JP2002243740A

JP2002243740A - 免疫測定試薬

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Publication number: JP2002243740A
Application number: JP2001045316A
Authority: JP
Inventors: Tsutomu Honjo; 勉本庄; Haruki Shibata; 治樹柴田; Masanori Sugitani; 政則杉谷; Shinichi Mamekoshi; 慎一豆越
Original assignee: Morinaga and Co Ltd
Current assignee: Morinaga and Co Ltd
Priority date: 2001-02-21
Filing date: 2001-02-21
Publication date: 2002-08-28
Anticipated expiration: 2021-02-21
Also published as: JP4590117B2

Abstract

(57)【要約】【課題】従来の免疫測定試薬に比べて、極めて高い測
定感度を有する免疫測定試薬及びキットを提供すること
を課題とする。【解決手段】抗原分子上の異なるエピトープを優先的
に認識するような２以上の高親和性抗体群（ポリクロー
ナル抗体）を選択し、これらを組み合わせて使用するこ
とにより、従来用いられてきた測定試薬より高感度な免
疫測定キットが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本願発明は、高い感度を有す
る免疫測定試薬及びキット並びにその製造方法に関し、
特に、インスリンを高感度に測定する免疫測定試薬及び
キット並びにその製造方法に関する。

【０００２】

【従来技術】インスリンは血糖降下作用をもつホルモン
として広く知られており、その血中濃度を測定すること
は糖尿病の診断や病態の把握に不可欠である。

【０００３】このようなヒト血中インスリン濃度の測定
は、当初、放射性同位元素を用いるラジオイムノアッセ
イで行われてきたが、後に酵素免疫測定法が確立され、
これもインスリンの測定に応用されるようになってきて
おり、したがって、当該免疫測定キットとしてはラジオ
イムノアッセイや酵素免疫測定法を利用したキットが臨
床診断薬キット等の目的で市販されている。

【０００４】しかしながら、上記いずれのキットも、測
定試料として数十マイクロリットルから百マイクロリッ
トル程度の試料を必要とし、測定感度は数百ｐｇ／ｍｌ
程度に過ぎない。

【０００５】一方、近年、糖尿病研究が盛んになるにつ
れて、実験動物でのインスリン測定の必要性も増大して
きている。

【０００６】このような実験動物でのインスリン測定に
おいても、従来はヒトインスリン測定試薬が用いられ、
その抗体の交差反応性を利用して実験動物のインスリン
が測定されてきた。しかしながら、標準品としてヒトイ
ンスリンを用いることで動物インスリン濃度の真の値が
得られないという問題があったことから、実験動物専用
の測定試薬が期待されるようになった。

【０００７】このため、ラットインスリン測定用ラジオ
イムノアッセイ法が最初に開発され、米国Ｌｉｎｃｏ
Ｒｅｓｅａｃｈ社、英国Ａｍｅｒｓｈａｍ社、米国Ｉ
ｎｋｓｔａｒ社等から市販されるに至った。これらのキ
ットには、標準品としてラットインスリンが添付されて
おり、ヒトインスリンを標準物質として用いることによ
るトラブルは回避されるようになった。

【０００８】しかし、そのようなキットでは、依然、用
いる試料の容量がヒトインスリン測定キットと同じ約１
００マイクロリットル程度であり、また、後の実験に支
障をきたさないように一匹の動物から得ることのできる
血液の量にも限界があるため、実験には必然的に多数の
動物を使う必要が生じた。とりわけ、体重がラットの十
分の一程度のマウスを用いる実験においては、一つのデ
ータを取るために複数のマウスを犠牲にする必要があ
り、後の実験が不可能となる場合さえあった。

【０００９】上記の問題を解決するために、従来の測定
試薬と同程度の感度を有し、且つ微量の試料でも測定可
能な方法が開発された。当該測定試薬は、本件出願人の
他、株式会社シバヤギやスウェーデンのＭｅｒｃｏｄｉ
ａ社からも販売されている。

【００１０】しかしながら、たとえ微量試料で測定可能
な上記の試薬であっても、それが従来の測定試薬と同程
度の感度では測定に不十分な場合がある。例えば、スト
レプトゾトシン処理ラットやマウスに代表されるＩ型糖
尿病のモデル等が示すような、低濃度の血中インスリン
を測定する場合等には、より高い測定感度が要求され
る。この場合、従来の測定試薬を用いつつ、逆に、比較
的大量の血清を試料とすれば、当該血清中に含まれてい
る多量の抗原抗体反応阻害物質により反応系が影響さ
れ、その影響を無視できなくなる。したがって、上記の
ような低濃度の血中インスリン測定等に際しても有効
な、極めて高い感度を有する免疫測定試薬の開発が望ま
れていた。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本願発明は、従来の免
疫測定試薬に比べて、極めて高い測定感度を有する免疫
測定試薬及びキットを提供することを課題とする。

【００１２】殊に、糖尿病の治療や研究においては血中
インスリンの濃度を測定することが必須であり、Ｉ型糖
尿病患者やストレプトゾトシン処理動物等の血中インス
リン濃度をも測定できる試薬が求められている。とりわ
け、実験用小動物の血中インスリン濃度を測定するには
ヒトインスリン測定に用いられるような１００マイクロ
リットルの試料を用いるのではなく、できるだけ小容量
の試料で測定できる極めて高い感度の測定系が必要とさ
れている。

【００１３】したがって、本願の免疫測定試薬及びキッ
トは、インスリンの濃度を測定する際に有利に使用され
得る。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記のとおり、本願発明
は、従来の免疫測定試薬に比べて、極めて高い測定感度
を有する免疫測定試薬及びキットを提供することを課題
とする。

【００１５】ここで、インスリンを例にとれば、現在市
販されているインスリン測定試薬やインスリン測定診断
薬の多くには、その特異性を高めるためにマウスを用い
て作製された「モノクローナル抗体」が使用されてい
る。

【００１６】ところが、これらのモノクローナル抗体
は、その特異性にも拘らず、一般的に抗原（インスリ
ン）に対する親和性がポリクローナル抗体に比べて低
く、そのため当該モノクローナル抗体を用いたインスリ
ン測定法の感度には自ずと一定の限界があった。

【００１７】すなわち、モノクローナル抗体は単一分子
であるが故に、その特異性も高いことが利点ではある
が、その抗原に対する親和性もまた単一である。一般
に、モノクローナル抗体の結合定数は１０^８程度、高く
ても１０^９が限度であり、１０^１ ^０程度の非常に高い結
合定数を持つモノクローナル抗体を分離するのは容易で
はない。

【００１８】これとは対照的に、ポリクローナル抗体は
複数の抗体分子の混合物であり、したがって、それが認
識する抗原上のエピトープは単一ではないが、その親和
性もまた単一ではなく、適当な方法で免疫された抗血清
の中には１０^１０程度の非常に高い結合定数を持つ抗体
も含まれる場合がある。とすれば、これらの高い結合定
数を有する抗体をポリクローナル抗体としてそのまま測
定に利用することにより、当該測定系の感度を上げ得る
ことが期待される。

【００１９】ところが、上記のとおり、ポリクローナル
抗体には親和性が高い抗体分子が含まれるという利点が
ある反面、それが抗原分子上の異なるエピトープを認識
する抗体分子の集合体であるという欠点も有している。
しかも、各免疫動物毎に血中に含まれる抗体分子の比率
や量、抗原分子に対する親和性が異なるため、同じ性質
を持つ抗血清を安定的に得るには同じ条件で免疫した動
物の抗血清を少なくとも数十匹分、理想的には数百匹分
をプールし、そこからポリクローナル抗体を調製しなけ
ればならないという欠点を有するものであった。したが
って、その高い親和性にも拘らず、ポリクローナル抗体
の免疫測定法への使用は、近年、一般的ではなかった。

【００２０】しかしながら、本発明者らは、インスリン
測定系の開発を進める過程で、驚くべきことに、インス
リン免疫したモルモットの抗血清に含まれる抗体群（ポ
リクローナル抗体）が優先的に認識するエピトープは免
疫モルモット個体毎に異なり、極端な例ではその特異性
がモノクローナル抗体に近い場合があることを見いだし
た。

【００２１】更に、本発明者らは、上記のモノクローナ
ル抗体に似た反応性（特異性）を有するという性質と、
インスリンに対して非常に高い親和性を持つことの二つ
の条件を併せ持つポリクローナル抗体を利用することに
より、インスリンの測定感度を上昇させる得ることを想
到した。

【００２２】すなわち、インスリン分子上の、互いに異
なるエピトープを優先的に認識する２以上の高親和性ポ
リクローナル抗体を選択して組み合わせることにより、
従来用いられてきた測定試薬より高感度な測定系を組み
立てることに成功した。したがって、本願発明の第１
は、（１）少なくとも２以上のポリクローナル抗体試薬
を含む免疫測定キットの製造方法であって、当該ポリク
ローナル抗体試薬は、互いに抗原上の異なるエピトープ
を優先的に認識するように選択されることを特徴とす
る、前記キットの製造方法である。

【００２３】より詳細には、モノクローナル抗体に匹敵
する特異性を有し、且つモノクローナル抗体に比べて高
い親和性を有する幾つかのポリクローナル抗体を個々の
免疫動物の抗血清から得た場合でも、それらを単に任意
に組み合わせて、キャプチャー側（固定化抗体側）及び
検出側（標識抗体側）の各試薬に用いたのでは、当該ポ
リクローナル抗体試薬間でエピトープの競合が起って、
折角の検出感度が損なわれてしまう場合がある。例え
ば、キャプチャー側と検出側のポリクローナル抗体試薬
が同一のエピトープを優先的に認識したのでは、キャプ
チャー側のポリクローナル抗体試薬が優先的に認識する
べきエピトープが、先に検出側のポリクローナル抗体試
薬に優先的に認識されてしまい、当該エピトープが検出
側の抗体試薬によって前もって塞がれてもはやキャプチ
ャー側と結合し得なくなり、そのことでサンドイッチア
ッセイの検出感度が低下する惧れがあるのである。

【００２４】これに対し、本願のように、キャプチャー
側と検出側が優先的に認識するエピトープが異なったも
のとなるように夫々を選択して組み合わせれば、上記の
ようなエピトープの競合が起こらず、したがって、互い
のポリクローナル抗体が有するモノクローナル抗体に比
べた高い親和性が損われることがなく、結果として高い
感度を達成することが可能なのである。

【００２５】更に、このような選択及び組み合わせは、
均質で安定的な免疫測定キットの供給をも可能にするの
である。

【００２６】従来のように、均質なポリクローナル抗体
を得る目的で複数の免疫動物からの抗血清を一旦プール
し、そこからポリクローナル抗体を得て免疫測定キット
の試薬として使用すると、個々のポリクローナル抗体が
有する有利な特徴であるモノクローナル抗体に似た高い
特異性と、抗原に対する高い親和性が希釈及び／または
相殺されて、ポリクローナル抗体を使用する本願の利点
が失われてしまう結果となる。

【００２７】これに対し、本願のようにポリクローナル
抗体を選択すれば、均質で安定的なキットを与えるよう
に各ポリクローナル抗体を簡便に組み合わせることがで
き、抗血清をプールする必要がなくなるのである。

【００２８】さて、以上の観点からすれば、本願の免疫
測定キットの製造方法においては各免疫動物から得られ
る抗血清に含まれるポリクローナル抗体のエピトープに
対する特異性を迅速に判別することが更に望ましい。し
たがって、本願発明の第２は、（２）上記（１）に記載
の免疫測定キットの製造方法であって、該方法は；（イ）少なくとも２以上の免疫動物から各々の抗血清を
得；（ロ）該免疫動物を免疫した抗原に対する特定のモノク
ローナル抗体と該抗血清との間でのエピトープの競合を
検査し；（ハ）該モノクローナル抗体とエピトープの競合を示す
抗血清からキャプチャー側または検出側のポリクローナ
ル抗体試薬を調製し；そして（ニ）該モノクローナル抗体とエピトープの競合を示さ
ない抗血清から他方のポリクローナル抗体試薬を調製す
ることを特徴とする、前記キットの製造方法である。

【００２９】上記の構成によれば、特定のモノクローナ
ル抗体は単一のエピトープを認識するので、当該モノク
ローナル抗体とのエピトープの競合を指標にすること
で、ポリクローナル抗体同士のエピトープの競合も迅速
に特徴付けることが可能である。すなわち、特定のモノ
クローナル抗体との間でエピトープの競合を示す抗血清
は、そこに含まれる抗体群（ポリクローナル抗体）が当
該エピトープ若しくはその近傍を優先的に認識している
と考えられる。一方、モノクローナル抗体との間でエピ
トープの競合が起こらなければ、その抗血清は当該エピ
トープとは別の、離れたエピトープを優先的に認識する
抗体群（ポリクローナル抗体）を含むと判別できるので
ある。

【００３０】なお、上記の判別は、特定のポリクローナ
ルを固相化して、サンドイッチアッセイ法の原理を利用
して行うのが更に簡便である。したがって、本願発明の
第３は、（３）上記特定のモノクローナル抗体と抗血清
の間でのエピトープの競合の検査が；（イ）一定濃度の抗原と抗血清の混合溶液を調製し；（ロ）該溶液内で抗原抗体結合体を形成させ；（ハ）次いで、該混合溶液を、上記特定のモノクローナ
ル抗体の固相化体に添加し；そして、（ニ）該固相化モノクローナル抗体と特異的に結合した
（ロ）の抗原抗体結合体の量を測定することを特徴とす
る、上記（２）に記載の方法である。

【００３１】上記において、固相化モノクローナル抗体
と特異的に結合した抗原抗体結合体の量の測定は、抗血
清に含まれる抗体分子に特異的に反応する酵素標識抗体
を用いて、「固相化モノクローナル抗体」−「抗原」−
「抗血清由来の抗体分子」−「酵素標識抗体」の４分子
結合体を形成させることで容易に測定できる。例えば、
抗原がマウスインスリンであり、免疫動物がモルモット
である場合は、「固相化マウスインスリンモノクローナ
ル抗体」−「マウスインスリン」−「モルモット由来の
抗インスリン抗体（ＩｇＧ）」−「抗モルモットＩｇＧ
抗体（酵素標識付き）」である。酵素標識抗体の固相支
持体への結合量が少ないことは、固相化モノクローナル
抗体と抗血清に含まれる抗体群（ポリクローナル抗体）
との間にエピトープ競合があったことを示し、逆に当該
結合量が多いことは、エピトープの競合が少なかったこ
とを示す。

【００３２】なお、抗原と抗血清との混合による上記抗
原抗体結合体の形成は、固相化モノクローナル抗体との
接触（添加）と同時に行われてもよい。

【００３３】更に、上記サンドイッチアッセイにおいて
は、検査する抗血清を段階的に希釈してその用量依存性
を調べることが、エピトープの競合の判別において有利
である。したがって、本願発明の第４は、（４）上記一
定濃度の抗原と混合される抗血清の濃度を段階的に希釈
して上記抗原抗体結合体量を測定することを特徴とす
る、上記（３）に記載の方法である。

【００３４】なお、本願発明に用いることのできるポリ
クローナル抗体試薬は、ポリクローナル抗体自身のほ
か、そのいかなる反応性のフラグメント、例えばポリク
ローナル抗体の酵素消化体をも含み得る。好適な酵素消
化体は、抗体分子をペプシンで消化したＦ（ａｂ’）_２
フラグメントであり、そのようなフラグメントの使用は
高感度測定では必須とされるバックグラウンドの低減に
有効である。したがって、本願発明の第５及び第６は、
（５）ポリクローナル抗体試薬の少なくとも１つが抗体
分子の酵素消化体から調製される、上記（１）乃至
（４）のいずれかに記載の方法であり、（６）上記酵素
消化体が抗体分子のＦ（ａｂ’）_２フラグメントであ
る、上記（５）に記載の方法である。

【００３５】本願発明の方法は、抗原の分子量が約５０
００以下のような場合に特に有効である。そのような抗
原では、固体に認識されるエピトープの数がそれほど多
くないため、任意のポリクローナル抗体の組み合わせの
結果生じるポリクローナル抗体試薬間でエピトープの競
合が起こりやすいからであり、そのような場合に本願の
ような特定のポリクローナル抗体どうしの組み合わせが
有効になるのである。

【００３６】抗原がインスリンである場合が特に有利で
ある。したがって、本願発明の第７は、（７）測定対象
がインスリンである、上記（１）乃至（６）のいずれか
に記載の方法である。

【００３７】また、ポリクローナル抗体の生産性の観点
等から、抗原がインスリンであるときは免疫動物として
モルモットを用いることが有利である。したがって、本
願発明の第８は、（８）ポリクローナル抗体がモルモッ
トを免疫動物として得られる、上記（１）乃至（７）の
いずれかに記載の方法である。

【００３８】更に本願は、上記のような、エピトープの
競合を起こさないポリクローナル抗体の組み合わせ、特
に、抗原に対する１のモノクローナル抗体との間でエピ
トープの競合を示すようなポリクローナル抗体と、競合
を示さないようなポリクローナル抗体を組み合わせた免
疫測定キットにも関する。したがって、本願発明の第９
乃至１５は、（９）測定対象である抗原に対する１のモ
ノクローナル抗体との間でエピトープの競合を示す第１
のポリクローナル抗体試薬と、該モノクローナル抗体と
の間でエピトープの競合を示さない第２のポリクローナ
ル抗体試薬を含む免疫測定キット、（１０）サンドイッ
チアッセイのための上記（９）の免疫測定キットであっ
て、上記第１のポリクローナル抗体試薬がキャプチャー
側または検出側であり、上記第２のポリクローナル抗体
試薬がその他方の側である前記キット、（１１）上記ポ
リクローナル抗体試薬の少なくとも一方が抗体分子のＦ
（ａｂ’）_２フラグメントから調製される、上記（９）
または（１０）に記載のキット、（１２）測定対象がイ
ンスリンである、上記（９）乃至（１１）のいずれかに
記載のキット、（１３）上記インスリンが実験動物由来
である、上記（１２）に記載のキット、（１４）上記実
験動物がマウス、ラット及びハムスターからなる群から
選択される、上記（１３）に記載のキットであり、ま
た、（１５）ポリクローナル抗体がモルモットを免疫動
物として得られる、上記（９）乃至（１４）のいずれか
に記載のキットである。

【００３９】上記のようなキットを用いれば、インスリ
ンを５ｐｇ/ｍｌの感度で検出可能である。したがっ
て、本願発明の第１６は、（１６）試料中のインスリン
を１ｐｇ/ｍｌの感度で検出可能な上記（１２）乃至
（１５）のいずれかに記載のキットである。

【００４０】

【発明の実施の形態】本願発明に用いるポリクローナル
抗体は、測定対象である抗原で免疫した実験動物からの
抗血清を使用して調製する。抗原の調製、免疫動物への
投与及び当該動物からの抗血清の採取は当業者にとって
周知のいずれのプロトコールをも使用することができ、
そのようなプロトコールの最適化も当業者にとって容易
であろう。

【００４１】免疫動物としては、ヒツジ、ウサギ、サル
等も用いられ得るが、モルモットを用いるのが特に有利
である。

【００４２】当該免疫動物からの抗血清は、例えば、ア
ジュバントと共に抗原を免疫動物に皮下注射し、当該皮
下投与を適当な間隔（例えば２週間）で所定の回数（例
えば４回）繰り返し、最終免疫後に全血を採集して、こ
れを分離することで得ることができる。そのような方法
は、例えば、「ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩ
ＮＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２.４章（発行元：Ｊｏ
ｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．,ＮｅｗＹｏ
ｒｋ）」等に記載されている。

【００４３】次いで、本願発明によれば、複数の免疫動
物から得られた個々の抗血清は、その抗原に対する親和
性と、モノクローナル抗体に似た反応性、すなわち、優
先的に特定のエピトープを認識するという性質の２つの
観点から分別され選択される。

【００４４】ここで、インスリンに対する親和性につい
ては、例えば、免疫測定用のマイクロプレートやビーズ
に固相化したインスリンとの反応の強さを測定すること
で容易に判定できる。

【００４５】次いで、エピトープの認識に関する特異性
は以下の方法に準じて判定することが可能である。

【００４６】すなわち、インスリンを例にとれば、ま
ず、インスリン分子上の１のエピトープを認識するマウ
スモノクローナル抗体を免疫測定用のマイクロプレート
やビーズに固相化（コート）する。次いで、そこに、一
定濃度のインスリンと、濃度を変えたモルモット抗イン
スリン（ポリクローナル）抗体溶液またはモルモット抗
インスリン血清を同時に加えて固相と反応させる。固相
を洗浄後、モルモットＩｇＧに特異的に反応する酵素標
識抗体を加えて更に反応させ、次いで固相を再度洗浄
後、酵素基質を加えて酵素反応を行わせる。

【００４７】コートされたマウスモノクローナル抗体と
同一、或いはその近傍のエピトープを認識する抗体群が
多く含まれるようなモルモットポリクローナル抗体溶液
や抗血清は、該エピトープ或いはその近傍部位と結合
し、それにより、コートされたモノクローナル抗体と当
該エピトープとが更に結合するのを阻害する（エピトー
プの競合が起こる）。その結果、酵素標識抗体（抗モル
モットＩｇＧ抗体）が固相化モノクローナル抗体と結合
する量が減少し、酵素反応が弱くなる。

【００４８】一方、コートされたモノクローナル抗体の
認識するエピトープとは別の、離れたところにあるエピ
トープを認識する抗体群が多く含まれるポリクローナル
抗体溶液や抗血清は、コートされたモノクローナル抗体
とインスリンが結合することを阻害しないために（エピ
トープが競合しないために）酵素反応が強くなる。従っ
て、このような方法により、異なるエピトープを認識す
る抗体溶液や抗血清を分別することができるのである。

【００４９】上記ようにしてインスリンに対する親和性
と、モノクローナル抗体とのエピトープの競合とを判別
することにより、モノクローナル抗体より高い親和性を
持ち、且つ、モノクローナル抗体と類似の反応性（特異
性）を持つポリクローナル抗体を選び出すことができ
る。

【００５０】そして、このようにして選び出された複数
の抗血清からＩｇＧ画分または特異（ポリクローナル）
抗体を精製し、そのままでキャプチャー側のポリクロー
ナル抗体試薬として使用することができ、また、酵素標
識すれば検出側のポリクローナル抗体試薬として用いる
ことができる。

【００５１】そのような、ＩｇＧ画分等の精製や酵素標
識の方法は当業者にとって周知のいかなる方法も用いる
ことができ、例えば、夫々、「ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯ
ＴＯＣＯＬＳＩＮＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２.７
章（発行元：ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ,Ｉ
ｎｃ．,ＮｅｗＹｏｒｋ）」記載の方法や、「Ｉｍｍ
ｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＲｅｌａｔ
ｅｄＳｔａｉｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒ/ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄＢｉｏｍｅ
ｄｉｃａｌＰｒｅｓｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、２１５
〜２２４頁（１９７８年））」、「化学と生物、第１２
巻、６２６〜６３１頁（１９７４年）」、「Ｓｃａｎ
ｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．８（Ｓｕｐｐｌ.
７）、４３〜５５頁（１９７８年）」記載の方法を利用
することができる。

【００５２】酵素標識に用いる酵素にも特に制限はな
く、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリ性フ
ォスファターゼ等の酵素が有利に使用される。西洋ワサ
ビペルオキシダーゼを使用する場合は、当該酵素の基質
として３,３',５,５'−テトラメチルベンチジンがキッ
トに含まれてよく、アルカリ性フォスファターゼを使用
する場合は、基質としてｐ−ニトロフェニル燐酸がキッ
トに含まれ得る。

【００５３】更に、本願発明のポリクローナル抗体試薬
には、上記のようなＩｇＧ画分または特異抗体の他、特
異抗体を酵素消化して得られるような、該抗体の反応性
フラグメントを用いることもできる。特に、該フラグメ
ントが、特異抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａ
ｂ’）_２フラグメントである場合が有利である。当該Ｆ
（ａｂ’）_２等の酵素消化フラグメントは、「ＣＵＲＲ
ＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＩＭＭＵＮＯＬＯ
ＧＹ、第２.７章（発行元：ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆
Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．,ＮｅｗＹｏｒｋ）」記載の方法
に準じて容易に調製可能である。

【００５４】上記のように調製されたポリクローナル抗
体試薬は、キャプチャー側と検出側でエピトープの競合
が起こらないように組み合わされて最終的に免疫測定キ
ットとなるのである。

【００５５】本願発明のキットの測定対象としては蛋白
質、ペプチド等があげられる。したがって、本願発明の
キットは、例えば、インスリン、カルシトニン、Ｃ−ペ
プチド、レプチン、ベータ２−ミクログロブリン、レチ
ノール結合タンパク、アルファ１−ミクログロブリン、
アルファ−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、トロポニ
ン−Ｉ、クルカゴン様ペプチド、インスリン様ペプチ
ド、腫瘍増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板成長因
子、上皮増殖因子等の測定に用いられ得るがこれに限定
されない。特に、分子量が５０００以下の蛋白質の測定
に関し本願のキットは好適に用いられる。測定対象とし
ての抗原がインスリン、とくにマウス、ラットやハムス
ター由来のインスリンである場合が一層好ましい。その
場合、インスリンの超高感度測定系を作製することがで
きる。

【００５６】以下に、本願発明を実施例により詳細に説
明するが、本願発明は当該実施例により何等限定される
ものではないことは言うまでもない。

【００５７】

【実施例】実施例１インスリンを１０ｍＭ塩酸に対して２ｍｇ／ｍｌの濃度
で溶解した後、０．４Ｍの炭酸水素ナトリウムで２倍に
希釈し、フロイントの完全アジュバントで水中油型エマ
ルジョンを作製して、２０匹のモルモットに一匹あたり
皮下２０箇所において０．０５ｍｌづつ注射し、免疫し
た。

【００５８】二週間の間隔をあけて４回の免疫を繰り返
し、最終免疫後２週間目に全採血した。

【００５９】分離した抗血清を、インスリンを固相化し
た免疫測定用のマイクロプレートを用いてインスリンと
の反応性を調べたところ、２０匹から得られた個々の抗
血清の全てが１００万倍の希釈でも吸光度が１．０以上
あり、インスリンに対する結合活性（親和性）は免疫測
定に用いるには十分なものであった。

【００６０】実施例２実施例１で作製した抗血清に含まれる抗体群（ポリクロ
ーナル抗体）と抗インスリンモノクローナル抗体との間
でエピトープの競合を調べた。

【００６１】測定結果は表１に示す。

【００６２】

【表１】このデータより１６番と１７番の抗血清がコート抗体と
して用いたモノクローナル抗体とほぼ同じエピトープ
を、１番と２０番の抗血清がコートに用いたモノクロー
ナル抗体と異なるエピトープを認識する抗体を多く含む
ことが明らかとなった。すなわち、１６番及び１７番で
は、希釈倍率が低い（すなわち、濃度が高い）抗血清に
おいて吸光度の顕著な低下が観察され、これはコートし
たモノクローナル抗体とのエピトープの競合によるもの
と考えられる。一方、１番及び２０番ではそのような吸
光度の低下は観察されず、これはエピトープの競合がな
いことを示す。

【００６３】実施例３実施例２において、インスリン分子上での認識するエピ
トープが異なることが明らかとなった抗血清１番と１６
番より、特異抗体（ポリクローナル抗体）をインスリン
固相化カラムを通じて精製した。

【００６４】９６穴の免疫測定用のマイクロプレートを
用い、１番より精製した特異抗体（ポリクローナル抗
体）を２μｌ／ｍｌの濃度で１００μｌづつウェルに分
注し、室温で２時間静置してコートし、その後２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４／１５０ｍＭＮａ
Ｃｌで溶解した０．１％ＢＳＡを２００μｌづつウェル
に分注してブロッキングを行った。

【００６５】１６番より精製した特異抗体を０．２Ｍ
炭酸水素ナトリウムに対して透析し、同重量の活性化ペ
ルオキシダーゼと混合して酵素標識抗体を得た。

【００６６】抗体固相化マイクロプレートに９５μｌの
インスリン除去ラット血清を分注し、次いで０ｐｇ／ｍ
ｌから５,０００ｐｇ／ｍｌの標準インスリン希釈系列
５μｌを分注し、室温で一時間反応させた。次いで、ウ
ェルを洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗体を加え、室温
で１時間反応させた。

【００６７】ウェルを洗浄後、１００μｌの酵素基質液
（ＴＭＢ溶液）を加えて３０分間酵素反応を行い、１規
定の硫酸を加えて酵素反応を止めた後、４５０ｎｍの吸
光度を測定した。

【００６８】その結果を図１Ａ及びＢに示す。

【００６９】この結果より、本発明の測定試薬で１００
μｌの試料を用いると１ｐｇ／ｍｌの濃度までインスリ
ンが測定できることが示された。

【００７０】実施例４実施例３で得られた特異抗体をペプシンで酵素消化して
Ｆ（ａｂ’）_２を作製し、この１ｍｇと活性化ペルオキ
シダーゼ０．７ｍｇと混合し、酵素標識Ｆ（ａｂ’）_２
得た。

【００７１】この酵素標識Ｆ（ａｂ’）_２を実施例３で
用いたペルオキシダーゼ標識抗体の代わりに用いてイン
スリンを測定した結果を図２に示す。

【００７２】この結果より１００μｌの試料を用いると
上記実施例３よりも０ｐｇ／ｍｌの時の吸光度が下が
り、より安定したデータが得られるようになった。

【００７３】実施例５実施例３に示した方法でラット血清を試料としてインス
リン濃度を測定した。

【００７４】同じラット血清の量を変えて測定した結果
を図３に示す。この結果より本発明の測定試薬を用いる
とラットの血清量５μｌから１００μｌまで良好な直線
性が得られ、１００μｌの血清試料を用いてもインスリ
ンが測定できることが示された（図１Ｂの標準曲線参
照）。

【００７５】実施例６実施例４と同様にマウス血清を試料としてインスリン濃
度を測定した結果を図４に示す。

【００７６】この結果より本発明の測定試薬を用いると
マウスの血清量５μｌから１００μｌまで良好な直線性
が得られ、１００μｌの血清試料を用いてもインスリン
が測定できることが示された。

【００７７】実施例７実施例５と同様にマウス血清及びマウス全血を試料とし
てインスリン濃度を測定した結果を図５に示す。

【００７８】この結果より本発明の測定試薬を用いると
マウスの全血を用いてもインスリン濃度を測定すること
ができることが示された。

【００７９】実施例８実施例３の方法に準じて、ヒトインスリン標準用液１０
０μｌを用い、ヒトインスリンの測定も行った。その結
果を図６に示す。

【００８０】この結果から、１００μｌのサンプル量に
おいてもヒトインスリンを１ｐｇ／ｍｌの感度で測定可
能なことが示された。

【００８１】

【効果】抗原分子上の異なるエピトープを優先的に認識
するような２以上の高親和性抗体群（ポリクローナル抗
体）を選択し、これらを組み合わせて使用するという本
願発明の構成により、従来用いられてきた測定試薬より
高感度な免疫測定キットが提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、本願のキットによるラットインス
リン（０〜５ｎｇ/ｍｌ）の測定結果を示す。

【図１Ｂ】図１Ｂは、本願のキットによるラットインス
リン（０〜２０ｎｇ/ｍｌ）の測定結果を示す。

【図２】図２は、ポリクローナル抗体試薬としてＦ（ａ
ｂ’）_２フラグメントを使用した場合の本願のキットに
よるラットインスリンの測定結果を示す。

【図３】図３は、本願のキットによるラット血清中のイ
ンスリン濃度の測定結果を示す。

【図４】図４は、本願のキットによるマウス血清中のイ
ンスリン濃度の測定結果を示す。

【図５】図５は、本願のキットによるマウス血清及びマ
ウス全血中のインスリン濃度の測定結果を示す。

【図６】図６は、本願のキットによるヒトインスリンの
測定結果（サンプル量１００μｌ）を示す。

フロントページの続き (72)発明者杉谷政則神奈川県横浜市鶴見区下末吉２丁目１番１号株式会社森永生科学研究所内 (72)発明者豆越慎一神奈川県横浜市鶴見区下末吉２丁目１番１号株式会社森永生科学研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも２以上のポリクローナル抗
体試薬を含む免疫測定キットの製造方法であって、当該
ポリクローナル抗体試薬は、互いに抗原上の異なるエピ
トープを優先的に認識するように選択されることを特徴
とする、前記キットの製造方法。
【請求項２】請求項１に記載の免疫測定キットの製
造方法であって、該方法は；（イ）少なくとも２以上の免疫動物から各々の抗血清を
得；（ロ）該免疫動物を免疫した抗原に対する特定のモノク
ローナル抗体と該抗血清との間でのエピトープの競合を
検査し；（ハ）該モノクローナル抗体とエピトープの競合を示す
抗血清からキャプチャー側または検出側のポリクローナ
ル抗体試薬を調製し；そして（ニ）該モノクローナル抗体とエピトープの競合を示さ
ない抗血清から他方のポリクローナル抗体試薬を調製す
ることを特徴とする、前記キットの製造方法。
【請求項３】上記特定のモノクローナル抗体と抗血
清の間でのエピトープの競合の検査が；（イ）一定濃度の抗原と抗血清の混合溶液を調製し；（ロ）該溶液内で抗原抗体結合体を形成させ；（ハ）次いで、該混合溶液を、上記特定のモノクローナ
ル抗体の固相化体に添加し；そして、（ニ）該固相化モノクローナル抗体と特異的に結合した
（ロ）の抗原抗体結合体の量を測定することを特徴とす
る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】上記一定濃度の抗原と混合される抗血
清の濃度を段階的に希釈して上記抗原抗体結合体量を測
定することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】ポリクローナル抗体試薬の少なくとも
１つが抗体分子の酵素消化体から調製される、請求項１
乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】上記酵素消化体が抗体分子のＦ（ａ
ｂ’）_２フラグメントである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】測定対象がインスリンである、請求項
１乃至６のいずれか一項に記載の方法
【請求項８】ポリクローナル抗体がモルモットを免
疫動物として得られる、請求項１乃至７のいずれか一項
に記載の方法
【請求項９】免疫測定キットであって、（イ）測定対象である抗原に対する１のモノクローナル
抗体との間でエピトープの競合を示す第１のポリクロー
ナル抗体試薬と、（ロ）該モノクローナル抗体との間でエピトープの競合
を示さない第２のポリクローナル抗体試薬とを含む、前
記キット。
【請求項１０】サンドイッチアッセイのための請求項
９に記載の免疫測定キットであって、上記第１のポリク
ローナル抗体試薬がキャプチャー側または検出側であ
り、上記第２のポリクローナル抗体試薬がその他方の側
である、前記キット。
【請求項１１】上記ポリクローナル抗体試薬の少なく
とも一方が抗体分子のＦ（ａｂ’）_２フラグメントから
調製される、請求項９または１０に記載のキット。
【請求項１２】測定対象がインスリンである、請求項
９乃至１１のいずれか一項に記載のキット
【請求項１３】上記インスリンが実験動物由来であ
る、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】上記実験動物がマウス、ラット及びハ
ムスターからなる群から選択される、請求項１３に記載
のキット。
【請求項１５】ポリクローナル抗体がモルモットを免
疫動物として得られる、請求項９乃至１４のいずれか一
項に記載のキット。
【請求項１６】試料中のインスリンを１ｐｇ/ｍｌの
感度で検出可能な請求項１２乃至１５のいずれか一項に
記載のキット。