DE3021208C2

DE3021208C2 - Verfahren zur Bestimmung eines Antigens, Antikörpers oder Antigen-Antikörperkomplexes und Verwendung eines in einer Verpackungseinheit konfektionierten Mittels zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE3021208C2
Application number: DE3021208A
Authority: DE
Inventors: Takashi Tokio/Tokyo Kudo; Ei Tokio/Tokyo Mochida; Hiroyuki Kawagoe Saitama Shinkai; Toshiyuki Urawa Saitama Sugawara
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1979-06-05
Filing date: 1980-06-04
Publication date: 1986-04-17
Also published as: IT1145374B; GB2053468B; GB2053468A; NL181461B; FR2458809B1; DE3021208A1; IT8048878A0; JPS6215825B2; BR8003501A; US4690908A; NL8003294A; NL181461C; FR2458809A1; US4332788A; JPS55162059A; CA1140850A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren der im Oberbegriff des Patentanspruchs 1 angegebenen ArL Solche Verfahren sind aus DE-OS 22 04 684 und DE-OS 27 43 445 bekannt

Die Feststellung des Vorliegens eines Antigens oder Antikörpers in Körperflüssigkeiten ist bekanntlich von großer Wichtigkeit bei der Diagnose oder Therapie von Erkrankungen oder abnormen oder pathologischen Zuständen. In neuerer Zeit wurden bestimmte Antigen-Antikörperkomplexe oder -konjugate, die in engem Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen wie systematischem Lupus erythematodes, rheumatoider Arthritis und gewissen Glomerulo-nephritiden stehen, gefunden, so daß die Bestimmung eines Antigens, Antikörpers oder Antigen-Antikörperkompiexes oder -konjugats in Körperflüssigkeit besonders wichtig gr , orden ist, um zur Diagnose oder Therapie von physiologischen oder pathologischen Zuständen oder Bedingjnren sowohl beim Menschen als auch bei Tieren beizutragen.

Hier und im folgenden sollen die Ausdrücke »Antigen oder Antikörper« auch »Antigen-Antikörperkomplexe« und der Ausdruck »Antigen-Antikörperkomplex« auch ein »Antigen-Antikörperkonjugat« umfassen, fails nichts anderes angegeben ist.

Aus den DE-OS 22 04 684 und DE-OS 27 43 445 ist es z. B. bekannt, die Agglutinationsreaktion nach Ablauf einer vorgegebenen Zeit zu bestimmen und gemäß der DE-OS 27 49 956 wird die Reaktionskinetik gemessen. Eine Unterbrechung der Reaktion vor Durchführung der Messung erfolgt dabei nicht.

Eines der üblichen Verfahren zur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern oder Antigen-Antitcörperkomplexen ist die sogenannte Objektträgermethode, bei der es sich um ein zweistufiges Verfahren handelt. In der ersten Stufe wird ein Stoff, der spezifisch an ein Antigen oder einen Antikörper gebunden werden kann, auf die Oberfläche eines Trägers, welcher aus feinkörnigen, unlöslichen Teilchen besteht, gebunden und die gebundenen Stoffe werden in einer geeigneten Flüssigkeit suspendiert. In der zweiten Stufe wird die erhaltene Suspension mit einer Probenlösung, weiche das Antigen oder den Antikörper, welche bestimmt werden sollen, enthält, gemischt Nach dieser Methode sind zahlreiche verschiedene Arten von Antigenen oder Antikörper semiquantitativ durch Beobachtung der Agglutination der Suspension bestimmbar.

Bekannt ist auch die quantitative Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers in einer Probenlösung durch spektrofotometrische oder elektrische Messungen einer Agglutinationsreaktion, wobei die gleichen Material.cn wie beim Objektträgerverfahren verwendet werden (vergl. z. B. Croatica Chemica Acta. 42: 457—466 (1970); European Journal of Biochemistry. 20:553-560 (197ί; JP-OS Nr. 24 015/1978. JP-OS Nr. 69 824/1978).

Die quantitative Bestimmung durch spektrofotometrische Messung der Ergebnisse der Agglutinationsreaktion geschieht wie folgt: Ein Stoff, welcher spezifisch an ein Antigen oder einen Antikörper, welche bestimmt werden sollen, gebunden werden kann, z. B. die den zu bestimmenden Antigenen bzw. Antikörpern entsprechenden Antikörper bzw. Antigene, wird physikalisch oder chemisch an feinverteilte, unlösliche Trägerteilchen gebunden, so daß man sensibilisierte Trägerteilchen erhält, welche dann in einer geeigneten Flüssigkeit suspensiert und mit einer Probenlösung, welche das Antigen oder den Antikörper, welche bestimmt werden sollen, enthält, unter vorgewählten Bedingungen zur Reaktion gebracht werden. Im Reaktionsgemisch wird sodann die Absorption oder Trübung zur quantitativen Bestimmung des in der Probenlösung vorliegenden Antigens oder Antikörpers gemessen. Mit »sensibilisierte Trägerteilchen« werden die unlöslichen Trägerteilchen bezeichnet, die durch Bindung eines Stoffes, welcher spezifisch an das zu bestimmende Antigen oder den Antikörper gebunden werden kann, gebildet wurden.

Mit HiIIe dieser spektrofotometrischen Methode ist es jedoch schwierig, das Antigen oder den Antikörper quantitativ genau zu bestimmen. Da bei diesem Verfahren die Absorption oder Trübung eines Reaktionsgemisches gemessen wird, während die Reaktion immer noch abläuft, neigt die Absorption oder Trübung dieses Reaktionsgemisches zu beträchtlichen Schwankungen im zeitlichen Verlauf iod die Messung der Absorption oder Trübung muß sofort nach Ablauf der vorgewählten Reaktionszeit durchgeführt werden, um die Schwankungen der Meßwerte zu begrenzen und die Genauigkeit der Messungen nicht zu stark herabzusetzen.

Ferner wird bei den üblichen bekannten quantitativen Verfahren die Reaktion einer Suspension von sensibilisicrten Trägerteilchen mit einer Probenlösung oft unter Rühren durchgeführt, um die Reaktion zu beschleunigen, Durch die Antigen-Antikörperreaktion gebildete Aggregate werden jedoch leicht durch mechanische Schläge oder Einwirkungen zerstört, wenn diese die Bindungskraft der durch die Antigen-Antikörperreak:ion gebildeten Aggregate übersteigen. Darüber hinaus unterliegt der Grad, bis zu welchem die Aggregate zersetzt werden, großen Schwankungen in Abhängigkeit von den Rührbedingungen, so daß die Meßgenauigkeit und die Empfindlichkeit der Meßmethode herabgesetzt werden.

Aufgabe vorliegender Erfindung ist daher ein spektrofotometrisches Verfahren mit verbesserter Empfindlichkeit und Genauigkeit zur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und Antigen-Antikörperkomplexen in einer Probenlösung, welches ausgeht vom eingangs genannten St. d. T. Die Lösung dieser Aufgabe ist im Anspruch 1

beschrieben. Demgemäß werden die Reaktionen auf einer geeigneten Reaktionsstufe unterbrochen und die durch die Reaktion gebildeten Aggregate fixiert, wodurch ihre Zersetzung aufgrund mechanischer Einflüsse, wie etwa Rühren, verhindert wird.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nach dem Anspruch 1 ist eine Verpackungseinheit mit räumlich getrennten Bestandteilen genau definierten Typs gemäß den Ansprüchen 9 bzw. 10 verwendbar. Die Erfindung wird durch die Zeichnung näher veranschaulicht, in der darstellen

F i g. 1 ein Diagramm, welches die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode mit üblichen Methoden bezüglich der Meßgenauigkeit vergleicht;

F i g. 2 ein Diagramm, welches die Wirkung verschiedener fixierender Verbindungen vergleicht;

., IO F i g. 3 ein Diagramm, welches Standardkurven der Bestimmungsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung

y f unter Verwendung verschiedener feinteiliger Träger zeigt;

F i g. 4 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Bestimmung von λ-Fötoprotein gemäß Beispiel 1 zeigt; Fig. 5 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Bestimmung von Human-Chorion-Gonadotrophin (HCG) gemäß Beispiel 2 zeigt:

Fig.6 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Bestimmung von östriol durch Agglutinationshemmungsreaktion gemäß Beispiel 3 zeigt;

Fig. 7 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Bestimmung des Rheumafaktors nach der Trübungsmethode gemäß Beispiel 4 zeigt:

Fig.8 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Bestimmung von menschlichem gamma-Globulin gemäß Beispiel 5 zeigt;

F i g. 9 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Bestimmung von a-Fötoprotein gemäß Beispiel 6 zeigt; Fig. 10 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Messung von östriol gemäß Beispiel 7 zeigt. Zu den immunchemischen Reaktionen, auf welchen das erfindungsgemäße Verfahren basiert, gehören die immunchemische Agglutinationsreaktion und die Agglutinationshemmungsreaktion. Das auf der immunchemisehen Agglutinaiionsreaktion basierende Verfahren besteht darin, daß man die immunchemische Agglutinationsreaktion von Antigenen, Antikörpern oder Antigen-Antikörperkompiexen mit sensibiiisierten Trägerteilchen durchführt jnd im Reaktionsgemisch dessen Absorption oder Trübung durch Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge von etwa 320 bis 2400 nm mißt. Das auf der Agglutinationshemmungsreaktion basierende Verfahren umfaßt eine Hemmung der immunchemischen Agglutinationsreaktion zwischen mit einem Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex sensibiiisierten unlöslichen Trägerteilchen und einem Agglutinationsmittel durch eine zu bestimmende Substanz, sowie die Messung der Absorption oder Trübung im Reaktionsgemisch in der oben angegebenen Weise. Erfindungsgemäß können das auf der immiinchemischen Agglutinationsreaktion basierende und im folgenden im Detail beschriebene Verfahren und das auf der immunchemischen Agglutinationshemmungsreaktion beruhende Verfahren im wesentlichen auf dieselbe Weise durchgeführt werden. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Stufe (1) eine Antigen-Antikörperreaktion zwischen (a) sensibiiisierten Trägerteilchen als erster Komponente und (b) einem Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex oder -konjugat als zweiter Komponente in einer Probenlösung bewirkt, wobei die

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CI31L rvUllipUll^lltt. UUIVtI LJlIlVIUIIg VXJl I ^ IJ /"VlJ tig CIlCIl, /1 Il UnVJI [JC I 11 UUC! ΓΛΙ1 llgCll-fVtlU HUl pCT HUIIIUICACI I, WCIl. I IC den zu bestimmenden Antigenen, Antikörpern oder Antigen-Antikörperkompiexen und -konjugaten entsprechen. mit (II) feinverteilten, unlösliche Trägerteilchen unter Bindung von mindestens zwei Einheiten der genannten Stoffe an jeden teilchenförmigen Träger gebildet wird, so daß die zweite Komponente die immunchemische Agglutinationsreaktion mit dem an die sensibiiisierten Trägerteilchen gebundenen Stoff bewirken kann. Die durch die Antigen-Antikörperreaktion gebildeten Aggregate werden erfindungsgemäß durch Zusatz einer fixierenden Verbindung zur Probenlösung fixiert. In Stufe (2) wird das Reaktionsgemisch mit Strahlen einer Wellenlänge von etwa 320 bis 2400 nm bestrahlt und die Absorption oder Trübung des Reaktionsgemisches gemessen zur Bestimmung der Menge oder Konzentration des zu testenden Antigens oder Antikörpers.

Zur Herstellung der sensibiiisierten Trägerteilchen wird ein Antigen oder Antikörper, die an das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper spezifisch gebunden werden können und diesen z. B. entsprechen, physikalisch oder chemisch an feinverteilte, unlösliche Trägerteilchen in üblicher bekannter Weise gebunden. Im allgemeinen werden physikalische Sorptionsverfahren oder chemische Bindungsverfahren herangezogen (vergl. JP-OS 16 623/1972 und JP-OS 8868/1973).

Bei den feinverteilten Trägern kann es sich um bekannte Träger handeln wie sie üblicherweise als sensibilisierte Trägerteilchen in Reagenzien für den Objektträgertest Verwendung finden, z. B. ein organischer Polymerlatex wie Polystyrollatex, carboxylierter Polystyrollatex, Styroldivinylbenzol-copolymerlatex, hydroxylierter oder carboxylierter Styrol-divinylbenzol-copolymerlatex, Polyvinylalkohollatex, Polyacrylesterlatex oder Vinylacetatacrylat-copolymer, ein anorganisches Material wie Kieselerde, Ruß oder Tonerde, oder Zellen wie Bakterien oder Erythrozyten.

Die sensibiiisierten Trägerteilchen werden in einer geeigneten Lösung, wie sie für diesen Zweck üblicherweise zum Einsatz gelangt, suspendiert. Die sensibiiisierten Trägerteilchen können darin in einer Menge von etwa 0.1 bis 200 mg. vorzugsweise von etwa 1 bis 50 mg pro ml der Lösung suspendiert werden. Bei der verwendeten Lösung kann es sich um Wasser oder jede andere Flüssigkeit handeln, welche keine nachteilige Wirkung auf die Reaktion und die mit der Bestimmungsmethode im Zusammenhang stehenden Bedingungen ausübt.

Eine das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper enthaltende Lösung wird sodann der Suspension der sensibiiisierten Trägerteilchen zugesetzt, so daß die immunchemische Agglutinationsreaktion des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers mit den sensibiiisierten Trägerteilchen bewirkt wird. Eine geringe Menge, z. B. etwa 0,05 bis 1,0 rni des durch die irnmunchernische Aggiutinaiionsreaktion erhakenen Reaktionsgemisches kann im allgemeinen für die Messung eingesetzt werden. Wenn die Menge an Reaktionsgemisch zu gering ist um ohne Schwierigkeiten deren Absorption oder Trübung messen zu können, kann ein

geeignetes Lösungsmittel, ζ. B. physiologische Kochsalzlösung, nach Abschluß der Fixierung der immunchemischen Agglutinaiionsreaktion durch einen fixierende Verbindung zugesetzt werden, um das Volumen des Reaklionsgemisches zu vergrößern.

Die Temperaturen, bei welchen die Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen mit einer Probenlösung zur Reaktion gebracht wird, sind nicht besonders kritisch und geeignet ist jede beliebige Temperatur, bei welcher die Antigen-Antikörperreaktion abläuft. Die Zeiten für die Reaktion der sensibilisierten Trägerteilchensuspension mit der Probenlösung betragen in der Regel etwa 1 min bis 24 h, liegen jedoch vorzugsweise bei etwa 3 bis 120 min, je nach Empfindlichkeit und Genauigkeit der Messung und praktischen Erwägungen. Um die Reaktion horps'fgen und gleichmäßig ablaufen zu lassen, wird das Reaktionsgemisch vorzugsweise allmählich und langsam gerühff.

Bei den erfindungsgemäß verwendeten fixierenden Verbindungen zum Stoppen der Antigen-Antikörperreak^ tion, welche die Agglutination der sensiti'isierten Trägerteilchen in der Suspension mit dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper bewirkt, handelt es sich z. B. um mehrfunktionelle Verbindungen wie Carbodiimide, z.B. l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid als »Propylcarbodiimid« bezeichnet) und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholino-ethy))carbodiimid (im folgenden als »Morpholinocarbodiimid« bezeichnet), Dialdehyde, z. B. Glutaraldehyd und Succinaldehyd, und Acylierungsmittel, z. B. N-Ethyl-5-phenylisoxazonium-3'-sulfonat und Succinylchlorid, sowie proteindenaturierende Mittel wie Tanninsäure, Formalin, Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Thiocyansäure und Thioglykolsäure.

Die erfindungsgemäß verwendeten fixierenden Verbindungen können dem Reaktionsgemisch jederzeit beginnend vorn Start bis zum A.bschluß der Agglutinationsreaktion zugesetzt werden, !m allgemeinen wird die fixierende Verbindung zugesetzt, nachdem die Suspension mit der Probenlösung über einen gewissen Zeitraum reagiert hat, welchen man unter Berücksichtigung des eingesetzten Systems bestimmt.

Die fixierende Verbindung kann dem System auch zusammen mit den anderen Bestandteilen zugesetzt werden, um die Reaktionsschritte zu vereinfachen und zu verkürzen.

Der für die Fixierung der Aggregate erforderliche Zeitraum und die optimale Konzentration an erforderlicher fixierender Verbindung stehen miteinander in Korrelation und können außerdem in Abhängigkeit von der Art der fixierenden Verbindung variieren, so daß keine allgemein gültigen Grenzen für bestimmte Fälle angegeben werden können. Im besonderen kann der Zeitraum für die Fixierung von etwa 3 bis etwa 120 min reichen und die optimale Konzentration an fixierenden Verbindungen zur Zeit der Fixation kann vorzugsweise etwa 0,1 bis 40% für Propylcarbodiimid, etwa 0,1 bis 5% für Morpholinocarbodiimid, etwa 0,1 bis 20% für Glutaraldehyd und etwa 1 bis 30% für Formalin betragen. Die Konzentration an fixierender Verbindung kann jedoch etwas hiesiger sein, wenn die fixierende Verbindung dem System zusammen mit der Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen und der Probenlösung zugesetzt wird.

Die erfindungsgemäß zugesetzte Menge an fixierender Verbindung zum Reaktionssystem kann im allgemeinen etwa 0,001 bis 10 ml, vorzugsweise etwa 0,01 bis 3 ml, unter Berücksichtigung des zu bestimmenden Reaktionsgemisches betragen.

Die Reaktionsabläufe können durch Verdünnung des Reaktionsgemisches wesentlich gestoppt werden, da diese zur Verrringerung der Reaktionsgeschwindigkeit führt. Werden große Mengen an Lösung, welche fixierende Verbindungen löst, dem Reaktionssystem zugesetzt, so kann dies den Stop des Reaktionsablaufs und die gleichzeitige Fixierung der Aggregate bewirken. Wird dementsprechend das Reaktionsgemisch verdünnt, dann kann die fixierende Verbindung in einer Konzentration zugesetzt werden, die nur zur Fixierung des Aggregates ausreicht, so daß sie die Antigen-Antikörperreaktion nicht notwendigerweise stoppt.

Bei der Pufferlösung, die zur Verdünnung des Reaktionsgemisches auf eine geeignete Konzentration eingesetzt wird, handelt es sich um eine Lösung, wie sie üblicherweise auf dem Gebiet der Immunchemie Verwendung findet, z. B. um eine glycingepufferte Kochsalzlösung, eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder eine boratgepufferte Kochsalzlösung. Eine geeignete Menge eines Proteins, z. B. Rinderserumalbumin und/oder Kaninchenserumglobulin, kann einer solchen Pufferlösung zugesetzt werden, um die Reproduzierbarkeit der Reaktion zu verbessern. Der Zusatz der Pufferlösung kann auch dazu dienen, im Reaktionssystem einen geeigneten pH und eine geeignete Ionenstärke aufrecht zu erhalten.

Nach Abschluß der Fixierung der Aggregate wird das diese Aggregate enthaltende Reaktionsgemisch der Absorptionsmessung nach üblichen Methoden zugeführt. Es können beliebige Strahlen mit Wellenlängen im Bereich von etwa 320 bis 2400 nm, vorzugsweise 400 bis 900 nm, eingesetzt werden und eine geeignete Wellenlänge für die Messungen, die in Abhängigkeit von den verschiedenen, in der Probenlösung enthaltenen Typen von Verbindungen und der Art von feinteiligem Träger und/oder seiner Teilchengröße variiert, kann aus dem angegebenen Wellenlängenbereich leicht gewählt werden. Anstelle der Absorption kann auch die Trübung des Reaktionsgemisches auf übliche Weise gemessen werden.

Die quantitative Bestimmung von zu messenden Antigen oder Antikörper im Reaktionsgemisch kann durch Vergleich mit einer Standardkurve für das zu bestimmende Antigen oder den Antikörper durchgeführt werden. Das Auftragen der Standardkurve für jedes der zu bestimmenden Antigene oder Antikörper kann dadurch erfolgen, daß eine Referenzsubstanz, die an sich oder in ihrer Reaktivität mit dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper identisch ist in verschiedenen Mengen in einer geeigneten Pufferlösung des oben angegebenen Typs aufgelöst und so eine Standardtestlösung mit einer gegebenen Menge der Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen unter vorgewählten Bedingungen hergestellt wird, worauf sofort danach die fixierende Verbindung zugesetzt wird, um die Reaktion am Weiterlaufen zu hindern, so daß die gebildeten Aggregate fixiert werden. Schließlich wird die Absorption oder Trübung des Reaktionsgemisches in einer Meßzelle bestimmt, wobei das Reaktionsgemisch erforderlichenfalls mit einer geeigneten Flüssigkeit oder Pufferlösung verdünnt werden kann. Die Standardkur/e kann zeichnerisch aufgetragen werden, als Menge oder Konzentration der Standardsubstanz in Abhängigkeit von ihrer Absorption oder Trübung. Die quantitative Auswertung von zu

bestimmenden Antigen oder Antikörper kann durchgeführt werden, indem das sensibilisierte Trägerteilchen mit einer unbekannten Probe praktisch auf die gleiche Weise und unter praktisch den gleichen Bedingungen, wie im Fall der Standardkurve für die Standardprobenlösung zur Reaktion gebracht und dann die Absorption oder Trübung des Reaktionsgemisches gemessen und die Ergebnisse dieser Bestimmung mit der erarbeiteten Slandardkurve verglichen werden, wodurch die quantitative Bestimmung des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers in der unbekannten Probe ermöglicht wird.

Um die Empfindlichkeit der Bestimmung zu erhöhen, wird die Verwendung einer Suspension von sensibilisierten Trägerteilchen mit einer etwas höheren Konzentration bevorzugt. Erfindungsgemäß kann eine verhältnismäßig hohe Konzentration der Suspension des sensibilisierten Trägerteilchens verwendet werden unter Erhöhung der Meßempfindlichkeit.

Bei den üblichen Bestimmungsverfahren wird das Reaktionsgemisch direkt der Messung zugeführt, ohne daß es vorher verdünnt wird, da die Verdünnung des Reaktionsgemisches die gebildeten Aggregate zerstören kann. Ist dementsprechend die Konzentration der Suspension zu hoch, dann ist es schwierig, das Reaktionsgemisch zu messen, so daß die Brauchbarkeit der üblichen Meßverfahren auf ein Reaktionsgemisch begrenzt ist, bei dem die Konzentration der Suspension niedriger als 0,6 Gew.-% ist (vergl. JP-OS 24 015/1978). Erfindungsgemäß kann demgegenüber selbst ein erforderlichenfalls verdünntes Reaktionsgemisch eingesetzt werden, so daß eine höchste Emptindlichkeit der Reaktion selbst dann erreicht wird, wenn die Konzentration der Suspension etwa 1 Gew.-% ausmacht.

Das auf der immunchemischen Agglutinationshemmungsreaktion basierende Verfahren gemäß vorliegender L^Fiiiiuüng üiTiiäut uic mcSSüfig VOn Änderungen der AuSOrpiiOn üdci Trübung, die durch die illlllluIIL'hciniscne

Agglutinationshemmungsreaktion bewirkt wird, bei der das zu bestimmende Antigen oder der Antikörper die immunchemische Agglutinationsreaktion der genannten unlöslichen Trägerteilchen mit einem Agglutinationsmittel hemmt.
Bei dem gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zu verwendende Agglutinationsmittel

handelt es sich um ein Mittel, welches die Induktion der Agglutination der Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen bewirken kann, wenn kein oder wenig oder eine sehr kleine Menge Antigen oder Antikörper, die bestimmt werden sollen, in einer Probelösung vorliegen. Es kann sich ganz allgemein um ein Antigen oder einen Antikörper handeln, die spezifisch an die sensibilisierten Trägerteilchen gebunden werden können sowie um ein Antigen oder einen Antikörper, die an den unlöslichen feinteiligen Träger gebunden werden.

Gemäß dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Antigen-Antikörperreaktion zwischen sensibilisierten Trägerteilchen als erster Komponente, einem zu bestimmenden Antikörper als zweiter Komponente und einem Agglutinationsmittel als dritter Komponente bewirkt, wobei die erste Komponente durch Bildung eines Antigens. Antikörpers oder Antigen-Antikörperkomplexes, der dem zu bestimmenden Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex entspricht, an feinverteilte, unlösliche Trägerteilchen in

solcher Weise, daß mindestens zwei der genannten Substanzen jeweils an ein Trägerteilchen gebunden werden, gebildet ist, die zweite Komponente zur immunchemischen Reaktion mit der an die sensibilisierten Trägerteilchen gebundenen Substanz befähigt ist, und wobei die dritte Komponente ein Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörnerkomnlex ist, welche zur immunchemischen Reaktion mit der ersten Komponente befähigt sind. Die durch die Antigen-Antikörperreaktion gebildeten Aggregate werden durch Zusatz einer fixierenden Verbindung zur Probelösung fixiert, das Reaktionsgemisch wird mit Strahlen einer geeigneten Wellenlänge bestrahlt und die Absorption oder Trübung des Reaktionsgemisches wird gemessen, wodurch die Menge oder Konzentration des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers festgestellt werden kann.

Der Probenlösung, Aa der das Agglutinationsmittel zugegeben wurde, wird eine gegebene Menge der fixierenden Verbindung zugesetzt. Der Zusatz der fixierenden Verbindung kann sofort nach der Hemmung der Antigen-

Antikörperreaktion erfolgen. Es ist jedoch auch möglich, das Agglutinationsmittel zusammen mit den anderen für die immunchemische Agglutinationshemmungsreaktion nötigen Komponenten zuzusetzen, um das Vorgehen zu vereinfachen und abzukürzen.

Wenn die beabsichtigte Antigen-Antikörperreaktion eine Agglutinationsreaktion ist, dann ist ein Mittel in einer Verpackungseinheit nach Anspruch 9 mit (a) einer Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen, (b) einer

Pufferlösung und (c) einer fixierenden Verbindung verwendbar. Ist die beabsichtigte Antigen-Antikörperreaktion eine Agglutinationshemmreaktion, so ist ein Mittel in einer Verpackungseinheit nach Anspruch !0 mit (a) einer Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen, (b) einer Pufferlösung, (c) einem Agglutinationsmittel und (c) einer fixierenden Verbindung verwendbar.
Einige oder alle Bestandteile in der Verpackungseinheit können gefriergetrocknet sein. In diesem Fall kann

der Verpackungseinheit ein geeignetes Lösungsmittel beigefügt werden, das zum Auflösen der gefriergetrockneten Reagenzien verwendbar ist Zur bequemeren Verwendung des Mittels können der Verpackungseinheit ein Reagenzglas, eine Pipette und andere zusätzliche Bestandteile beigegeben werden.

Antigene oder Antikörper, welche erfindungsgemäß bestimmt werden können, sind z. B. Proteinhormone wie Human-Choriongonadotrophin (HCG), Insulin und menschliches Wachstumshormon, Proteine wie Λ-Fötopro-

tein, Hepatitis-B-Virus (HBs), Immunglobulin, Antigen-Antikörperkomplexe, Ceruloplasmin und Transferrin, und Haptene wie Thyroxin, Testosteron, Phenytoin und Phenobarbital.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat insbesondere folgende Vorteile:

Da die Antigen-Antikörperreaktion in ihrem Ablauf durch Zusatz der fixierenden Verbindung zum Reaktionsgemisch gestoppt wird, kann sie nicht weiterlaufen, während die Absorption gemessen wird. Demzufolge können

Änderungen der gemessenen Werte verringert und die Meßgenauigkeit verbessert werden.

Da die durch die Reaktion gebildeten Aggregate durch die fixierende Verbindung fixiert v/erden, wird die mechanische Festigkeit der Aggregate erhöht und die Desintegration der einmal gebildeten Aggregate durch Rühren des Reaktionsgemisches oder Überführung desselben in z. B. eine Meßzelle für die Absorptions- oder

T'-üb'i.ngsmes.iJng kann merklich verringert werden. Demzufolge können die Schwankung der gemessenen Werie oder die Verringerung der Meßgenauigkeit aufgrund der Desintegration der einmal gebildeten Aggregate verhindert und die Messung mit hoher Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin begründet, daß keine spezielle Meßvorrichtung erforderlich ist. Insbesondere bleibt, da beim erfindungsgemäßen Verfahren ein weiteres Fortschreiten der Reaktion durch Zugabe der fixierenden Verbindung verhindert wird, genügend Zeit, das Reaktionsgemisch in eine Meßzelle für die Absorptionsmessung zu überführen. Da ferner die gebildeten Aggregate stabil fixiert sind, kann die Desintegration der Aggregate durch das Überführen des Reaktionsgemisches wirksam verhindert werden. Demzufolge kann der gesamte Arbeitsgang unter Verwendung eines gewöhnlichen Reaktionsgefäßes durchgeführt werden, ohne daß spezielle Vorrichtungen erforderlich sind. |-j»

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin begründet, daß alle Stufen der Bestimmung automatisiert werden können. Da, wie oben beschrieben, die mechanische Beständigkeit der Aggregate durch Zugabe der fixierenden Verbindung erhöht und die Desintegration der einmal gebildeten Aggregate durch Transport und Rühren des Reaktionsgemisches beträchtlich verringert wird, können alle Verfahrensschritte einschließlich des Transports, der Überführung und des Rührens automatisiert werden.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin begründet, daß die quantitative Messung unter Verwendung der Reagenzien für die übliche, auf einem Objektträger erfolgende halbquantitative Messung durchgeführt werden kann. Die erfindungsgemäß verwendbare Verpackungseinheit weicht von den üblichen halbquantitativen Fertigpacks nur insofern ab, daß sie zusätzlich die fixierende Verbindung enthält. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung des in der Verpackungseinheit untergebrachten Mittels wird daher die Reaktion, welche bisher auf einem Objektträger durchgeführt wurde, in einem Reagenzglas ausgeführt und die Absorption=- oder Trübungsmessung erfolgt wie oben beschrieben, wodurch eine quantitative Messung erreicht wird.

Wird daher die erfindungsgemäß eingesetzte fixierende Verbindung mit der üblichen Verpackungseinheit kombiniert, so kann je nach Wunsch und Erfordernis das halbquantitative Bestimmungsverfahren oder das quantitative Bestimmungsverfahren unter Messung der Absorption gewählt werden.

Die F i g. 1 der beiliegenden Zeichnungen ist ein Diagramm, das die Meßgenauigkeit, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Fixierung der Aggregate durch Zugabe einer fixierenden Verbindung zum Reaktionsgemisch erreichbar ist, mit der nach üblicher Methode ohne Verwendung einer fixierenden Verbindung erzielbaren Genauigkeit vergleicht. Dabei wird nach dem im unten angegebenen Beispiel 1 beschriebenen Verfahren ein anti-«-fötoprotein-sensibiIisiern--s Latexreagenz mit einer Lösung einer Standardprobe von ar-Fötoprotein umgesetzt und gegebenenfalls eine 10%ige Propylcarbodiimid-Suspension als fixierende Verbindung zum Reaktionsgemisch zugegeben. In jedem Fall wird das Reaktionsgemisch einige Male in verschiedene Gefäße transportiert und die Absorption des Reaktionsgemisches wird gemessen, um die Änderungen der gemessenen Werte aufgrund des beschriebenen wiederholten Transports zu erfassen. Wie aus F i g. 1 ersichtlich, nimmt bei dem üblichen Verfahren ohne Verwendung einer fixierenden Verbindung die Absorption jedesmal, wenn das, Reaktionsgemisch transportiert wird, zu, woraus ersichtlich ist, daß die einmal gebildeten Aggregate durch mechanische Einflüsse die durch den Transport bewirkt werden, desintegrieren.

im Gegensatz dazu ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung einer fixierenden Verbindung die Änderung der gemessenen Werte sehr gering, woraus sich ergibt, daß eine Desintegration der Aggregate kaum erfolgt.

Die Fig. 2 zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs der Wirkungen verschiedener fixierender Verbindungen. Dabei wird auf die gleiche Weise, wie oben beschrieben, ein anti-«-fötoprotein-antikörper-sensibilisiertes Latexreagenz mit einer Standardprobenlösung von A-Fötoprotein umgesetzt, worauf verschiedene fixierende Verbindungen zum Reaktionsgemisch zugegeben werden unter Erzielung von Standardkurven, die in F i g. 2 geicigt sind. Aus Fi g. 2 ist ersichtlich, daß bei Verwendung dieser fixierenden Verbindungen steilere Standardkurven erreicht und gute Ergebnisse durch Fixieren der durch die Antigen-Antikörperreaktion gebildeten Aggregate erzielt werden.

F i g. 3 zeigt Beispiele für Standardkurven, die durch Herstellung von Reagenzien, die gegen einen Anti-Λ-ίο-toprotein-antikörper sensibilisiert wurden gemäß dem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren unter Verwendung von verschiedenen feinteiligen Trägern und Bestimmung einer Standardprobe von Λ-Fötoprotein unter Verwendung dieser Reagenzien erhalten wurden. Aus F i g. 3 ist ersichtlich, daß unabhängig vom Typ des verwendeten Trägers ähnliche Standardkurven erhalten werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

55 Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung von Λ-Fötoprotein (λ¥Ρ).

(a) Ein Anti «FP-Antikörper wurde in einer Konzentration von 0,08% in einer glycingepufferten Kochsalzlösung (Glycinpuffer) mit einem pH von 8,2 gelöst und 5 ml dieser Lösung wurden zu 5 ml einer 10°/oigen Suspension von Polystyrollatex (ein Produkt von Dow Chemical Co., mittlere Teilchengröße 0,48 um) gegeben und man inkubierte 60 Minuten bei 45° C, um den Polystyrollatex mit dem Anti-«FP-Antikörper zu inkubieren. Nach der Sensibilisierung wurde der Überstand durch Zentrifugation abgetrennt und der Niederschlag wurde in 50 ml Glycinpuffer, der 0,1% Rinderserumalbumin (RSA) enthielt, zur Herstellung eines Anti-«FP-Antikörper sensibilisierter Latexreagenz suspendiert.

(b) «-Fötoprotein wurde aus der Ascitesflüssigkeit eines Patienten mit Hepatom gemäß dem Vorgehen von Nishi et al. (Cancer Res., 30:2507—2523 [1970J) extrahiert und das gereinigte aFP in einer 0,l%igen Lösung von RSA in einer Konzentration von 10^J, 10²,10¹ oder 0 ng/ml als Standardprobenlösung gelöst.

Dann wurden 25 μΐ der Standardlösung, 50 μΐ Glycinpuffer und 25 μΐ des anti-ÄFP-antikörpersensibilisierten Latexreagenz, das unter (a) hergestellt wurde, in ein Reagenzglas gegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über 40 Minuten bei leichtem Schütteln durchgeführt Nach Tier Reaktion wurden 0,1 ml einer 10%igen Lösung von Propylcarbodümid in Glycinpuffer als fixierende Verbindung zugesetzt und die Reaktion wurde 20 Minuten unter Schütteln ausgeführt. Nach dieser Reaktion wurden 4 ml einer physiologischen Kochsalzlösung dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Absorption wurde unter Verwendung eines Spektrofotometers bei einer Wellenlänge von 500 nm gemessen. Die Messung wurde für jede Standardlösung zweimal ausgeführt Die erhaltenen Ergebnisse sind in einer Kurve als Standardkurve in F i g. 4 aufgetragen.

(c) die Konzentration von Λ-Fötoprotein in den Seren von Hepatom-Patienten wurde vorher nach dem halbquantitativen Verfahren bestimmt und jedes Serum wurde auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse entsprechend verdünnt 25 μΐ des verdünnten Serums wurden in ein Reagenzglas gegeben und die Absorption wurde nach dem in (b) beschriebenen Verfahren gemessen. Die Konzentrationen von äFP in den Patientenseren wurden aus den jeweils erhaltenen Werten unter Verwendung der unter (b) erhaltenen Standardkurve bestimmt Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt

Tabelle 1

Patient Nr.

Probe Material

Verdünnungsverhältnis (χ)

Absorption

a¥P-

IConzentration

(ng/ml)

Serum Serum Serum Serum Serum

Beispiel 2

0,611
0,541
0,581
0321
0,553

4520

3450

298

3600

Dieses Beispiel erläutert die Messung von Human-Chroniogonadotrophin (HCG).

(a) Nach dem in Beispiel 1 (a) beschriebenen Vorgehen wurden ein Anti-HCG-Antikörper und ein carboxylierter Polystyrollatex (ein Produkt der Dow Chemical Co., mittlere Teilchengröße 0,25 μπι) gemischt und zur Herstellung eines anti-HCG-antikörpersensibilisierten Latexreagenz inkubiert.

(b) HCG (mit einer spezifischen Aktivität von 6000 IU/mg) wurde in Glycinpuffer in einer Konzentration von 3,4. 2. 1,05 und 0.25 IU/ml als Standardlösungen gelöst. 25 μΐ der Standardlösung. 50 μΐ einer Pufferlösung und 25 μ'Ι des in (a) hergestellten anti-HCG-antikörpersensibilisierten Latexreagenz wurden in ein Reagenzglas gegeben. Die Reaktion wurde über 60 Minuten unter mildem Schütteln bei Raumtemperatur durchgeführt Nach der Reaktion wurden 4 ml einer 10%igen Lösung von Glutaraldehyd dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Reaktion wurde über weitere 30 Minuten ausgeführt Die Absorption bei 500 nm wurde gemessen und man erhielt die in F i g. 5 gezeigte Standardkurve.

(c) Humanserum oder Urin wurde, wie in (b) beschrieben, behandelt und die Absorption wurde bestimmt. Dann wurde die Menge an HCG in der Serum- oder Urinprobe auf der Basis der unter (b) erhaltenen Standardkurve bestimmt Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 2 aufgeführt. Außerdem sind in der Tabelle 2 die nach der Objektträgermethode (minimale Empfindlichkeit: 1 IU/ml) und nach der Radio-Immunassay-Methode (RIA-Methode) erhaltenen Ergebnisse als Bezug angeführt.

	Tabelle	2	Material	. I IU/ml HCG	Verdünnungs-	Absorption	HCG- Objektträger-	RIA-
	Patiem-Nr. Probe		I IU/ml HCG	verhälinis(x)	(Mittel)	Konzentration methode	Methode
50		Urin	1 IU/ml HCG	1		(IU/ml)	(IU/ml)
		Urin		1	0.589	0,28	0,41
	1	Urin		1	0,421	0,99 +	1,02
	2	Urin	1	0,458	0,86 ±	0,89
55	3	Urin	10	0,212	2,93 +	3,21
	4	Serum	1	0339	13,67 + +	17.36
	5	Serum	1	0.543	034 -	0.66
	6	Serum	1	0,203	332 + +	3,12
	7	Serum	1	0,551	0,86 ±	0,91
60	8	Serum	1	0,458	030 -	0,57
	9	- : kein HCG oder < I IU/ml HCG		0,309	1,55 +	2,26
	10	±: ca
	+ : >
	+ +: >
65

Beispie! 3

Dieses Beispiel erläutert eine Ausführungsform des auf der Agglutinationshemmreaktion basierenden Verfahrens.

(a) Nach dem in Beispiel 1 (a) beschriebenen Vorgehen wurde hydroxylierter Styrol-divinylbenzol-copolymerlatex (ein Produkt der Rohne-Poulenc, Paris, Frankreich, mittlere Teilchengröße 033 um) mit einem Antiöstriol-Antikörper sensibilisiert, welcher unter Verwendung von an Rinderserumalbumin konjugiertem Östriol-16,17-dihemissucinat hergestellt war, unter Bildung eines anti-östriol-antikörper-sensibilisierten Latexreagenz sensibilisiert

(b) Östriol wurde in physiologischer Kochsalzlösung in Konzentrationen von 160,80,40,20,10 oder 5 ng/ml als Standardlösung gelöst 25 μΐ des in (a) hergestellten anti-östriol-antikörper-sensibilisierten Latexreagenz, 25 ul einer Lösung eines Komplexes von Östron-17-(O-carboxymethyl)oxim mit Rmderserumalbumm (im folgenden als »Ei-RSA« bezeichnet) in einer Konzentration von 100 μg/ml als Agglutinationsmittel und 25 μΐ der Standardlösung wurden zugesetzt und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über 40 Minuten ausgeführt. Nach dem Abschluß der Reaktion wurden 4 ml einer 10%igen Lösung von Propylcarbodiimid zugesetzt und die Reaktion wurde 20 Minuten weitergeführt Dann wurde die Absorption des Reaktionsgemisches gemessen und "lan erhielt die in F i g. 6 gezeigte Standardkurve.

(c) Der Urin einer schwangeren Frau wurde mit physiologischer Kochsalzlösung geeignet verdünnt in einem Verdünnungsverhältnis, das aus den Ergebnissen der Voruntersuchung mit der halbquantitativen Bestimmung gewählt wurde. Nach dem in (b) beschriebenen Vergehen wurde die Konzentration von Östriol im Urin quantitativ bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt

Tabelle 3

Nr. der
Patientin

Schwangerschaftswoche

Probe
Material

Verdünnungsverhältnis (χ)

Absorption

östriol-

konzentration

(mg/1)

4
16
28
31
36

Urin
Urin
Urin
Urin
Urin

10

50

500

1000

Beispiel 4

0,455
0,299
0,200
0,534
0,483

0,08
0,48
Ul
5,30
9.80

(a) Ein Polystyrollatex wurde mit denaturiertem Immunglobulin (IgG) nach dem in Beispiel 1 (a) beschriebenen Vorgehen zu einem gegen denaturiertes IgG sensibilisierten Latexreagenz sensibilisiert.

(b) Rheumafaktor-positives Serum als Standardprobe wurde in einem Verdünnungsverhältnis von 1600, 800, 400, 200 und lOOfacher Verdünnung zur Herstellung einer Standardlösung verdünnt. 25 μΙ der Standardlösung, 50 μΐ Pufferlösung und 25 μΐ des in (a) hergestellten Latexreagenz, das gegen denaturiertes IgG sensibilisiert war, wurden in ein Reagenzglas gegeben und die Reaktion wurde über 40 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt Nach der Reaktion wurden 0,1 ml einer 10%igen Propylcarbodiimidlösung zugesetzt und die Reaktion wurde weitere 20 Minuten ausgeführt Dann wurden 4 ml physiologischer Kochsalzlösung dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Trübung wurde mit einem Turbidimeter (Corona UT-11) gemessen, wobei ein voller Skalenausschlag gleich 100 gesetzt wurde. Ein Beispiel der Standardkurven ist in F i g. 7 gezeigt.

(c) Unier Verwendung eines Patientenserums anstelle der Standardlösung wurde der Rheumafaktor in Serum, wie in (b) oben beschrieben, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 4 gezeigt

Tabelle 4	Probe	Trübung	Verdünnungsverhältnis (χ) von Rheumafaktor-positivem Standardserum	Beurteilung
Probe Nr.	Serum Serum Serum Serum Serum Rheümafaktdr negativ. : R-heumafaktor positiv.	89,0 66,8 89.7 56.5 77,9	0 700 0 300 1000
1 2 3 4 5

Beispiel 5

(a) Nach dem in Beispiel 1 (a) beschriebenen Vorgehen wurde ein Polystyrollatex mit einem Antikörper gegen menschliches gamma-Globulin (HGG) als anti-HGG-antikörper-sensibilisiertes Latexreagenz sensibilisiert

(b) Die Standardlösung wurde durch Lösen von HGG in einer Pufferlösung in einer Konzentration von 80,40, 20, 10 und 5 mg/ml hergestellt. 25 μΐ der Standardlösung, 50 μΐ einer Pufferlösung und 0,1 ml einer l°/oigen Propylcarbodiimidlösung wurden in ein Reagenzglas gegeben und 25 μ] des unter (a) hergestellten anti-HGG-antikörper-sensibilisierten Latexreagenz wurden zugesetzt und die Reaktion wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt Nach der Reaktion wurden 4 ml einer physiologischen Kochsalzlösung zugesetzt und die Absorption bei 500 nm wurde gemessen. Ein Beispiel der so erhaltenen Standardkurven ist in F i g. 8 gezeigt Die Konzentration von HGG konnte unter Verwendung der in F i g. 8 gezeigten Standardkurve bestimmt werden.

Beispiel 6

Ruß (»Show Black«, der Firma A. A. Chemical, mittlere Teilchengröße 0,02 bis 0,04 .um) wurde in Glycinpuffer in einer Konzentration von 10% suspendiert Dann wurden 0,5 ml der Suspension mit 2 ml einer Lösung eines Anti-rtFP-Antikörpers gemischt und 20 Minuten bei 56° C inkubiert Nach der Inkubation wurde der Oberstand durch Zentrifugation entfernt und der verbleibende Rückstand wurde in 5.5 ml Glycinpuffer, der 0,1% RSA enthielt, al;: <uiti-a:FP-antikörper-sensibi]isiertes Rußreagenz suspendiert

(b) 25 μΐ-dir in Beispiel 1 (b) hergestellten «FP-Standardlösung, 50 μΐ einer Pufferlösung und 25 μΐ des unter (a) hergestellten anti-«FP-antikörper-sensibilisierten Rußreagenz wurden in ein Reagenzglas gegeben und die Reaktion wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Reaktion wurden 0,1 ml einer 10%igen Propylcarbodiimidlösung zugesetzt und die Reaktion wurde weitere 20 Minuten ausgeführt Dann wurden 4 ml physiologische Kochsalzlösung dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Absorption wurde bei 500 nm gemessen. Ein Beispiel einer Standardkurve ist in F i g. 9 gezeigt. Die Konzentration von arFP im Serum konnte unter Verwendung der Standardkurve bestimmt werden.

Beispiel 7

(a) Nach dem in Beispiel 1 (a) beschriebenen Vorgehen wurde ein Copolymerlatex von hydroxyliertem |

Styrol-divinyibenzol mit EpRSA zur Herstellung von E|-RSA-sensibilisiertem Latexreagenz sensibilisiert.

(b) 25 μΙ des unter (&) hergestellten Ei-RSA-sensibilisierten Latexreagenz, 25 μΐ einer Pufferlösung und 25 μΙ

der in Beispiel 3 (b) hergestellten Standardlösung wurden in ein Reagenzglas gegeben und man setzte 25 μΐ des §

in Beispiel 3 (a) hergestellten an: -östriol-antikörper-sensibilisierten Latexreagenz zu. Im folgenden verfuhr man f

wie in Beispiel 3 beschrieben. Die so erhaltene Standardkurve ist in F i g. 10 gezeigt

Beispiel 8

it Nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Vorgehen wurden 25 μΐ des anti-östriol-antikörper-sensibilisierten ^

ι; AO Latexreagenz, 25 μΐ der Standardlösung, 25 μΐ des Agglutinationsmittels und 1 ml einer Pufferlösung in ein |

Reagenzglas gegeben und die Reaktion wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur ausgeführt. Nach der Reaktion κ

■ wurden 0,1 ml einer 10%igen Propylcarbodiimidlösung zugesetzt und die Reaktion wurde weitere 20 Minuten

\ durchgeführt. Die Absorption des Reaktionsgemisches wurde gemessen und man trug eine Standardkurve auf. |

\ Das obige Vorgehen wurde in ähnlicher Weise unter Vorgehen von Urin einer schwangeren Frau anstelle der ^f

\ 45 Standardlösung ausgeführt. Man beobachtete Ergebnisse, die den in Beispiel 3 ähnlich waren.

j Beispiel 9

(a) Serratia marcescens wurde in einer Konzentration von 10 Gew.-% in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (Phosphatpuffer) vom pH 7,2 suspendiert und man setzte der Suspension eine gleiche Menge einer 3%igen Lösung von Formalin in Phosphatpuffer zu und rührte das Gemisch 4 Stunden bei 37°C. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, mit ausreichend destilliertem Wasser gewaschen und in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 5 Gew.-% suspendiert. Die Suspension wurde 20 Minuten auf 120°C erhitzt und die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt.

(b) Die Konzentration von acFP im Serum eines Patienten wurde wie in Beispiel 1 bestimmt, wobei man die nach (a) erhaltenen Zellen als Träger verwendete. Die Ergebnisse waren den in Beispiel 1 erhaltenen ähnlich.

Beispiel 10

Dieses Beispiel erläutert eine Verpackungseinheit für die auf der Agglutinationsreaktion beruhenden Messung.

Es wurde ein HCG-Reagenziensatz hergestellt, welcher die folgenden Reagenzien umfaßte:

(a) 5 Ampullen mit einer lyophilisierten Standardprobe von HCG in einer Menge von 4 lU/Ampulle; |

(b) eine Flasche mit 1,5 ml eines anti-HCG-antikörpsr-sensibilisierten Latexreagenz; |

(c) eine Flasche mit 3 ml einer glycingepufferten Kochsalzlösung (pH 8,2);

(d) 5 Ampullen, die jeweils ein lyophilisiertes Produkt enthielten, das man durch Gefriertrocknung von 0,5 ml

einer 24%igen Propylcarbodiimidlösung erhielt. |

Die Bestimmung und Verwendung dieser Verpackungseinheit wurde beispielsweise wie im folgenden beschrieben durchgeführt

Eine Ampulle der Standardprobe von HCG wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und man stellte Standardlösungen in Konzentrationen von 4, 2, 1, 0,5 und 0 IU/ml her. 25 ul der Standardlösung, 50 μΐ der glycingepufferten Kochsalzlösung und 25 μΐ des anti-HCG-antikörper-sensibilisierten Latex wurden in ein Reagenzglas gegeben und die Reaktion wurde unter mildem Schütteln über 40 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt 1,2 ml physiologische Kochsalzlösung wurden dem Inhalt einer Ampulle mit Propylcarbodumid zugesetzt und man erhielt eine Lösung der fixierenden Verbindung vor Abschluß der obigen Reaktion. Nach der Reaktion wurden 0,1 ml der Lösung der fixierten Verbindung dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Fixierungsreaktion wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur ausgeführt Nach dieser Fixierungsreaktion wurden 4 ml physiologische Kochsalzlösung dem Reaktionsgemisch zugegeben und die Absorption bei 500 nm wurde gemessen und eine Standardkurve aufgetragen. Das obige Vorgehen wurde unter Verwendung von Serum oder Urin eines Patienten anstelle der Standardlösung wiederholt und die Konzentration von HCG im Serum oder Urin wurde bestimmt

15 Beispiel 11

Dieses Beispiel erläutert eine Verpackungseinheit für die auf der Agglutinationshemmreaktion beruhende Messung.
Ein Östriol-Bestimmungssatz wurde hergestellt, der die folgenden Reagenzien enthielt:

(a) Vier Fläschchen mit jeweils 1 ml von Standardlösungen, welche E3 in Konzentrattonen von 200,100,50 und 25 ng/ml in physiologischer Kochsalzlösung enthielten;

(b) ein Fläschchen mit 1,7 ml eines anti-östriol-antikörper-sensibilisierten Latexreagenz;

(c) sechs Ampullen mit jeweils einem lyophilisierten Produkt, d^rts durch Gefriertrocknung von 0,5 ml einer 24%igen Lösung von Propylcarbodiimid hergestellt war;

(d) ein Fläschchen mit 3,2 ml einer Lösung von Ej-RSA (5 μg/ml) als Agglutinationsmittel in einer Pufferlösung;

(e) Eine graduierte Pipette (1,2 ml);

(f) 30 Tropfpipetten (15 μΙ/Tropfen).

Die Bestimmung der Verwendung dieser Verpackungseinheit beispielsweise nach dem folgenden Vorgehen durchgeführt: 25 μΐ des anti-östriol-antikörper-sensibilisierten Latexreagenz und 50 μΐ der Lösung von E_rRSA (Agglutinationsmittel) wurden in ein Reagenzglas gegeben und 25 μΐ der Standardlösung wurden zugesetzt und die Reaktion 40 Minuten bei mildem Schütteln bei Raumtemperatur durchgeführt. Arbeitsgänge, wie Zusatz der Lösung der fixierenden Verbindung wurden wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt und die östriolkonzeniration im Serum oder urin wurde bestimmt. Da die graduierte Pipette und die Tropfpipetten dem Reagenziensalz beigelegt waren, konnte die Bestimmung, wenn dieser Reagenziensatz verwendet wurde, leicht auch an einem Ort durchgeführt werden, der mit Laborgeräten oder Ausrüstung nicht ausgestattet war.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung eines Antigens, Antikörpers oder eines Antigen-Antikörperkomplexes, wobei man

(1) eine Agglutinationsreaktion zwischen (a) einem sensibilisierten Trägerteilchen, das durch Bindung eines Antigens. Antikörpers oder Antigen-Antikörperkomplexes an einen aus unlöslichen, reinverteilten Teilchen bestehenden Träger gebildet ist und (b) dem zu bestimmenden Antigen. Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex bewirkt oder

(V) eine Agglutinationshemmungsreaktion zwischen (a') einem sensibilisierten Trägerteilchen, das durch Bindung eines Antigens, Antikörpers oder Antigen-Antikörperkomplexes an einen aus unlöslichen, feinverteilten Teilchen bestehenden Träger gebildet ist, (b') dem zu bestimmenden Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex und (c) einem Agglutionationsmittel, welches zur immunchemiscnen Reaktion mit dem genannten sensibilisierten Trägerteilchen (a') befähigt ist, bewirkt und

(2) die Absorption oder Trübung des in Stufe (1) oder (V) gebildeten Reaktionsgemisches durch Bestrahlung dieses Gemisches mit Strahlen einer Welletiänge von etwa 320 bis 2400 nm mißt zur Bestimmung der Menge oder Konzentration des in dieser Antigen-Antikörperreaktion gebildeten Aggregats, g

dadurch gekennzeichnet, daß man dem Reaktionssystem der Stufe (1) oder (V) eine fixierende Verbindung zusetzt, welche die Agglutimaiionsreaktion oder die Agglutionationshemmungsreaktion auf einer gevünschten Stufe der Reaktion zu unterbrechen und die gebildeten Aggregate vor der Zersetzung zu bewahren vermag.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierende Verbindung dem Reaktionsgemisch zugesetzt wird, nachdem in Stufe (1) oder (V) eine Antigen-Antikörperreaktion bewirkt wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierende Verbindung gleichzeitig mit

dem Start der Antigen-Antikörperreaktion in Stufe (1) oder (V) zugesetzt wird, wodurch die Aggregatbil- κ

dung durch diese Reaktion und die Fixation dieser Aggregate gleichzeitig bewirkt wird. j

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als fixierende Verbindung polyfunktionelle Verbindungen und/oder proteindenaturierende Mittel verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als polyfunktionelle Verbindung ein Carbodiimid, Dialdehyd, Imidester oder ein Acylierungsmitiel verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als polyfunktionelle Verbindung 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, l-Cyclohexyl-S^-morpholinoethylJcarbodiimid, Glutaraldehyd, Succininaldehyd, N-Ethyl-S-phenylisoxazonium-3-sulfonat oder Succinylchlorid verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als proteindenaturierendes Mittel Tanninsäure, Formalin. Perchlorsäure.'i richloressigsäure.Thiocyansäure oder Thioglykolsäure verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß als Agglutinationsmittel ein Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex eingesetzt werden, die entweder nicht gebunden oder an einen Träger gebunden sind, welcher aus unlöslichen feinverteilten Teilchen besteht.

9. Verwendung eines in einer Verpackungseinheit konfektionierten, die folgenden rä-.-nlich getrennten Bestandteile

(a) eine Suspension von sensibilisierten Trägerteilchen, die durch Bindung eines Antigens, Antikörpers oder Antigen-Antikörperkomplexes an einen aus unlöslichen feinverteilten Teilchen bestehenden Träger gebildet wurden.

(b) eine Pufferlösung und

(c) eine fixierende Verbindung, welche die Agglutinationsreaktion auf einer gewünschten Stufe der Reaktion zu unterbrechen und die gebildeten Aggregate vor der Zersetzung zu bewahren vermag,

umfassenden Mittels zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1.

10. Verwendung eines in einer Verpackungseinheit konfektionierten, die folgenden räumlich gelrennten Bestandteile

_f (a) eine Suspension von sensibilisierten Trägerteilchen, die durch Bindung eines Antigens, Antikörpers oder

Antigen-Antikörperkomplexes an einen aus unlöslichen, feinverteilten Teilchen bestehenden Träger

\ gebildet wurden,

(b) eine Pufferlösung.

(c) ein Agglutinationsmittel, welches zur immunchemischen Reaktion mit den sensibilisierten Trägerteilchen befähigt ist, und

(d) eine fixierende Verbindung, welche die Agglutinationshemmungsreaktion auf einer gewünschten Stufe der Reaktion zu unterbrechen und die gebildeten Aggregate vor der Zersetzung zu bewahren vermag,

umfassenden Mittels zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1.

11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierende Verbindung ein

65 polyfunktionelles Reagenz und/oder ein proleindenaturierendes Reagenz ist.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das polyfunktionelle Reagenz ein Carbo- « diimid, Dialdehyd, Imidester oder ein Acylierungsmittel ist.

fl

13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das polyfunktionelle Reagenz ί-Ethyl-

3-(3-dimethyIaminopropyI)carbodiimid, l-Cyclohexyl-S-p-morpholinoethylJcarbodiimid, Glutaraldehyd, Succinaldehyd, N-EthyI-5-phenylisoxazonium-3-sulfonat oder Succinylchlorid ist.

14. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das proteindenaturierende Reagenz Tanninsäure, Formalin, Perchlorsäure, Trichloressigsäure.Thiocyansäure oder Thioglykolsäure ist.

15. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Bestandteile gefriergetrocknet ist.

16. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Agglutinationsmittel ein Antigen, Ajitikörper oder Antigen-Antikörperkomplex ist, die entweder ungebunden oder an einen aus unlöslichen, feinverteilten Teilchen bestehenden Träger gebunden vorliegen.