CN1030300A - 利用酶标免疫检测法同时测定人体中的抗原和/或抗体 - Google Patents

Abstract

为了测定人生理体液中单结合对(在免疫学上成 对的)的抗原和/或抗体的成员，本发明提供一种固 相免疫检测法。本免疫检测法能够同时测定出受试 样品中单结合对的抗原和/或抗体。因为在受试样 品中可能有流动着的抗原和/或抗体。本检测法的 特征是把结合对的适量抗原或增量加入到受试样品 中，然后，在结合对固相吸收抗体存在的条件下温育 受试样品。为了均匀分散受试样品中可能存在的抗 原，最好在受试样品中先加入溶解液，然后再温育。

Description

本发明提供一种单一免疫检测法可以同时测出人体生理体液受试样品中单结合对的抗原和/或抗体。因为体液受试样品中可能含有正在流动着的抗原和/或抗体。

本发明在优选实施方案中提供一种独特的酶标免疫检测法。利用该检测法可以在某一人的血浆或血清样品中，或在培养细胞的上清液中测定出HIV，HIV片断，HIV感染细胞和/或与HIV生物体相联的人抗体，或携带有HIV抗原的片断。实施本发明的免疫检测法，根据情况的不同，可以得出不同的试验结果，或者是抗体阳性，抗原阳性，或者是抗体、抗原“阴性”，尤其是在测定HIV抗原方面，与目前已有的方法相比，该发明则更精确，更敏感，结果较一致，并且所用时间也较短。

HTLVⅢ感染，目前被称为HIV感染，通常引起艾滋病（AIDS）（获得性免疫缺陷综合症）。美国报导的艾滋病患者数量的不断增加已经使人们把艾滋病看成是近乎流行性疾病，且尚无有效的治疗方法，或疫苗。由于艾滋病是借助于性活动，滥用药物，移殖术过程中器官的污染以及输血进行传递的，因此，艾滋病事件首先在欧洲、非洲国家连续不断地出现。HIV的其它毒株，如HTLVⅣ由于病毒突变正在发展中。

分别测定HIV抗体或HIV抗原的方法已被许多研究者，包括国家卫生协会（The    National    Institute    of    Health）（NIH）的科学工作者发展起来。检验血浆和血清中HIV抗体的测定法已得到临床批准而商品化。大家知道，检验HIV抗原的测定法在研究使用中，但就我们所知，还没有一个得到临床批准并达到商品化。这些试验法分别独立地分析血浆，血清或筛选个体的血浆、血清或血细胞培养的上清液，来测定HIV抗原或者与HIV抗原相结合的人体抗HIV抗体的含量。近期的比较若干种试验方法的综述文章，请看抗HIV试验法：筛选和确定试验，医学实验室产品，1987年4月，p16-18。

通过性交，输血，或通过移植污染的器官或使用被滥用药物污染的针头，可感染HIV，受感染者的70-80%在4-6周内可以产生抗体。还有20-30%的受感染的个体，在长达6个月期间，不产生抵抗侵入病毒的抗体，他们是社会上保留的未检出的携带者。因此，如果说人们应该有效地筛选血液和器官的供给者，淘汰含有传播艾滋病的血液制品，那么就必须有筛选免疫检测法，它不仅能够检测HIV抗体而且能够检测出HIV病毒本身和/或被感染而携带病毒的细胞。

目前，所遇到的困难是可能出现假阳性结果，或是由于非特异性抗体，或是由于抗体直接作用于支持细胞培养液中的正常细胞抗原。在支持细胞培养液中曾得到含有足够量病毒颗粒的上清液。因此，一般地说，必须克服现有检测法不够理想的敏感性问题。

人们不了解有任何研究的或临术应用的免疫检测法可通过分析单一部分的生理体液受试样品能同时测出单结合对的两个成份，如抗HIV抗体，HIV生物体，或HIV感染的血细胞，如人血样品。实施本发明的检验法既可以成功地检测出病毒，病毒感染细胞，又可以检测出与HIV生物体联结的抗体。在一个器皿中，如在微滴板孔中即可进行此检验法。病人的受试样品最好是由人血浆（即一开始就除去所有细胞的全血）或血清（即除去所有凝血因子的血浆）组成。利用酶标免疫检测法（EIA），可根据情况的不同得出“阳性”或“阴性”结果。利用本发明方法鉴定艾滋病感染病人的适宜性明显地高于目前所实施的方法。目前所实施的免疫测定法仅仅是跟踪生理样本如外周血中的抗HIV抗体。约4个小时，可得出测定结果。

利用溶解病毒浓缩物释放出病毒蛋白，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使病毒蛋白，即抗原扩散开，这就是已知的Western吸印技术，只能用来确认抗HIV抗体存在而不能确认抗原存在。当病人已感染上HIV，但还没有出现抗体之前的一段时间内，该检测法实际上没有利用价值。同样，利用HIV溶菌产物作为固相蛋白，附着到固相支持物，如聚苯乙烯制成的微滴板上。这就是已知的ELISA技术，在受到HIV感局螅姑挥谐鱿挚固宓囊欢问奔淠冢缮秆〕隹乖荒苌秆】笻IV抗体。还有一种方法，即在已知的适量HIV抗原存在的条件下，溶解样品中的HIV，使其与抗体包被的固相接触，然后在含有单结合对一个成员的生物素基化抗体存在的条件下温育受试样品，这一方法比较快，定量敏感，单个受试样品既可测定抗体，又可测定抗原。然而，这一方法尚未得到公认。

为了测定人生理体液的受试样品如血浆、或血清，或细胞培养上清液中的单结合对的抗原和/或抗体，现在提供一种酶标免疫检验法。在本发明优选的实施方案中，免疫检验法被用来同时测定一个样品的HIV抗原和/或抗体。这里所用的方法是固相测定法，即酶联免疫吸附法（ELISA）。该法采用微滴板，微滴条，聚苯乙烯小珠或铁珠作为支持基。在特别优选的实施方案中，预定体积的如200μl的受试样品或标本，被引入到微滴板的一小孔中，该微滴板的小孔已经用纯化的抗HIV抗体所包被。该抗体是从具有适当高效价的人，山羊或其它哺乳动物血清或血浆制备的。如来自山羊的抗HIV抗体是通过常规的注射和采血程序，并利用纯化的HIV提供P24，GP120和GP160病毒蛋白或病毒糖蛋白而制得的。当得到足够效价的羊抗HIV抗体之后，回收和纯化抗HIV抗体。将样品进行温育，该温育程序采用挑选的发育试剂。

检验程序中一个有意义的方面是包含有引导步骤，即把待测的单结合对抗原（事先选择好已知量，给定体积）加入到含有试验样品的已包被的小孔中。在测定的最后一步，已知量的抗原在事先选择的定量值水平上通常是可测的。如按设计对使用微微克浓度的抗原可测得一个光密度。光密度值不仅提供一条“基线”（试验结果阴性），而且更重要的是在这一个检测样品中既可定量测定抗体阳性，又可定量测定抗原阳性，或测二者之一。本发明的一个有意义的方面是在进行试验的试剂盒中引入了或提供了无活性的或无传染性的病毒抗原，被称为“增量”（Spike）。如同将解释的那样，正是利用抗原增量，才能在一个小孔的待测样品中测出病毒抗原和抗体，或者是无。对于该发明来说，可将增量抗原理解为不是必需局限于由抗原位点组成，换句话说，从HIV外壳或膜上突出的增量实际上是由包括HIV核心蛋白在内的病毒蛋白混合物所组成。所选用的固相检测法是采用ELISA技术，通过测量可见反应物的光密度来显示免疫学反应。相对于各种病毒和含有抗体的生理体液和组织，关于采取各种方法显示免疫反应方面，应注意一系列综述性文章，题目是放射免疫检测法和饱和分析（Radioimmunoassay    and    Saturation    Analysis，British    medical    Bulletin，Vol.30，No.1，Jan.1974）。

该发明的抗体/抗原双重试验的功能，在其最广泛的意义上可以看作是受试样品中的特异抗体特异地与病毒抗原增量相结合的结果。如果免疫学反应检测或显示程序判定，某些或所有的已知量的病毒抗原正好与受试样品中的特异抗HIV抗体相结合，这样，少量抗原能从增量中监测出来，于是，试验结果则被解释成“抗体阳性”。另一方面，通过增量的形式，受试样品中的抗原右增加到已知的抗原量。如果检测程序表明，这是附加效应，试验结果则被解释为“抗原阳性”。然而，免疫反应所显示的试验结果，如光密度仅相当于通过增量加入的预先定量的微微克量抗原的光密度，那么，试验结果被解释为抗原抗体皆为阴性。

本发明优选的实施方案中，提供一种单样品检测法，可以同时测定人生理受试样品如血浆或血清中的HIV抗原和/或HIV抗体。微孔，如具有微孔条的微滴板上的微孔，用得自显示高效价抗HIV抗体的血清的抗HIV抗体包被。该检验法的固相支持基，即微滴板是用纯化的抗HIV抗体（来自高效价的哺乳动物血清或血浆，如人的，山羊的或其它物种的）涂在微孔上包被而成的。

把受试样品加入到一个已包被的微孔中，或者加入到几个已包被的微孔中，最好有重复实验。应设正常对照孔，即抗原和抗体阴性，生理体液即正常人血浆或血清。最好再设一个抗原阳性对照孔。将已知量的HIV抗原，即“增量”加到每个样品微孔中和每一对照孔中，将这样结合的样品和增加的抗原加入到溶素（Lyse）缓冲液中，保证存在于受试样品中的病毒破坏成它的组成成分。在体温下进行简单培育之后，冲洗微滴板，除去可能干挠信号产生系统的物质，接着，让捕获抗原与已经与生物系结合的抗HIV抗体起反应。与抗生物素蛋白链菌素过氧化物酶试剂一起温育之后，利用适当的底物，结合酶产生的颜色便会显示出来。在受试样品和抗原阳性对照中或在缺少受试样品和对照组中，反应生成物的光芏扔胂喙氐腍IV抗原和/或抗HIV抗体的量成比例。

习惯上，包被固相支持物的抗体以及为完成该检测所必需的所有普通试剂以试剂盒形式供应。在本发明优选实施例中，这样的试剂盒包括：

一个96孔的聚苯乙烯微滴板，各孔已用抗HIV抗体包被;

备用一个微滴板盖;

溶素缓冲液;

抗原试剂“增量”;

抗原稀释液;

抗HIV抗体-生物素试剂;

生物素试剂稀释液;

抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化物酶（HRPO）结合剂;

3，3′，5，5′，四甲替联苯胺（TMB）试剂;

TMB稀释缓冲液;

正常人血浆对照;

正常人血清对照;

抗原阳性对照（50微微克抗原/20    μl）;

10x冲洗缓冲液;

H₂O₂溶液;

阻化液。

试剂汇集

一般地说，试剂需事先配制，以便在进行典型优选的免疫检测程序中，在适当步骤就可得以利用。试剂配方如下：

溶素缓冲液

无过氧化物多辛酚（乙二醇醚）

即Triton    X-100，（Boehringer    Mannheim）

生化试剂    50%

聚氧乙烯山梨醇

单月桂酸盐    即吐温20

Sigma    化学公司    2%

乙汞硫代水杨酸钠    即Thimersol

Sigma化学公司    0.05%

染料    FDC蓝    No.1    0.9mg/ml

蒸馏水    加至1升。

抗原试剂：

用抗原稀释液稀释足够量的HIV抗原，提供的增量为每20μl稀释剂中含50微微克HIV抗原。在P24等价物基础上，利用DupontP24放射免疫测定法（RIA）可以测定增量中抗原浓度。

抗原稀释液：

无蛋白酶牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲盐水

（PBS）    1.0%

叠氮化钠    0.1%

染料，FDC红    No.3    0.5mg/ml

抗HIV抗体-生物素试剂：

人抗HIV抗体-生物素结合剂（最好是冰冻干燥的）

生物素试剂稀释液：1升

Triton    X-100    0.5%

正常人血清（加热失活的）    0.5%

吐温    0.2%

乙汞硫代水杨酸钠    0.5%

10×磷酸盐缓冲盐水（PBS）    100ml

（100mM    磷酸盐，1.455M    NaCl    pH7.2）

蒸馏水    加至1000ml

抗生物素蛋白链菌素一辣根过氧化物酶结合剂：

（Calbiochem-Behring    corp.）

TMB试剂：

TMB（3，3′，5，5′四甲替联苯胺）    1.0g

DMSO（二甲基亚砜）    加至100.0ml

TMB稀释缓冲液：

Na₂PO₄.7H₂O 24.13g

一水合柠檬酸    11.38g

氯乙酰胺    1.00g

蒸馏水    加至1000ml

pH调至4.4

阻化液

18M浓硫酸    100.0ml

蒸馏水    800.00ml

过氧化氢溶液

30%H₂O₂

10X冲洗缓冲液（稀释1-10）

吐温20    10.0ml

10X    PBS    0.99L

1%    氯乙酰胺    10.0g

根据试剂的性质以及计划，在免疫检验技术方面的熟练者将会预计到，单个溶剂的浓度可能会变化很大。据评价，该发明的一个有意义方面存在于加入增量的步骤上。增量是由已知量的待测单结合对的抗原组成的。

免疫检测程序

实施本发明的免疫检测法最好在熟悉的微滴板孔内进行。在优选实例中，用200μl病人样品进行测试。病人样品可以是血浆（离心除去全血中的血细胞而得），血清或培养细胞。把200μl受试样品移入到微滴板的孔内。该孔已用热失活的提纯的抗HIV抗体包被过。

纯化的抗HIV抗体是从高效价的血清源或血浆源衍生得来的。该血清源或血浆源可以是人血清或人血浆。为了包被孔，哺乳动物抗体，即人的抗HIV抗体在所谓的“镀金式缓冲液”中稀释成2.5μg/ml。镀金式缓冲液含有250mM磷酸钾，pH6.0。把25μl已稀释的抗体移入孔中，在4℃下保存约16小时。然后，从孔中移出，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗液冲洗三次。然后在室温下，用325μl的阻滞剂阻滞1小时。阻滞剂中含有1%的牛血清白蛋白（BSA）（无蛋白酶），5%蔗糖加1%乙基汞硫代水杨酸钠，溶于PBS中，经0.2μm滤膜过滤。然后，从孔中移出，快速真空干燥，放入袋中（袋内附有干燥剂袋），4℃下保存。

虽然已描述了单孔的包被程序，但带有许多孔的习惯用的微滴板也可利用。也可以利用仪器来包被多数孔。于是，在实施本发明的免疫检测法的操作中，可以采用带有众多孔的仪器。

向孔中的200μl受试样品中添加20μl溶素缓冲液来溶解膜片断，并加入20μl人抗原工作液（用抗原稀释液将抗原试剂稀释成事先选择的50微微克抗原/20μl）。然后，盖上孔，在适当的摇动器上摇动1分钟。使混合物成份混合。接着，混合物在37℃下温育1小时。

温育之后，孔中内容物被吸出，按照传统方式，用冲洗缓冲液冲洗三次。抗HIV抗体-生物素（最好是处于冻干状态）被重建，并用生物素试剂稀释液稀释成5%溶液。取200μl，添加到孔中，微滴板放在37℃下温育1小时。

温育后，孔中内容物被吸出，利用冲洗缓冲液冲洗三次。然后，把200μl抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶结合剂加入到孔中，加盖，37℃下温育30分钟。温育后，孔中内容物被吸出，用冲洗缓冲液冲洗三次。然后，将200μl    TMB底物溶液移入孔中，加盖，室温下培育30分钟。

然后，将50μl2M H₂SO₄加入到孔中终止反应。利用570nm作为参此，可以利用二元波长能力，在微滴板的读数器上可以读出孔中溶液在波长45nm处的光密度。如果不利用二元波长能力，可以在两个波长上进行读数，并且在450nm的读数是通过减去570nm的读数而被校正。

实施本发明的免疫检测法提供了一种包括预先定量的一个增量的失活的HIV病毒抗原（在设计的微微克水平的灵敏度上，其量是可监测的）在内的定量的病人样品，并被移入到抗体包被的微滴板孔中。然后利用指定的人造药物共价偶联到得自哺乳动物，如人的抗HIV抗体上的生物素进行各种常规的温育。偶联的下一步是形成生物素-抗生物素蛋白结合的过氧化酶复合物。其后，加入TMB底物，以便比色，显示反应。已经注意到，当抗HIV抗体生物素结合物采用长链生物素时，监测的敏感性甚佳。然后位于孔中的抗原（包括增量抗原和病人样品抗原;该抗原又与包被孔周壁的俘获抗体相结合）的浓度借助于生物素化的抗HIV抗体，和与抗生物素蛋白过氧化物酶反应的复合物，以及显示反应的TMB底物可以被识别。反应终止之后，与对照的直接读数相比较，可以得到酶标免疫检验法（EIA）的读数。

从病人受试样品中得到的读数和对照组读数相比较，如同正常的人血浆（无抗HIV抗体，无HIV抗原，或经免疫检验程序测定为无感染病毒）的读数相比较。我们确认，把增加或降低大约30%作为病人试验结果的参照点。这样，如果光密度读数降低大于增量光密度的30%，则定为抗体阳性。若光密度增加大于约30%，则定为抗原阳性。

由于在优选的方法学中已经描述了ELISA利用配体和受体的结合，即生物素-抗生物素蛋白计划，为免疫学反应提供了一个可监测信号，因此可以预计，可以采用许多其它方法来显示反应生成物的免疫反应。在此方面，可以采用其它标记或标志来显示生成物的免疫学反应，如放射性核苷，其它的酶，荧光剂，化学发光剂，底物，颗粒物（如磁性颗粒），除了生物素和抗生物素蛋白以外的配体和受体的结合。

按照上述的改进的ELISA计划，要在单个的试验孔中同时测定HIV抗原和/或抗HIV抗体，需要进行一系列试验。当某些病人被怀疑受到HIV影响，诊断为ARC，或怀疑有艾滋病，或被诊断是艾滋病，在五个医学研究所得到的病人血样衍生成血浆和血清，并对此种血浆和血清进行测定。在试验系列中，完成了99个检测，使用了三个96孔的微滴板。

关于微滴板1，进行了32个试验，50微微克/20μl增量被用于确定基线光密度，其表现为光密度（OD）等于0.894+0.061。利用光密度0.894上下30%误差作为上下临界线。对于检测而言，确定光密度小于0.626为抗HIV抗体阳性，而光密度大于1.16为HIV抗原阳性。

同样，关于微滴板2，进行了34个试验，50微微克/20μl增量的光密度为0.715±0.56，可以认为，光密度读数小于0.500为抗HIV抗体阳性，光密度大于0.93为HIV抗原阳性。

同理，关于微滴板3，进行了33个测定，50微微克增量的光密度为0.655±0.59。光密度小于0.459认为是抗HIV抗体阳性，而光密度大于0.852认为是HIV抗原阳性。

所有的样品除了受到本发明测定以外，又都受到ELISA技术的筛选测定，还利用Western吸附技术的确认测定治龊图℉IV蛋白P24和GP120，然后，对样品“打分”，判断是阳性或阴性。在99个样品中，有70%或70.7%的样品被定为或是对HIV抗原阳性，或者是对抗HIV抗体阳性。有29%或29.3%的样品被定为或者是对HIV抗原阴性，或者是对抗HIV抗体阴性。在70个阳性样品中，6个样品（或大约6.1%的样品）属于HIV抗原和抗HIV抗体双阳性。然而还发现，被定为“阳性”的17个样品仅仅是对HIV抗原阳性。根据这一事实可以预估含有本发明的免疫检测的特殊意义。

免疫检测方法的显著进步是对于单个试验容器中的一个生理体液样品，能够同时筛选单结合对的抗原和抗体。在本发明的优选实施方案中，利用单个测试孔，对来自供血者的血浆或血清的受试样品能够同时筛选抗HIV抗体和HIV抗原，或者更重要的是能够筛选出只有HIV抗原存在。当人受到HIV感染和出现抗HIV抗体的一段时间内，需要临界值来鉴定仅仅含有HIV抗原的供血，而当抗HIV抗体上升到足以被筛选试验检出的水平时，就用不着重视临界值了。

作为Western吸附技术确认试验结果而搜集的试验资料似乎指出，利用本发明方法所进行的试验，约10%属于假阳性，约有15%属于假阴性。可以预计，假结果的百分率可能归因于某种未定因子，如实验中的人差或读数中的人差。因此，很明显，假结果百分率不是这里描述的典型试验效率的真实反映。

Claims (14)

1、单一免疫检验法可以同时检测人的生理体液受试样品(可能含有循环的抗原)中单一结合对的抗原和/或抗体。该检测法包括：

(a)使受试样品与固体表面接触，能够与对应的抗原决定簇(包含有上述单一结合对其它成员)相连接的抗体又可结合到固体表面上，并且引入预先定量的已选好的上述抗原，为正常的阴性受试样品提供一个有用的可监测信号；

(b)温育反应生成物复合体并经历上述的结合信号而产生结合，此种结合能够产生与正常受试样品信号有关的可定量测定的信号，从而指出受试样品或者是抗原阳性，抗体阳性，或者是上述的正常的阴性。

2、权利要求1的免疫检测法，包括使受试样品和步骤（a）中预先定量的上述抗原与溶剂接触的步骤，为的是均匀分散可能存在于受试样品中的抗原。

3、权利要求1的免疫检测法，其中单一结合对的抗原和/或抗体分别是由HIV抗原或抗HIV抗体组成的。

4、权利要求1的免疫检测法，其中步骤（a）的抗体，即能与对应的抗原决定簇结合的抗体，是从包括人和羊在内的一群哺乳动物中衍生来的。

5、权利要求1的免疫检测法，其中步骤（b）按照ELISA方法学进行。

6、单一酶联免疫吸附检测法，其中受试样品中单结合对的抗原和/或抗体是可测的，该检测法包括：

（a）使受试样品与固体表面接触，上述抗体能结合到固体表面上，并引入预先定量的上述所选择的抗原，为正常阴性受试样品提供一个有用的可监测的光度信号，并为可能存在于受试样品中的抗原的释放引入一种溶剂;（b）温育反应生成物的复合体，并加入上述糖蛋白结合抗体结合物和适当底物，其在温育之后产生颜色监测信号（与正常受试样品上述监测信号相关），从而指出受试样品或者是抗原阳性，抗体阳性，或者是上述的正常阴性。

7、权利要求6的免疫检测法，其中单结合对的抗原和/或抗体分别是由HIV抗原或抗HIV抗体组成。

8、权利要求6的免疫检测法，其中步骤（a）的抗体，即能与对应的抗原决定簇相连接的抗体是从包括人和羊在内的一类哺乳动物中衍生的。

9、权利要求6的免疫检测法，其中步骤（b）按照ELISA方法学进行。

10、在酶联免疫吸附检测法中，采用分光光度测量法监测受试样品中单结合对的抗原和/或抗体;其改进方法包含有：

在预先定量的上述所选抗原的生物素化抗体存在的条件下，先引入受试样品，然后再温育受试样品，这样，为正常阴性受试样品提供一种可监测的光度信号，以致一完成检测即可提供可监测的颜色信号。

11、权利要求10的免疫检测法，其中单结合对的抗原和/或抗体分别是由HIV抗原或抗HIV抗体组成。

12、权利要求10的免疫检测法，其中步骤（a）的抗体，即能与对应的抗原决定簇结合的抗体是从包括人和羊在内的一类哺乳动物中衍生的。

13、权利要求10的免疫检测法，其中步骤（b）按ELISA方法学进行。

14、按照权利要求1进行的免疫检测法所使用的试剂盒归纳如下：

（a）固体表面，能与对应的抗原决定簇（含有上述单结合对其它成员）结合的抗体可结合到固体表面上。

（b）适量的已知浓度的抗原，该抗原是由单结合对的其它成员组成，并为正常阴性的受试样品提供有用的监测信号。

（c）适量的溶剂，用于均匀地分散可能存在于受试样品中的单结合对的抗原。

（d）必备的材料，在进行免疫检测中，由于使用该必备材料可以显示免疫学反应。