CN1164949C - 用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1164949C
CN1164949C CNB011265000A CN01126500A CN1164949C CN 1164949 C CN1164949 C CN 1164949C CN B011265000 A CNB011265000 A CN B011265000A CN 01126500 A CN01126500 A CN 01126500A CN 1164949 C CN1164949 C CN 1164949C
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
colloid gold
preparation
room temperature
syphilis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB011265000A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1405564A (zh
Inventor
胡赓熙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HUZHOU SHUKANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
SHUKANG BIO-TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CNB011265000A priority Critical patent/CN1164949C/zh
Application filed by SHUKANG BIO-TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI filed Critical SHUKANG BIO-TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI
Priority to DE60109311T priority patent/DE60109311T2/de
Priority to PCT/CN2001/001519 priority patent/WO2003016914A1/zh
Priority to EP01274437A priority patent/EP1327885B1/en
Priority to JP2003521370A priority patent/JP3853317B2/ja
Priority to CA002422942A priority patent/CA2422942A1/en
Priority to US10/393,555 priority patent/US20030165970A1/en
Publication of CN1405564A publication Critical patent/CN1405564A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1164949C publication Critical patent/CN1164949C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/571—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses for venereal disease, e.g. syphilis, gonorrhoea
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B

Abstract

本发明涉及一种用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法。该试剂盒由免疫渗滤金标法联检反应装置、缓冲液和胶体金标记物混合液组成，其中在免疫渗滤金标法联检反应装置中的硝酸纤维素膜上，点制有HBsAg单抗、HCV抗原、梅毒抗原、HIV抗原四种蛋白和标记物羊抗鼠IgG抗体。本发明还公开了该检测试剂盒的制备方法。本发明试剂盒利用胶体金免疫渗滤方法的原理，在同一载体上实现了对乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病传染性疾病同时检测，操作简便、迅速、准确，可适用于各种血样的多病种检测，特别适用于大规模血液检查，也为传染性疾病的检测提供了新思路。

Description

用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法。
背景技术
乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒和艾滋病是四种常见的传染性疾病。据2000年卫生部的统计年报资料显示，此四种疾病的发病数约占传染病总发病数的27.57％，给社会和人民生活带来了极大的危害。
乙型肝炎是可能由药物、毒素和病毒等引起的炎症。在我国，约占人口总数10％-15％的人群为乙型肝炎病毒(HBV)的感染者。HBV可通过输血、血浆、血制品或使用被病毒污染的注射器针头、针灸用针、采血用具和血液透析等发生感染。其中通过输血这一途径感染因其发病率高，发病时间短，受累人群广而受到了极大的关注。
丙型肝炎的传染源主要为急性临床型病人和无症状的亚临床病人，慢性病人和病毒携带者。一般病人发病前12天，其血液即有感染性，并可带毒12年以上。丙型肝炎的传染主要通过输血而引起，在大多数发达国家，丙型肝炎是输血后感染的肝炎中最常见的一种类型，国外30-90％输血后感染的肝炎为丙型肝炎，我国输血后感染的肝炎中丙型肝炎占1/3。
梅毒病人是梅毒螺旋体唯一的传染源。性接触传染占95％。输血时如供血者为梅毒患者可传染于受血者。献血者如患梅毒并处于梅毒螺旋体血症阶段，可以传播梅毒。梅毒螺旋体在体外生活能力低，4℃时生存48-72小时，40℃无传染力，100℃立即死亡，近年来我国性病增加，因此对预防输血传播梅毒应给予高度重视。
HIV病毒是艾滋病的病原体，一般感染源以血液、精液、阴道分泌物、母乳等为主。如果被输入带HIV的血液，感染HIV的可能性估计超过90％(相反，一次性交的风险为百分之几到小于1％)，一次输血带入HIV病毒量是非常大的，通过这种方式感染后，很快就会发展为AIDS，平均时间是3-5年(儿童约为2年)。
可见，对血液和血液制品进行包括HIV，梅毒，HBV，HCV在内的所有能通过血液传播的病毒的严格检查是非常必要的。我国卫生部早在一九九八年发布的《献血者健康检查标准》就规定了9项必检项目，其中包括乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗体(HCV抗体)、艾滋病病毒抗体(HIV抗体)和梅毒抗体。目前，对于梅毒的检测，一般采用RPR法(快速血浆反应素试验)或TRUST法(梅毒血清学试验)，而对于HIV、HBV、HCV的检测，一般采用ELISA方法(酶联免疫吸附分析)，该方法一次检测需血清400μl，耗时1-2小时。由于目前对于献血者所献血液没有一种快速、彻底、覆盖多种疾病的检验方法，导致很多人在接受输血时感染肝炎、艾滋病和梅毒等传染病，严重地影响了受血者的身心健康和社会的安定。
胶体金免疫渗滤方法是从酶联免疫结合方法(ELISA)的基础上发展起来的，最初应用的结合物是酶标记的，称为酶免疫渗滤试验。90年代初发展了以胶体金为标记物的渗滤试验又称为金免疫渗滤试验(IGFA)。
胶体金免疫渗滤方法的原理是以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性和毛细管作用，使抗原与抗体的反应、洗涤在一个特殊的渗滤装置上，以液体渗滤过膜的方式迅速完成。
由于此方法简单、快速、除商品试剂外不需任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果。目前已在临床检测中取得了广泛的应用。胶体金免疫渗滤方法可应用于免疫学检测的几乎所有方面，但主要用于检测正常体液中不存在的抗原性物质(例如诊断传染病中的抗原或抗体)，以及正常含量极低而特殊情况下异常升高的物质(如HCG、甲胎蛋白等)。近年来由于试剂原料的精选和制备技术的改进，应用范围更加广阔。但目前尚未有将胶体金免疫渗滤法用于多种传染性疾病相关抗原、抗体的同时检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是利用胶体金免疫渗滤原理同时对多种传染性疾病进行检测，提供一种反应灵敏、准确，迅速的多用途检测试剂盒。
本发明公开的用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒由免疫渗滤金标法(斑点金免疫渗滤法)联检反应装置、缓冲液、胶体金标记物混合液组成；
其中所述的免疫渗滤金标法联检反应装置中的硝酸纤维素膜上，相距一定距离点制有HBsAg单抗(鼠抗人)、HCV抗原、梅毒抗原、HIV抗原四种蛋白和质控物羊抗鼠IgG抗体，抗原的点样量为0.3-3μl；
其中所述的胶体金标记物混合液是四种胶体金标记物的混合溶液，包括HBsAg单抗(鼠抗人)、HCV抗原、梅毒抗原和HIV抗原的胶体金标记物；HBsAg的单抗(鼠抗人)被胶体金标记的蛋白浓度为20-50μg/ml，HCV抗原被胶体金标记的蛋白浓度为90-120μg/ml，梅毒抗原被胶体金标记的蛋白浓度为90-120μg/ml，HIV抗原被胶体金标记的蛋白浓度为80-120μg/ml，它们依次按体积比为1∶1∶1.2-2.5∶1.2-2.5的比例相混合；胶体金颗粒大小为20-30nm；
其中所述的缓冲液为含有0.03-0.05％Tween 20的PH7.2-8.8的PBS(由磷酸二氢钾或磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制而成的缓冲液)缓冲液。
本发明所述的梅毒抗原可以为单一的梅毒抗原，也可以是多种梅毒抗原的混合物；HIV抗原可以是HIV-1(1型艾滋病病毒)抗原、HIV-2(2型艾滋病病毒)抗原或HIV-1抗原和HIV-2抗原的混合物。
本发明所要解决的另一技术问题是提供上述检测试剂盒的制备方法。
本发明公开的用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒的制备方法包括下列步骤：
一、制备免疫渗滤金标法联检反应装置
1.膜上加样物的制备
将HBsAg单抗(鼠抗人)置于0.02M，pH8.0的PBS中，4℃透析过夜。透析后的鼠抗人HBsAg单抗用0.02M，pH8.0的PBS稀释至0.2-2.0mg/ml，4℃保存备用。
将HCV抗原置于0.02M，pH8.0的PBS中，4℃透析过夜。透析后的HCV抗原用0.02M，pH8.0的PBS稀释至0.2-2.0mg/ml，4℃保存备用。
将梅毒抗原置于0.02M，pH8.0的PBS中，4℃透析过夜。透析后的梅毒抗原用0.02M，pH8.0的PBS稀释至0.2-2.0mg/ml，4℃保存备用。
将HIV抗原置于0.02M，pH8.0的PBS中，4℃透析过夜。透析后的HIV抗原用0.02M，pH8.0的PBS稀释至0.2-2.0mg/ml，4℃保存备用。
将羊抗鼠IgG抗体置于0.02M，pH8.0的PBS中，4℃透析过夜。透析后的羊抗鼠IgG抗体用0.02M，pH8.0的PBS稀释至0.2-2.0mg/ml，4℃保存备用。
2.在膜上加样
分别吸取上述HBsAg单抗(鼠抗人)、HCV抗原、梅毒抗原、HIV抗原，仔细地点于硝酸纤维素膜的特定位点上，点样体积为0.3-3μl/点。
另吸取羊抗鼠IgG抗体，于同一硝酸纤维素膜上远离上述各点样位置的地方作一标记，此标记可为一点、一条线或其他符号。
3.膜的后处理
将上述硝酸纤维膜(NC)，置37℃烘箱内30分钟。取出后室温放置20分钟以上。然后将其浸没于37℃的封闭液中20分钟。取出后，在室温下置于洗涤液中振荡洗涤5-10分钟。更换洗涤液，重复上述振荡洗涤过程。取出后，室温下晾干。4℃干燥环境中保存备用。
其中所述的封闭液为含有0.01-0.03％Tween20的0.05M pH7.2-8.0的PBS缓冲液；其中所述的洗涤液为含有0.03-0.05％Tween20的0.01M pH7.2-8.0的PBS缓冲液。
4.装置的装配
取两层吸水滤纸垫于上述硝酸纤维素膜下方，再将滤纸与膜一齐装入并固定于塑料反应装置盒中。
二、制备胶体金标记物混合液
1.制备胶体金颗粒
取0.01％的氯金酸水溶液，加热煮沸，快速加入1％枸橼酸三钠溶液，继续煮沸5分钟，使得胶体金的大小为20-30nm。
2.制备胶体金标记物
2.1.HBsAg单抗(鼠抗人)的胶体金标记物的制备
取颗粒大小为20-30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入HBsAg单抗(鼠抗人)，使其最终浓度为20-50μg/ml。室温下搅拌30分钟。加入10％BSA溶液使单抗终浓度为0.2-1.0％，室温下搅拌5分钟。加入10％PEG20000溶液使单抗终浓度为0.1-0.5％，室温下搅拌5分钟。12000-15000r/min离心60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用。
2.2.HCV抗原的胶体金标记物的制备
取颗粒大小为20-30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入HCV抗原，使其终浓度为90-120μg/ml。室温下搅拌30分钟。加入10％BSA溶液使抗原终浓度为0.2-1.0％，室温下搅拌5分钟。加入10％PEG20000溶液使抗原终浓度为0.1-0.5％，室温下搅拌5分钟。12000-15000r/min离心60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用。
2.3.梅毒抗原的胶体金标记物的制备
取颗粒大小为20-30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入梅毒抗原使抗原终浓度为90-120μg/ml。室温下搅拌30分钟。加入10％BSA溶液使抗原终浓度为0.2-1.0％，室温下搅拌5分钟。加入10％PEG20000溶液使抗原终浓度为0.1--0.5％，室温下搅拌5分钟。12000-15000r/min离心60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用。
当胶体金标记液中的梅毒抗原指多个梅毒抗原的混合物时，各个梅毒抗原的胶体金标记物要分别制备，混合，保存备用。
2.4 HIV抗原的胶体金标记物的制备
取20-30nm颗粒的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入HIV抗原使抗原终浓度为80-120μg/ml。室温下搅拌30分钟。加入10％BSA溶液使抗原终浓度为0.2-1.0％，室温下搅拌5分钟。加入10％PEG20000溶液使抗原终浓度为0.1--0.5％，室温下搅拌5分钟。12000-15000r/min离心60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用。
当胶体金标记液中的HIV抗原指多个HIV抗原的混合物时，各个HIV抗原的胶体金标记物要分别制备，混合，保存备用。
3.制备胶体金标记物混合液
将分别配制的胶体金标记物按体积比为HBsAg的单抗(鼠抗人)胶体金标记液：HCV抗原胶体金标记液：梅毒抗原胶体金标液：HIV抗原胶体金标记液＝1∶1∶1.2-2.5∶1.2-2.5的比例混合完全。
三、缓冲液的制备
在pH7.2-8.8的PBS中加入Tween20，使Tween20的浓度为0.03-0.05％。
本发明所要解决的再一技术问题是公开上述检测试剂盒在同时检测乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病传染性疾病中的应用。
本发明所述试剂盒的检测方法如下：
1.取出免疫渗滤金标法联检反应装置，水平置于桌面；
2.在免疫渗滤金标法联检反应装置孔内加入两滴缓冲液，湿润表面；
3.加入待测血清50ul，等其渗滤入膜内；
4.加入三滴缓冲液，待其渗入后加入两滴胶体金标记液；
5.加入三滴缓冲液；
6.1分钟后观察相应位置有无红色斑点，有则认为该位置对应的疾病病毒在体内呈阳性，没有则认为该位置对应的疾病病毒在体内呈阴性。
若待测血清中有HBsAg、HCV抗体、梅毒抗体、HIV抗体中的一种或数种，当硝酸纤维素膜与血清接触时，膜上的抗原(或抗体)会与血清中的对应抗体(或抗原)发生反应，然后再与相应的胶体金标记物进行反应，从而显色。所以，从显色的情况可以判断出待测病人感染了何种病毒。由于羊抗鼠IgG抗体不会与人血清内的抗体发生反应，而在胶体金标记液中含有的HBsAg单抗(鼠抗人)可与羊抗鼠IgG抗体发生反应，对应于羊抗鼠IgG抗体的位置就会显色，被肉眼识别出；当试剂盒由于某组分的质量问题无法进行检测实验时，膜上对应于羊抗鼠IgG抗体的位置就不会显色，所以，通过羊抗鼠IgG抗体可对试剂盒进行质量控制。
本发明的检测试剂盒利用了胶体金免疫渗滤的原理，使多种传染性疾病的相关抗原、抗体在同一渗滤装置(硝酸纤维素膜)上进行反应、洗涤，通过肉眼观察各斑点的显色情况，对多种传染性疾病进行检测。
本发明试剂盒与传统的金标试剂盒、RPR试剂盒、TRUST试剂盒相比，其优点在于：
(1)检测多疾病
在同一装置内同时进行四种传染性疾病的检测。
(2)同时检测多个抗原和抗体
在同一装置内既可以检测多个抗体，也可以同时检测多个抗原，实现了多种蛋白检测条件的一体化。
本发明试剂盒与ELISA试剂盒相比，其优点在于：
(1)检测多疾病
在同一装置内可进行四种传染性疾病的检测。
(2)同时检测多个抗原和抗体
在同一装置内既可以检测多个抗体，也可以同时检测多个抗原，实现了多种蛋白检测条件的一体化。
(3)反应时间短
整个实验可在3-5分钟内完成，适合大规模的快速血检。该试剂盒只有2步检测步骤，即加样、反应，均通过渗滤完成，检测全过程仅需数分钟，但敏感度却与需1-2小时完成的ELISA实验相仿。
(4)采血量小
需要的血清量仅50ul，只采集指血、耳血即可。而ELISA法测一个指标就需要100ul血清，则测试四项指标需要400ul左右的血清。所以本试剂盒对于儿童、新生儿的使用十分方便，而ELISA方法取样只能采静脉，对新生儿十分痛苦。
(5)检测结果不受仪器的影响；不受反应环境的影响。
(6)加入胶体金标记物即可显色，操作步骤简单，而且试剂可在室温长期保存。
本发明试剂盒利用胶体金免疫渗滤方法的原理，在同一载体上实现对多种抗原和抗体的同时检测，操作简便、迅速、准确，可适用于各种血样的多病种检测，特别适用于大规模血液检查，也为传染性疾病的检测提供了新思路。
附图说明
图1  硝酸纤维素膜上点样示意图；
其中1、2、3、4分别表示点样位置。“C”的两点之间为羊抗鼠IgG抗体点样位置。
图2  1号血清检测显示示意图，检测结果均为阴性；
图3  2号血清检测显示示意图，检测结果丙型肝炎病毒抗体为阳性；
图4  3号血清检测显示示意图，检测结果梅毒抗体，艾滋病HIV-1&2抗体为阳性；
图5  4号血清检测显示示意图，检测结果梅毒抗体，艾滋病HIV-1&2抗体，乙型肝炎病毒表面抗原为阳性；
图2-5中C-C代表羊抗鼠IgG抗体的横线为阳性。
具体实施方式
一、试剂盒选用抗体及材料
在实施本发明的优选方法中，HBsAg单抗(鼠抗人)S1、HBsAg单抗(鼠抗人)S2由倍尔乐生物科技有限公司提供；HCV抗原、TP47梅毒抗原、TP15梅毒抗原、TP47/TP15梅毒混合抗原、HIV-1抗原、HIV-2抗原、HIV-1/2混合抗原由美国BioDesign公司提供；硝酸纤维素膜由S&S公司提供；被测血清由上海市疾病控制中心提供。
二、免疫渗滤金标法联检反应装置的制备方法如下：
(1)将HBsAg单抗(鼠抗人)S2置于0.02M，pH8.0的PBS中，4℃透析过夜。透析后的鼠抗人HBsAg单抗S2用0.02M，pH8.0的PBS稀释至0.5mg/ml，4℃保存备用。
(2)将HCV抗原置于0.02M，pH8.0的PBS中，4℃透析过夜。透析后的HCV抗原用0.02M，pH8.0的PBS稀释至0.4mg/ml，4℃保存备用。
(3)将TP47/TP15梅毒混合抗原置于0.02M，pH8.0的PBS中，4℃透析过夜。透析后的TP47/TP15混合抗原用0.02M，pH8.0的PBS稀释至0.5mg/ml，4℃保存备用。
(4)将HIV-1/2混合抗原置于0.02M，pH8.0的PBS中，4℃透析过夜。透析后的HIV-1/2混合抗原用0.02M，pH8.0的PBS稀释至0.6mg/ml，4℃保存备用。
(5)羊抗鼠IgG抗体置于0.02M，pH8.0的PBS中，4℃透析过夜。透析后的羊抗鼠IgG抗体用0.02M，pH8.0的PBS稀释至0.6mg/ml，4℃保存备用。
(6)如附图1所示，在硝酸纤维素膜上的1、2、3、4位置处，分别用微量加样器点上四种蛋白：TP47/TP15梅毒混合抗原、HIV-1/2混合抗原、HBsAg单抗(鼠抗人)S2、HCV抗原，每点的点样体积为1.0μl；在硝酸纤维素膜上标有“C”的两点之间，用0.2mm绘图笔吸取羊抗鼠IgG抗体画一横线。
(7)将此硝酸纤维素膜置于37℃烘箱内30分钟，取出后室温放置25分钟。然后将其浸没于37℃的封闭液中20分钟。取出后，在室温下置于洗涤液中振荡洗涤5分钟，重复洗涤数次。室温晾干。
(8)取两层吸水滤纸垫于上述硝酸纤维素膜下方，再将滤纸与膜一齐装入并固定于塑料反应装置盒中。
三、缓冲液是由pH为7.8，0.10M的PBS和0.10％Tween20等体积混合而成的溶液。
四、胶体金标记液由HBsAg单抗(鼠抗人)S1的胶体金标记物、HCV抗原的胶体金标记物、TP47/TP15梅毒混合抗原的胶体金标记物、HIV-1/2混合抗原的胶体金标记物按照体积比为1∶1∶1.2-2.5∶1.2-2.5的比例混合而成。各个胶体金标记物所用胶体金的颗粒大小均为30nm。胶体金标记物的制备方法如下：
(1)HBsAg单抗(鼠抗人)S1的胶体金标记物的制备
取颗粒大小为30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入HBsAg单抗(鼠抗人)S1，使其最终浓度为20μg/ml。室温下搅拌30分钟。加入10％BSA溶液使单抗终浓度为0.6％，室温下搅拌5分钟。加入10％PEG20000溶液使单抗终浓度为0.2％，室温下搅拌5分钟。12000-15000r/min离心60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用。
(2)胶体金-HCV抗原的胶体金标记物的制备
取颗粒大小为30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入HCV抗原，使其终浓度为90μg/ml。室温下搅拌30分钟。加入10％BSA溶液使抗原终浓度为0.6％，室温下搅拌5分钟。加入10％PEG20000溶液使抗原终浓度为0.2％，室温下搅拌5分钟。12000-15000r/min离心60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用。
(3)TP47/15梅毒混合抗原的胶体金标记物的制备
取颗粒大小为30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入TP47梅毒抗原使抗原终浓度为90μg/ml。室温下搅拌30分钟。加入10％BSA溶液使抗原终浓度为0.6％，室温下搅拌5分钟。加入10％PEG20000溶液使抗原终浓度为0.2％，室温下搅拌5分钟。12000-15000r/min离心60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用。
TP15抗原的胶体金标记物制备方法同TP47。
将TP47抗原和TP15抗原的胶体金标记物等体积混合，4℃保存备用。
(4)HIV-1/2抗原的胶体金标记物的制备
取30nm颗粒的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入HIV-1抗原使抗原终浓度为100μg/ml。室温下搅拌30分钟。加入10％BSA溶液使抗原终浓度为0.6％，室温下搅拌5分钟。加入10％PEG20000溶液使抗原终浓度为0.2％，室温下搅拌5分钟。12000-15000r/min离心60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶于保存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用。
HIV-2抗原的胶体金标记物制备方法同HIV-1。
将HIV-1抗原和HIV-2抗原的胶体金标记物等体积混合，4℃保存备用。
当胶体金标记液中的HIV抗原指多个HIV抗原的混合物时，各个HIV抗原的胶体金标记物要分别制备，再按照一定倍数稀释、混合，保存备用。
用该试剂盒来测试不同的血清，医院提供的资料显示，1号血清的提供者未患上述四种传染性疾病中任一种；2号血清的提供者仅患有丙型肝炎；3号血清的提供者患有艾滋病和梅毒；4号血清的提供者患有乙型肝炎、艾滋病和梅毒。检测结果依次见附图2、附图3、附图4、附图5。

Claims (5)

1、一种用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒，该试剂盒由斑点金免疫渗滤法联检反应装置、缓冲液和胶体金标记物混合液组成，其特征在于：
(1)其中所述的斑点金免疫渗滤法联检反应装置是由硝酸纤维素膜和垫于膜下的两层吸水滤纸组成，在硝酸纤维素膜上，相距一定距离点制有HBsAg单抗、HCV抗原、梅毒抗原、HIV抗原四种蛋白和质控物羊抗鼠IgG抗体；
(2)其中所述的胶体金标记物混合液是四种胶体金标记物的混合溶液，包括HBsAg单抗、HCV抗原、梅毒抗原和HIV抗原的胶体金标记物，且胶体金标记液中HBsAg的单抗被胶体金标记的蛋白浓度为20-50μg/ml，HCV抗原被胶体金标记的蛋白浓度为90-120μg/ml，梅毒抗原被胶体金标记的蛋白浓度为90-120μg/ml，HIV抗原被胶体金标记的蛋白浓度为80-120μg/ml，它们依次按体积比为1∶1∶1.2-2.5∶1.2-2.5的比例相混合；胶体金颗粒大小为20-30nm。
2、一种如权利要求1或2所述的用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒，其特征在于其中所述的梅毒抗原为单一的梅毒抗原或是多种梅毒抗原的混合物；HIV抗原是HIV-1抗原、HIV-2抗原或HIV-1抗原和HIV-2抗原的混合物。
3、一种如权利要求1所述的用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒，其特征在于其中所述的缓冲液为含有0.03-0.05％Tween 20的PH7.2-8.8的PBS缓冲液。
4、一种如权利要求1所述的用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒的制备方法，其特征在于试剂盒的制备方法包括下列步骤：
(一)斑点金免疫渗滤法联检反应装置的制备
(1)膜上加样物的制备
将HBsAg单抗、HCV抗原、梅毒抗原、HIV抗原分别用0.02M，pH8.0的PBS，4℃透析过夜；透析后的各蛋白分别用0.02M，pH8.0的PBS稀释至0.2-1.0mg/ml；
(2)在膜上加样
分别吸取上述HBsAg单抗、HCV抗原、梅毒抗原、HIV抗原，点于硝酸纤维素膜特定的位点上，每点0.3-3μl；另吸取羊抗鼠IgG抗体，于同一硝酸纤维素膜上远离上述各点样位置的地方作一标记，此标记可为一点、一条线或其他符号；
(3)膜的后处理
将此硝酸纤维素膜置于37℃烘箱内30分钟，取出后室温放置20分钟以上，然后将其浸没于37℃的封闭液中20分钟，取出后，在室温下置于洗涤液中振荡洗涤5-10分钟，重复洗涤数次，室温晾干；
(4)反应装置的装配
取两层吸水滤纸垫于上述硝酸纤维素膜下方，再将滤纸与膜一齐装入并固定于塑料反应装置盒中；
(二)制备胶体金标记物混合液
(1)制备胶体金颗粒
取0.01％的氯金酸水溶液，加热煮沸，快速加入1％枸橼酸三钠溶液，继续煮沸5分钟，使得胶体金的大小为20-30nm；
(2)制备胶体金标记物
2.1.HBsAg单抗的胶体金标记物的制备
取颗粒大小为20-30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入HBsAg单抗，使其最终浓度为20-50μg/ml；室温下搅拌30分钟；加入10％BSA溶液使单抗终浓度为0.2-1.0％，室温下搅拌5分钟；加入10％PEG20000溶液使单抗终浓度为0.1-0.5％，室温下搅拌5分钟；12000-15000r/min离心60分钟，吸取上清液，弃去；沉淀溶于保存液中，用孔径为0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用；
2.2.HCV抗原的胶体金标记物的制备
取颗粒大小为20-30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入HCV抗原，使其终浓度为90-120μg/ml；室温下搅拌30分钟，加入10％BSA溶液使抗原终浓度为0.2-1.0％，室温下搅拌5分钟；加入10％PEG20000溶液使抗原终浓度为0.1-0.5％，室温下搅拌5分钟；12000-15000r/min离心60分钟，吸取上清液，弃去；沉淀溶于保存液中，用孔径为0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用；
2.3.梅毒抗原的胶体金标记物的制备
取颗粒大小为20-30nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入梅毒抗原使抗原终浓度为90-120μg/ml；室温下搅拌30分钟；加入10％BSA溶液使抗原终浓度为0.2-1.0％，室温下搅拌5分钟；加入10％PEG20000溶液使抗原终浓度为0.1--0.5％，室温下搅拌5分钟；12000-15000r/min离心60分钟，吸取上清液，弃去；沉淀溶于保存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用；
2.4 HIV抗原的胶体金标记物的制备
取20-30nm颗粒的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入HIV抗原使抗原终浓度为80-120μg/ml；室温下搅拌30分钟；加入10％BSA溶液使抗原终浓度为0.2-1.0％，室温下搅拌5分钟；加入10％PEG20000溶液使抗原终浓度为0.1--0.5％，室温下搅拌5分钟；12000-15000r/min离心60分钟，吸取上清液，弃去；沉淀溶于保存液中，用孔径为0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用；
(3)制备胶体金标记液
将分别配制的胶体金标记物按体积比为HBsAg的单抗胶体金标记液：HCV抗原胶体金标记液：梅毒抗原胶体金标液：HIV抗原胶体金标记液＝1∶1∶1.2-2.5∶1.2-2.5的比例混合完全；
(三)缓冲液的制备
在pH7.2-8.8的PBS中加入Tween20，使Tween20的浓度为0.03-0.05％。
5、一种如权利要求1所述的用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒在制备同时检测乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病传染性疾病试剂中的应用。
CNB011265000A 2001-08-17 2001-08-17 用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法 Expired - Fee Related CN1164949C (zh)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB011265000A CN1164949C (zh) 2001-08-17 2001-08-17 用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法
PCT/CN2001/001519 WO2003016914A1 (fr) 2001-08-17 2001-10-30 Kit de diagnostic simultane d'une pluralite de maladies infectieuses et technique de preparation de celui-ci
EP01274437A EP1327885B1 (en) 2001-08-17 2001-10-30 A kit for the simultaneous diagnosis of a plurality of infectious diseases and a method for preparation of it
JP2003521370A JP3853317B2 (ja) 2001-08-17 2001-10-30 複数感染症の同時検出診断キットおよびその製造方法
DE60109311T DE60109311T2 (de) 2001-08-17 2001-10-30 Kit zur simultanen diagnose mehrerer ansteckender krankheiten und verfahren zu seiner herstellung
CA002422942A CA2422942A1 (en) 2001-08-17 2001-10-30 Diagnostic kit for simultaneously detecting multiple infectious disease s and the preparation thereof
US10/393,555 US20030165970A1 (en) 2001-08-17 2003-03-21 Diagnostic kit for simultaneously detecting multiple infectious diseases and the preparation thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB011265000A CN1164949C (zh) 2001-08-17 2001-08-17 用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1405564A CN1405564A (zh) 2003-03-26
CN1164949C true CN1164949C (zh) 2004-09-01

Family

ID=4666516

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB011265000A Expired - Fee Related CN1164949C (zh) 2001-08-17 2001-08-17 用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20030165970A1 (zh)
EP (1) EP1327885B1 (zh)
JP (1) JP3853317B2 (zh)
CN (1) CN1164949C (zh)
CA (1) CA2422942A1 (zh)
DE (1) DE60109311T2 (zh)
WO (1) WO2003016914A1 (zh)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050153382A1 (en) * 2002-06-06 2005-07-14 Chengdu Kuachang Science And Technology Co., Ltd. Biochip kit comprising biochip based on antigen-antibody reactions, and its usage
CN1164948C (zh) * 2002-06-06 2004-09-01 成都夸常科技有限公司 一种基于抗原抗体反应的试剂盒
CN100434901C (zh) * 2006-01-12 2008-11-19 上海交通大学 血红蛋白凝胶层析的教学试剂盒
CN100396774C (zh) * 2006-07-17 2008-06-25 华中农业大学 检测磺胺类药物残留的免疫胶体金试纸条
EP2067045B1 (en) 2006-09-28 2020-08-05 The Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health Limited Method for determining the cd4+ t-cell count and kit therefor
CA2578313A1 (en) * 2007-03-01 2007-05-14 Biolytical Laboratories Inc. Highly accurate rapid parallel immunoassay device
CN101487062B (zh) * 2008-10-31 2013-11-27 武汉大学 同步检测肝炎、艾滋病毒和梅毒螺旋体核酸的试剂盒
GB201018096D0 (en) * 2010-10-27 2010-12-08 Binding Site Group The Ltd Coated beads
CN102323401B (zh) * 2011-05-30 2014-04-16 上海北加生化试剂有限公司 葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原体外检测试剂盒及制备方法
RU2488832C1 (ru) * 2012-01-13 2013-07-27 Общество с ограниченной ответственностью "Передовые диагностические платформы" Способ комплексной диагностики инфекционных заболеваний человека путем твердофазного иммуноферментного анализа
CN102980997B (zh) * 2012-06-23 2014-11-05 北京新兴四寰生物技术有限公司 EB病毒衣壳抗原IgM抗体胶体金法检测试剂及其制备方法
CN102768277B (zh) * 2012-07-25 2014-05-07 成都协和生物技术有限责任公司 口腔黏膜渗出液胶体金法检测hiv抗体的样本稀释液及其制备方法
CN103175958B (zh) * 2013-02-17 2015-04-08 北京市药品检验所 快速鉴别重组乙型肝炎疫苗的方法
CN103792351A (zh) * 2014-01-23 2014-05-14 新疆纳秒脉冲技术应用研究所 一种快速检测革兰氏菌的方法及试剂盒
US10416158B2 (en) 2014-03-11 2019-09-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptide MHCII tetramers to detect endogenous calnexin specific CD4 T cells
WO2016035099A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Meril Diagnostics Private Limited A flow through device for detection of multiple bioanalytes and a process thereof
CN105486854B (zh) * 2015-09-29 2017-12-05 南方医科大学 一种信号放大方法及相关装置
CN106290927B (zh) * 2016-07-26 2018-12-14 鲁东大学 强力霉素快速检测试剂盒及其制备、使用方法
CN106771145A (zh) * 2016-08-23 2017-05-31 广东优尼德生物科技有限公司 一种检测d‑二聚体斑点金渗滤试剂盒及定量检测方法
CN106771144A (zh) * 2016-08-23 2017-05-31 广东优尼德生物科技有限公司 一种检测c‑反应蛋白斑点免疫金渗滤试剂盒及定量检测方法
CN108761058A (zh) * 2018-05-19 2018-11-06 大连大学 用于平行检测多种感染性疾病标志物的纸芯片及方法
CN109900896A (zh) * 2019-03-12 2019-06-18 江苏伯纳德生物科技发展有限公司 一种酶联免疫法检测试剂盒及其制备方法
CN109991416A (zh) * 2019-03-12 2019-07-09 江苏伯纳德生物科技发展有限公司 一种免疫层析法检测试剂盒及其制备方法
CN110078822B (zh) * 2019-05-20 2021-03-02 浙江大学医学院附属第一医院 抗梅毒螺旋体膜蛋白Tp47的单克隆抗体ZJTP47-1B3及其应用
CN110907638B (zh) * 2020-02-14 2020-09-22 北京纳百生物科技有限公司 一种免疫胶体金均相标记用抗体分散剂及其应用
US11549114B2 (en) * 2020-03-27 2023-01-10 Apollo Biomedical, LLC Multiple rapid detection kits and methods for various viruses
US11011278B1 (en) * 2020-09-21 2021-05-18 Biolytical Laboratories Inc. Methods and rapid test kits facilitating epidemiological surveillance
CN112684171B (zh) * 2021-01-20 2022-09-30 季华实验室 一种梅毒抗体检测的免疫传感载体、试剂盒和制备方法
CN115015543B (zh) * 2022-04-17 2023-02-28 吉林迅准生物技术有限公司 一种多项病原体联合检测装置及其制备方法
CN117571988A (zh) * 2024-01-09 2024-02-20 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种血筛多线试纸条、试剂盒及其制备方法和应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW203120B (zh) * 1985-10-04 1993-04-01 Abbott Lab
EP0302154A1 (en) * 1987-07-20 1989-02-08 Soficorp Scientific Inc. Detection of HIV and anti-lymphocyte antibodies
GB8915512D0 (en) * 1989-07-06 1989-08-23 Sec Dep For Health Silver enhanced gold-labelled immuno assay method
US5474900A (en) * 1990-03-16 1995-12-12 Sekisui Chemical Co., Ltd. Process for preparing purified syphilis antigen from Treponema palljdum
EP0532762B1 (en) * 1991-03-28 1998-09-09 Nippon Shoji Kabushiki Kaisha Simple analyzing device
US5637508A (en) * 1993-03-26 1997-06-10 Geo-Centers, Inc. Biomolecules bound to polymer or copolymer coated catalytic inorganic particles, immunoassays using the same and kits containing the same
CN1140258A (zh) * 1995-07-05 1997-01-15 中国人民解放军第四军医大学 检测乙型肝炎病毒抗体的免疫胶体金试剂及方法
DE29811606U1 (de) * 1998-06-29 1999-05-06 Sension Biolog Detektions Und Kombi-Vorrichtung zur simultanen Durchführung von Immunfiltrationstests
JP2000097942A (ja) * 1998-09-18 2000-04-07 Matsushita Electric Ind Co Ltd 免疫クロマトグラフィーのためのキット
CN1307238A (zh) * 2000-02-02 2001-08-08 昆明广博科技有限公司 多种常见性病快速检测试纸条及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1405564A (zh) 2003-03-26
US20030165970A1 (en) 2003-09-04
JP3853317B2 (ja) 2006-12-06
JP2004538489A (ja) 2004-12-24
WO2003016914A1 (fr) 2003-02-27
EP1327885A1 (en) 2003-07-16
EP1327885B1 (en) 2005-03-09
EP1327885A4 (en) 2004-04-21
DE60109311T2 (de) 2006-04-06
CA2422942A1 (en) 2003-03-19
DE60109311D1 (de) 2005-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1164949C (zh) 用于同时检测多种传染性疾病的试剂盒及其制备方法
Hodinka et al. Detection of human immunodeficiency virus antibodies in oral fluids
Awole et al. Seroprevalence of HBsAg and its risk factors amoung pregnant women in Jimma, Southwest Ethiopia
CN1161611C (zh) 生物传感器
CN1030300A (zh) 利用酶标免疫检测法同时测定人体中的抗原和/或抗体
Omatola et al. Seroprevalence of HBV, HCV, and HIV and associated risk factors among apparently healthy pregnant women in Anyigba, Nigeria
Manning et al. SARS-CoV-2 cross-reactivity in prepandemic serum from rural malaria-infected persons, Cambodia
CN1673749A (zh) Hiv病毒抗体/抗原诊断试剂盒及其制备方法、检测方法
JP4895727B2 (ja) 抗ｈｉｖ抗体検出試薬、試薬キット、試薬の製造方法、及び抗ｈｉｖ抗体の検出方法
CN1580777A (zh) 胶体金层析法检测血液hiv1/2抗体的试纸条及其制备方法
CN112379089A (zh) 一种基于量子点微球免疫层析试纸条的新冠病毒检测方法
CN1409111A (zh) 一种能同时检测多种与疾病有关的抗原、抗体的装置
CN1407340A (zh) 用于同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒及其制备方法
CN108982838A (zh) 一种用于传染病检测的蛋白芯片及其制备方法
Kalantari et al. Prevalence of hepatitis C virus, hepatitis B virus, human immunodeficiency virus and related risk factors among hemophilia and thalassemia patients In Iran
CN102944677A (zh) 一种手足口病分型检测试剂盒及其制备方法
Thomas et al. Association of hepatitis C virus infection with false-positive tests for syphilis
Toqeer et al. Visceral leishmaniasis in immunosuppressed Caucasian patient
CN103149356B (zh) 一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗原的检测试纸卡
Shrestha et al. Occult hepatitis B infection in end-stage renal disease patients starting maintenance hemodialysis at a tertiary care hospital: a descriptive cross-sectional study
Manning et al. Pre-pandemic SARS-CoV-2 serological reactivity in rural malaria-experienced Cambodians
CN207036860U (zh) 一种用于检测猪流行性腹泻病毒的免疫生物传感器
Weinig et al. Hepatitis C virus and HIV antibodies in patients with hepatocellular carcinoma in Zimbabwe: a pilot study
CN106153894A (zh) 一种测定弓形虫IgM抗体的检测试剂盒及其检测方法
JP3654731B2 (ja) アレルギー検査容器、キット及び検査方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: HUZHOU HEALTHDIGIT CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: SHUKANG BIO-TECHNOLOGY CO LTD, SHANGHAI

Effective date: 20100325

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 200233 HOUSE 4, BUILDING 51, NO.1089, QINZHOU NORTH ROAD, SHANGHAI CITY TO: 313000 NO.666, TIANHENG ROAD, HUZHOU CITY, ZHEJIANG PROVINCE

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20100325

Address after: 313000 Zhejiang province Huzhou Tianheng Road No. 666

Patentee after: Huzhou Shukang Biological Technology Co., Ltd.

Address before: 200233, No. 51 North Qinzhou Road, building 4, building 1089, Shanghai

Patentee before: Shukang Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20040901

Termination date: 20200817

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee