
疫吸着剤に対するＣＯＬ−１結合を評価することもでき
る。

液体サンプル中のＣＥＡＯ量を決定するため、免疫吸着
剤に結合した標識の量または未結合の標識化抗体（すな
わち、可溶性の形で残っている標識化抗体）のいずれか
を測定する。一般に、免疫吸着剤に結合した標識を測定
することが好ましい。

何故ならば、極めて低濃度の抗原については、免疫吸着
剤１ｃは非常に少量の標識化抗体しか結合しないからで
ある。したがって、正確を期するために、免疫吸着剤に
結合する標識を直接測定しなければならない。標識は、
それが放射性ガンマ線放射体である場合はガンマ計数器
で、また例えばそれが螢光物質である場合は螢光計で、
検出できる。

酵素標識の場合、酵素に対する競合物質を用いる比色法
によって検出を行うことができる。

次いで、検出された標識の測定量を、標識の量とＣＥＡ
Ｏ量との間の予じめ決定された量的関係と比較する。こ
の量的関係は、既知量のＣＥＡを含有する標準液体サン
プルによる検定を行うことにより決定できる。異なる量
のＣＥＡを含有するいくつかのサンプルについて、検定
を行い、そして免疫吸着剤に結合または非結合のいずれ
かの標識の量を決定し、標識の量とＣＥＡＯ量との定量
的関係を定める曲線を作る。この曲線を参照して。

未知量のＣＥＡを含有する液体サンプル中のＣＥＡの量
を検出された標識の量から決定できる。３ｄ６およびＣ
ＯＬ−１モノクローナル抗体は、鉱油でプライミングさ
れたマウスの腹腔中に抗体分泌ハイプリドーマ細胞を注
射し、次いで抗体が分泌される腹水を採取することによ
って検定に使用するために多量に生産できる。抗体はア
フィニティークロマトグラフィーにより、腹水からＭ装
できる。

精製抗体は、０．１％アジ化ナトリウムのような防腐剤
を含有するホウ酸塩緩衝化食塩溶液中で使用時まで保存
できる。

本発明の検定を行うための試薬を検定用キットにするこ
ともできる。例えば、キットは、３ｄ６またはＣＯＬ−
１のいずれかを含む固相免疫吸着剤。

標識化３ｄ６またはＣＯＬ−１モノクローナル抗体およ
び、必要により、ＣＥＡのスタンダードから構成できる
。ＣＯＬ−１および３ｄ６モノクローナル抗体はキット
にするのに適している。この抗体によって調製される試
薬は保存した場合、長期にわたって安定だからである。

特に好ましい態様の検定は以下に詳しく説明する固相免
疫酵素検定（Ｉ　ＥＭＡ　）である。３ｄ６抗体を、例
えば物理的吸着（例えば、Ｋインチ径のビーズ１個当り
６ｍ９の抗体）によりポリスチレンビーズに固定する。

３ｄ６で被覆したビーズは乾燥形態で少くとも６ケ月間
保存し、検定用に供することができる。ＣＯＬ−１抗体
を例えば直接結合によってＨＲＰで標識化する。

検定を行うために、このポリスチレンビーズを患者の血
清または血漿サンプルと共にインキュベートする。イン
キュベーションは約４５℃で約１時間行う。次いで、ビ
ーズをサンプルから分離し、洗浄（例えば水洗３回）す
る。次いで、ビーズなＣＯＬ−１−ＨＲＰ　　複合体の
溶液と共に４５℃で約１時間インキュベートする。その
後、ビーズを溶液から分離し、前述のように洗浄し、そ
してビーズに結合した酵素標識を測定する。ビーズに結
合したＨＲＰ活性の測定は、慣用の比色法によって行う
ことができる。例えば、ビーズは基質である０−フ二二
レンジアミン−２ＨＣＡ　（ＯＰＤ　）と共に室温で約
１５−３０分間インキュベートする。酵素反応はＩＮ硫
酸の添加により停止され、転化基質の量は４９２画にお
ける反応溶液の光学濃度を測定することにより決定され
る。光学濃度はサンプル中のＣＩＡの濃度と比例する。

ＩＥＭＡ実施のためのキットは次の試薬を含めることが
できる。

（α）　６ｄ６抗体を被覆したポリスチレンビーズを入
れた容器； （ｂ）ＨＲｐで標識化したＣＯＬ−１抗体の溶液を入れ
た容器。

キットのその他の構成員としては、 （Ｃ）　　０−１２０　ｎｇ／Ｉ”　の濃度範囲でＣＩ
Ａを含むヒト血清をベースにする溶液（例えば、２０％
血清）の入った容器 （（’）　　１０　ｎｇ／ｍｅでＣＥＡを含有するヒト
血清のような正のＣＥＡ対照、および （６）ＨＲＰ基質。

本発明の３　ｄ　６／ＣＯＬ−１検定はいくつかの利点
を持つ。最も重要なのは、正常者、喫煙者および良性の
結腸疾病患者について検出される低いＣＥＡ値によって
示されるように、本検定は誤りの陽性率が低いことにあ
る。患者群についてのＣＥＡ値の統計的分布に基づけば
、この検定は結腸直腸ガンについて診断の価値がある。

更に、この検定は非常に高感度である。０．２５ｎｇ／
ｌｎｌ程度のＣＥＡ濃度も十分な信頼性で検出できる。

更に、３ｄ６およびＣＯＬ−１抗体は、高分子量の形態
にあるＣＥＡに対して特異的であるから、血漿または血
清サンプルを抽出する必要がない。

本発明はさらに次の実施例により示される。

実施例 細胞抽出物および膜調製物 新生細胞株および正常ヒト成人組織はワシントンＤ、Ｃ
，、ジョーク・ワシントン大学、外科病理学部から入手
した。組織および細胞株の細胞抽出物および部分精製膜
はコルチャー（Ｃｏｌｃｈｅｒ、Ｄ、　）らのＣａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅｓ、、　４１：１４５１〜１４５９（１９８
１）に記載されるようにして調製した。タンパク質濃度
はローリ−（Ｌｏｗｒｙ）らのＪ、Ｂｉｏｌ、　−Ｃｈ
ｅｍ、、　１９３：２６”ｒ−２７５（１９５１’）に
記載の方法により測定した。

生後４週目のＢＡＬＢ／ｃ　マウスは等容量の完全フロ
インドアジュバント中に乳化した結腸癌の細胞抽出物ま
たは膜に富む両分１００μｇを腹腔内注射することによ
り免疫化した。７日後等容量の不完全７０インドアジユ
バントに乳化した免疫原１００μｇを腹腔内に追加接種
した。さらに７口径免疫原１０μｇを静脈内に追加免疫
注射し、３口径融合のために牌臓を摘出した。

ＭＡｂ　　ＣＯＬ−９，−１２，−１１および−１５の
生成のために用いた免疫原は、リンパ腺へのヒト結腸癌
転移物の抽出物であった。ＭＡｂ　　ＣＯＬ−２の生成
のために用いた免疫原は一次ヒト結腸癌の抽出物であっ
た。ＭＡｂ　ＣＯＬ−３，−５，−６，−７，−８゜−
１０および−１４の生成のために使用した免疫原は、上
記試験で使用した一次結腸癌の部分精製膜調製物であっ
た。２種類の結腸癌転移物（１つはリンパ腺、も５１つ
は牌臓）の抽出物および一次結腸癌の抽出物はＭＡｂ　
　ＣＯＬ−１，−４および−１１の生成のための遂次免
疫原として使用した。リンパ腺転移物の抽出物１００μ
ｇを一次免疫原として使用し、続いて牌臓転移物および
一次結腸癌抽出物１００μｇで遂次免疫化した。最終の
静脈内追加免疫は両方の転移物および一次結腸癌抽出物
１００μｇの混合物から成っていた。

体 体細胞ハイブリッドはワイアー（Ｄ、　Ｍ、Ｗｅ　ｉｒ
　）編染、実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ
　ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ）　、　　ｐ、　２５．　１′２５．７＋オツクス
フオード・バックウェル・サイエンティフィック・バプ
リケーションズ、１９７８におけるハーゼンバーブ（Ｈ
ｅｒｚｅｎｂｅｒｇ）らのゞ抗体生産細胞をもつ骨髄腫
とＴ細胞をもつ１９７７球との細胞ハイブリッドに記載
の方法を若干変更して用いることにより形成した。コル
チャーらの上記文献を参照されたい。全てのハイプリド
ーマ細胞株は限界希釈法により２回クローニングした。

１５個の同定されたハイプリドーマ培養物はどれもマイ
コプラズマの存在について陰性であることが判明した。

免疫グロブリンのアイソタイプはコルチャーらの上記文
献に記載されるようにして調べた。

各ＭＡｂからのハイプリドーマ組織培養上清の単一プー
ルを以下で述べる全ての実験のために使用した。こうし
てＭＡｂ力師の差は１つの実験を他の実験と比較するこ
とにより除外することができる。抗ＨＣＥＡ、ＩｇＧ１
はカリフォルニア州。

ラジョラ、ハイプリチク社から購入した。ＭＡｂＢｌ、
１．ＩｇＧ２ａはＣＥＡおよびＣＥＡ関連決定基と反応
性であり、Ｉｍｍｕｎｏａｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　
り。

２１５−２５８（１９８３）におけるコルチャーらの９
ヒト乳＠ｉ関連抗原に対するモノクローナル抗体および
それらの診断、予後および治療用途“に記載されている
。

細　　　　胞 ＢＡＬＢ／ｃ　　非分泌骨髄腫細胞株、Ｐ　３−　Ｎ５
１−Ａｇ４−１　（ＭＳ−１）はメリーランド州ベテス
ダ、ＮＩＨのキム（Ｊ、　Ｋｉｍ）博士から入手した。

ＷｉＤｒおよびＬＳ−１７４Ｔ結腸癌細胞株はメリーラ
ンド州ロックビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションから入手した。ＨＴ　−２９結腸癌細胞株
および胸部癌細胞株ＭＣＦ−７およびＢＴ−２０はメリ
ーランド州ペテスダ、ＮＩＨ，国立がん研究所、胸部癌
特別調査委員会から入手した。Ａ２０４横紋筋肉腫細胞
株ならびに膀胱癌細胞株ＨＡ−６９８およびＨＡ−１０
５４＆Ｌ　メリーランド州ペテスダ。

Ｎ　Ｉ　Ｈ、国立がん研究所、アロンソン（Ｓ、Ａａｒ
ｏ−ｎｓｏｎ）博士から入手した。細胞株ＷｉＤｒ−５
１はＷｉＤｒの抗ＣＥＡ　ＭＡｂ　Ｂ１．１にヨル反復
螢光活性イ］偉（Ｕ胞選別によって誘導された〜ＶｉＤ
ｒ結腸癌細胞株由来の細胞のサブセットである。全ての
細胞株は、それらのそれぞれの入手源によって推せんさ
れた増殖培地上に保持した。５人の異なる結腸癌患者か
らのＮ％　ＣＦ、　Ａはニューシャーシー州ナットレー
、ホフマンーラ・ローシェ、ハンセン（Ｈ。

Ｈａｎｓｅｎ）博士から提供された。１つのＣＥＡ調製
物はカリフォルニア州すンマルコス、アルド・サイエン
ティフィック社から購入した。

固相ＲＩＡ ハイプリドーマ上清は異なる結腸癌組織および正常組織
からの細胞抽出物ならびに精ｋｃＥＡを用いてる固相Ｒ
ＩＡにより特異的抗体生産について検定した。細胞抽出
物５μｇまたは精、ＭＣＥＡ２０ｎｇを含むサンプル５
０μｌを９６−ウェルポリビニル微量滴定器の各ウェル
に加え、非湿潤インキュベーター内３７℃で一晩乾燥さ
せた。各ウェルはカルシウムおよびマグネシウムを含有
するＰＢＳ（Ｃａ　　、Ｍｇ　　含有ＰＢＳ）中の５　
％　ＢＳＡ　Ｉ００μｌの添加により非特異的タンパク
質結合を最小限に抑えるべく消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ
）　　した。３７°Ｃで１時間インキュベーション後Ｂ
ＳＡを吸引して除き、各ウェルに組織培養上清５０μｌ
を加えた。１時間インキュベーション後非結合免疫グロ
ブリンを除去し、滴定器をＰＢＳ中１％ＢＳＡで洗った
。その後各ウェルは２５μｌ中７５０００　ｃｐｍの１
２５工標識ＧαＭｕ１ｇＧと共に　３７℃で１時間イン
キュベートした。非結合ＧαＭｕ１ｇＧを吸引して除き
、各ウェルをＰＢＳ−１％　ＢＳＡで十分に洗浄した。

その後コダックＸａｒフィルムおよびデュポン・ライト
ニング・プラス増感板を使って、各ウェルをオートラジ
オグラフィーにかけた。フィルムは７０’Ｃで一晩感光
させた後に現像した。また、結合＋２４１　■−ＧαＭ
ｕ１ｇＧは個々のウェルを切断し、ガンマカウンターで
放射能を測定することにより検出した。

螢光活性化細胞選別 フローサイトメトリー（流動細胞計測法）標的細胞を採
取し、Ｃａ、Ｍｇ　　不含ダルベツコＰＢＳで洗った。

これらの細胞（１０６個）をハイプリドーマ組織培養上
清１００μｌと共に４℃で６０分インキュベートした。

インキュベーション後細胞ヲ完全培地で洗い、螢光標識
化ヤギ抗マウス免疫グロブリン（カペル研究所）１００
μｌ　と共に４°Ｃで６０分さらにインキュベートした
。次に、細胞を洗い、２％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ中
に１０６細胞／ｍｌで懸濁した。この細胞懸濁液は出力
が２００ｍＷの４８８ｎｍに合わせたアルゴンイオンレ
ーザ−を用いるオルソ・サイトフルオログラフ・システ
ム５０（Ｏｒｔｈｏ　Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｆ　
Ｓｙｓｔｅｍ　５０）で分析した。死滅細胞は軸方向消
衰により排除し、−次元ヒストグラムをオルソ２１５０
ｍコンピューターシステムで分析した。陽性細胞の百分
率は、−次抗体を含まない細胞の閾値な求め、得られた
値を抗体染色細胞の全百分率から減じることにより計算
した。

ウェスターンプロッティング ５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液［：０．１２５　Ｍ　トリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ６，８）−４係ＳＤＳ　−２０係グリ
セロール−１０％２−メルカプトエタノール〕　で希釈
した細胞抽出物４０μｇまたは精製ＣＥＡ　１μｇを、
５→２０チ線状勾配の５ＤＳ−ＰＡＧＥにのせた。電気
泳動後、タンパク質は移行緩衝液［２５ｍＭ　）　’）
スーＨＣ１（ｐＨ８，３）−１９２ｍＭグリシン−２０
％メタノール〕　中３０Ｖ、４℃で４時間ニトロセルロ
ース紙へ移行させた。その後プロットを５％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ中室温で１時間インキュベートし、０．０５％Ｔ
ｗｅ　ｅｎ−２０含有ＰＢＳで洗った。ハイプリドーマ
組織培養上清１０ｍｅを加え、穏やかに攪拌しながら室
温で１時間インキュベーションを続けた。０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ　−２０含有ＰＢＳで洗った後、プロットを＋
２５ニ一標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（メリーランド州ガイ
サースバーグ、キルケガードＬベリー）と共に室温で１
時間インキュベートした。その後、フィルターを一晩十
分に洗浄し、デュポン・ライトニング・プラス増感スク
リーンを用いてコダックＭａｒ−５Ｘ線フィルムに一７
０℃で２時間感光させた。全ての実験のためにＮ５−１
組織培養上清を陰性対照として使用した。

結　　　　果 ＢＡＬＢ／ｃマウスは上記の４つの異なる方法を用いて
ヒトー次および／または転移結腸癌の抽出物で免疫化し
た。６種の異なる腫瘍による遂次免疫感作も、両方の転
移物および一次結腸癌によって共有される決定基に対す
る抗体の生産を誘発させるために、これらの方法の１つ
において使用された。さらに、同一の一次結腸癌からの
細胞抽出物および部分精製膜が２つの異なる免疫感作法
において使用された。免疫化マウスの牌臓細胞は非免疫
グロブリン分泌Ｎ５−１骨髄腫細胞と融合させて、５０
５２−次ハイプリドーマ培養物をつくった。これらの培
養物からの上清液を採取し、固相ＲＩＡで試験してそれ
らのそれぞれの結腸癌免疫原の抽出物と反応性であるが
、明らかに正常なヒト牌臓の抽出物とは反応しない免疫
グロブリンの存在について調べた。初期スクリーニング
に用いた牌臓はＣＥＡおよびＣＥ　Ａ関連決定基と交差
反応する若干のＭＡｂと反応性であることが以前に知ら
れていた。多くの培養物からの免疫グロブリンは牌臓抽
出物と結腸癌抽出物の両方と反応することが立証された
が、３４１培養物は使用したそれぞれの結腸癌抽出物と
のみ反応する免疫グロブリンを生産した。限界希釈法に
よるハイプリドーマ細胞の２回クローニング後に、得ら
れた培養上清は５つの結腸癌生検棟木の抽出物および数
種の明らかに正常なヒト組織（４つの牌臓、２つの腎臓
および３つの肝臓を含む）の抽出物に対する結合につい
て固相ＲＩＡで検定した。４９のＭＡｂが５つの結腸癌
抽出物と反応性であって正常組織のどれとも非反応性で
あることがわかった。これらのＭＡｂはまた主要な血液
型（Ａ、　Ｂ、　Ｏ）のすべてを表わすＲＢＣの１１の
調製物の抽出物、および正常ヒ）ＰＭＮの抽出物と固相
ＲＩＡにおいて非反応性であることが見出された。さら
に、４９のＭＡｂはＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼ技法を
用いて５つの結腸癌抽出物に対する反応性、および正常
ヒト結腸、汗腺、骨髄およびリンパ腺の抽出物に対する
反応性の欠如について試験した。これらの初期スクリー
ニングの結果として、１５のＭＡｂ　（ＣＯＬ−１〜−
１５と命名）がその後の性状決定のために選ばれた。Ｉ
ＶＩＡ　ｂ　ＣＯＬ−１〜−１５と結腸癌抽出物との固
相ＲＩＡにおける反応性は表１に示す。

ＭＡｂはどれも３つの正常成人肝臓および４つの正常成
人牌臓からの生検材料の抽出物と反応しなかった。さら
に、１５のＣＯＬ　ＭＡｂはすべて異なる結腸癌患者か
ら得られた５つのＣＥＡ調製物と固相ＲＩＡにおいて反
応した。

ＭＡｂの結腸癌抽出物およびＣＥＡ調製物に対する反応
性の差異は以下で論するであろう。１５のＭＡｂはすべ
て表１に示すように１，２ａおよび２ｂサブクラスのＩ
ｇＧアインタイプのものであった。

その後、ＭＡｂ　　ＣＯＬ−１〜−１５は正常ヒト多形
核白血球の表面に対する結合についてＦＡＣ８により試
験した。先に述べたように、これは抗ＣＥＡモノクロー
ナル抗体と異種血清との主要な交差反応である。ボーデ
ス（Ｂｏｒｄｅｓ、Ｍ、　）　ラのＥｕｒ、Ｊ、Ｃａｎ
ｃｅｒ、　　１１ニア８３〜７８６（１９７５）　　を
参照されたい。これらのＣＯＬ　ＭＡｂの反応性は市販
の抗ＨＣＥＡ　　と比較された。その結果を第１図に示
す。各パネルの点線は一次抗体の不在下（すなわち陰性
対照）での選別パターンを表わす。ＣＡ。

ＣＯＬ−１を用いる選別パターン（陰性）；Ｂ、抗ＣＥ
Ａを用いる選別パターン（陽性）〕第１Ｂ図だ示すよう
に、抗ＨＣＥＡＭＡｂ　　は９０俤以上のヒトＰＭＨの
表面と反応した。１５０ＣＯＬＭＡｂ　　はすべて同じ
調製物と反応しなかつた。ＰＭＨに対するこの非反応性
の代表的な例（ＭＡｂ　ＣＯＬ−１を使用）を第１Ａ図
に示す。

これらの研究の延長として、ＭＡｂＣＯＬ−１はいろい
ろな濃度のＰＭＮ抽出物との反応性についてＭＡｂＢｌ
、１　　と比較された。ＭＡｂＢｌ、１　　は精製ＣＥ
ＡおよびＣＥＡ関連決定基の双方と反応性であることが
わかっている。バーリン（Ｈｅｒｌｙｎ、Ｍ、　）らの
Ｈｙｂ　ｒ　ｉ　ｄｏｍａ、　２３　：３２９〜３３９
　（１９８３）を参照されたいｏ　１．６　ｎｇの精製
ＭＡｂ　ＣＯＩ、−１およびＢ１．１を使用することに
より、抗原希釈実験は１１００ｎ程度に少ないＰＭＮ抽
出物と共にＭＡｂＢｌ、１　　を使用した場合に陽性の
反応性を示した。一方、゛反応混合物へ５０００ｎｇ程
度に多いＰＭＮ抽出物を添加してもＭＡｂ　ＣＯＬ−１
との反応性を示さなかった。Ｂ１．１およびＣＯＬ−１
は両方とも精製されたＣＥＡ調製物に対する反応性が等
しく陽性であった。

表１および第１図の結果をさらに立証するために、抗Ｃ
ＥＡＭＡｂと反応性のＰＭＮを含むことが知られている
正常牌臓の抽出物がＣＯＬＭＡｂとの反応性について試
験された。第１図の挿入図は一次結腸癌抽出物（・）；
正常牌１ｄ抽出物（−）；ＰＢＳ（町に対する固相ＲＩ
ＡでのＣＯＬ−１の反応性を示す。

ＭＡｂ　ＣＯＬ−２はこの牌ぬ抽出物と比較して結腸癌
抽出物に対して高度の選択的反応性を示す。

その後、ＭＡｂ　　ＣＯＬ−１〜−１５はウェスターン
プロッティング実験によりＣＥＡと免疫反応するそれら
の能力について同定された。第２図において、各レーン
は単一のＣＯＬ　ＭＡｂ（ＣＯＬ−１〜ＣＯＬ−１５）
のＣＥＡ調製物への結合を示す。縦の目盛りは分子量マ
ーカー（Ｘ　１Ｏ−３）である。第２図に示すように、
１５のＣＯＬ　ＭＡｂはＣＥＡ分子の特徴であるＭｒ　
１８０，０００タンパク質を免疫検出した。

以前の研究は、精製したＭｒ　１８０，０００　ＣＥＡ
分子と免疫反応性の他のモノクローナル抗体が結腸癌細
胞の中のＭｒ　１６０，０００．９０．ＯＤＤ、　５０
，０００および／または４０，０００タンパク質とも反
応しうろことを示した。プラズズイック（Ｂｌａｓｚｃ
ｚｙｋ）らのＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、＋　４４：２４５
〜２５３（１９８４）を参照されたい。これらの低分子
量分子は多形核白血球および他の正常組織上に現われる
ＣＥＡ交差反応抗原であると考えられる。この型の交差
反応の例は第３Ｂ図に示す。〔レーン１．転移結腸癌；
レーン２、−次結腸癌；レーン６、正常ヒト牌臓；の抽
出物においてタンパク質がＭＡｂ　ＣＯＬ−，１（第３
Ａ図）およびＭＡｂＢｌ、１（第３Ｂ図）により検出さ
れた；中央の目盛りは分子量マーカー（ｘｌｏ−）であ
る。〕結腸癌転移物、−次結腸癌および正常牌臓からの
抽出物は５ＤＳ−ＰＡＧＥ　勾配ゲルによる電気泳動で
分離し、ニトロセルロースに移行させた。免疫プロッテ
ィング後、ＭＡｂ　　Ｂ１．１　（ＣＥＡと反応するこ
とが知られている）は結腸癌抽出物中に存在する特徴的
なＭｒ　１８０，０００分子を検出したが、さらに正常
牌臓抽出物だけでなく一次結腸癌にも存在するＭｒ　９
０，０００成分を検出した。一方、ＭＡｂ　ＣＯＬ−１
〜−１５は結腸癌抽出物中のＭｒ１８０．０ＯＯＣＥＡ
のみを検出し、同じ牌臓抽出物中の他の成分をどれも検
出しなかった。これは第３Ａ図に記載の結果により例示
される。

ＣＯＬ−１／３ｄ６免疫酵素検定法 ３ｄ６抗体はペンシルバニア州フィラデルフィア、ウィ
スター研究所（Ｔｈｅ　Ｗｉｓｔａｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅ）から入手し、ＣＯＬ−１抗体はメリーランド州ベ
テスダ、ＮＩＨ，国立がん研究所のジェフリー・シュロ
ム（Ｊｅｆｆｒｅｙ　Ｓｃｈｌｏｍ）博士から提供され
た。

ハ・イブリドーマ細胞は組織培養で増殖させ、そしてプ
リスタン（ウィスコンシン州ミルウォーキー、アルドリ
ッチ・ケミカル社）で感作したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹
水を生産させるために使用した。抗ＣＥＡモノクローナ
ル免疫グロブリンは、セファロース４Ｂにュージャージ
ー州ヒスカタウエイ、ファーマシア・ファイン・ケミカ
ルズ）に結合したプロティンＡを用いるアフィニティー
クロマトグラフィーにより腹水からＭＨした。

３ｄ６抗体は０．１　Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４，０）　　を用いてプロティンＡカラムから溶離し
た。ｃｏＬ−１挽体は０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ３，５）　　を用いてプロティンＡカラムから
溶離した。単離した免疫グロブリンの純度はゲル電気泳
動（ドデシル硫酸す）　ＩＪウム／ポリアクガロースゲ
ル）および免疫電気泳動ゲルにより確立した。

精製した３ｄ６抗体はｚインチのポリスチレンビーズ（
イリノイ州シカゴ、プレシッション・プラスチック・ポ
ール社）に塗布し、ＰＶＰ／シヨ糖溶液で処理した後に
乾燥した。

精製したＣＯＬ−１抗体はナカネ（Ｎａｋａｎｅ）の変
法を用いてＨＲＰ（インジアナ州インジアナポリス、ベ
ーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ）と結合さ
せた。ナカネ（Ｎａｋａｎｅ　Ｐ、に、　）のＣ１１ｎ
ｉｃａｌ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
　ｆｏｒ　ｔｈｅ１９８０　’　ｓ　（Ｒ，Ｍ、　Ｎａ
ｋａｍｕｒａおよびＥ、　Ｓ、　Ｔｕｃｋｅｒ編集）ア
ランＲ，リス社、ニューヨーク（１９８１）を参照され
たい。

ＨＲＰ　１０ｍｑはＢ２０２５ｍ１　Ｋ　溶解し、０．
０５Ｍｍ−過ヨウ素酸ナトリウムを用いて室温で２０分
酸化した。続いて、この溶液を４℃で０．００１　Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，４’）に対して透析した
。透析後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５
）をＨＲＰに加え、すぐにＣＯＬ−１抗体（０，０１Ｍ
炭酸す）　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ９，５）中８ｍり７ｍ
ｌ）と反応させた。

この反応は室温で２時間インキュベートし、その後０．
０５Ｍ水素化ホウ素ナトリウム（０，０１Ｍ炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９，５）中１．８９　ｍ９／ｍｅ　）
で還元した。還元反応混合物はり、　Ｉ　Ｍ　！Ｊン酸
ナナトリウム緩衝液ｐＨ７，５）に対して４℃で一晩透
析した。セファロースｄＢＣＬカラムにュージャーシー
州ヒスカタウエイ、ファーマシア・ファイン・ケミカル
ズ）によるゲル透過により非結合ＨＲＰまたは非結合Ｃ
ＯＬ−１抗体を除いた。この複合体の純度は高圧液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬ（ｊ　　により証明した。

ＣＥＡＩ品はプールしたヒ１−ＣＥＡ陰性血清で希釈し
た細胞株５Ｗ１１１６［レイボビッッ（Ｌｅ　ｔｂｏ−
ｖｉｔｚ、Ａ−）らのＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　、　３
６．４５６２〜４５６９（１９７６）を参照］から誘導
されたヒト結腸直腸癌培養物の上清から調製した。これ
らの標品はＣＥＡのは界保健機関標品（英国ＮＷ３　６
ＲＢ、ロンドン。

ホーリーヒル、ナショナル・インステイチュート・ホー
・バイオロジカルスタンダード・アンド・コントロール
）に対して検量した。

全ての試料は２つの部位の免疫酵素検定法（ＩＥＭＡ　
）を用いて次のように検定した： 標本または標準物質０．２　ｍｌは１個の３ｄ６被覆ポ
リスチレンビーズを含む反応ウェルに加えた。

固相抗体と試料は４５°Ｃで１時間インキュベートさせ
た。次いでビーズを洗い、ＣＯＬ−１−ＨＲＰ複合体Ｑ
、　２ｍｌを加えた。この複合体は固相複合体と４５℃
で１時間反応させた。ビーズを洗って、試験管に移した
。このビーズにＯ−フェニレンジアミン−２ＨＣ１基質
０．５ｍｌを加え、室温でろ０分インキュベートした。

ＩＮ　Ｈ２ＳＯ４１ｍｐ！を加えて反応を止めた。反応
した基質溶液試験管は０Ｄ４９□で分光光度計により読
み取った。ＯＤ４＋１２に対するＣＥＡ標品の濃度をプ
ロットすることにより検定標準曲線を作成した。実験結
果は作成した標準曲線から内挿された。

表２は正常人および喫煙者に対して得られた平均ＣＥＡ
値を示す。予期したように、喫煙者は正常人よりも高い
ＣＥＡ値を示した。血漿および血清中のＣＥＡｆｉｔは
実質的に同じであり、どちらの血液成分もＣＥＡ＆を評
価するために使用できることを示している。

表２ 人数　　平均ＣＥＡ　（ｎ、９７ｍｌ）喫煙者　　３２
３　３．９９±３．２１正常人　血漿　　　１１０　　
１．５５±１．０４血清　　　　８２　　１．２４±０
．７７表３は様々な悪性および良性疾患を有する患者お
よび正常人からの血清のＮＣＩパネルにおけるＣＥＡ量
の分布を示す。

駆　　ロぽ　♀　カ　呂　毛　二　錫　話　冨裂　七疋
　憲　昧　＠　煩　碩　碩　堀結腸直腸癌患者の８５チ
以上は３　ｄ　６／ＣＯＬ−１免疫酵素検定法により５
　ｎｇ／ｍｅより多いＣＥＡ量を示す。その他の悪性癌
患者は５ｎｇ／ｍ１以上のＣＥＡ量を示す者が非常に少
ない。正常人の約５係は５ｎｇ／ｍ１以上のＣＥＡｆｆ
ｉを示した。このことは、このパネルにおける正常人を
喫煙経歴についてスクリーニングしなかったので、この
群の喫煙者が原因であるかも知れない。

表６のデータは、３ｄ６／ＣＯＬ−１免疫酵素検定法が
結腸直腸癌に対して診断上価値があることを示している
。表３のデータに基づいて５　ｎｇ／ｍｌまたはそれ以
上のＣＥＡ量が結腸直腸癌の指標として選ばれる場合、
この疾患をもつ患者の８５多以上は上記試験によって確
認することができる。正常の非喫煙者は表２に示すＣＥ
Ａ値の統計学的分布に基づいて約１／１０００の偽陽性
率（５ｎｇ／ｍ１以上のＣＥＡ値）を示すと予期される
。偽陽性の結果を減じて検定の予測値を高めるために、
正常集団中の喫煙者を診断医がスクリーニングすること
もできる。

３ｄ　６／ＣＯＬ−１免疫酵素検定はアボットＣＥＡ−
ＥＩＡモノクローナル試験（イリノイ州北シカゴ。

アボットラボラトリーズ）と比較した。アボット検定は
製造者の標準的手法に従って行った。要約すると、この
方法は次の通りであった：試料または標品Ｑ、　１　ｍ
ｌおよび試料用希釈剤Ｑ、１　ｍｌを抗ＣＥＡ抗体被覆
ビーズに加えた。この混合物を４５°Ｃで１時間インキ
ュベートした。次に、ビーズを水で６回洗った。

このビーズに抗ＣＥＡ−ＨＲＰ溶液０．２　ｍｌを加え
、混合物を４５°Ｃで１時間インキュベートした。ビー
ズを水で６回洗った。ビーズを透明なプラスチック試験
管に移し、基質Ｑ、３　ｍｌを加えた。酵素反応を室温
で３０分進行させた。ＩＮ硫酸を加えて反応を止めた。

この酵素反応溶液は０Ｄ４９２で分光光度計により読み
取った。ろｄ６／ＣＯＬ−１検定は上記のように行った
が、初めのインキュベーション工程での希釈を除いた。

ＣＥＡ濃度（ｎｇ　／ｒｎｌ）に対するＣＥＡ標品の吸
光度ん、２のプロットをそれぞれの検定法について作成
した（第４図参照；・・・・・・・・　アボット検定法
；−３ｄ６／ＣＯＬ−１検定法）。明らかなように、３
　ｄ６／ＣＯＬ−１検定法はアボット検定法よりも一層
感度がすぐれていた。

アボット検定法とＣＯＬ−１／３ｄ６１ＥＭＡの比較は
、様々な悪性および良性疾患をもつ患者および正常人か
らの血清のＮＣＩパネルを用いて実施した。表４はそれ
ぞれの検定法によって測定されたＣＥＡ値は比較可能で
ある。

表４ 産業上の利用可能性 本発明の高分子１ＣＥＡの免疫検定法は、結腸直腸癌の
管ＢＪｉｍよび予後の判定、あるいはゝ健康“に見える
人の結腸直腸悪性疾患の診断に応用することができる。

均等範囲 当分骨で習熟した者は日常の実験手法を用いることによ
り、ここに記載の特定方法の多数の均等物を認識し、ま
た確かめることができるだろう。

このような均等物は本発明の範囲内であると考えられ、
特許請求の範囲により保護されるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト多形核白血球の表面に結合する抗ＣＥＡモ
ノクローナル抗体の流動細胞計測法による分析、および
結腸癌抽出物対牌臓抽出物とＣＯＬ−１抗体との反応性
を示すグラフである。 第２図はウェスターン法を用いたモノクローナル抗体Ｃ
ＯＬ−１〜−１５によるＣＥＡの免疫検定を示す。 第３図はヒト組織の抽出物中のＣＥＡおよびＣＥＡ関連
抗原のウェスターン法による免疫検定を示す。 第４図は３ｄ６／ＣＯＬ−１免疫酵素検定及びアボット
（Ａｂｂｏｔｔ）　ＣＥＡ　−Ｅ　Ｉ　Ａモノクローナ
ル試験のための標準曲線の比較を示す。 （外５名） 郭−脅 ぐ−一 ２５．７−菅 １Ｂ、４　　　＃ １２．３−一 ネＺ図 ７　　Ｂ　　９　１０　１１　１２　　１１１４　１５
９ｇ情ｇ−９０１１ 市３図 尾４図 手続補正、４）（方式） １１．。（’ｔ’）ｈｔｓ：　　　　　　　　　’Ｉ＜
昭ｆｉｌ　（３１’Ｙ１４Ｉｎ％（Ｉ第２５１５７１：
２、発明の名称 高分子泪癌ＩＭｉ児性抗原の免疫検定法３、補正を４る
名 事１′１どの関係　　　出　願　人 住所 名　称　　セントコ−・インコーホレーテッド４、代理
人 ＩＬ　　所　　東京都千代１１．１巨大手町二丁し１２
番１１コを仔状及訳文 クイブしｌこ明細ｉＬｆ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）３ｄ６モノクローナル抗体およびＣＯＬ−１モノ
   クローナル抗体を使用する高分子量癌胎児性抗原のため
   の固相サンドイッチ免疫検定法。
2. （２）３ｄ６抗体は固相に固定され、ＣＯＬ−１抗体は
   可溶性標識抗体である、特許請求の範囲第１項記載の検
   定法。
3. （３）ａ）液体試料と、３ｄ６抗ＣＥＡモノクローナル
   抗体を含有する固相免疫吸着剤とのインキュベーション
   混合物を調製し； ｂ）該インキュベーション混合物を、液体試料中のＣＥ
   Ａが免疫吸着剤に結合するのに十分な条件下で十分な時
   間インキュベートし； ｃ）その後免疫吸着剤を液体試料から分離し；ｄ）該免
   疫吸着剤と可溶性の標識ＣＯＬ−１抗ＣＥＡモノクロー
   ナル抗体とのインキュベーション混合物を調製し； ｅ）該混合物を、標識抗体が免疫吸着剤に結合するのに
   十分な条件下で十分な時間インキュベートし； ｆ）固相免疫吸着剤を非結合標識ＣＯＬ−１抗ＣＥＡ抗
   体から分離し； ｇ）免疫吸着剤に結合した標識モノクローナル抗体の量
   または非結合標識抗体の量を検出し；そして ｈ）検出された結合標識モノクローナル抗体または非結
   合標識抗体の量を、標識抗体量とＣＥＡ量との間の予め
   定められた定量的関係と対比させて、液体試料中のＣＥ
   Ａの量を求める； 各工程から成る液体試料中の高分子量癌胎児性抗原（Ｃ
   ＥＡ）の免疫検定法。
4. （４）固相免疫吸着剤は３ｄ６抗ＣＥＡモノクローナル
   抗体が結合したポリスチレンビーズであり、標識された
   可溶性抗体はＣＯＬ−１抗ＣＥＡモノクローナル抗体で
   ある、特許請求の範囲第１項記載の免疫検定法。
5. （５）可溶性ＣＯＬ−１抗ＣＥＡ抗体は酵素、放射性同
   位体または螢光化合物で標識される特許請求の範囲第１
   項記載の免疫検定法。
6. （６）ａ）血漿または血清試料と、３ｄ６抗ＣＥＡモノ
   クローナル抗体が付着したポリスチレンビーズからなる
   固相免疫吸着剤とのインキュベーション混合物を調製し
   ； ｂ）該混合物を大体室温から約４５℃までの温度で約１
   〜４時間インキュベートし； ｃ）その後免疫吸着剤を液体試料から分離し；ｄ）該免
   疫吸着剤と酵素により標識された可溶性ＣＯＬ−１抗Ｃ
   ＥＡモノクローナル抗体とのインキュベーション混合物
   を調製し； ｅ）該混合物を大体室温から約４５℃までの温度で約１
   〜４時間インキュベートし； ｆ）免疫吸着剤を結合しなかつた酵素標識 ＣＯＬ−１抗ＣＥＡモノクローナル抗体から分離し；ｇ
   ）免疫吸着剤に結合した酵素標識抗体の量を検出し；そ
   して ｈ）結合した酵素標識ＣＯＬ−１抗ＣＥＡモノクローナ
   ル抗体の量を、酵素標識抗ＣＥＡ抗体量とＣＥＡ量との
   間の予め定められた定量的関係と対比して、試料中のＣ
   ＥＡの量を求める； 各工程から成る血漿または血清試料中の癌胎児性抗原（
   ＣＥＡ）の前進的なサンドイッチ免疫酵素検定法。
7. （７）検定すべき試料を、不溶化した第１の抗ＣＥＡ抗
   体とインキュベートし；該不溶化抗体と試料とを分離し
   ；該不溶化抗体を標識された第２の抗ＣＥＡ抗体の溶液
   とインキュベートし；不溶化抗体を標識抗体溶液から分
   離し；そして標識抗体の量を試料中のＣＥＡ量の指標と
   して評価する；各工程から成る液体試料中の癌胎児性抗
   原（ＣＥＡ）の固相サンドイッチ検定法であつて、 その改良点が第１抗体として３ｄ６抗ＣＥＡモノクロー
   ナル抗体を、そして第２抗体としてＣＯＬ−１抗ＣＥＡ
   モノクローナル抗体を使用することから成る検定法。
8. （８）ａ）液体試料と可溶性の標識ＣＯＬ−１抗ＣＥＡ
   抗体とのインキュベーション混合物を調製し；ｂ）該イ
   ンキュベーション混合物を、液体試料中のＣＥＡが可溶
   性の標識ＣＯＬ−１モノクローナル抗体と結合するのに
   十分な条件下で十分な時間インキュベートし； ｃ）３ｄ６抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含む固相免疫
   吸着剤と該インキュベーション混合物とを、可溶性標識
   ＣＯＬ−１モノクローナル抗体に結合したＣＥＡが免疫
   吸着剤に結合するのに十分な条件で十分な時間接触させ
   ； ｄ）固相免疫吸着剤をインキュベーション混合物から分
   離し； ｅ）固相免疫吸着剤に結合した標識ＣＯＬ−１モノクロ
   ーナル抗体の量または結合しなかつた標識ＣＯＬ−１抗
   体の量を検出し；そして ｆ）検出された標識モノクローナル抗体の量を、標識抗
   体量とＣＥＡ量との間の予め定められた定量的関係と関
   連させて、液体試料中のＣＥＡの量を求める； 各工程から成る液体試料中の高分子量癌胎児性抗原（Ｃ
   ＥＡ）の免疫検定法。
9. （９）ａ）ｉ、液体試料； ｉｉ、固定化３ｄ６モノクローナル抗体を含む固相免疫
   吸着剤；および ｉｉｉ、可溶性の標識ＣＯＬ−１モノクローナル抗体； を含有するインキュベーション混合物を調製し；ｂ）該
   混合物を、液体試料中のＣＥＡが固定化３ｄ６モノクロ
   ーナル抗体および可溶性標識ＣＯＬ−１モノクローナル
   抗体と複合体を形成するのに十分な条件下で十分な時間
   インキュベートし；ｃ）その後該固相免疫吸着剤をイン
   キュベーション混合物から分離し； ｄ）固相免疫吸着剤に結合した標識ＣＯＬ−１モノクロ
   ーナル抗体の量、または結合しなかつた標識ＣＯＬ−１
   抗体の量を検出し；そして ｅ）検出された標識ＣＯＬ−１モノクローナル抗体の量
   を、標識抗体量とＣＥＡ量との間の予め定められた定量
   的関係と関連させて、液体試料中のＣＥＡの量を求める
   ； 各工程から成る液体試料中の高分子量癌胎児性抗原（Ｃ
   ＥＡ）の免疫検定法。
10. （１０）ａ）３ｄ６抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含む
    固相免疫吸着剤；および ｂ）標識ＣＯＬ−１抗ＣＥＡモノクローナル抗体の溶液
    ； から成る高分子量癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のサンドイッ
    チ型免疫検定法を行うための試薬類を含有するキット。
11. （１１）ａ）３ｄ６抗ＣＥＡモノクローナル抗体を被覆
    したポリスチレンビーズ；および ｂ）西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したＣＯＬ−１
    抗ＣＥＡモノクローナル抗体の溶液；から成る高分子量
    癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のサンドイッチ型免疫酵素検定
    法を行うための試薬類を含有するキット。
12. （１２）高分子量癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の異なる抗原
    決定基に対してそれぞれ特異的に反応性である２つのモ
    ノクローナル抗体を用いる、高分子量ＣＥＡのための固
    相免疫検定法。