CH636258A5 - Einrichtung zur bestimmung von antigenen oder antikoerpern in menschlichen koerperfluessigkeiten. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur Bestimmung von Antigenen, insbesondere von Hepatitis-B-Surface-An-tigen oder von Antikörpern, in menschlichen Körperflüssigkeiten, wie Humanplasma, Humanserum und deren Fraktionen, in Form eines Antigen-Antikörper-Komplexes, bei dem die Antikörperkomponente radioaktiv markiert ist.
Radioimmunotests - auch Radioimmunoassays genannt - wurden anfangs vorwiegend zum Nachweis von Hormonen verwendet. Das von Yalow und Berson (J. Clin. In-vest. 1157-1175,1960, «Immunoassay of endogenous plasma insulin in man») beschriebene System basiert auf der Fähigkeit eines hochspezifischen Antikörpers, sein radioaktiv markiertes Antigen zu binden und auf der Hemmung dieser Reaktion durch das unmarkierte (Probe-)-Antigen, welches nachzuweisen ist. Anschliessend wird das nichtgebundene radioaktive Antigen quantitativ aus dem Testgemisch entfernt und die gebundene Aktivität in einem geeigneten Gerät gemessen. Die Schwierigkeit bei der Durchführung solcher Bestimmungen besteht darin, die bei der Komplexbildung nichtumgesetzten Komponenten quantitativ abzutrennen. Zur Trennimg kommen die Methoden der Papierelektrophorese, Fällung mit einem zweiten Antikörper (Doppelantikörpermethoden), Fällung des Antigen-Antikörper-Komplexes mit Polyäthylenglycol, Adsorption des freien Antigens an Aktivkohle oder Trennung durch Reaktion an einer festen Phase in Betracht. Im letzteren Fall wird die feste Phase entweder durch covalente Bindung einer Reaktionskomponente an aktivierter Cellulose, Sephadex oder Se-pharose (Wide und Porath, Biochem. Biophys. Acta 130, 257-260,1966, «Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex coupled antivodies»), oder durch Adsorption eines Reaktionspartners an eine geeignete Oberfläche, vorzugsweise Kunststoffe, (Catt, Niall und Tregear, Biochem. J., 100, 31C-33C, 1966, «Solid-phase radioimmunoassay of human growth hormone») hergestellt.
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Für den Nachweis von Hepatitis-B-Surface-Antigen (HBSAG) und den entsprechenden Antikörper (antiHBsAB) mittels Radioimmunotests sind bisher die folgenden Methoden bekannt:
1. Ausria I, Ausria II, Ausab (Abbott Laboratories). Diese arbeiten nach dem sogenannten Sandwich-Prinzip.
Bei der Ausria I-Methode wird ein mit Antikörper be-ladenes Röhrchen verwendet, in welches die zu untersuchende Probe gefüllt wird; nach Inkubation bildet sich bei Vorhandensein von Antigen ein Komplex Antikörper-Antigen (AB-AG), wobei die Antikörper-Komponente am Röhrchen fixiert ist. Die Flüssigkeit wird dann entfernt, das Röhrchen gewaschen und mit einer Lösung von radioaktiv markiertem Antikörper versetzt. Nach nochmaliger Inkubation bildet sich ein Komplex Antikörper-Antigen-markierter Antikörper (AB-AG-AB*); das Röhrchen wird wieder gewaschen und die Radioaktivität des AB-AG-AB*-Komplexes (Sandwich-Komplex) bestimmt. Die Markierung des Antikörpers erfolgt durch Einbau von radioaktivem Jod (125J) in bekannter Weise. Die Ausria II-Methode verwendet anstelle von Röhrchen kugelförmige feste Träger. Die Ausab-Me-thode ist den Ausria-Methoden weitgehend ähnlich. Hier wird jedoch ein umgekehrter Aufbau des Sandwich-Kom-plexes, nämlich AG-AB-AG* gewählt;
2. Riausure-Methode der Electro Nucleonics Laboratories. Bei dieser Methode wird in ähnlicher Weise wie bei der Ausria II-Methode ein Sandwich-Komplex gebildet, jedoch werden statt Kugeln Glaspartikel als feste Träger verwendet;
3. Combi RIA Biotest-Methode. Bei dieser wird die auf Antigen zu prüfende Probe mit einem eingestellten Antikörper versetzt und das Gemisch in ein mit Antigen beschichtetes Näpfchen übergeführt. Nach Inkubation und Waschung wird radioaktives Antigen zugefügt, inkubiert und wieder gewaschen.
Auch hier handelt es sich also um eine der Sandwich-Methoden, bei denen umständliche Wasch- und Trennoperationen erforderlich sind. Bei einem geringen Gehalt an Antigen in Proben sind alle diese Methoden ungenau.
Die vorliegende Erfindung bezweckt die Vermeidung der geschilderten Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, eine geeignete Einrichtung zu schaffen, durch welche aufwendige Trennungs- und Waschvorgänge vermieden werden und die Genauigkeit der Bestimmung erhöht wird.
Die erfindungsgemässe Einrichtung zur immunologischen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in menschlichen Körperflüssigkeiten mit einer Mikrotiterplatte mit Ausnehmungen zur Aufnahme zu untersuchender Proben und mit festen, von einem Komplexbildner beladbaren Trägern ist dadurch gekennzeichet, dass die Träger aus Plättchen oder Stiften bestehen, die an einer Halteleiste befestigt und in die Ausnehmungen der Mikrotiterplatte einsetzbar sind.
Diese Einrichtung erlaubt, dass die auf Antigengehalt oder Antikörpergehalt zu prüfende Probe mit einer Lösung des radioaktiv markierten Antikörpers versetzt und sodann ein mit unmarkiertem Antigen beladener fester Träger mit der Probeflüssigkeit in Kontakt gebracht wird, worauf nach Waschen des Trägers die Radioaktivität des Trägers gemessen wird.
Bei diesem, mit der neuen Einrichtung durchführbaren Verfahren erfolgt die Auswertung durch direkte Messung der Radioaktivität an der festen Phase - nicht durch Messung der Radioaktivität der Überstände, wie dies bei den bisher bekannten Radioimmunotests der Fall war. Abgesehen von der Arbeitsersparnis durch Vermeidung von Zen-trifugieren und Pipettieren erhält man die höchsten Zählraten im Bereich der negativen oder sehr schwach positiven
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Proben, was eine wesentliche Verbesserung und Sicherung des Testergebnisses darstellt.
Im Falle, dass die untersuchte Probe Antigen erhält, reagiert dieses mit dem radioaktiv markierten Antikörper.
Beim nachfolgenden Schritt, bei dem der mit unmarkiertem Antigen beladene Träger in die Reaktionsflüssigkeit eingetaucht wird, kann nur noch jener Teil des markierten Antikörpers mit dem an dem Träger adsorbierten Antigen reagieren, der nicht durch den Probe-Antigengehalt verbraucht wurde. Man wird also nach dem Waschen des Trägers ein gewisses Mass an gebundener Radioaktivität vorfinden, das umgekehrt proportional ist dem Antigengehalt in der Probe.
Im Falle, dass die zu untersuchende Probe nicht Antigen, sondern Antikörper enthält, wird der Antikörpergehalt in der Probeflüssigkeit erhöht. Während der ersten Inkubation erfolgt also keine Reaktion. Wird sodann beim nächsten Schritt der mit unmarkiertem Antigen beladene feste Träger mit der Probeflüssigkeit in Kontakt gebracht, so entsteht eine Konkurrenz des unmarkierten und des markierten Antikörpers in der Reaktion mit dem adsorbierten Antigen am Träger, was bedeutet, dass auch in diesem Fall ein bestimmtes Mass an Radioaktivität an dem gewaschenen Träger festgestellt wird, welches wieder umgekehrt proportional ist dem Antikörpergehalt der untersuchten Probe. Stellt man bei einer Reihenuntersuchung von Proben eine verminderte Radioaktivität gegenüber einer Kontrollprobe fest, die weder Antigen noch Antikörper enthält, so weiss man zwar, dass die jeweilige Probe entweder Antigen oder Antikörper enthalten hat, aber man weiss noch nicht, ob das eine oder das andere; um nun dieses herauszufinden, kann eine sogenannte Differentialdiagnose durchgeführt werden, bei der eine zweite Probe der gleichen Art mit einem zweiten Träger in Kontakt gebracht und inkubiert wird. Der Träger wird gewaschen und in einem weiteren Schritt mit radioaktiv markiertem Antikörper in Kontakt gebracht und inkubiert. Stellt man bei dieser Messung der Radioaktivität eine erhöhte Zählrate fest, so heisst dies, dass kein Antikörper in der Probe war, sondern Antigen, weil das ganze adsorbierte Antigen zur Bildung des Komplexes Antigen-Antikörper verbraucht wurde. Stellt man hingegen eine erniedrigte Zählrate fest, so bedeutet dies, dass bei der Inkubation der Antikörper der Probe mit dem adsorbierten Antigen zur Bildung des An-tigen-Antikörper-Komplexes verwendet wurde und nur noch wenige Bindungsstellen für den markierten Antikörper an dem mit Antigen beladenen Träger frei waren.
Vorteilhaft wird ein mit Heparin stabilisierter, radioaktiv markierter Antikörper verwendet.
Zweckmässig werden die Inkubationen bei einer Temperatur zwischen 18 und 45 °C während einer Dauer von 30 Minuten bis 15 Stunden, vorzugsweise bei 45 °C während 60 Minuten, durchgeführt.
Die erfindungsgemässe Eineichtung ist im besondern für die Bestimmung von HBSAG und antiHBsAB geeignet. Sie kann jedoch im Prinzip für den Nachweis aller Antigene verwendet werden, gegen die man spezifische Antikörper entwickeln kann. Ebenso eignet sie sich zum Nachweis von Antikörpern, deren Antigene Proteine bzw. Polypeptide darstellen und die in gereinigter Form dargestellt werden können. Es kann auch angewendet werden, wie das System HBSAG/ antiHBsAB zeigt, für den relativ seltenen Fall, dass in Patientensera sowohl das Antigen als auch der Antikörper enthalten ist. Weitere Anwendungsmöglichkeiten liegen in der Bestimmung von Virus-Antigenen und in der Bestimmung von Blutgerinnungsfaktoren, insbesondere des Faktor-VIII-Proteins.
In der erfindungsgemässen Einrichtung ist vorteilhaft zwischen der Halteleiste und jedem einzelnen Plättchen eine
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Nut zur Bildung einer Sollbruchstelle vorgesehen. Die Trä-gerplättchen können vorteilhaft aus Kunststoff bestehen.
Die Beladung des Trägers kann derart erfolgen, dass er mit einer Antigen-Lösung durch Tauchen während einer Zeit von 24 bis 60 Stunden behandelt wird.
In der Zeichnung ist eine bevorzugte Ausfuhrungsform der Einrichtung näher erläutert, wobei Fig. 1 eine schaubildliche Ansicht darstellt und Fig. 2 den Aufriss eines Trägers zeigt.
Die Einrichtung umfasst eine Mikrotiterplatte 1, die mehrere Reihen von z.B. zwölf Ausnehmungen 2,2', 2"... zur Untersuchung der Probe aufweist. Weiter gehören zur Einrichtung Halteleisten 3, an denen jeweils eine Reihe von numerierten Plättchen 4,4', 4"... angeordnet ist, entsprechend der Zahl der Ausnehmungen einer Reihe der Mikroti- . terplatte. Die Plättchen 4,4', 4"... sind an der Halteleiste 3 mittels Halsstücken 5,5', 5"... befestigt, deren Querschnitt geringer ist als der der Plättchen. Diese Halsstücke bilden Sollbruchstellen. Nachdem die Plättchen nach dem beschriebenen Verfahren mit der zu untersuchenden Flüssigkeit in Ausnehmungen der Mikrotiterplatte reagiert haben, werden die Plättchen abgebrochen und in Zählröhrchen 6 fallen gelassen, wie in Fig. 2 angedeutet ist.
Diese Einrichtung lässt sich zum Beispiel wie folgt verwenden:
Beispiel 1
Bestimmung von HBSAG und antiHBsAB
Bei dieser Untersuchung können in der zu untersuchenden Probe einer menschlichen Körperflüssigkeit entweder das HBSAG oder das antiHBsAB oder keine der beiden Substanzen enthalten sein. In einem ersten Untersuchungsansatz werden 0,2 ml des zu untersuchenden Materials etwa 60 Minuten bei 45 °C in einem Brutschrank mit dem gereinigten 125J markierten antiHBsAB (0,1 ml enthält ca. 0,1 mcCi) in einer Mikrotiterplatte inkubiert, wobei zwei HBSAG positive, drei HBsAG/antiHBsAB negative und sieben HBsAG schwach positive Kontrollproben mitgeführt werden. Am Ende dieser Inkubation werden die mit HBSAG beschichteten kammartigen Träger in die vorinkubierten Mischungen eingebracht und bei 45 °C 90 bis 120 Minuten weiter inkubiert. Danach werden die kammartigen Träger aus den Testlösungen entfernt und in einer Wanne mit Leitungswasser gewaschen. Die einzelnen Testplättchen an den kammartigen Trägern werden durch Abbrechen an den Sollbruchstellen in Teströhrchen überführt und in einem Gamma-Spektrometer die gebundene Radioaktivität an den einzelnen Plättchen ermittelt. Es wurden an den mitgeführten Kontrollproben 1 bis 12 und an den zu prüfenden Proben 13 bis 24 die folgenden Werte erhalten:
Probe
Zeit in min cpm
(Impulse pro min)
1
1,00
684
2
1,00
672
3
1,00
4644
4
1,00
4148
5
1,00
4087
6
1,00
1974
7
1,00
1997
8
1,00
1846
9
1,00
2035
10
1,00
1942
11
1,00
2455
12
1,00
1598
13
1,00
433 positiv
14
1,00
340 positiv
Probe
Zeit in min cpm
(Impulse pro min)
15
1,00
4996
16
1,00
4020
17
1,00
2946
18
1,00
2673
19
1,00
2445
20
1,00
2822
21
1,00
1317 positiv
22
1,00
1550 positiv
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1,00
3991
24
1,00
4052
Die Proben 1 und 2 sind stark HBsAG-positives Kontrollserum, die Proben 3 bis 5 HBsAG/antiHbsAB-negatives Kontrollserum; die Proben 6 bis 12 sind HBsAG-schwach-positives Kontrollserum. Von diesen drei Gruppen wurden die Durchschnittswerte ermittelt und bei den sieben HBSAG-schwach-positiven Kontrollsera 20% zum Durchschnittswert zugezählt bzw. abgezogen. Es ist nun gefordert, dass zumindest sechs der sieben Proben innerhalb dieser ermittelten Grenzen liegen. Befindet sich eine Probe ausserhalb der beiden Grenzwerte (in der hier vorliegenden Reihe Probe Nr. 11), so wird ihr Wert bei der Auswertung nicht berücksichtigt. Der Durchschnittswert der bleibenden sechs Proben plus 20% gilt als Grenzwert. Jede Probe, diecine niedrigere Zählrate als dieser Grenzwert hat, ist als positiv anzusehen und ist in der Tabelle als positiv bezeichnet (Proben 13,14, 21,22).
Nach diesem ersten Testansatz ist zu entscheiden, ob die positive Reaktion vom HBSAG oder vom antiHBsAB herrührt. Zur Erstellung der Differentialbestimmimg führt man nun einen zweiten Testansatz in der folgenden Weise durch:
Es werden Proben mit je 0,2 ml in die Mikrotiterplatte vorgelegt und mit HBsAG beschichteten kammartigen Trägern 60 Minuten bei 45 °C inkubiert. Die Träger werden danach aus den Probelösungen entfernt und, wie oben beschrieben, gewaschen und weitere 60 bis 120 Minuten in 0,2 ml einer 1 plus 1 Verdünnung des 12SJ markierten antiHBsAB in physiologischer Salzlösung inkubiert. Danach werden die kammartigen Träger ein zweites Mal gewaschen und wie oben in einem Gamma-Spektrometer untersucht. Dabei ist zu beachten, dass bei der ersten Testreihe es beim Vorhandensein von HBSAG in der Probe bei der ersten Inkubation zu einer spezifischen Inhibition des radioaktiv markierten Antikörpers, beim Vorhandensein von antiHBsAB in der Probe es jedoch nur zu einer Vermehrung der Gesamtantikörpermenge im Reaktionsgemisch kommt. Nach Einsetzen der kammartigen Träger wird der nicht an Probeantigen gebundene radioaktiv markierte Antikörper an die Oberfläche der Testplättchen gebunden, und bei Vorhandensein von HBSAB wird sowohl ein Teil des Probeantikörpers als auch ein Teil des radioaktiv markierten Antikörpers an die Oberfläche der kammartigen Träger fixiert. Es kommt im Vergleich zu HBsAG/antiHBsAB-netativen Kontrollproben sowohl beim Vorhandensein von HBSAG in einer Probe als auch beim Vorhandensein von HBSAB in einer Probe zu einer Reduktion der Zählraten an den Testplättchen. Bei der Differentialbestimmung erfolgt bei der Inkubation der kammartigen Träger mit den Proben bei Vorhandensein von HBSAG in den Proben bzw. bei Proben, die HBS AG/anti-HBsAB-negativ sind, keine immunologische Reaktion. Ist antiHBsAB in der Probe, so kann er die Antigenbindungs-stellen am kammartigen Träger besetzen.
Werden die kammartigen Träger nun gewaschen und nochmals, diesmal mit12 5 J markiertem antiHBsAB, ins
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kubiert, so kann das radioaktive Material nur die noch freien Antigenbindungsstellen an der festen Phase besetzen. Es kommt also bei Vorhandensein von antiHBsAB in den Proben zu einer Verringerung der Zählraten. Bei Anwesenheit von HBSAG oder HBsAG/antiHBsAB-negativen Proben bleiben die Zählraten hoch.
Die gefundenen Ergebnisse sind in der umseitigen Tabelle angeführt:
Probe
Zeit in min cpm
(Impulse pro min)
1
1,00
3866
2
1,00
3716
3
1,00
3949
4
1,00
3799
5
1,00
3964
6
1,00
1435
7
1,00
1504
8
1,00
1605
9
1,00
1627
10
1,00
1482
11
1,00
1449
12
1,00
1448
13
1,00
3951 positiv HBSAG
14
1,00
4026 positiv HBSAG
15
1,00
3910
16
1,00
3996
17
1,00
3884
18
1,00
3843
19
1,00
3917
20
1,00
3871
21
1,00
363 positiv antiHBsAB
22
1,00
1335 positiv antiHBsAB
23
1,00
3776
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Als Kontrollsera Nr. 1 und 2 HBSAG wurde schwach positives Serum eingesetzt; Nr. 3 bis 5 sind HBsAG/anti-HBsAB-negative Sera und die Kontrollproben Nr. 6 bis 12 sind antiHBsAB positive Sera. Es wurden wieder die Durchschnittswerte dieser drei Gruppen und der Grenzwert der an-tiHBsAB-positiven Gruppe wie oben ermittelt. Jede Probe, deren Zählrate unter diesem Grenzwert liegt, ist als positiv hinsichtlich antiHBsAB anzusehen (Proben 21,22). Die Proben 13 und 14 lieferten hohe Zählraten und sind als HBS AG-positiv zu werden. Alle restlichen Proben, die in beiden Reaktionen hohe Zählraten geliefert haben, sind HBSAG und antiHBsAB-negativ.
Beispiel 2
Bestimmung von Alpha-Fetoprotein (AFP) Alpha-Fetoprotein, das mittels Gelchromatographie gereinigt wurde, wird zur Beschichtung der kammartigen Träger verwendet. Anti-Alpha-Fetoprotein-Antikörper wird über ein Immunsorbens (BRCN-Sepharose) gereinigt und mit 125J markiert. Die Normalspiegel liegen zwischen 0 und 40 ng/ml Serum. Bei bestimmten Lebererkrankungen und bei Carzinomen sind die Werte auf 100 ng/ml bis 1000 ng/ml erhöht.
Die quantitative Bestimmung der Antigene bzw. Antikörper wird in folgender Weise durchgeführt:
Man führt statt der Kontrollseren eine Verdünnungsreihe des zu bestimmenden Antigenes mit. Die Verdünnungsreihen zur Erstellung einer Eichkurve werden wie folgt angesetzt: Man wählt vorzugsweise geometrische Verdünnungen des Standards in negativem Kontrollserum und setzt als Kontrollproben zusätzlich negatives Kontrollserum und den markierten Antikörper alleine ein. Die Proben mit dem reinen Antikörper liefern Werte für die maximale Bindungskapazität des Ansatzes. Die Proben mit dem negativen Kontrollserum liefern Werte für maximale Bindung bei Anwesenheit negativer Proben. Mit steigender Konzentration des Standardantigens in der Eichkurve sinkt die gebundene Aktivität proportional zur Konzentration. Alle Kontrollproben sollen zumindest in Doppelbestimmung, vorzugsweise in Dreifachbestimmung angesetzt werden.
Eine aus den folgenden Einzelwerten gewonnene Eichkurve ist im beiliegenden Diagramm (Fig. 3) dargestellt und mit AFP-Standard bezeichnet:
Einzelwerte
Eichkurve
10 ng AFP
Cx = 2516
c2 = 2488
c = 2460 cpm
c3 = 2376
20 ng cx = 2276
c2 = 2360
c = 2287 cpm
c3 = 2225
40 ng
Cj = 2100
c2 = 2045
c = 2100 cpm
c3 = 2156
80 ng
Cx = 1673
c2 = 1515
c =1581 cpm
c3 = 1555
160 ng cx = 983
c2 = 875
c = 955 cpm
c3 = 1006
320 ng AFP
Ci =: 614
c2 = 588
c = 567 cpm
c3 = 499
640 ng AFP
cx = 143
c2 = 205
c = 171 cpm
c3 = 166
1280 ng
Cx = 122
c2 = 166
c = 126 cpm
c3 = 89
negatives Kontrollserum ct = 2625
c2 = 2783 c = 2707 cpm c3 = 2712
max. Bindung mit125 J Antikörper cx = 3540
c2 = 3236 c = 3340 cpm c3 = 3245
Die weitere Vorgangsweise ist nun die gleiche wie die gemäss Beispiel 1 im HBSAG-Test.
Man inkubiert die zu untersuchende Probe mit dem markierten Antiserum und setzt danach die kammartigen Träger, die mit AFP beschichtet sind, in die Mikrotiterplatten ein. Nach einer weiteren Inkubation werden die kammartigen Träger gewaschen und die Aktivität an den einzelnen Testplättchen in einem Gamma-Spektrometer ermittelt. Die ermittelten Zählraten waren die folgenden:
Probe
1 C! = 2525
c2 = 2481 c = 2472 cpm c3 = 2411
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Probe
2
cx = 1142
c2 = 1276
c = 1212 cpm
ca = 1217
3
Cj = 475
c2= 512
c = 492 cpm
c3= 489
4
ct = 146
c2= 135
c = 128. cpm
c3= 104
5
ct = 2017
c2 = 1965
c = 2005 cpm
c3 = 2034
Diese wurden in das Eichkurvendiagramm eingetragen und ergaben folgenden Befund:
Probe negativ 140-145 ng 380 ng ca. 1000 ng 48 ng
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mit Hilfe von markierten Antikörpern gegen dieses Allergen dasselbe Testverfahren allergenspezifisch durchgeführt werden.
Beispiel 7 Bestimmung von Tetanusantikörper Tetanusantikörper werden an die kammartigen Träger gebunden. Die Proben werden mit 12SJ-markiertem Tetanus-toxin vorinkubiert und danach die kammartigen Träger eingesetzt. Das Vorhandensein von Tetanusantikörpern in der Probe wird durch Verringerung der Zählraten im Vergleich zu Kontrollproben festgestellt.
Beispiel 8 Bestimmung von DNS-Antikörper Die Bestimmung von anti-DNS-Antikörpertitern stellt ein empfindliches Verfahren zum Nachweis von Lupus erythematodes visceralis dar und ermöglicht die Differentialbestimmung gegenüber Kollagenosen anderer Genese. Die kammartigen Träger werden mit anti-DNS-Antikörper beschichtet. 12SJ-markierte DNS wird mit der Probe inkubiert und danach der kammartige Träger eingesetzt. Das Vorhandensein von anti-DNS-Antikörpern äussert sich durch verringerte Zählraten an den Testplättchen.
Beispiel 3
Bestimmung von HCG (Human chorionic Gonadotropin) HCG, ein Glycoproteinhormon, wird zur Beschichtung der kammartigen Träger verwendet; antiHCG AB wird mit 12SJ radioaktiv markiert. Die Normalwerte liegen bei 2 mIU/ml; bei Auftreten von Carzinomen sind die Werte bis zu 100 mIU/ml erhöht. Die Bestimmung des HCG ist besonders bei der Verfolgung der Chemotherapie wertvoll.
Beispiel 4 Bestimmung von Gastrin Gastrin wird zur Beschichtung der kammartigen Träger verwendet. Als Antikörperlösung wird eine mit125 J markierte Antigastrin-AB-Lösung bereitgestellt.
Die Bestimmung von Gastrin ist von zunehmender Bedeutung, da es von Tumoren direkt produziert wird. Weiter treten erhöhte Gastrinspiegel bei mangelnder Säuresekretion des Magens auf.
Bestimmung von Antikörpern
Beispiel 5 Bestimmung von IgE IgE ist ein spezifisches Immunoglobulin, dessen Vorhandensein einen Hinweis auf das Vorhandensein von atopischen Allergien geben kann. In diesem Fall wird an die kammartigen Träger ein anti-IgE gebunden, das als Antigen wirkt. Werden nun die Proben mit einem markierten IgE vorinkubiert und danach die Träger eingesetzt, so ist die gebundene Aktivität an den Trägern verkehrt proportional der IgE-Konzentration im Untersuchungsmaterial.
Beispiel 6 Bestimmung von Allergen Wird anstelle des anti-IgE an den kammartigen Träger ein spezifisches Allergen (z.B. Penicillin) gekoppelt, so kann
Beispiel 9 Bestimmung von Immunkomplexen Methode a) Die kammartigen Träger werden mit hitze-30 aggregierten IgG beschichtet; (IgG wird durch Inkubation bei 60 °C nacht 20 Minuten aggregiert). Dieses Material verhält sich immunologisch wie Immunkomplexe, "^-markierter Rheumafaktor wird mit der Probe vorinkubiert und bindet sich an Immunkomplexe. Danach werden die kammar-35 tigen Träger eingesetzt. Der nichtverbrauchte Tracer bindet sich an die Testplättchen. Niedere Zählraten an den Testplättchen deuten auf das Vorhandensein von Immunkomplexen in der Probe.
Methode b) Der 125J-markierte Rheumafaktor kann 40 durch 12SJ-markierte Clq (erste Komponente des Komplementsystems) ersetzt werden. Der Reaktionsmechanismus bleibt gleich.
Die Bestimmung von Antigen-Antikörperkomplexen gewinnt zunehmende Bedeutung, da diese Komplexe mit der 45 Pathogenese einer Reihe von Krankheitsbildern, wie Arthritis, systemic Lupus erythematosus, Glomerulonephritis, Hepatitis und eventuell Krebs in Verbindung gebracht werden.
so Beispiel 10
Simultane Bestimmung von Antigen und Antikörper Das Auftreten von Antikörpern gegen das zu untersuchende Antigen ist im herkömmlichen Radioimmunoassay • ungewöhnlich, da meist sehr kleine Antigene (z.B. Hor-55 mone) bestimmt werden, die von sich aus nichtantigen wirken bzw. als körpereigene Substanzen keine Antikörper produzieren. Da in zunehmenden Masse jedoch auch hochmolekulare pathogene Substanzen mit diesen Methoden untersucht werden, ist in solchen Fällen mit gelegentlichem Auf-60 treten von Antikörpern gegen diese Substanzen in einzelnen Proben zu rechnen.
s
1 Blatt Zeichnungen
Claims (11)
1. Einrichtung zur immunologischen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in menschlichen Körperflüssig-keiten mit einer Mikrotiterplatte mit Ausnehmungen zur Aufnahme zu untersuchender Proben und mit festen, von einem Komplexbildner beladbaren Trägern, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger aus Plättchen (4,4', 4"...) oder Stiften bestehen, die an einer Halteleiste (3) befestigt und in die Ausnehmungen (2, 2', 2"...) der Mikrotiterplatte (1) einsetzbar sind.
2. Einrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Halteleiste (3) und jedem einzelnen Plättchen (4,4', 4"...) eine Nut zur Bildung einer Sollbruchstelle vorgesehen ist.
3. Einrichtung nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Trägerplättchen (4,4', 4"...) aus Kunststoff verwendet werden.
4. Einrichtung nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger mit Antigen beladen ist.
5. Verwendung einer Einrichtung nach Patentanspruch 1 zur Bestimmung von Antigenen, insbesondere von Hepati-tis-B-Surface-Antigen (HBSAG) und von Antikörpern in menschlichen Körperflüssigkeiten, durch Bildung eines An-tigen-Antikörper-Komplexes, bei dem die Antikörperkomponente radioaktiv markiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass die auf Antigengehalt oder Antikörpergehalt zu prüfende Probe mit einer Lösung des radioaktiv markierten Antikörpers versetzt und sodann ein mit unmarkiertem Antigen beladener fester Träger mit der Probeflüssigkeit in Kontakt gebracht wird, worauf nach Waschen des Trägers die Radioaktivität des Trägers gemessen wird.
6. Verwendung nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein mit Heparin stabilisierter, radioaktiv markierter Antikörper verwendet wird.
7. Verwendung nach Patentanspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationen bei einer Temperatur zwischen 18 und 45 °C während einer Dauer von 30 Minuten bis 15 Stunden, vorzugsweise bei 45 °C während 6 Minuten, durchgeführt werden.
8. Verwendung nach Patentanspruch 5 zur Bestimmung eines Antigens, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe der menschlichen Körperflüssigkeit mit einer Lösung eines radioaktiv markierten Antikörpers, der dem Antigen entspricht, versetzt und bei einer Temperatur zwischen 18 und 45 °C während 30 Minuten bis 15 Stunden inkubiert wird, wobei ein Antigen-radioaktiver Antikörper-Komplex (AG-AB-Komplex) gebildet wird, worauf ein mit unmarkiertem Antigen beladener Träger mit der Probe in Kontakt gebracht und bei einer Temperatur zwischen 18 und 45 °C während 30 Minuten bis 15 Stunden inkubiert wird, anschliessend der Träger gewaschen und die Radioaktivität des am Träger absorbierten radioaktiv markierten Antikörpers gemessen wird, wobei bei Vorhandensein von Antigen in der Probe die gemessene Radioaktivität zum Antigengehalt der Probe umgekehrt proportional ist.
9. Verwendung nach Patentanspruch 5 zur Bestimmung eines Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe der menschlichen Körperflüssigkeit mit einer Lösung eines radioaktiv markierten Antikörpers versetzt und bei einer Temperatur zwischen 18 und 45 °C während 30 Minuten bis 15 Stunden inkubiert wird, ein mit unmarkiertem Antigen beladener Träger mit der Probe in Kontakt gebracht und bei einer Temperatur zwischen 18 und 45 °C während 30 Minuten bis 15 Stunden inkubiert wird, wobei durch Absorption am Träger ein Antikörper-Antigen-Komplex (AB-AG-Komplex) und ein radioaktiver Antikörper-Antigen-Kom-plex (AB-AG-Komplex) gebildet wird, worauf der Träger gewaschen und die Radioaktivität des am Träger adsorbierten radioaktiv markierten Antikörpers gemessen wird, wobei bei Vorhandensein von Antikörpern in der Probe die gemessene Radioaktivität zum Antikörpergehalt der Probe umgekehrt proportional ist.
10. Verwendung nach Patentanspruch 8 zur Bestimmung, ob in einer Probe menschlicher Körperflüssigkeit Heptatitis-Antigen (HBSAG) oder Hepatitis-Antikörper (an-tiHBsAB) vorhanden ist, dadurch gekennzeichnet, dass nach Messung der Radioaktivität an einem ersten Träger ein zweiter, mit unmarkiertem Antigen beladener fester Träger mit einer zweiten Probe der menschlichen Körperflüssigkeit in Kontakt gebracht, der zweite Träger bei einer Temperatur zwischen 18 und 45 °C während 30 Minuten bis 15 Stunden inkubiert wird, anschliessend der zweite Träger gewaschen, in eine Lösung von radioaktiv markierten Antikörpern eingeführt und während 30 Minuten und 15 Stunden bei einer Temperatur zwischen 18 und 45 °C inkubiert und ein zweites Mal gewaschen wird, worauf die Radioaktivität des zweiten Trägers gemessen wird, wobei eine gegenüber der ersten Messung erhöhte Zählrate auf das Vorhandensein von Antigen und eine gegenüber der ersten Messung relativ gleichbleibend niedrige Zählrate auf das Vorhandensein von Antikörpern deuten.
11. Verwendung nach einem der Patentansprüche 5 bis 10 zur Bestimmung von Antigenen oder von Antikörpern in Humanplasma, Humanserum und deren Fraktionen.
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