DE69025940T2

DE69025940T2 - Durch Silber intensiviertes, auf Goldmarkierung beruhendes Immuntestverfahren

Info

Publication number: DE69025940T2
Application number: DE69025940T
Authority: DE
Inventors: Michael Bailey; Vanessa Bertram; Bernard Rocks
Original assignee: SECR HEALTH BRIT; UK Secretary of State for Health
Current assignee: SECR HEALTH BRIT; UK Secretary of State for Health
Priority date: 1989-07-06
Filing date: 1990-07-06
Publication date: 1996-10-17
Anticipated expiration: 2010-07-07
Also published as: ATE135466T1; EP0481020B1; DE69025940D1; WO1991001003A1; EP0481020A1; AU5948090A; GB8915512D0

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Testen von Vollblut auf Substanzen, die spezifische Eindungsreaktionen eingehen können, wobei die zu analysierenden Substanzen beispielsweise spezifische Antikörper oder Antigene und die Antigene beispielsweise Proteine, Viren, Hormone, Arzneimittel, Nucleinsäuren und Polysaccharide sind.
Die vorliegende Erfindung gibt ferner ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins und/oder der Menge von spezifischen zu analysierenden Substanzen, insbesondere von Antikörpern, in Vollblut an.
Der Test auf spezifische Antikörper der Klassen IgG, IgM, IgD oder IgA ist das hauptsächlich verwendete Verfahren zum Nachweis von Infektionen durch Antigene, insbesondere bakterieller Infektionen oder Virusinfektionen, für welche die Antikörper spezifisch sind. Allgemein bekannt ist die Anwendung von ELISA-Verfahren (enzyme-linked immunosorbent assay) zum Nachweis von Antikörpern.
Bei ELISA-Verfahren wird allgemein der zu testende Antikörper oder das Antigen von einem auf einem Substrat immobilisierten Antigen bzw. Antikörper gebunden und dann mit einem zweiten, mit einem Enzym markierten Antikörper in Kontakt gebracht. Der zweite Antikörper bindet an den kombinierten Antikörper oder das kombinierte Antigen, so daß sein Vorhandensein oder seine Menge in Korrelation mit der Aktivität des gebundenen Enzyms, üblicherweise durch eine Enzymreaktion, die eine Farbänderung hervorruft, getestet werden kann.
Diese Verfahren sind gegenwärtig infolge der durch die Entdeckung des humanen Immunschwächevirus (human immunodeficiency virus (HIV)) - das bis vor kurzem als HTLV- III (human T-cell lymphotropic virus type 3) oder LAV (lymphadenopathy-associated virus) bezeichnet wurde - und durch seine Rolle im erworbenen Immunschwächesyndrom (acquired immune deficiency syndrome (AIDS)) notwendig gewordenen ausgedehnten Reihenuntersuchungen von besonderer Wichtigkeit.
Tests zum Nachweis der HIV-Infektion sind insbesondere in Studien zur epidemiologischen Verbreitung, als Hilfsmittel bei der Diagnose von AIDS und beim Screening zur Vermeidung der Verwendung von Blutspenden infizierter Personen von Nutzen. Da HIV durch Bluttransfusionen und durch Blutprodukte (Faktor VIII wird beispielsweise bei der Behandlung der Hämophilie verwendet) übertragen werden kann, müssen alle Blutspenden getestet werden. Derzeit angewendete Screening-Tests beruhen auf dem Nachweis spezifischer Antikörper in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Blut.
Neben dem ELISA-Verfahren wurden andere Assays, einschließlich des Fluoreszenz-Immunoassays, Radioimmunoassays und des Western-Blottings, verfügbar. Im Vergleich zu diesen Assays hat ELISA den Vorteil, einfacher und kostengünstiger zu sein, es weist aber immer noch einige Probleme auf. Die Verwendung von Enzymmarkern macht einen zusätzlichen Schritt erforderlich, in dem die üblicherweise in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten durchgeführten Tests mit einem Enzymsubstrat-Reagens inkubiert werden, um eine Farbreaktion hervorzurufen. Die Farbreaktion wird während eines vorgegebenen Zeitraums ablaufen gelassen und dann unter Verwendung einer starken anorganischen Säure beendet, worauf die Farbe visuell oder photometrisch bestimmt wird. Dieser Schritt ist anfällig für Fehler und verlängert die zum Erhalt von Ergebnissen benötigte Zeit wesentlich. ELISA zeigt auch Nachteile durch die Sperrigkeit und Labilität des Enzymmarkers, ergibt falsche Ergebnisse mit Vollblut und ist gegen Inhibition und Denaturierung empfindlich.
In jüngster Zeit wurden Assays angegeben, bei denen der Enzymmarker am zweiten Antikörper durch einen konjugierten Goldmarker ersetzt ist, welche hier als Immunogoldassays bezeichnet werden. Die Verwendung der mit Gold markierten zweiten Antikörper gegen die zu untersuchenden Antikörper oder Antigene erlaubt die visuelle Erkennung des Antikörper-Antigen-Komplexes als pinkfarbener Fleck.
Während für ELISA allgemein komplizierte Geräte zur Messung des Substrat- und Produktgehalts erforderlich sind, ist dies mit dem Immunogoldassay nicht der Fall. Im Gegensatz zu mehreren Stunden, die aufgrund des Schrittes der Substratinkubation oft zur Fertigstellung des ELISA benötigt werden, kann der Immunogoldassay Ergebnisse in nur 10 Minuten liefern und ist daher bei der Herstellung von Produkten wie Faktor VIII sehr hilfreich, wo die Geschwindigkeit der Gewinnung aus frisch gespendeten Blutchargen eine wesentliche Rolle spielt. Diese Immunogoldassays werden beispielsweise im DuPont HIVCHEK (eingetragenes Warenzeichen) und im Organon Teknika SPIA verwendet. Das Goldkonjugat ist relativ kostengünstig, zeigt nicht die Unbeständigkeit der Enzymmarker und erfordert weniger Manipulationen als der ELISA-Assay.
Die Immunogoldassays weisen jedoch eigene Probleme auf. Der Goldmarker zeigt eine Pinkfärbung als positives Ergebnis, die oft nur sehr schwierig erkannt werden kann. Da 10 % aller Männer im betreffenden Spektralbereich etwas farbenblind sind, können Probleme beim Nachweis auftreten, ohne daß der ausführende Techniker sich dessen bewußt ist. Der Test macht zudem ebenso wie ELISA die Verwendung von Serum oder proteinfreien Flüssigkeiten wie Urin notwendig, um korrekt zu arbeiten.
Mit Gold markierte Antikörper werden ferner in der Histologie zur Färbung ganzer Zellen oder von Gewebeproben verwendet, um ihre Struktur unter dem Mikroskop sehen zu können. In der Histologie wurde ein Verfahren entwickelt, um die Goldfärbung zu verstärken, wobei die gebundenen Goldteilchen zur Katalyse der Abscheidung von Silberteilchen aus einer Silbersalzlösung benutzt werden, wodurch eine wesentlich dunklere Färbung auftritt (G. Danscher, Histochemistry 71 (1981) 81; C. Holgate et al., J. Histochem. Cytochem. 31 (1983) 938). Das Verfahren der Verstärkung mit Silber (im Stand der Technik als IGSS (immunogold silver staining) bekannt) weist Probleme wie die Selbstabscheidung von Silber auf, wodurch Silber in anderen als den mit Gold markierten Bereichen abgeschieden wird, und benötigt eine spezielle Verfahrensweise, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
Die Anwendung dieser Silberverstärkung in Immunogoldassays mit Blotting wurde (1) in EP-A-0158746 und (2) in EP-A-0293947 vorgeschlagen: (1) beschreibt eine vorangehende Reinigung der komplizierter zu analysierenden Substanzen (s. (1), Seite 1, Zeilen 31-37), und (2) verwendet eine Filtration der Proben (s. (2), Spalte 10, Zeilen 4-38; Beispiel 1.3; Zeilen 30-34), keine der beiden Druckschriften beschreibt jedoch die Eignung dieses Verfahrens zum Test von Vollblut. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, visuell verstärkte Immunogoldassays und Immunogoldassays zur permanenten Aufzeichnung anzugeben sowie die Durchführung von Immunogoldassays mit Vollblutproben zu ermöglichen; letztere konnten mit den herkömmlichen ELISA-Verfahren nicht getestet werden. Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann mit Bezug auf die nachfolgende Beschreibung und die nachfolgenden Beispiele ersichtlich.
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren an, um Immunogoldassays, die spezifisch bindende, auf festen Substraten immobilisierte Agentien verwenden, bei visueller und/oder photometrischer und/oder kolorimetrischer Auswertung zu verstärken, das folgende Schritte umfaßt: Inkontaktbringen der Endproben aus dem Immungoldassay mit einer Silberionen enthaltenden Lösung, wobei Silber auf mindestens einem Teil des Goldes abgeschieden wird, und anschließend Korrelieren des Vorhandenseins und/oder der Menge des abgeschiedenen Silbers mit dem Vorhandensein und/oder der Menge der zu analysierenden Substanz; es ist dadurch gekennzeichnet, daß der Assay mit Vollblut durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung gibt daher eine erste Ausführungsform eines nicht-kompetitiven verstärkten Immunogoldassays zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz in Vollblut an, die folgende Schritte umfaßt:
(a) Immobilisierung eines spezifisch bindenden Agens, mit dem die zu analysierende Substanz durch eine spezifische Bindung kombiniert, auf einem festen Substrat,
(b) Inkontaktbringen des immobilisierten spezifisch bindenden Agens mit einer zu untersuchenden Vollblutprobe,
(c) Inkontaktbringen des immobilisierten spezifisch bindenden Agens aus Schritt (b) mit einem zweiten spezifisch bindenden Agens, das eine Bindung mit der spezifisch kombinierten zu analysierenden Substanz eingehen kann und an das kolloidale Goldteilchen gebunden wurden,
(d) Inkontaktbringen des immobilisierten spezifisch bindenden Agens aus Schritt (c) mit einer Silberionen enthaltenden Lösung, wobei sich das Silber auf mindestens einem Teil des Goldes abscheidet, das an einem gebundenen zweiten bindenden Reagens gebunden ist, und
(e) Korrelation des Vorhandenseins und/oder der Menge des abgeschiedenen Silbers mit dem Vorhandensein und/oder der Menge der zu analysierenden Substanz im Vollblut.
Ferner wird eine zweite kompetitive Ausführungsform zur Durchführung eines erfindungsgemäßen verstärkten Immunogoldassays angegeben, die folgende Schritte umfaßt:
(a) Immobilisierung eines spezifisch bindenden Agens, mit dem die zu analysierende Substanz durch eine spezifische Bindung kombiniert, auf einem festen Substrat,
(b) Inkontaktbringen des immobilisierten spezifisch bindenden Agens mit einem Gemisch aus dem zu analysierenden Vollblut und einer Lösung, die einen Anteil der zu analysierenden Substanz oder eine ihr analoge Substanz enthält, die spezifisch an das spezifisch bindende Agens binden und an die kolloidale Goldteilchen gebunden wurden, enthält,
(c) Inkontaktbringen des immobilisierten spezifisch bindenden Agens aus Schritt (b) mit einer Silberionen enthaltenden Lösung, wobei sich das Silber auf mindestens einem Teil des Goldes abscheidet, das über eine markierte zu analysierende Substanz oder eine ihr analoge Substanz an das bindende Agens gebunden ist, und
(d) Korrelation des Vorhandenseins und/oder der Menge des abgeschiedenen Silbers mit dem Vorhandensein und/oder der Menge der zu analysierenden Substanz im Vollblut.
Eine weitere kompetitive Ausführungsform zur Durchführung eines verstärkten Immunogoldassays umfaßt folgende Schritte:
(a) Immobilisierung einer zu analysierenden Substanz, mit der ein spezifisch bindendes Agens durch eine spezifische Bindung kombiniert, auf einem festen Substrat,
(b) Inkontaktbringen der immobilisierten zu analysierenden Substanz mit einem Gemisch aus dem zu analysierenden Vollblut und dem spezifisch bindenden Agens, mit dem die Substanz durch eine spezifische Bindung kombiniert,
(c) Inkontaktbringen der zu analysierenden Substanz aus Schritt (b) mit einem zweiten spezifisch bindenden Agens, das eine Bindung mit der spezifisch kombinierten zu analysierenden Substanz eingehen kann und an das kolloidale Goldteilchen gebunden wurden,
(d) Inkontaktbringen der immobilisierten zu analysierenden Substanz aus Schritt (c) mit einer Silberionen enthaltenden Lösung, wobei sich das Silber auf mindestens einem Teil des Goldes abscheidet, das an ein zweites bindendes Agens gebunden ist, und
(e) Korrelation des Vorhandenseins und/oder der Menge des abgeschiedenen Silbers mit dem Vorhandensein und/oder der Menge der zu analysierenden Substanz im Vollblut.
In allen Ausführungsformen wird das Vorhandensein der zu analysierenden Substanz durch das Vorhandensein oder das Fehlen einer Silberabscheidung bestimmt. In der ersten nicht-kompetitiven Ausführungsform wird ein positives Ergebnis durch das Vorhandensein einer Silberabscheidung angezeigt, wogegen die beiden kompetitiven Ausführungsformen eine verminderte oder keine Silberabscheidung als Zeichen für ein positives Ergebnis anzeigen, d.h., die markierten Substanzen wurden durch Konkurrenz mit der Substanz im zu untersuchenden Blut an einer Bindung gehindert. Die Menge der Substanz kann aus dem Abscheidungsgrad ermittelt werden, beispielsweise durch visuelle, kolorimetrische oder photometrische Auswertung. Die Verwendung von Eichkurven oder Farbtabellen für Absorptionswerte der immobilisierten Oberfläche bei bekannter Konzentration macht eine bequeme und doch genaue Bestimmung der Menge der Substanz in der Testflüssigkeit möglich. Es ist anzunehmen, daß sich die Erfindung für alle Arten von Immunoassays mit Vollblut eignet, bei welchen kolloidale Goldteilchen als Marker verwendet werden; dem Fachmann auf dem Gebiet der auf Bindung beruhenden Assays erschließen sich weitere Ausführungsformen.
Die Erfindung gibt ferner Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens an, die ein auf einem Substrat immobilisiertes spezifisch bindendes Reagens oder eine darauf immobilisierte zu analysierende Substanz, eine Silberionen enthaltende Lösung und entweder ein mit Gold markiertes zweites bindendes Reagens oder einen mit Gold markierten zu analysierenden Antikörper enthalten.
Die Verfahren und Kits der vorliegenden Erfindung ermöglichen mit Silber verstärkte Immunogoldassays, die zumindest zum Teil die mit ELISA und den oben beschriebenen Immunogoldassays verbundenen Probleme lösen und eine noch größere Empfindlichkeit mit einer Verbesserung in der Absorption, die 100mal größer ist als üblicherweise, aufweisen.
Durch die Verwendung einer Silberionen enthaltenden Verstärkerlösung wird das Gold vollständig sichtbar gemacht, wobei eine dunkelbraune bis tiefschwarze Abscheidung von metallischem Silber auf dem Gold entsteht, die in einer Menge proportional zur Menge des an das spezifisch bindende Reagens in der festen Phase gebundenen mit Gold markierten Reagens erzeugt werden kann. Wenn in der ersten Ausführungsform die Probe keine zu analysierende Substanz enthält, kann das zweite bindende, mit Gold markierte Reagens nicht binden, und es tritt keine Färbung auf, wodurch auf einfache Weise festgestellt werden kann, daß keine zu analysierende Substanz vorliegt. Die kompetitiven Assays zeigen eine dunkle Färbung als negatives Ergebnis. Die Ergebnisse können alternativ visuell unter Verwendung eines üblichen Plattenkolorimeters bestimmt werden, ohne daß Filter notwendig sind.
Da die Silberschicht permanent ist, können die getrockneten Platten für künftige Bestimmungen oder Überprüfungen verwendet werden. Alle Reagenzien sind stabil, und die Silberverstärkung findet unter Umgebungsbedingungen statt. Ein wesentlicher Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist die Möglichkeit, im Gegensatz zu den Assays im Stand der Technik, Vollblut zu testen, wo notwendigerweise Serum, Plasma oder andere, von Blut verschiedene Flüssigkeiten verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Nachweis beliebiger zu analysierender Substanzen in beliebigen Flüssigkeiten verwendet werden. Typische zu analysierende Substanzen sind spezifische Proteine, Viren, Hormone, Arzneimittel, Nucleinsäuren und Polysaccharide; spezifische Antikörper, beispielsweise IgD-, IgG-, IgM- oder IgA- Immunglobuline gegen HTLV-I, HIV, Hepatitis A, B und Non- A/non-B, Röteln, Masern, menschlichen Parvovirus B19, Mumps, Windpocken oder Leukämie; menschliche und tierische Hormone, beispielsweise menschliches Wachstumshormon (hGH), Choriongonadotropin (hCG); Arzneimittel, beispielsweise Paracetamol oder Theophyllin; Nucleinsäuremarker, beispielsweise Marker für genetische Fingerprint- Analysen; Polysaccharide, beispielsweise Antigene an der Zelloberfläche für HLA-Gewebebestimmungen und bakterielles Zellwandmaterial; Proteine wie karzinoembryonales Antigen (CEA) oder α-Fetoprotein.
Das Vollblut kann auch unverdünnt verwendet werden, es wird aber vorzugsweise beispielsweise im Bereich von 1:1 bis 1:10 verdünnt, aber auch eine Verdünnung von bis zu etwa 1:5000 brachte brauchbare Ergebnisse. Geeignete Verdünnungsmittel sind Standard-Verdünnungsmittel für Proben, beispielsweise phosphatgepufferte Kochsalzlösung.
Beim Test auf bestimmte Substanzen, wie HIV-Antikörper, können sozial bedingte Empfindlichkeiten auftreten; das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es in vorteilhafter Weise, Proben in Form von Abstrichen auf einem Absorptionsmittel wie Filterpapier zu testen, das getrocknet und mit einem geeigneten wäßrigen Medium, wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung, extrahiert werden kann; die getrocknete Probe kann dann wie oben beschrieben getestet werden. Nur 20 µl Vollblut müssen in dieser Ausführungsform auf das Absorbens aufgebracht werden, und eine Extraktion in ein typischerweise zwanzigfaches Volumen eines wäßrigen Mediums gibt einen geeigneten Extrakt zum Testen.
Das feste Substrat kann irgendein Material sein, auf dem das spezifisch bindende Reagens immobilisiert werden kann; bevorzugte Materialien sind Kunststoffe oder Cellulosenitrat. Das Substrat kann günstigerweise Stab-, Perlen- oder Plattenform aufweisen. Am meisten bevorzugt ist, wenn das Substrat eine Mikrotiterplatte, ein Streifen mit Mikrovertiefungen oder eine poröse Membran ist und das spezifisch bindende Reagens nach einem aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, wie solchen, die bei der Substratpräparation in konventionellen ELISA- Assays verwendet werden, in einer oder mehreren Vertiefungen auf den äußeren Oberflächen des Substrats immobilisiert wird.
Das spezifisch bindende Reagens kann irgendein Material sein, an das die Substanz spezifisch bindet, beispielsweise ganze Zellen oder Gewebe, Zellfragmente oder Proteine, einschließlich Proteinen, die aus einem Organismus gewonnen oder durch Rekombinationsverfahren hergestellt wurden, für den auf Infektion getestet wird. Im Falle von Arzneimitteln kann das bindende Reagens ein dafür spezifischer Antikörper sein, im Falle von HIV ein Antigen, das kommerziell erhältlich ist. Substrate, auf denen das Antigen immobilisiert ist, sind ebenfalls im Handel erhältlich, beispielsweise Streifen mit Mikrovertiefungen, die das Antigen in Form einer Beschichtung enthalten, als Teil des HTLV-III/LAV ELISA-Kits von DuPont. Bei Verwendung dieser kommerziell erhältlichen Substrate und immobilisierten Antigene kann Schritt (a) bei der praktischen Durchführung des Assays vermieden werden.
Das mit Gold markierte zweite bindende Reagens kann irgendein an die zu analysierende Substanz bindender Antikörper sein, der kolloidale Goldteilchen an sich gebunden hat. Die Goldteilchen haben vorzugsweise eine Größe von 10 nm oder weniger, wobei 5 nm oder weniger am wirksamsten ist. Die genaue Art des zweiten bindenden Reagens hängt natürlich von der Art des zu analysierenden Antikörpers ab, und geeignete zweite Antikörper sind dem Fachmann geläufig. Verfahren, um kolloidale Goldteilchen mit dem zweiten Antikörper zu verbinden, sind im Stand der Technik bekannt, und mit Gold markierte zweite bindende Reagentien sind kommerziell erhältlich. Diese können im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, jedoch vorzugsweise verdünnt. Eine bevorzugte Konzentration des mit Gold markierten zweiten bindenden Reagens ist so, wie sie durch Verdünnen des im Handel erhältlichen AUROPROBE LM GaHu-Reagens (Mercia Diagnostics Ltd.) im Bereich von 1:10 bis 1:50 erhalten wird; die Verdünnung 1:50 ist am wirksamsten, und andere Arten von mit Gold markierten Substanzen sollten vorzugsweise so verdünnt werden, daß dieses Konzentrationsniveau erreicht wird.
Eine Vielzahl von Antikörpern gegen Immunglobuline des Menschen (beispielsweise anti-α, anti-µ und anti-γ), der Ratte, der Maus, des Meerschweinchens und des Kaninchens, die bereits mit Gold markiert sind, sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Janssen Life Science Products unter dem Handelsnamen AUROPROBE. Um menschliche Antikörper gegen die meisten Infektionen, beispielsweise HIV, zu testen, sind spezifisch an IgG bindende anti-γ- Agentien am nützlichsten, wie Protein-A, das zum Nachweis des Antikörper-Moleküls häufig verwendet wird und ebenfalls an Gold gebunden im Handel ist.
Die in der Lösung aus Schritt (d) verwendeten Silberionen können von jeder Silberverbindung stammen, die in Ionen überführt werden kann, vorausgesetzt, das Gegenion stört den Test nicht in anderer Weise. Bevorzugte Silberverbindungen sind organische Silbersalze, insbesondere Silbercitrat und Silberlactat, aber es kann auch jedes lösliche anorganische Silbersalz, wie Silbernitrat, verwendet werden. Die Konzentration der Silberionen kann stark schwanken; sie liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,1 bis 1000 mM, noch bevorzugter von 1 bis 100 mM und insbesondere in einem Bereich von 2 bis 20 mM. Bevorzugt sind ein Reduktionsmittel, beispielsweise ein Amino- oder Hydroxybenzol, wie Hydrochinon, und ein Verzögerer, der eine zu schnelle Abscheidung verhindert, in der Silberionen enthaltenden Lösung aus Schritt (d) beispielsweise Gummi arabicum; das Hydrochinon oder Gummi arabicum sind vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 0,10 Gew.-% enthalten.
Der Silberniederschlag kann ferner in den Vertiefungen unter Verwendung einer geeigneten Lösung, z.B. von Natriumthiosulfat, fixiert werden, dies ist jedoch normalerweise unnötig. Die bevorzugten Bestandteile werden so ausgewählt, daß ein lichtstabiler Assay erhalten werden kann, der relativ unempfindlich gegenüber Verunreinigungen im Wasser ist, mit einem großen Sicherheitsbereich zwischen den für die Empfindlichkeit des Assays geeigneten Silberionenkonzentrationen und Silberionenkonzentrationen, die durch Selbstabscheidung zu einer unerwünscht hohen "Hintergrundsilberabscheidung" führen. Geeignete Silberionen enthaltende Lösungen zur Verwendung in Schritt (d) sind kommerziell erhältlich, beispielsweise zur Verwendung in dem oben beschriebenen IGSS-Verfahren von Janssen unter dem Handelsnamen IntenSE*II oder von Sigma Chemical Co unter dem Namen SE-100. Eine typische Vorgehensweise für die erste nicht-kompetitive Ausführungsform zur Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens wird im folgenden für die Anwendung auf HIV beispielhaft beschrieben. Die Schritte (a) und (b) können in der gleichen Weise wie in den bekannten ELISA-Verfahren durchgeführt werden, außer daß Vollblut, vorzugsweise in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), als Flüssigkeit verwendet wird. Vorzugsweise wird das bindende Reagens, d.h. das Antigen, zuerst mit Ziegenserum enthaltender PBS während etwa zwei Minuten in Kontakt gebracht, um eine unspezifische Bindung bei geringeren Konzentrationen des Ziegenserums, als sie sonst verwendet würden, zu vermeiden.
Es wurde festgestellt, daß das Verfahren bei Serumverdünnungen im Bereich von 1:1 bis 1:1600 arbeitet, ohne daß es einen Hinweis gibt, daß Verdünnungen außerhalb dieses Bereichs zu Fehlern führen würden. Das Vollblut wird typischerweise bis zu 30 Minuten bei 37 ºC mit dem immobilisierten Antigen inkubiert, wobei jedoch auch Zeiten von 15 Minuten angewandt werden können. Nach Schritt (b) wird überschüssiges Vollblut durch bekannte Verfahren, beispielsweise Waschen mit PBS, entfernt.
Das mit Gold markierte bindende Agens wird vorzugsweise 10 bis 60 Minuten mit den kombinierten und unmarkierten Agentien inkubiert, noch mehr vorzuziehen sind 20 bis 40 Minuten, und am besten sind 30 Minuten. Schritt (c) der ersten Ausführungsform wird typischerweise durch Inkubation des bindenden Reagens, beispielsweise des Antigens, mit einer das mit Gold markierte zweite bindende Reagens enthaltenden Lösung, beispielsweise dem zweiten Antikörper, bei 37 ºC während 15 Minuten durchgeführt, wobei die Lösung beispielsweise 5 % AUROPROBE, Gelatine (beispielsweise 5 %, um nichtspezifische Bindung zu vermindern) und 0,1 % Ziegenserum in PBS enthält. Diese Vorgehensweise ist für die Verwendung mit einem Substrat in Form von Mikrotitervertiefungen, die eine Beschichtung mit 300 ng IgG enthalten, optimal. Eine Inkubationszeit von 5 bis 30 Minuten scheint bei hohen Anti-HIV-Titern nicht kritisch zu sein, während HIV-positive Seren mit niederem Titer jedoch etwa 10 Minuten Inkubationszeit benötigen, um maximale Bindung zu erreichen. Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen zeigt die Wirkung verschiedener AUROPROBE-Konzentrationen und Inkubationszeiten bezüglich der Endabsorption der Vertiefungen nach der Silberverstärkung. Nach Schritt (c) wird die Lösung mit überschüssigen mit Gold markierten Antikörpern durch bekannte Verfahren entfernt, beispielsweise durch Waschen mit entmineralisiertem Wasser.
Das Inkontaktbringen mit den Silberionen in den Schritten (d) und (e) wird typischerweise durch Inkontaktbringen des immobilisierten spezifisch bindenden Agens, beispielsweise des Antigens, mit einer Silberionen enthaltenden Lösung, beispielsweise IntenSE*II (nach den Vorschriften des Herstellers hergestellt), bei Raumtemperatur während 15 Minuten, vorzugsweise unter Schütteln durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß die erforderliche Zeit, um maximale Absorption in einem Anti-HIV-Assay zu erreichen, vom Anti-HIV-Titer abhängt. Etwa während der ersten 20 Minuten ist die Silberabscheidung spezifisch für Goldteilchen, danach tritt Selbstabscheidung auf. Die Silberlösung wird daher vorzugsweise 10 bis 60 Minuten, und noch bevorzugter 20 bis 30 Minuten mit dem fertiggestellten Immunogoldassay inkubiert.
Das Vorhandensein der zu analysierenden Substanz in der ersten Ausführungsform zeigt sich - wie oben erwähnt - durch das Auftreten einer sichtbaren braunen oder schwarzen Färbung, deren Intensität durch Absorptionsmessung oder Vergleich mit standardisierten Farbtabellen quantitativ bestimmt werden kann. Vorzugsweise werden mehrere Assays durchgeführt und mit Standard- und Kontrollproben verglichen. Die beim erfindungsgemäßen Assayverfahren verwendeten speziellen Volumina, usw. variieren selbstverständlich mit den gegebenen Parametern, beispielsweise der Beschaffenheit des Substrats; sie können aber so angepaßt werden, daß bei Verwendung von Substraten mit Mikroliter-Vertiefungen im Mikrolitermaßstab gearbeitet werden kann. Die Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können in einer Vielzahl von Formen angegeben werden, und Wege, um Immunoassayverfahren in Kitform anzugeben, sind allgemein bekannt. Die Erfindung wird im folgenden beispielhaft mit Bezug auf die Figuren erläutert; Fig. 1 zeigt die chemische Grundlage des für HIV angewendeten Verfahrens in der ersten nicht-kompetitiven Ausführungsform; Fig. 2 zeigt graphisch die Wirkung einer Erhöhung des prozentualen Gehalts an AUROPROBE und der Inkubationszeiten in Schritt (c) ; Fig. 3 zeigt Testergebnisse; Fig. 4 zeigt die Wirkung einer Verdünnung der Serumprobe; die Fig. 5 und 6 zeigen die Absorption von Mikrotitervertiefungen von ELISA- und SEGLISA-Assays bei 450 nm, die mit den gleichen HIV-Vollblutproben durchgeführt wurden; die Fig. 7 und 8 zeigen in Form von Histogrammen die Ergebnisse aus SEGLISA von 50 positiven und 50 negativen HIV-Proben; die Fig. 9 und 10 zeigen im Vergleich die Ergebnisse von HIV-Antikörperassays, die mit Vollblut und Serumproben durchgeführt wurden; Fig. 11 zeigt ein Histogramm zur Wirkung der Probeninkubationszeit mit Serum und Vollblut in den Mikrotitervertiefungen; Fig. 12 zeigt schematisch die Grundlage der Bindung in einem SEGLISA-Assay für Theophyllin; Fig. 13 zeigt die Grundlage zur Bindung für einen SEGLISA-Assay für Rubella-Antikörper; die Fig. 14 bis 21 zeigen die Wirkung der Verdünnung des Goldkonjugats, der Größe der Goldteilchen, der Inkubationszeit mit dem Goldkonjugat, des Volumens der Goldkonjugatlösung, der Menge der Gelatine in der Konjugatlösung, der Art des verwendeten Kits zur Silberverstärkung, der Inkubationszeit mit der Silberverstärkerlösung und des Volumens des Silberverstärkers auf die Assayergebnisse, die über die Absorption der Mikrovertiefungen bestimmt wurden.
Das Prinzip der Verstärkungsmethode ist unter Bezug auf die erste Ausführungsform in Fig. 1 gezeigt. Ein Antigen (1) wird auf einem festen Polystyrolsubstrat (2) immobilisiert. Ein menschlicher Anti-HIV-Antikörper (3) wurde durch das Antigen (1) eingefangen und daher selbst auf dem Substrat (2) immobilisiert. Der Antikörper (3) wurde mit einem mit kolloidalen Goldteilchen (5) markierten Anti-IgG des Menschen (4) in Kontakt gebracht, wodurch das markierte IgG (4) an den Antikörper (3) gebunden wurde. Der Antigen-Antikörper-IgG-Komplex (1) (3) (4) wurde mit einer Silberionen enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht, die um die Goldteilchen (5) als feste Silberteilchen (6) mit einer für das Auge dunklen Farbe abgeschieden wurden.
In Figur 12 bedeuten (1) Theophyllin, (2) eine Theophyllinprobe, (3) einen monoklonalen Anti-Theophyllin-Antikörper, (4) ein Anti-IgG-Gold-Konjugat der Maus, (5) das darin enthaltene Gold, (6) die Silberabscheidung und (7) die Vertiefungen. Figur 13 ist eine schematische Darstellung des Mechanismus dieses Assays, wobei (1) gebundenes Anti-hGH, (2) hGH, (3) einen monoklonalen Antikörper gegen hGH, (4) ein Anti-IgG-Gold-Konjugat, (5) den Goldmarker des Konjugats, (6) die Silberabscheidung auf dem Gold und (7) die Vertiefungsoberfläche bedeuten.
Der Ausdruck SEGLISA wird hier verwendet, um die Verwendung des vorliegenden mit Gold markierten und durch Silber verstärkten Immunoassays zu bezeichnen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird nun im folgenden durch die Beispiele erläutert, woraus für den Fachmann ersichtlich wird, daß zahlreiche weitere Möglichkeiten im Rahmen der vorliegenden Erfindung für den Test anderer zu analysierender Substanzen abgeleitet werden können.

VERGLEICHSBEISPIEL 1, SEGLISA-ASSAY VON HIV IN MENSCHLICHEM BLUTSERUM.

Materialien:

Falls nicht anders angegeben, wurden die Laborreagentien von BDH Ltd., Poole, Dorset, BH12 4NN, bezogen. Die mit Antigen beschichteten Streifen mit Mikrovertiefungen waren von DuPont (UK) Ltd., Stevenage, UK, zur Verfügung gestellt, die normalerweise als Teil des DuPont HTLV-III/LAV-ELISA-Kits verkauft werden.
Die Gold- und Silberreagentien wurden von Janssen Life Sciences, Wantage, Oxon, OX12 ODQ, geliefert. Sie bestanden aus anti-human-IgG der Ziege, die mit kolloidalen Goldteilchen einer mittleren Größe von 10 nm markiert sind (AUROPROBE BL plus GAHu) und IntenSE*II (Produkt Nr. 30.653.01), einem Kit mit einem Reagens zur Silberverstärkung, das sehr gut unter Umgebungslichtbedingungen arbeitet. Beide Reagentien waren nach einjähriger Aufbewahrung noch gut verwendbar (AUROPROBE bei 4 ºC und IntenSE*II bei Raumtemperatur). AUROPROBE und IntenSE*II sind eingetragene Warenzeichen von Janssen.

Proben:

Um den neuen Assay zu beurteilen, wurden Probenplatten aus bekannten Anti-HIV-positiven und -negativen Proben zusammengestellt. Die negativen Seren wurden aus Proben erhalten, die für andere als HIV-Tests eingesandt worden waren. Die positiven Proben stammten von Patienten, die auf HIV-Infektion, persistierende generalisierte Lymphadenopathie, AIDS-related-Komplex oder AIDS untersucht oder behandelt wurden. Vorbereitend zu dieser Studie wurden alle Proben getestet und entweder als positiv oder negativ eingestuft, wobei eine Reihenuntersuchung mit kommerziell erhältlichen ELISA-Kits durchgeführt wurde und die positiven Ergebnisse durch das Virus Reference Laboratory (Colindale Avenue, London) unter Verwendung zusätzlicher Tests bestätigt wurden. Die Central Public Health Laboratory Division of Microbiological Reagents and Quality Control (DMRQC) lieferte sechs Plasmakontrollproben (Platte Nr. 8), die aus fünf positiven Proben, die durch Verdünnen einer positiven Probe mit hohem Titer hergestellt worden waren, und einer negativen Probe bestanden. Eine andere DMRQC-Kontrollprobe (als LP3 bezeichnet) wurde als Referenzserum verwendet und war eine positive Probe, die so weit verdünnt worden war, daß sie weder eine starke positive noch eine starke negative Bestimmung ergab.

Vorrichtung:

Es wurde ein Standard-ELISA-Laborgerät verwendet. Die Absorption der Mikrotitervertiefungen wurde mit einem Dynatech-MR250-Photometer (eingetragenes Warenzeichen) zur Plattenauswertung mit einem 450-nm-Filter bestimmt. Es wurde eine spezielle mikrobiologische Schutzkappe Stufe 2 verwendet.

Vorgehensweise:

100 µl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (0,14 M NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 8,1 mM Na&sub2;PO&sub4;, pH 7,3) mit 10 % normalem Ziegenserum und 0,5 % Tween 20 (eingetragenes Warenzeichen) wurden in die Vertiefungen einer Standard-ELISA-Mikrotiterplatte gegeben, und die Platten wurden mindestens 2 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. 50 µl PBS wurden dann aus jeder Vertiefung entnommen, wonach 50 µl Testserum (oder ggf. Referenzserum oder PBS) zugegeben wurden. Jeder Streifen enthielt typischerweise eine Referenz und eine leere Vertiefung. Die Vertiefungen wurden verschlossen, worauf 10 Sekunden bewegt und dann 15 Minuten bei 37 ºC inkubiert wurde, bevor sie fünfmal mit 300 µl PBS mit 0,1 % Ziegenserum gewaschen wurden. Dann wurden 50 µl des Goldkonjugats zugesetzt (die Lösung enthielt 5 % AUROPROBE, 5 % Gelatine und 0,1 % Ziegenserum in PBS).
Die Vertiefungen wurden verschlossen, worauf wie oben bewegt und dann bei 37 ºC 15 Minuten inkubiert wurde. Nachdem sie nochmals wie oben mit entmineralisiertem Wasser (3 x 300 µl) gewaschen worden waren, wurden 200 µl einer frisch angesetzten Silberverstärkerlösung (hergestellt durch Mischen des gleichen Volumens der beiden Lösungen aus dem IntenSE*II-Kit) in die Vertiefungen gegeben, wonach bei Raumtemperatur 15 Minuten geschüttelt wurde. Die Absorption der Vertiefungen wurde anschließend gemessen, wobei bekannte negative und positive Kontrollproben in jede Charge eingeschlossen wurden.
HIV-positive Proben ergaben eine dünne schwarze, sehr kontrastreiche Beschichtung am Boden und an den Seiten der Vertiefung (Absorption typischerweise größer als 1), wogegen sehr verdünnte positive Seren eine braune Verfärbung in den Vertiefungen hervorriefen. Mit negativen Seren trat keine sichtbare Färbung auf.

Entwicklung der Silberverstärkung:

Es wurden Versuche durchgeführt, um den Einfluß der Variablen auf die zeitaufwendigen Inkubationsschritte zu bestimmen, um einen Assay zu entwickeln, der Ergebnisse in einer relativ kurzen Zeit liefern kann. Einige Beobachtungen werden im folgenden zusammengefaßt.

Antigen/Anti-HIV-Reaktion:

Rindertestserum wurde verdünnt, indem es in Mikrovertiefungen mit einem gleichen Volumen Pufferlösung gegeben wurde. Ziegenserum in der Pufferlösung war notwendig, um nichtspezifische Bindung zu verhindern, es verringerte jedoch auch die Reaktionsgeschwindigkeit. Es wurde festgestellt, daß durch den Zusatz der Ziegenserum enthaltenden Pufferlösung vor dem Zusatz des Testserums (mindestens 2 Minuten) nichtspezifische Bindung vermieden werden konnte, wobei eine geringere Konzentration an Ziegenserum als sonst verwendet wurde.
Eine Verminderung der Inkubationszeit von 30 Minuten auf 15 Minuten ergab keine Verminderung der Absorption, so daß eine weitere Verringerung der Reaktionszeit möglich wäre; durch die Voraussetzung eines genauen zeitlichen Ablaufs zwischen der manuellen Befüllung jeder Vertiefung und der Messung sind kurze Inkubationszeiten jedoch schwieriger durchzuführen.

Ergebnisse:

Eine Platte mit 61 Proben, die 30 HIV-negative und 31 HIV-positive Proben umfaßten, wurde mit SEGLISA getestet. Die als LP3 bezeichnete DMRQC-Kontrollprobe wurde als Referenz verwendet (Grenzwert-Standardprobe). Die Ergebnisse werden als Verhältnis der Absorption der Probe (P) zur Absorption der Referenz (R) dargestellt. Dieses Verhältnis P/R ist gleich 1, wenn die Absorption der Testprobe gleich der vom Referenzserum hervorgerufenen Absorption ist. Diese Verhältnisse sind in Fig. 3 graphisch dargestellt.
Positive und negative Seren konnten in zwei klar unterscheidbare Gruppen eingeteilt werden. Für die negativen Seren betrug das mittlere P/R-Verhältnis 0,31, wogegen es für positive Proben 2,72 war. Mittlere positive Verhältnisse/mittlere negative Verhältnisse ergaben einen Wert von 8,66. Die DMRQC-Kontrollproben konnten ebenso korrekt in Kategorien eingeteilt werden (d.h., eine negative und fünf positive).
Wie bei allen Anti-HIV-Testverfahren wird die Empfindlichkeit und die Spezifität des Assays durch die gewählte Höhe der Grenzwerte beeinflußt; leider gibt es keine absoluten Standardproben. Wenn der Schwellenwert zur Festlegung des minimalen positiven SEGLISA-Verhältnisses sinkt, steigt die Empfindlichkeit des Assays zum Nachweis schwacher Anti-HIV-Fälle, wogegen die Spezifität sinkt. Da in einer Reihenuntersuchung festgestellte positive Ergebnisse normalerweise durch verschiedene andere Tests verschiedenster Ausführungsformen bestätigt werden, ist es besser, den Grenzwert in Richtung falsch positiver Ergebnisse anstatt in Richtung falsch negativer Ergebnisse zu verschieben. Für den vorliegenden Assay wird beispielsweise ein Grenzwertverhältnis von 0,8 zur Anwendung bei Blutreihenuntersuchungen vorgeschlagen. Bei diesem Verhältnis sollte der Grenzwert keine großen Mengen gespendeten Bluts unnötigerweise ausschließen.
Wenn die Empfindlichkeit des Assays als Anteil der korrekt identifizierten positiven Seren definiert wird, hat der Test eine Empfindlichkeit von 100 %; wenn der Test speziell als Anteil der korrekt identifizierten negativen Proben definiert wird, dann war die Spezifität ebenfalls gleich 100 %.

Analytische Empfindlichkeit:

Die Eignung des Tests, niedrige Konzentrationen von HIV-Antikörpern nachzuweisen, wurde durch Titration zweier Anti-HIV positiver Seren bewertet. Die positiven Seren wurden in einem negativen Serum 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 und 1:1600 verdünnt. Bei einer Verdünnung von 1:1600 zeigten beide Seren noch positive Ergebnisse. Wie Fig. 4 zeigt, ist die Steigung der Kurve für hohe Probenverdünnungen am steilsten. Daraus ergibt sich eine maximale Empfindlichkeit für den Nachweis von Seren mit sehr niedrigen Antikörpertitern.

BEISPIEL 1.

SEGLISA-ASSAY VON HIV IN MENSCHLICHEM VOLLBLUT.

Verfahren und Materialien:

Die mit HIV-Antigen beschichteten Vertiefungen und positive und negative HIV-Antikörper-Kontrollproben wurden von Mercia Diagnostics Ltd. geliefert; das Anti-HuIgG-Konjugat (AUROPROBE LM GaHu) stammte von Janssen Life Sciences, die Anti-HuIgG- Meerrettichperoxidase, die Lösung zur Silberverstärkung (SE-100) und alle anderen Reagentien waren von Sigma Chemical Company. Die Reagentien wurden bei 4 ºC aufbewahrt mit Ausnahme der Ausgangschemikalien für die Silberverstärkerlösung, die bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt wurden. Alle Versuche wurden zweifach durchgeführt, wobei die Ergebnisse als mittlere Absorption der beiden Versuche gewertet wurden. Der Grenzwert für einen positiven und einen negativen HIV-Antikörpergehalt wurde als mittlere Absorption der positiven HIV-Antikörperkontrollprobe dividiert durch zwei angenommen. Absorptionen von Testproben oberhalb dieses Wertes wurden als positiv für HIV-Antikörper und unter diesem Wert als negativ für HIV- Antikörper bewertet.

Proben:

Eine Platte mit 50 bekannten anti-HIV positiven Proben wurde aus Blutproben zusammengestellt, die von an HIV-Infektion leidenden Patienten an das Labor geschickt worden waren. 50 Blutproben wurden ferner Proben entnommen, die für andere biochemische Analysen an das Labor geschickt worden waren.

Geräte:

Es wurde eine Standard-Mikrotiter-Laborausrüstung verwendet. Alle Tests wurden unter einem speziellen mikrobiologischen Schutzabzug Stufe 2 durchgeführt. Die Absorption der Mikrotiter-Vertiefungen wurde unter Verwendung eines Dynatech-MR250-Photometers mit einem 450 nm- Filter bestimmt.

Ausführung des Assays:

Testseren und Kontrollseren wurden 1 : 20 und das zu testende Vollblut 1 : 10 mit Probenverdünnungsmittel (8 g NaCl, 0,2 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,9 g NaH&sub2;PO&sub4; 12H&sub2;O + 1 % BSA + 0,05 % Tween 20, mit destilliertem Wasser auf 1 l aufgefüllt) verdünnt; jeweils 200 µl wurden in mit inaktiviertem HIV-Antigen vorbeschichtete Mikrotitervertiefungen gegeben, worauf die Vertiefungen bei 37 ºC während 60 min inkubiert wurden. Das Serum oder das Vollblut wurde dann abgesaugt, und die Vertiefungen wurden 5mal in Waschpuffer (8 g NaCl, 0,2 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,9 g NaH&sub2;PO&sub4; 12H&sub2;O + 0,05 % Tween 20, mit destilliertem Wasser auf 1 l aufgefüllt) gewaschen. Der Antikörper-Antigen-Komplex wurde dann entweder mit ELISA oder SEGLISA quantitativ bestimmt.

SEGLISA:

100 µl des IgG-Gold-Konjugats (1 : 50 mit Probenverdünnungsmittel verdünnt) wurde in jede der Vertiefungen gegeben, worauf wieder bei 37 ºC während 60 min inkubiert wurde. Die Vertiefungen wurden dann 3mal mit Waschpuffer gewaschen und 30 min bei Raumtemperatur mit Silber verstärkt (100 µl eines Gemisches gleicher Volumina Initiator A und Verstärker B). Nach 3maligem Waschen in destilliertem Wasser wurde die Absorption der Vertiefungen bei 450 nm bestimmt.

ELISA (Vergleich):

100 µl des Anti-HuIgG-Meerrettichperoxidase-Konjugats (1 : 200 mit Probenverdünnungsmittel verdünnt) wurde in jede Vertiefung gegeben, wonach wieder bei 37 ºC 60 min inkubiert wurde. Das Konjugat wurde dann abgesaugt; die Vertiefungen wurden 3mal mit Waschpuffer gewaschen. Das Substrat wurde 10 min vor der Verwendung durch Verdünnen des Chromogens Tetramethylbenzidin (TMB) im Verhältnis 1 : 100 mit Substratlösung (Citratpuffer + H&sub2;O&sub2;) hergestellt. Es wurde in den Vertiefungen bei Raumtemperatur 30 min inkubiert; anschließend wurden 25 µl 2 M H&sub2;SO&sub4; zugesetzt, um die Reaktion abzubrechen. Die Vertiefungen wurden dann innerhalb von 30 min auf ihre Absorption bei 450 nm untersucht.

Ergebnisse:

15 bezüglich HIV-Antikörpern negative Blutproben wurden unter Verwendung von Serum und Vollblut mit den oben beschriebenen ELISA- und SEGLISA-Verfahren getestet. Tabelle 1 faßt die erhaltenen Ergebnisse zusammen. TABELLE 1. Assay Serum Vollblut Grenzwert ELISA SEGLISA + = positives Ergebnis; - negatives Ergebnis.
Der Grenzwert für positive und negative Ergebnisse ist die mittlere Absorption der positiven Kontrollprobe geteilt durch zwei.
Die Messungen wurden bei 450 nm durchgeführt.
Die Figuren 5 (ELISA) und 6 (SEGLISA) zeigen dieses Ergebnis im einzelnen. Durch ELISA wurden bei Verwendung von Serum alle 15 Proben korrekt als negativ zugeordnet; bei Verwendung von Vollblut wurden jedoch 12 Proben falsch als positiv angegeben, wobei im Vergleich zu äquivalenten Serumproben alle 15 Proben eine mindestens doppelt so hohe Absorption zeigten. Durch SEGLISA wurden sowohl bei Verwendung von Serum als auch von Vollblut alle 15 Proben korrekt als negativ bezüglich HIV-Antikörpern identifiziert. Diese Ergebnisse zeigen, daß ein HRP-ELISA zum Testen von Vollblutproben ungeeignet ist, wogegen SEGLISA verläßliche Ergebnisse liefert, die vom Vorliegen roter Blutkörperchen unbeeinflußt sind.
50 bekannte positive HIV-Antikörper- und 50 bekannte negative HIV-Antikörper-Vollblutproben wurden mit SEGLISA getestet. Tabelle 2 zeigt die erhaltenen Ergebnisse. TABELLE 2. Positive Proben Positiv Negativ Zahl der Proben Negative Proben
Der Grenzwert für positiv war 0,362 und für negativ 0,368. Die Figuren 7 und 8 zeigen Histogramme der negativen bzw. positiven Reihenuntersuchung. Alle 50 negativen Patientenproben zeigten eine Absorption unter 0,362 und alle 50 positiven Proben eine Absorption über dem Grenzwert von 0,368.

Genauigkeit:

Eine positive HIV-Antikörper-Vollblutprobe und eine entsprechende Serumprobe wurden mit SEGLISA 16mal getestet. Alle Bedingungen des Assays wurden konstantgehalten. Die Ergebnisse dieser Genauigkeitsuntersuchungen sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3. Serum Vollblut Zahl der Versuche Mittelwert
Der angegebene Mittelwert ist die mittlere Absorption aller Einzelergebnisse, SD die Standardabweichung der Ergebnisreihe und C von V der Korrelationskoeffizient. SEGLISA mit Vollblut weist einen sehr guten C-von-V-Wert von 7,5 % auf, der eine gute Genauigkeit anzeigt. Dies ist auch vergleichbar mit dem Serum-SEGLISA mit einem C-von-V-Wert von 8,7 %, d.h., Vollblut hat keine unterschiedliche Wirkung auf den Assay.

Empfindlichkeit:

Die Empfindlichkeit des Assays wurde unter Verwendung verschiedener Titrationen positiver und negativer Anti-HIV-Vollblutproben bestimmt, und die Ergebnisse wurden mit dem äquivalenten Serumtest verglichen. Das Serum wurde 1:10, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280, 2560, 5120, 10240, 20480 und 40960 mit Probenverdünnungsmittel verdünnt. Die Blutzellenfraktion einer negativen HIV-Antikörper-Probe wurde zum Zusatz zu jeder Verdünnung verwendet, um das Verhältnis von Serum/Blutzellen unter Aufrechterhaltung der angegebenen Verdünnungen bei 1:1 zu halten, wobei PBS-Puffer für den äquivalenten Serumassay zugefügt wurde. Figur 9 zeigt die aus dem Vollblutassay erhaltenen Ergebnisse; es ist ersichtlich, daß eine positive Probe durch Verdünnung mit einem Verdünnungsfaktor von 5120 negativ wird. Diese Ergebnisse sind, wie in Figur 10 gezeigt, mit dem Serumassay vergleichbar, der ebenfalls mit einem Serumverdünnungsfaktor von etwas über 5120 negativ wird. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Empfindlichkeit bei Verwendung von Vollblut nicht verlorengeht.

Inkubationszeiten von Vollblut:

Eine positive und eine negative HIV-Antikörper-Probe wurde als Vollblut und als Serum mit variierenden Inkubationszeiten getestet: 0, 5, 10, 25, 30, 45, 60 und 120 min wurden getestet. Das Aussehen des Vollbluts in den Vertiefungen nach jeder Inkubationszeit wurde ebenfalls aufgezeichnet und ist in Tabelle 4 angegeben. TABELLE 4. Minuten Zustand Vollständig gemischt. Schwache Serumschicht auf dem oberen Fünftel des Bluts. Diffuse Serumschicht auf dem oberen Drittel des Bluts. Diffuse Serumschicht auf der oberen Hälfte des Bluts. Zellschichten im unteren Fünftel des Bluts.
Figur 11 zeigt ein Histogramm der erhaltenen Ergebnisse: Mit steigender Inkubationszeit steigt die Absorption, wobei das Serum eine geringfügig höhere Absorption als das Vollblut aufweist. Es konnte daher gezeigt werden, daß die Trennung von Zellen und Serum/Puffer während der Inkubation an Vertiefungen keine signifikante Wirkung auf die immunologische Reaktion hat.

BEISPIEL 2. SEGLISA-ASSAY FÜR HIV IN VOLLBLUTPROBEN, DIE AUF FILTERPAPIER GEBLOTTET WURDEN.

Es wurde ein Test entwickelt, um feststellen zu können, ob Antikörper aus Vollblut extrahiert werden können, das auf einer absorbierenden Trägersubstanz, beispielsweise Filterpapier, aufgebracht wurde, um ein "Fernabgabeverfahren" anzugeben, bei dem die Patienten die Proben mit der Post übersenden können; da die zu bestimmende Substanz kein gewissermaßen lebender Teil der Infektion sein muß, kann auf eine beliebige charakteristische Verbindung getestet werden.
Es wurde Guthrie-PKU-Probenfilterpapier als Auftragungsmedium verwendet. Quadrate von 1 cm² Fläche wurden ausgeschnitten und auf den Boden von 5 ml-Reagenzgläsern gelegt. Eine Lösung von mit I¹²&sup5; markierten IgG einer Konzentration von 0,1 µg/ml wurde mit Vollblut 1:10 verdünnt. Anschließend wurden je 20 µl in die 5 Reagenzgläser gegeben; eines diente als Leerprobe. Alle 6 Reagenzgläser wurden sofort 120 s lang mit einem NE-1600- Gammazähler auf ihre Gammaemission getestet. Die Reagenzgläser wurden dann zum Trocknen 60 min in einen Inkubator bei 37 ºC gebracht. Danach wurden 500 µl PBS-BSA-Tween in jedes Reagenzglas gegeben, worauf 1 min verwirbelt wurde; anschließend während 15 min gerührt. Der Puffer wurde dann abgesaugt und in ein separates Reagenzglas gebracht; anschließend wurden sowohl das Filterpapier als auch der Puffer 120 s lang auf ihre Gammaemission untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. TABELLE 5. Reagenzglas Leerprobe Mittelwert Gesamt Filter Puffer
Der Bindungsprozentsatz beträgt 100 %.
Nach der Extraktion am Filterpapier verbleibender Prozentsatz = 235/1248 x 100 = 18 %.
Nach der Extraktion im Puffer verbleibender Prozentsatz = 1032/1248 x 100 = 82 %.
Eine Sephadex-G-75-Säule wurde zur Abtrennung der in den Versuchen verwendeten IgG-Marker verwendet; es wurde festgestellt, daß 78 % des Markers an den Antikörper gebunden wurde. 80 % der durch Zählung ermittelten Radioaktivität wurde aus dem Filterpapier extrahiert, d.h., der Anteil an extrahiertem Antikörper beträgt 58/(58+20) x 100 = 74 %. Nachdem die Brauchbarkeit der Antikörperextraktion nachgewiesen worden war, wurde ein SEGLISA-Assay folgendermaßen durchgeführt:
Ein Guthrie-PKU-Filterpapier wurde als Auftragungsmedium verwendet, wobei 1 cm² große Quadrate ausgeschnitten und auf den Boden von 5 ml-Reagenzgläsern gelegt wurden; es wurden für HIV-Antikörper positive und 15 für HIV-Antikörper negative Vollblutproben gegenüber Kontrollproben mit positivem und negativem HIV-Antikörper-Serum getestet. 20 µl jeder Probe wurden auf das Filterpapier in den Reagenzgläsern aufgebracht. Alle Reagenzgläser wurden dann verschlossen und über Nacht zum Trocknen stehengelassen. Danach wurden in jedes Reagenzglas 400 µl PBS- BSA-Tween gegeben, worauf mit einem Sero-Rührer 30 min gemischt wurde. Dann wurden 200 µl des Puffers abgesaugt und in eine mit HIV-Antigen beschichtete Vertiefung gebracht, um ein SEGLISA nach dem Verfahren von Beispiel 2 durchzuführen; die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. TABELLE 6. Probe Positiv Abs&sub4;&sub5;&sub0; Negativ Abs&sub4;&sub5;&sub0; Kontrolle
Alle Ergebnisse wurden mit einem Untergrundfaktor von 0,109 korrigiert, der aus den vorliegenden und vorangehenden Mittelwerten der negativen Ergebnisse abgeleitet worden war.

BEISPIEL 3. OPTIMIERUNG DER SEGLISA-PARAMETER.

Um optimale Parameter für den SEGLISA-Assay zu bestimmen, wurden Standardversuche unter Verwendung von mit Immunglobulin G des Menschen (HuIgG) beschichteten Mikrotiterplatten durchgeführt, um dafür spezifische Antikörper- Gold-Konjugate zu binden und anschließend unter Verwendung einer Reihe von Verstärkungsbedingungen eine Verstärkung zu erzielen.

Verfahren und Materialien:

Die Mikrotiterplatten stammten von Greiner Co., das Protein A-Gold-Konjugat und der Kit zur Silberverstärkung SE-100 von Sigma Chemical Co, wobei die Größe der Goldteilchen von 5, 10 bzw. 20 nm betrug. Das Anti-HuIgG-Gold-Konjugat (AUROPROBE GAHu G5) und die Kits zur Silberverstärkung IntenSE M und IntenSE BL waren von Janssen Life Science Products Ltd. Alle anderen Chemikalien stammten, falls nichts anderes angegeben, von Sigma Chemical Co. Die Chemikalien und Reagentien wurden bei 4 ºC aufbewahrt, mit Ausnahme des Protein A-Gold- Konjugats, das bei -20 ºC aufbewahrt wurde. Alle Versuche wurden zweifach durchgeführt, und die mittlere Absorption wurde herangezogen.

Beschichten der Mikrotiterplatten mit HuIgG:

Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurde mit gereinigtem Immunglobulin G des Menschen (HuIgG) beschichtet. 1 mg HuIgG wurde in 1 ml Beschichtungspuffer (1,59 g Na&sub2;CO&sub3;, 2,93 g NaHCO&sub3;, 0,2 g NaN&sub3;, mit entmineralisiertem Wasser auf 1 l aufgefüllt, pH-Wert auf 9,6 eingestellt) gelöst. Die Ausgangslösung mit 1mg/ml wurde weiter verdünnt, um die gewünschten HuIgG-Konzentrationen zu erhalten. Die Absorption der HuIgG-Lösung wurde bei 280 nm bestimmt. 200 µl der Lösung wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Platte wurde über Nacht bei 4 ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Absorption der HuIgG-Lösung in den Vertiefungen nochmals bei 280 nm bestimmt. Die Berechnung der Menge des an der Platte absorbierten HuIgG ergab einen Bereich von 200 bis 300 ng HuIgG pro Vertiefung. Die Platte wurde mit PBS + 1 % BSA (8 g NaCl, 0,2 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,9 g NaH&sub2;PO&sub4; 12H&sub2;O + BSA, mit entmineralisiertem Wasser auf 1 l aufgefüllt) dreimal gewaschen und anschließend 1 h mit 250 µl PBS + 1 % BSA pro Vertiefung bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurde die Platte nochmals dreimal mit PBS + 1 % BSA + 0,5 % Tween 20 (8 g NaCl, 0,29 KH&sub2;PO&sub4;, 2,9 g NaH&sub2;PO&sub4; 12H&sub2;O + 1 % BSA + 0,5 % Tween, mit entmineralisiertem Wasser auf 1 l aufgefüllt) gewaschen und getrocknet. Die Platte wurde anschließend sofort bei 4 ºC aufbewahrt.

SEGLISA:

50 µl des mit PBS + 1 % BSA + 0,5 % Tween verdünnten Protein A-Konjugats wurden in jede Vertiefung gegeben, worauf 20 min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Platte wurde anschließend dreimal mit PBS + 1 % BSA + 0,5 % Tween 20 gewaschen und dann getrocknet. 200 µl einer frisch angesetzten Silberverstärkerlösung (gleiche Volumina von Verstärker A und Initiator B) wurden in jede Vertiefung gegeben, worauf wieder 15 min stehengelassen wurde. Danach wurde der Verstärker mit entmineralisiertem Wasser ausgewaschen, und die Vertiefungen wurden sofort mit einem Photometer bei 520 nm vermessen.

Ergebnisse:

Um den SEGLISA-Assay zu optimieren, wurden verschiedene Parameter unter Anwendung von konstanten Werten für nicht untersuchte Parameter untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Figuren 14 bis 23 zusammengefaßt. Diese Ergebnisse liefern folgende Befunde:

Figur 14:

Zeigt Absorptionswerte für SEGLISA, die wie oben unter Verwendung verschiedener Verdünnungen des Goldkonjugats im Bereich von 1:10 bis 1:200 in PBS + 1 % BSA + 0,5 % Tween 20 durchgeführt wurden. Die Abbildung zeigt ein Plateau in einem Bereich von Verdünnungsfaktoren von 10 bis 50, wobei ersichtlich wird, daß ein Verdünnungsfaktor von 50 am wirksamsten ist.

Figur 15:

Zeigt Absorptionswerte bei Verwendung verschiedener Teilchengrößen des Golds im Konjugat, wobei ersichtlich ist, daß die Goldteilchen mit 5 nm die größte Absorption ergeben, wogegen Goldteilchen mit 20 nm so gut wie keine Absorption ergeben.

Figur 16:

Zeigt Absorptionswerte bei Anwendung verschiedener Inkubationszeiten für das Goldkonjugat im Bereich von 0 bis 60 min: 30 min erweisen sich als optimale Zeit.

Figur 17:

Zeigt Absorptionswerte unter Verwendung verschiedener Volumina der Goldkonjugatlösung im Bereich von 0 bis 100 µl. Ein Volumen von 5, 10 bzw. 20 µl ist nicht ausreichend, um den gesamten Boden der flachen Mikrotiterplatte zu bedecken; ein Volumen von 50 und 100 µl zeigt hohe Absorption, wobei die Vertiefungen vollständig bedeckt sind und wodurch ein gleichmäßiges Konjugat und nachher auch eine gleichmäßige Silberabscheidung gebildet werden.

Figur 18:

Zeigt den Einfluß einer Variation der Menge an Gelatine in der Konjugatlösung (als Kolloidstabilisator); es konnte kein signifikanter Unterschied für Gelatinezugaben im Bereich von 0 bis 0,5 % festgestellt werden.

Figur 19:

Zeigt die erhaltene Absorption unter Verwendung äquivalenter SEGLISA-Proben und unter Verwendung von drei verschiedenen Kits zur Silberverstärkung; IntenSE M zeigte die größte Absorption mit einer spiegelnden schwarzen Abscheidung. Der Sigma-Kit ergab eine spiegelnde schwarze Abscheidung, die im Falle der Stabilisierung mit Hydrochinon und Gummi arabicum wie in den anderen Beispielen zufriedenstellend war.

Figur 20:

Zeigt den Einfluß der Inkubationszeit mit dem Silberverstärker für jeden Kit; 20 bis 30 Minuten ergeben eine ausreichend hohe Absorption, mit der gearbeitet werden kann, bevor Selbstabscheidung auftritt.

Figur 21:

Zeigt eine stetige Erhöhung der Absorption, wenn das Volumen des Verstärkers auf bis zu 100 µl erhöht wird.

BEISPIEL 4. GEEIGNETE, IM LABOR HERGESTELLTE SILBERVERSTÄRKERREAGENTIEN.

Um eine kommerziell nicht erhältliche, im Labor herstellbare alternative Silberverstärkerlösung anzugeben, wurden Versuche mit der HIV-Immunogold-Prozedur durchgeführt, und es wurde festgestellt, daß folgender Reagentienkit geeignet ist, der vier Reagenslösungen enthält:
(1) Lösung A: Gummi arabicum als Schutzkolloid, 50 g in 100 ml destilliertem Wasser,
(2) Lösung B: Citratpuffer, 23,5 g Tri-Natriumcitrat 2H&sub2;O und 16,36 g wasserfreie Citronensäure in 100 ml destilliertem Wasser,
(3) Lösung C: Reduktionsmittel, 0,85 g Hydrochinon in 15 ml destilliertem Wasser (erst kurz vor Verwendung hergestellt), und
(4) Lösung D: 0,11 g Silberlactat in 15 ml destilliertem Wasser (erst kurz vor Verwendung hergestellt).
Die vier Lösungen werden vor der Verwendung zusammengemischt und anschließend im Dunkeln aufbewahrt. Der Anteil jeder Lösung in der endgültigen Verstärkerlösung war: Lösung A - 7,5 ml mit destilliertem Wasser auf 60 ml aufgefüllt; Lösung B - 10 ml; Lösung C - 15 ml; Lösung D - 15 ml. 100 µl Lösungsgemisch wurden im Dunkeln in jede Vertiefung gegeben, worauf 15 min inkubiert und dann dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen wurde.

Claims

1. Verfahren, um Immunogoldassays, die spezifisch bindende, auf festen Substraten immobilisierte Agentien verwenden und die mit Vollblut durchgeführt werden, bei visueller und/oder photometrischer und/oder colorimetrischer Auswertung in ihrer Färbung zu verstärken, das folgende Schritte umfaßt:

Inkontaktbringen der Endproben aus dem Immunogoldassay mit einer Silberionen enthaltenden Lösung, wobei Silber auf mindestens einem Teil des Goldes abgeschieden wird, und

anschließend Korrelieren des Vorhandenseins und/oder der Menge des abgeschiedenen Silbers mit dem Vorhandensein und/oder der Menge der zu analysierenden Substanz.

2. Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz in Vollblut, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Immobilisierung eines spezifisch bindenden Agens, mit dem die zu analysierende Substanz durch eine spezifische Bindung kombiniert, auf einem festen Substrat,

(b) Inkontaktbringen des immobilisierten spezifisch bindenden Agens mit einer zu untersuchenden Vollblutprobe,

(c) Inkontaktbringen des immobilisierten spezifisch bindenden Agens aus Schritt (b) mit einem zweiten bindenden Agens, das eine Bindung mit der spezifisch kombinierten zu analysierenden Substanz eingehen kann und an das kolloidale Goldteilchen gebunden wurden,

(d) Inkontaktbringen des immobilisierten spezifisch bindenden Agens aus Schritt (c) zu einer Silberionen enthaltenden Lösung, wobei sich das Silber auf mindestens einem Teil des Goldes abscheidet, das an einen gebundenen zweiten bindenden Reagens gebunden ist, und

(e) Korrelation des Vorhandenseins und/oder der Menge des abgeschiedenen Silbers mit dem Vorhandensein und/oder der Menge der zu analysierenden Substanz im Vollblut.

3. Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz in Vollblut, das folgende Schritte umfaßt:

(b) Inkontaktbringen des spezifisich bindenden Agens mit einem Gemisch aus Vollblut und einer Lösung, die einen Anteil der zu analysierenden Substanz oder eine ihr analoge Substanz, die spezifisch an das spezifisch bindende Agens binden und an die kolloidale Goldteilchen gebunden wurden, enthält,

(c) Inkontaktbringen des immobilisierten spezifisch bindenden Agens aus Schritt (b) mit einer Silberionen enthaltenden Lösung, wobei sich das Silber auf mindestens einen Teil des Goldes abscheidet, das über eine markierte zu analysierende Substanz oder eine ihr analoge Substanz an das bindende Agens gebunden ist, und

(d) Korrelation des Vorhandenseins und/oder der Menge von abgeschiedenem Silber mit dem Vorhandensein und/oder der Menge der zu analysierenden Substanz im Vollblut.

4. Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz in Vollblut, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Immobilisierung einer zu analysierenden Substanz, mit der ein spezifisch bindendes Agens über eine spezifische Bindung kombiniert, auf einem festen Substrat,

(b) Inkontaktbringen der immobilisierten zu analysierenden Substanz zu einem Gemisch aus dem zu analysierenden Vollblut und dem spezifisch bindenden Agens, mit dem die Substanz durch eine spezifische Bindung kombiniert,

(c) Inkontaktbringen der immobilisierten zu analysierenden Substanz aus Schritt (b) mit einem zweiten bindenden Agens, das an das spezifisch kombinierte spezifisch bindende Agens gebunden werden kann und an das kolloidale Goldteilchen gebunden worden sind,

(d) Inkontaktbringen der immobilisierten zu analysierenden Substanz aus Schritt (c) mit einer Silberionen enthaltenden Lösung, wobei Silber sich auf mindestens einem Teil des Goldes abscheidet, das an ein gebundenes zweites bindehdes Agens gebunden ist, und

(e) Korrelation des Vorhandenseins und/oder der Menge Anteils des abgeschiedenen Silbers mit dem Vorhandensein und/oder der Menge der zu analysierenden Substanz im Vollblut.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die zu analysierende Substanz ein Antikörper, ein Protein, ein Virus, ein Hormon, ein Arzneimittel, eine Nucleinsäure oder ein Polysaccharid ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zu analysierende Substanz ein für HTLV-I, HIV, Hepatitis, Masern, Windpocken, Leukämie oder Rubella spezifisches Immunglobulin ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zu analysierende Substanz ein spezifischer Antikörper ist und das immobilisierte bindende Agens ein Antigen ist, für das der Antikörper spezifisch ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, 4 oder 5, wobei die zu analysierende Substanz ein Arzneimittel ist und das verwendete spezifisch bindende Agens ein dafür spezifischer Antikörper ist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immobilisierte spezifisch bindende Agens oder die immobilisierte zu analysierende Substanz in Form einer Beschichtung auf einer Mikrotiterplatte, einem Streifen mit Mikrovertiefungen oder einer porösen Membran vorliegen.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mit Gold markierte bindende Agens ein Antikörper ist, der gegen IgA, IgG, IgD oder IgM-Immunglobuline des Menschen, der Ratte, der Maus, des Meerschweinchens oder des Kaninchens gerichtet ist.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Silberionen enthaltende Lösung Silberlactat, Silbercitrat, Silbernitrat oder Silberchlorid als Reagentien enthält.

12. Verfahren nach Anspruche 11, wobei die Silberionenkonzentration in der Lösung in einem Bereich von 0,1 bis 1000 mM liegt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Silberionenkonzentration in der Lösung in einem Bereich von 1 bis 100 mM liegt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Silberionenkonzentration in der Lösung in einem Bereich von 2 bis 20 mM liegt.

15. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Silberionen enthaltende Lösung ferner ein Stabilisierungsmittel und/oder einen Verzögerer enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Stabilisierungsmittel ein Reduktionsmittel ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Reduktionsmittel ein Hydrochinon ist.

18. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Verzögerer Gummi arabicum ist.

19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Hydrochinon in einer Konzentration von 1 bis 0,01 Gew.-% eingesetzt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Gummi arabicum in einer Konzentration von 1 bis 0,01 Gew.-% eingesetzt wird.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das kolloidale Gold eine Teilchengröße von 10 nm oder weniger aufweist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das kolloidale Gold eine Teilchengröße von 5 nm aufweist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das mit Gold markierte bindende Agens mit den immobilisierten kombinierten nichtmarkierten Agentien 10 bis 60 min inkubiert wird.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das mit Gold markierte bindende Agens mit den immobilisierten kombinierten nichtmarkierten Agentien für einen Zeitraum von 20 bis 40 min inkubiert wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das mit Gold markierte bindende Agens mit den immobilisierten kombinierten nichtmarkierten Agentien etwa 30 min inkubiert wird.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Silberlösung mit dem fertig durchgeführten Immunogoldassay 10 bis 60 min inkubiert wird.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Silberlösung mit dem fertig durchgeführten Immunogoldassay 20 bis 30 min inkubiert wird.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die immobilisierten Agentien zwischen jedem Inkontaktbringen gewaschen werden.

29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Waschen unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder entmineralisiertem Wasser durchgeführt wird.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, wobei die Menge der zu analysierender Substanz durch Ermittlung der Absorption der Oberfläche des mit Silber verstärkten fertig durchgeführten Immunogoldassays bei einer bestimmten Wellenlänge und durch anschließende Korrelation mit der Absorption einer standardisierten Menge der zu analysierenden Substanz bestimmt wird.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 5, wobei das Vorhandensein einer Silberabscheidung das Vorhandensein der zu analysierenden Substanz im Vollblut anzeigt.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4 und 5, wobei die Abwesenheit einer Silberabscheidung das Vorhandensein der zu analysierenden Substanz im Vollblut anzeigt.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, wobei die zu analysierende Substanz ein Antikörper gegen HIV oder Rubella, Theophyllin oder menschliches Wachstumshormon ist.

34. Kit zur Bestimmung von zu analysierenden Substanzen in Vollblut nach dem Verfahren von Anspruch 2, der enthält:

(a) ein auf einem festen Substrat immobilisiertes spezifisch bindendes Agens, mit dem die zu analysierende Substanz über eine spezifische Bindung kombiniert,

(b) ein zweites bindendes Agens, das eine Bindung mit der kombinierten zu analysierenden Substanz eingehen kann und an das kolloidale Goldteilchen gebunden wurden, und

(c) eine Silber enthaltende Verstärkerlösung, aus der sich Silber auf Goldteilchen abscheidet.

35. Kit zur Bestimmung von zu analysierenden Substanzen in Vollblut nach dem Verfahren von Anspruch 3, der enthält:

(b) eine zu analysierende Substanz oder eine zu ihr analoge spezifisch bindende Substanz, an die kolloidale Goldteilchen gebunden wurden, und

36. Kit zur Bestimmung von zu analysierenden Substanzen in Vollblut nach dem Verfahren von Anspruch 4, der enthält:

(a) eine auf einem festen Substrat immobilisierte zu analysierende Substanz, mit der ein spezifisch bindendes Agens über eine spezifische Bindung kombiniert,

(b) das spezifisch bindende Agens,

(c) ein zweites bindendes Agens, an das kolloidale Goldteilchen gebunden wurden und das sich an das spezifisch bindende Agens binden kann, wenn dieses an die immobilisierte zu analysierende Substanz gebunden ist, und

(d) eine Silber enthaltenden Verstärkerlösung, aus der sich Silber auf Goldteilchen abscheidet.

37. Kit nach einem der Ansprüche 34 bis 36, der ferner eine Pufferlösung und eine Lösung aus entmineralisiertem Wasser enthält.

38. Kit nach einem der Ansprüche 34 bis 37, wobei die Silberionen enthaltende Lösung ein lösliches Silbersalz enthält.

39. Kit nach Anspruch 38, wobei die Silberionen enthaltende Lösung ein lösliches organisches Silbersalz enthält.

40. Kit nach einem der Ansprüche 34 bis 39, wobei ferner ein Stabilisierungsmittel und/oder ein Verzögerer für die Silberionen enthaltende Lösung enthalten sind.

41. Kit nach Anspruch 40, wobei das Stabilisierungsmittel ein Reduktionsmittel ist.

42. Kit nach Anspruch 41, wobei das Reduktionsmittel ein Hydrochinon ist.

43. Kit nach Anspruch 40, wobei der Verzögerer Gummi arabicum umfaßt.

44. Kit nach einem der Ansprüche 34 bis 43, wobei die Silberionen enthaltende Lösung Silberlactat, Silbercitrat, Silbernitrat oder Silberchlorid enthält.

45. Kit nach einem der Ansprüche 34 bis 44, der ein spezifisch bindendes Agens für einen HIV- oder Rubella-Antikörper oder ein spezifisch bindendes Agens für Theophyllin oder menschliches Wachstumshormon enthält.