DE3636724A1

DE3636724A1 - Enzymimmunoassay (elisa) zur insulinbestimmung im mikrotiterplattensystem

Info

Publication number: DE3636724A1
Application number: DE19863636724
Authority: DE
Inventors: Joern Dr Med Kekow
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-10-29
Filing date: 1986-10-29
Publication date: 1988-06-23

Description

Die Erfindung betrifft einen ELISA im Mikrotiterplattensystem zur Insulinbestimmung. Insulin wird von den Beta-Zellen der Langerhansschen Inseln des Pankreas gebildet und reguliert entscheidend den Glucosestoffwechsel. Besonders in der Medizin wird in Diagnostik, Therapie und in der Wissenschaft Insulin quantitativ bestimmt.

Yalow und Berson (J. Clin. Invest. 39, 1157, 1960) haben 1960 erstmals einen Radioimmunoassay (RIA) zur Insulinmessung vor gestellt. Variationen kommen in Klinik und Forschung zur Anwendung (L. G. Heding, Diabetologica 8, 260, 1972). Benutzt man Spezies-gleiche Standards, kann man mit dem gleichen Assay Insulin vom Menschen und anderen Säugetierspezies messen, sofern der verwandte Insulinantikörper eine entsprechende Kreuzreaktivität besitzt. Eine neue Entwicklung, ohne radioaktives Material Stoffe im Nanogramm-Bereich zu messen, ist ein ELISA (A. Voller, A. Bartlett und D. E. Bidwell, J. Clin. Pathol. 31, 507, 1978). Ein ELISA ist im Mikrotiterplattensystem (z. B. von der Firma Nunc, Dänemark) durchführbar und ermöglicht bislang nicht gekannte Laborkapazitäten. Während in der Hepatitis-Diagnostik und der Mikrobiologie die ELISA-Technologie den RIA zunehmend verdrängt, liegen in der Hormondiagnostik noch keine vergleichbaren Testsysteme vor.

Eine Insulinmessung mit handelsüblichen RIAs ist von Radionu kleotiden abhängig. Dies erfordert ein nach der Strahlenschutz verordnung zugelassenes Labor und geschultes Personal. Nur frisch markiertes Insulin kann für die Messungen verwandt werden, so daß Insulinbestimmungen nicht zu beliebigen Zeitpunkten durchgeführt werden können. Die Durchführung in Röhrchen (meist 5-10 ml Volumen) und ein Testaufbau mit freier Antigen (Insulin)- und Antikörper (Insulinantikörper)-Phase bedingen insgesamt geringe Laborkapazitäten und aufwendige Wasch- und Fällungsvorgänge (Literatur bei L. G. Heding, s. o.).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Insulin ohne Verwendung radioaktiven Materials zu messen. Als grundsätzliche Ausführung des Meßsystems bietet sich ein ELISA an. Die praktische Durchführung soll in einem Mikrotiterplattensystem erfolgen. Dabei ergibt sich gegenüber der RIA-Methode die Problematik, daß der Insulinantikörper in einem Festphasensystem vorliegen muß. Eigene Vorversuche (siehe auch Ausführungsbeispiel und Zeichnung 1) zeigten dabei, daß der Insulinantikörper bei direkter Bindung an die Mikrotiterplatte seine Insulinbindungsfähigkeit in hohem Maße verliert. Deshalb war die Entwicklung einer neu artigen Insulinantikörperfixierung an eine feste Phase notwen dig.

Die Aufgabe wird erfindungsmäßig dadurch gelöst, daß der In sulinantikörper über einen zweiten Antikörper, der gegen den Insulinantikörper gerichtet ist, an die Mikrotiterplatte gebunden wird. Dieses "Sandwich"-artige Coating-Verfahren ermöglicht eine für die Insulinmessung ausreichende Bindungskapazität des Insulinantikörpers. Diese Ausgangssituation läßt dann einen ELISA für Insulin mit handelsüblichen Reagenzien zu.

Ausführungsbeispiel Prinzip

Der hier beschriebene ELISA basiert auf dem Prinzip der kompetitiven Bindung von markiertem und unmarkiertem Insulin an einem fest gebundenen Insulinantikörper.

Reagenzien

Der Kaninchen-anti-Meerschweinchenantikörper, der zur Fixierung des Insulinantikörpers an die Mikrotiterplatte benutzt wird, ist über die EY Laboratories Inc, San Mateo, CA., USA erhältlich (Katalog Nr. AT-2358). Der Insulinantikörper wird vom Novo Forschungslabor, Bagsvaerd, Dänemark, vertrieben (Code Nr. 8309). Dieser Antikörper stammt von Meerschweinchen, die mit Schweineinsulin immunisiert wurden. Er besitzt eine Kreuzreaktivität mit diversen tierischen Insulinen und mit menschlichem Insulin. Insulinstandardpräparationen sind eben falls über Novo erhältlich. Das markierte Insulin (hier ein Insulin-Peroxidase-Konjugat) ist bei der Firma Sigma, St-Louis, MO, USA (Katalog Nr. 1-2133) zu kaufen. Das Konjugat setzt Or thophenylendiamindihydrochlorid (OPD) um, es kommt zu einem gelb-braunen Farbumschlag, der photometrisch erfaßt wird.

Pufferlösungen: Coating-Puffer (zum Binden des Anti-Meer schweinchenantikörpers an Polystyrol <der Mikrotiterplatte<): Carbonpuffer pH 9,6. Inkubationspuffer für das Binden des Insulinantikörpers an den Kaninchenantikörper: Phosphatpuffer pH 7,4 0.04 molar, Rinderalbumin (RIA-grade, z. B. von der Firma Sigma) 1 g/l. Inkubationspuffer für die Standards/zu messenden Proben: Phosphatpuffer pH 7,4 0.04 molar mit 6 g NaCl/l und Rinderalbumin 60 g/l. Enzympuffer für OPD: Phosphatpuffer pH 5,6 mit 20 mg OPD/100 ml und 0.15% H₂O₂. Waschpuffer: Phosphatpuffer pH 7,4 mit 0.05% TWEEN.

ELISA-Durchführung

Mikrotiterplatten (z. B. von der Firma Nunc, Roskilde, Dänemark) werden ähnlich einem "Sandwich" vorbereitet. Der 1 : 1000 verdünnte Kaninchenanti-Meerschweinchen antikörper wird bei pH 9,6 in 2 stündiger Inkubation bei 37°C an die Platten gebunden (150 µl/well). Dann werden überschüssige Antikörper abgewaschen und eine 1 : 60 000 Verdünnung des Insulinantikörpers zugegeben (pH 7,4; 100 µl/well für 2 Stunden bei 37°C). Aus der Standardlösung wird eine entsprechende Standardreihe mit abfallenden Verdünnungsschritten hergestellt (Beginn z. B. mit 100 ng/ml Insulin). Die zu messenden Proben werden ebenfalls verdünnt. Nach Waschen der Mikrotiterplatte werden Standards und Meßpro ben als Dreifachansätze in die Platten gegeben (100 µl/well). Es folgt eine 18stündige Inkubation bei 4°C. Ohne Waschen werden dann je 100 µl/well einer 1 : 10 000 Verdünnung des Konjugates zuge geben und für weitere 4 Stunden bei 4°C inkubiert. Nicht gebundenes Insulin wird durch Waschen entfernt und 100 µl/well OPD werden zugegeben. Die Extinktion wird dann bei 492 nm gemessen (Dauer des Farbumschlages etwa 30 min und Stoppen der Enzymre aktion mit H₂SO₄). Sämtliche Pipettier- und Waschvorgänge sind automatisierbar, z. B. durch einen ELISA-Mikroprozessor der Firma Behring, Marburg. Die Datenauswertung kann ein Rechner mit Interface zum Photometer übernehmen.

Zeichnung 1 gibt eine bildliche Darstellung der Bedeutung der Erfindung für die Durchführung des ELISA zur Insulinbestimmung wieder. Es ist die Auswirkung der Art der Insulinantikörper bindung an die Mikrotiterplatte wiedergegeben: Nur die Fixierung über einen zweiten Antikörper (Kurve C) führt zu einer brauchbaren Standardkurve.

Charakteristische Meßergebnisse des vorgestellten Ausführungs beispiels sind für Ratteninsulin in den Tabellen 1-3 zusammen gefaßt.

Tabelle 1

Variation innerhalb eines Assays (für Ratteninsulin)

Tabelle 2

Variation zwischen Assays (für Ratteninsulin)

Tabelle 3

Wiederfindung (für Ratteninsulin)

Zeichnung Nr. 1:
Darstellung typischer Standardkurven für Ratteninsulin.

Kurven A+B:Der Insulinantikörper wurde direkt auf die Mikrotiter platte gecoatet (Verdünnung des Insulinantikörpers bei Kurve A = 1 : 12 500 und bei Kurve B = 1 : 60 000). Kurve C:Der Insulinantikörper wird über einen zweiten Anti körper (Kaninchen-anti-Meerschweinchenantikörper) in einem "Sandwich"-artigen System an die Mikrotiterplatte gebunden (Verdünnung des Insulinantikörpers hier 1 : 60 000).

Die Extinktion ist als Mittelwert ±Standardabweichung bei Drei fachbestimmung dargestellt.

Claims

Enzymimmunoassay (ELISA) zur Insulinbestimmung im Mikrotiter plattensystem.
Er ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Insulinmessung durch kompetitive Bindung (markierten/unmarkierten Insulins) an Insulin antikörper in einem "Sandwich"-Festphasensystem (Mikrotiter platte) mit einem zweiten Antikörper erfolgt.