JPH07507634A - イムノアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イムノアッセイ法 本発明は、とくにヒトおよび非ヒト動物から得られる体液および他のサンプルに ついてのイムノアッセイの実施方法の改良に関する。

イムノアッセイフォーマットには本質的に２つのタイプがある。１つは検討する サンプルから抗体または抗原を固相上に選択的に捕獲するものであり、もう１つ は検討する抗体または抗原を溶液中で検出する均一相アッセイフォーマットであ る（とくに指摘のない限り１本明細書で用いられる「抗原」の語にはハプテンが 包含される）。

イムノアッセイを微小チューブ、またはとくにマイクロタイタープレートのウェ ル（マイクロウェル）中で行うのは、このような容器の取り扱いには自動システ ムの利用が可能なことから、とくに便利である。自動化システムとしては、単な る分光光度計マイクロプレートリーダーから、さらに進んで洗浄、各種試薬の分 配およびインキコペーシ謬ンのような工程、ついでア・ツセイ結果のとくに分光 光度計での読み取りを実施できるシステムまである。

検討するサンプルから抗原または抗体を捕獲しイムノアッセイ容器内に固定化す るイムノア１セイにおいては、捕獲が起こる固相は、たとえばポリマー物質とく に合成プラスチック材料のビーズ、または粒子、たとえばいわゆる「ラテツクス 」粒子、安定化した血液細胞もしくは赤血球、細菌もしくはかびの細胞、胞子。

金もしくは他の金属ゾル、および蛋白性コロイドである１粒子のサイズは一般的 に約０１〜５ミクロンで、ビーズは一般的にもつと大きくたとえば約２ｍｍ〜１ ０ｍｍである。別法として、抗体または抗原を捕獲する固相は、マイクロタイタ ープレートのコーティングされたウェル、またはコーティングされた凹部を有す るスライドもしくは「タイル」とすることもできる、スライド、カードおよびタ イルは、凝集アッセイのためのイムノアッセイ容器として使用できる、その他の 種類のイムノアッセイには、２つの成分の間の免疫学的相互作用が関与し、肉眼 および／または光学的方法で測定できる綿状反応を利用する７０キュレ−／ａン アノセイがある。陽性および陰性反応の肉眼的な差を増大させるために、微粒子 たとえば微粒子カーボンを使用することができる。

ポリマー材料のマイクロタイタープレートおよびビーズは、上述のように、この ような試験フォーマットの操作には自動システムの使用が可能なことから、大規 模な使用に便利である。一般的にイムノアッセイに必要なサンプルおよび希釈液 は、使用するシステムによっては手動で分配することもできるし、また自動のサ ンプルまたは希釈液ディスペンサーを使用することもできる。

「イムノアッセイ容器」の語は本明細書においては、その内部でイムノアッセイ を実施する容器、たとえばマイクロウェル、ビーズとともに使用するチューブ。

スライド、カードまたはタイルを意味して使用してされる。抗体および抗原以外 の特異的結合対、たとえば受容体およびそれらのリガンドのアッセイは、イムノ アッセイ容器中でイムノアッセイと同様に行うことが可能であって、この語の使 用はイムノアッセイのみに限定されるものではない。

一般的に均一相アッセイにおいては、抗体および抗原はいずれもＩｊｌ識され、 抗体と抗原が溶液中で相互作用した場合に、２つの標識も相互作用して、たとえ ば。

一方の標識によって捕獲されたエネルギーの他方の標識への非放射性伝達が、励 起された第二の標識または消光した第一の標識のたとえば蛍光分光法、磁気共鳴 または酵素測定により適当に検出することが可能になる。検討すべきサンプル中 に抗原または抗体を添加すると、標識された対の相互作用に変動を生じ、シグナ ルのレベルが変化する。多くの場合、シグナルは好ましくは色の変化である。

固相アッセイでは、捕獲された抗原または抗体は一般的に、シグナルを与える任 ！の手段、たとえば捕獲された抗体または抗原と反応する標識分子または粒子の 使用により検出される。抗体が捕獲される場合には、標識された成分は、プロテ ィンＡ、プロティンＧ、抗一種もしくは抗−免疫グロブリンサブタイブ、リニー マトイド因子、抗体を捕獲するために用いられた抗原に対する抗体（この抗体は 競合的または遮断的様式で使用される）または抗体と相互作用する抗原たとえば 捕獲用に用いられる抗原のエピトープを含有する分子とすることができる。抗原 が捕獲される場合には、その抗原と相互作用する標識抗体が一般的に使用される 。

検出可能なシグナルは、光学的、放射性または物理化学的シグナルであり１分子 または粒子を、上述のように、たとえば染料、放ｌ″ｌｌ識、電子活性種、磁気 共鳴橿、化学発光種または発蛍光団で１ｍすることにより直接、あるいは分子ま たは粒子を、上述のように、それ自体任意の種類の検出可能な変化を生じること ができる酵素で標識することにより間接に提供される。別法として、シグナルは 。

７０キュレーン叢ン、凝集、固相がたとえば上述のような適当な大きさの粒子で ある場合に生じる回折効果または複屈折効果に由来するものであってもよい。

イムノアッセイの理論および実際については多くの著書および総説論文がある。

イムノアツセイの設計、たとえば均一もしくは捕獲フォーマット、捕獲アッセイ の場合には固体基板の特性および選択、標識（シグナル発生システム）の性質お よび選択、ならびに様々な他の実用上の問題たとえば希釈および洗浄溶液の組成 に関して助言が与えられている。標準的な参考書の例には、　”　ＥＬＩＳＡ　 ａｎｄ　０ｔｈｅｒＳｏｌｉｄｓ　Ｐｈａｓｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓａｙｓ、Ｔｈ ｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｒａｅｔｉｅａｌ＾５ｐｅｃｔｓ”　、Ｄ、Ｍ AＩｅｎｅｄｙ ＆　Ｓ、　Ｊ、　Ｃｈｉｌｌａｃｏｍｂｅ編、Ｊｏｈｎ　ＷｉｌｅＦ刊、　１９ ８ｇがある。

上述のように、均一相アッセイは、小チューブまたはマイクロウェル中で実施す るのが便利である。コーティングされたマイクロウェルおよびコーティングされ たビーズが大規模固相アッセイに広く用いられている。ビーズおよびマイクロウ ェルフォーマットに最近使用されている自動システムは、一般的に、検出に化学 発光、蛍光または発色標識を用いる酵素イムノアッセイ用に設計されている。

凝集アッセイは凹部っきのスライド、カードまたはタイル上で、小規模の検討の ために行われることが多い、たとえば、大規模のラテツクスおよびヘマグルチネ ー／ヲンのような凝集アッセイはマイクロタイタープレート上で実施されること が多く、凝集は分光測光的に測定される。７０キーレーン璽ンアツセイはマイク ロウェルまたは小カップ内で行われる。

イムノアッセイ容器中で行われるすべてのアッセイにおいては、アッセイのフォ ーマットまたは被検物質の性質の如何にかかわらず、検討するサンプルは、たと えばコーティングされたビーズを含有するチューブ、マイクロタイタープレート のコーティングもしくは非コーテイングウェル、スライドもしくはタイル中の凹 部、またはカードもしくはタイル上のサークルのようなイムノア１セイ容器に添 加される。１個の試験単位は複数個のイムノアッセイ容器から構成されていても よく、たとえばマイクロタイタープレート試験単位は一般に９６個のマイクロウ ェルを含み、それぞれが１個のイムノアッセイ容器である。

本発明は、サンプルの不存在が偽陰性結果の一つの原因になるので、必ず添加し なければならないサンプルを各イム／アッセイ容器に実際にすでに添加したが否 かを使用者が容易に確認できることが重要であるとの本発明者らの認識に基づく ものである。自動装置の使用が増えるに従い、技術スタッフが手動でイムノアッ セイを行うことは稀にしかなり、シたがって操作の熟達度は低下して、たとえば イムノアッセイを手動で行う場合、どのイムノアッセイ容器にはサンプルが添加 されたかを明示する補助が必要になる。自動システムも絶対に誤りがないという ものではなく、イムノアッセイ容器にサンプルを分配し損う場合がある。自動イ ムノアッセイを含めてすべてのイムノアッセイにおいて、サンプルの存在のモニ ターはきわめて望ましいものであると確信する。

イムノアッセイ容器中のサンプルの存在を検知することは比較的容易であると思 われがちであるが、これは実際にはきわめて困難である。マイクロウェルまたは 他の容器中の容量を肉眼で検査することは、サンプルが添加されているかどうか を決定するのに実用的な方法ではない、多くの市販のアッセイにおいて、サンプ ルはきわめて小容量であり、これがはるかに大容量の希釈液または他の試薬と混 合されるからである。

本発明は、サンプル中の被検物質についてイムノアッセイまたは特異的結合対ア ッセイを行うイムノアッセイ容器中における体液サンプルまたはヒトもしくは非 ヒト動物生体に由来するサンプルの存在を確定する方法において。

（ｉ）　（ａ）イムノアッセイ容器中において、サンプル、およびサンプルが存 在するとシグナルを産生できるサンプルモニター試薬または試薬系からなる液体 を混合するか、または （ｉ）　（ｂ）サンプルが存在するとシグナルを産生できるサンプルモニター試 薬または試薬系が固体支持体上に固定化されてなるイムノアッセイ容器にサンプ ルを添加し、ついで （ｉｉ）　シグナルを検出することからなり。

サンプルが存在するとシグナルを産生できるサンプルモニター試薬または試薬系 はイムノアッセイ自体における被検物質の検出に用いられる被検物質特異的試薬 または試薬系とは異なる方法を提供する。

本発明はまた。被検物質は抗体もしくは抗原または特異的結合対のメンバーであ り、アッセイはイムノアッセイ容器中における被検物質と相当する抗原もしくは 抗体または特異的結合対の２つのメンバーの間の特異的相互作用ならびにその相 互作用の検出からなる。サンプル中の被検物質のイムノアッセイまたは特異的結 合対アッセイにおいて、イムノアッセイ容器中におけるサンプルの存在または不 存在を、サンプルが存在するとシグナルを産生できるサンプルモニター試薬また は試薬系によって検出し、サンプルモニター試薬または試薬系はイムノアッセイ または特異的結合対アッセイ自体における被検物質の検出に用いられる被検物質 特異的試薬または試薬系とは異なるイムノアッセイまたは特異的結合対アッセイ を提供する。

サンプルの存在を確定する本発明の方法ならびに本発明のイムノアッセイおよび 特異的結合対アッセイにおいて、サンプルモニター試薬または試薬系は、検討す るサンプルを含有していなければならない反応混合物中に存在する。サンプルの 存在下にサンプルモニター試薬または試薬系によって産生されるシグナルは。

定性的または定置的に測定することができる。陽性または陰性シグナルはそれぞ れ、サンプルの存在または不存在を意味する。シグナルの定量的測定はサンプル の定量的測定を可能にする。イムノアッセイまたは特異的結合対アッセイ自体は 。

捕獲アッセイの場合、一般的にサンプル検出工程の後に行われる。均一相アッセ イの場合には、サンプルモニタ一工程は一般的に、アッセイ自体に必要な各種試 薬のすべての添加が完了する前に、予備的工程として行われる。しかしながら。

所望により、サンプルモニタ一工程とアッセイの順序は適宜変動させることがで きる。

サンプルモニター系がイムノアッセイ容器中のサンプル欠落を示している場合。

サンプルはその段階で添加され、アッセイ自体を行ってもよい、あるいは全アッ セイ過程を反復してもよい、小規模なアッセイの場合、サンプルの欠落した容器 があればサンプルを添加し、アッセイ手順を継続する方が便利である。大規模ア ッセイの場合、とくに複数のアッセイを同時に行っている場合には、サンプルの 欠落した容器を書き留め、一連のアッセイを継続し、書き留めたサンプルのアッ セイを再実施する方がより便利である。サンプル検出工程ならびにアッセイ自体 の結果が記録されるシステム、とくに部分的もしくは完全に自動化されている過 程においては、サンプル検出工程の結果を別個に記録しないで全アッセイの工程 を実施してもよい、アブセイ終了時、サンプル検出工程での陰性結果から偽陰性 結果が明らかになる。そのサンプルについてのアッセイはその後に反復すること ができる。

したがって１本発明はサンプル中の被検物質についてのイムノアッセイまたは特 異的結合対アッセイを行うイムノアッセイ容器中における体液サンプルまたはヒ トまたは非ヒト動物生体由来サンプルの存在を確認する方法において。

（１）　（ａ）イムノアッセイ容器中で、サンプル、およびサンプルが存在する 場合にシグナルを産生できるサンプルモニター試薬または試薬系からなる液体を 混合するか、または （１）　（ｂ）サンプルが存在するとシグナルを産生できるサンプルモニター試 薬または試薬系が固体支持体上に固定化されてなるイムノアッセイ容器にサンプ ルを添加し。

（ｉｉ）サンプルモニター試薬または試薬系によって発生したシグナルを検出し 。

この場合、サンプルが存在するとシグナルを産生できるサンプルモニター試薬ま たは試薬系はイムノアッセイもしくは特異的結合対アッセイ自体において被検物 質の検出に用いられる被検物質特異的試薬または試薬系とは異なり、ついで（ｉ ｉｉ）関心被検物質のイムノアッセイまたは特異的結合対アッセイを行い。

サンプルモニター試薬または試薬系によって生じる陰性シグナルは偽結果とする 。

イムノア、セイにおける偽陰性結果を確定する方法を提供するものである。

「被検物質」の語は本明細書においては、検討するサンプル中の関心抗体もしく は抗原、または抗原および抗体以外の特異的結合対の場合には測定されるその対 のメンバーを意味して使用される。上述のように、サンプル自体の検出に用いら れるサンプルモニター試薬または試薬系は、関心被検物質の検出のためのアッセ イ自体で用いられる試薬または試薬系とは異なる。「サンプルモニター試薬また は試薬系」および「非被検物質特異的試薬または試薬系」の語は本明細書におい てはいずれも検討するのサンプルの検出に用いられる試薬または試薬系を意味し 、その試薬または試薬系は関心被検物質の検出に用いられる試薬または試薬系（ 被検物質特異的試薬または試薬系）とは異なる。すなわちそれぞれが発生するシ グナルは異なる。

本発明はさらに、イムノアッセイもしくは特異的結合対アッセイにおいて検討す るサンプルのイムノア１セイ容器中における存否を検出するためおよび／または 偽陰性結果を検出するための、関心サンプルが存在する場合にシグナルを産生で きるサンプルモニター試薬または試薬系の使用を提供する。

本発明はまた。被検物質のイムノアッセイまたは特異的結合対アッセイに使用す るための液体試薬であって、検討するサンプルが存在する場合にはシグナルを産 生できるサンプルモニター（非被検物質特異的）試薬または試薬系からなる液体 試薬を提供する。液体試薬は一般に希釈液、と（にサンプル希釈液である。

さらに本発明は、イムノアッセイまたは特異的結合対アッセイに使用するための ビーズまたはイムノアッセイ容器であって、そのビーズ上またはその容器の内部 表面に検討するサンプルが存在する場合にはシグナルを産生できるサンプルモニ ター（非被検物質特異的）試薬または試薬系が固定化されているビーズまたはイ ムノアッセイ容器を提供する２別法として、またはさらに付加的に、ビーズまた はウェルを被検物質の捕獲剤でコーティングすることもできる。他の可能性とし て、イムノアッセイとビーズの一方をサンプルモニター試薬もしくは試薬系でコ ーティングし、他方を関心被検物質の捕獲剤でコーティングすることも考えられ る。このような２成分の系も本発明の一部である。

本発明はまた。複数個のこのようなイムノア１セイ容器と（にマイクロウェルの アセンブリーの形態、とくにマイクロタイタープレートを提供する。

本発明はまた。検討するサンプルについてイムノアッセイまたは特異的結合対ア ッセイを行うためのキットであって。

（ａ）サンプルの存在下にシグナルを産生できるサンプルモニター試薬または試 薬系からなる液体および／または （ｂ）各ｓ器またはビーズにはサンプルの存在下にシグナルを産生できるサンプ ルモニター試薬または試薬系が固定化されている複数個のイムノアッセイ容器ま たはイムノアッセイ容器中に用いられるビーズ。

からなるキットを提供する。

被検物質の捕獲剤も、サンプルモニター試薬または試薬系が固定化されているビ ーズまたはウェルに固定化することができる。キットがサンプルモニター試薬も しくは試薬系が固定化されたビーズもしくはウェルから構成されていない場合。

キットは検討する被検物質の捕獲剤でコーティングされたビーズもしくはウェル 。

またはコーティングされていないウェルから構成されてもよい、イムノアッセイ 容器とビーズの一方がサンプルモニター試薬または試薬系でコーティングされ。

他方が関心被検物質の捕獲剤でコーティングされた上述の２成分系は９本発明の キットとして提供することもできる。凝集または７０キユレーンツンアノセイの スライドまたはタイルをウェルおよびビーズの代替として提供することもできる 。

所望により１本発明で用いられるイムノアッセイ容器は固定化された型でのサン プルモニター試薬系の一成分を構成し、液体試薬一般的には希釈液、とくにイム ノアッセイまたは特異的結合対アッセイのサンプル希釈液はサンプルモニター試 薬系の他の成分を構成することもできる。このような試薬系は本発明のキットに 使用することができる。

本発明のサノブルモニター系は偽陰性結果の原因の一つ、すなわち、イムノア、 セイ容器中のサンプル不存在の排除を可能にする。たとえば、被検物質の量を測 定するイムノアッセイまたは特異的結合対アッセイにおいて、結果が検出の下限 に近い場合、サンプルモニター試薬または試薬系の使用はサンプルは存在したこ との確証を提供する。被検物質の存在または不存在が決定されるイムノアッセイ または特異的結合対アッセイにおいて、サンプルモニター試薬または試薬系の使 用は陰性結果が真の陰性かまたはサンプルの欠落による偽陰性かの明快で直接的 な証明を提供する。

したがって９本発明のサノブルモニター系はすべてのイムノアッセイおよび特異 的結合対アッセイにおいて偽陰性結果の検出、すなわち排除を可能にする点で価 値がある。その結果が臨床診断および予後判定に用いられるイムノアッセイおよ び特異的結合対アッセイの場合にはとくに価値のあるものである。また、病原性 生物たとえばＨＩＶ、肝炎ウィルスおよび梅毒についての供血のスクリーニング に用いられるイムノアッセイにおいてもとくに価値がある。血液のスクリーニン グアッセイにおける偽陰性結果は汚染白液が血液供給へ混入する可能性を生じる ことになる。

検討するサンプルは、ヒトまたは非ヒト動物体液、たとえば血液（一般に血清ま たは血漿の形態）、尿、唾液または脳を髄液である。サンプルはヒトまたは非ヒ ト生体由来のサンプル、たとえば組織、たとえば生検標本に由来するものでもよ （、また生体産物たとえば糞、痰、膿、膿瘍液または他の滲出液に由来するもの でもよい。

イムノアッセイまたは特異的結合対アッセイにより検討される被検物質の例は後 述する１本発明の一つの重要な０様は、たとえば病原生物、あるいは生体内の生 理的もしくは生化学的変化または生体内機能不全たとえば癌もしくは自己免疫疾 患によって引き起こされる疾患状態の検知のためのイムノアッセイまたは特異的 結合対アブセイにおけるサンプルの検出への１本発明のサンプルモニター試薬ま たは試薬系の応用である８本発明のその他の重要な側面は１本発明のサンプルモ ニター試薬および試薬系の供血のスクリーニングのためのイムノアッセイへの応 用である。

サンプルモニター試薬または試薬系によって発生するシグナルは、たとえば色の 変化または化学発光もしくは蛍光シグナルの変化である。変化はたとえばサンプ ルが添加されたときの希釈液の色の変化のように直接肉眼でＵ察できるもの。

および／またはたとえば光度計または蛍光光度計を用いて測定できるような色ま たは他の変化であってもよい、自動または半自動のイムノアッセイシステムを用 いる場合、アフセイブロトコールにサンプル添加工程後の余分の測定工程を組み 入れることは容易に可能である。

本発明の方法はイムノアッセイ容器中におけるサンプルの存否の検出および／ま たは、とくに適当な機器たとえば光度計または蛍光光度計により色または他の変 化が測定される場合には、どれだけのサンプルが添加されたかの検出に利用でき る。

サンプルが血清または血漿で、血清または血漿から構成されていない希釈液を必 要とするイムノアッセイまたは特異的結合対アッセイでは、血清または血漿中に は存在するが希釈液中には存在しない成分の存在によりシグナルを産生できるサ ンプルモニター試薬または試薬系を使用してサンプルの存在を検出することが可 能である。

アルブミンを検出するのがとくに有利であるが、他の血清−もしくは血漿−特異 的タンパク質、または他の高分子量成分、たとえばセル口プラスミン、トランス フェリン、血清もしくは血漿酵素も検出できる。そのほか、血清または血漿の低 分子量成分、たと丈ば金属イオン、アミノ酸または糖たとえばグルコース、カル シウム、マグネ／ラム、鉄、トリグリセライド、チロシン、または尿素がたとえ ば後述のようにして検出できる。

血清−または血漿−特異的タンパク質、血清または血漿の高分子量または低分子 量成分のいずれが検出される場合であっても、希釈液およびサンプルが混合され た場合、希釈液中のサンプルモニター試薬または試薬系は検出可能なシグナル。

たとえば色の変化を生じるものでなければならない。

血清または血漿サンプルの存在が得られた混合物中におけるアルブミンの存在に より検出される場合には、様々の適当な指示薬が知られている。たとえば、ブロ モクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールブルーお よびンアノージ（４−ニトロフェニル）−メタンであり、それぞれアルブミンの 存在下に特徴的な色の変化を示す、たとえば、ブロモクレゾール／く一プルはア ルブミンの存在下に黄色から紫色へ変化する。ラーマ１ンーブリリアントブルー はさらに適当な指示薬である。これはアルブミンと結合して黄色から青色へ変化 する。いずれの場合も２色の変化は肉眼および／または分光光度計で測定できる 。

上記の試薬はそれぞれ、至適な挙動を示す特有のｐＨ範囲があり、好ましくは試 薬の選択に際して、それが使用される特定のアッセイ系のｐＨを考慮するべきで ある。たとえば、ブロモクレゾールパープルは中性のすぐ下のｐＨ値で最適に機 能シ、シフ／−ノ（４−ニトロフェニル）−メタンは中性以上のｐＨ［でｊｌｌ ｌｌ−機能し、ブロモクレゾールグリーンはｐＨ６付近で最適に機能する。

米国特許明細書第５．１８２．２１４号には、ヒト面消アルブミンに特異的で。

とくに高感度であるという陰イオン性ンア二ン色素が記載されている　それらは 蛍光色素である。

イムノアッセイのデザインは希釈剤中のｍｌ清または血漿の使用から離れていく 傾向にはあるが、なお多くのイムノアッセイにおいて血清または血漿からなる希 釈液の使用が要求されている。たとえば、比較的低分子量の成分たとえば金属イ オン、Ｉ！およびアミノ酸を除去するために、イム／アッセイ希釈液に用いる前 に血清または血漿を透析またはゲル濾過することは好都合な製造実務であり１本 発明の目的からもまた好ましいものである。

用いられる希釈液が血清も血漿も含有しないか、または希釈液中に使われる血清 または血漿が上述のように低分子量成分の除去処理が行われている場合には。

サンプルの存在はイムノアッセイ容器中における血清または血漿の低分子量成分 の存在によって検出することができる。検出可能な低分子量成分の例には、たと えばグルコース、カルシウム、マグネシウム、鉄、トリグリセライド、チロシン および尿素がある。

血清または血漿サンプル中において、グルコースは比色酵素検出系、たとえばグ ルコースオキシダーゼ／ペルオキ／ダーゼを用いて検出できる。このような系は よく知られていて、グルコースの存在下５０５ｎｍにおいて色の変色が起こる。

他の低分子量成分の検出に適した試薬および試薬系もよく知られていて、たとえ ば、カル／ラムは０−タレオゾールフタレイン、マグネ／ウムはエリオクロムブ ラノク、鉄はフェロジンによって検出可能であり、尿素はウレアーゼ／グルタメ ートデヒドロゲナーゼ系を用い３４０ｎｍにおける吸収で測定される。

しかしながら、使用する希釈液が血清または血漿を含有する場合でもなお、ある 条件下ではアルブミンの存在によってサンプルを検出することが可能である。

アルブミンの指示薬が使用される場合に観察される色の変化はアルブミン分子上 の特定部位への指示薬の結合の結果化じる。他の化合物、たとえばサリチル酸塩 。

アミノ−ナフタレンスルホン酸、パルプロ酸および胆汁色素はそれらの部位に一 般的には指示薬より強（結合できる。このようなより強力に結合する化合物を遮 断化合物として用い、アルブミン上の結合部位を遮断することが可能である。

アルブミンを含有する希釈液への遮断化合物の滴定により、希釈液中に存在する アルブミンに結合する指示薬の量を最小限に抑え、サンプルがサンプル希釈液と 混合された場合にサンプル中のアルブミンは最大量の指示薬と結合し、したがっ てシグナル好ましくは色の変化が生じるような、遮断化合物の濃度を見出すこと が可能である。たとえば１０％血清からなる希釈液において、最終イムノアノセ イ混合物中に等容量のサンプルと希釈を用いる場合、遮断剤として用いるパルプ ロ酸の至適濃度は希釈液巾約０．５ｍＭである。

検出するサンプルが血清または血漿以外の場合には、アッセイの希釈液は、サン プルの成分であるが希釈液中には存在しない物質の存在下に検出可能なシグナル たとえば色の変化を引き起こすサンプルモニター試薬または試薬系から構成され なければならない。

たとえばサンプルが尿の場合、希釈液には、たとえば尿素の存在ををたとえば上 述ノウ−アーゼ／グルタメートデヒドロゲナーゼ系を用い、または尿酸の存在を ウリカーゼ／ベルオキ／ダーゼ系を用い、５２０ｎｍにおいて色の変化を測定し て検出する試薬または試薬系を含有させることができる。

サンプルがたとえば脳腎髄液の場合、サンプルの存在はグルコースまたはアルブ ミンの存在により測定できる。同様に、サンプルが唾液の場合、グルコースの存 在がサンプルの存在を指示する。

他のサンプル検出方法にはサンプルと希釈液が混合されたときに起こるｐＨ効果 を利用する方法がある。イムノアッセイにおいては、そして特異的結合対アッセ イにおいても、アッセイの各種段階でｐＨが最適値に維持されていることを保証 するため、用いる試薬を緩衝化するのは慣行である。しかしながら、試薬たとえ ばサンプル希釈液が弱くしか緩衝化されていない場合または全く緩衝化されてい ないと、サンプルが添加されたときｐＨは変化することになる。たとえば、サン プル希釈液が最初はわずかに酸性またはわずかにアルカリ性で、緩衝能が弱いか 全くない場合、血清または血漿のタンパク質および無機成分の緩衝作用のため。

希釈液が血清または血漿と混合されるとｐＨは中性方向へ変化する。このような ｐＨ変化はｐＨ指示薬（染料）の試薬たとえばサンプル希釈液中への導入により 。

サンプル添加のモニターに利用することができる。指示薬は肉眼で較察可能およ び／または分光光変法測定により検出可能な色の変化を与える。

イムノアッセイのｐＨは一般的にｐＨ５からｐＨ９の範囲に維持される。したが って、サンプルモニター試薬の初期ｐＨは、サンプルの添加後に得られた混合物 のｐＨが５〜９の範囲内たとえば６５〜７５の範囲内になるような値でなければ ならない１選択された指示薬はｐＨが中性方向に動くに従って変色するものでな ければならない、たとえば初期ｐＨが酸性であってもアルカリ性であっても指示 薬は血清または血漿のサンプルがｐＨを中性方向に動かすのに応じて変色をしな ければならない、たとえば、ｐＨが酸性側から動く場合にはｐＨ５付近で好まし くは約６．５で、アルカリ性のｐＨから中性方向に動く場合にはｐＨ約９で好ま しくは約７．５で、指示薬は変化しなければならない。

酸性から中性へのｐＨ変化に適した指示薬の列には、エチルレッド（ピンクから 黄色）、メチルレフト（赤から黄色）、ニュートラルレッド（プラムレッドから オレンジ）、クロロフェノールレッド（黄から紫色）およびフェノールレッド（ オレンジから赤）がある、アルカリ性から中性へのｐＨ変化に適した指示薬の例 には、フタレインパープル（紫から黄色）、チモールブルー（青から緑）、およ びチモールフタレイン（青から無色）がある。

指示薬の濃度は必要に応じて調節できる。たとえばサンプルのモニターが肉眼検 査によって行われる場合には２分光光度法が使用される場合よりも高′ａ度の指 示薬の使用が望ましい、一部の指示薬たとえばチモールフタレイン、クロロフェ ノールレッドおよびフェノールレッドは他の指示薬より水性溶液中に溶は易く。

したがって、高濃度の指示薬が用いられることからサンプル添加の肉眼的評価に おける使用に、より適している。

一部の指示薬の変色は他の指示薬の場合より肉眼による検出が容易である。

本発明者らは、クロロフェノールレッドが、その黄色から紫への変色が明瞭かつ 劇的であることから、肉眼的評価にとくに有用であることを見出している。変色 は肉眼的評価に代えてまたはさらに付加的に分光光度計によって読み取ることが できる。サンプルの定量的測定は分光光度法を用いて行うことができる。

上述したように、サンプルが存在するとシグナルを産生できるサンプルモニター 試薬または試薬系は、一般には希釈液に添加される。希釈液は一般にサンプル希 釈液であるが、別法としてイムノア、セイ操作の別の段階に用いられる希釈液で あってもよい、凝集アッセイ、たとえばラテックス凝集アッセイもしくはヘマグ ルチネーンヲンアブセイ、またはフロキュレーンゴンア１セイの場合には、希釈 液は粒子を懸濁させる希釈液であってもよい、サンプルの存在下にシグナルを生 じる試薬または試薬系は、とくに均一相アッセイの場合、イムノアッセイまたは 特異的結合対アッセイで用いられる他の試薬に添加することができる（本明細書 中の希釈液に関するすべての記述は９問題のアッセイにおいて用いられる池のす べての液体試薬にも同様に適用されることを理解すべきである）。

液体の形態でサンプルモニター試薬または試薬系を提供する場合の別法として。

すべてのまたは一部のサンプルモニター試薬または試薬系は固体支持体上１こ固 定化することもできる。支持体は、とくにマイクロウェルの場合、イムノアッセ イ容器自体の内壁であってもよく、また固体支持体はビーズもしくはさらに小さ い粒子、一般的には市販の系で用いられるビーズであってもよい、固体支持体上 に固定化されている場合には、サンプルモニター試薬または試薬系は単独でもし くは多目的コーティングたとえばそのイムノアッセイ自体の被検物質の捕獲剤も 包含するコーティングの一成分として、容器の内壁またはビーズ上のすべてまた は一部にコーティングすることができる。すなわち、コーティングされたイムノ ア１セイ容器は、たとえばマイクロタイタープレートの形態でのコーティングさ れたマイクロウェルのように、複数の他の容器と組合わせて存在さ壮ることがで きる。ビーズ系の場合には、一部のビーズおよび容器がサンプルモニター試薬ま たは試薬系で、残部は被検物質捕獲剤でコーティングすることもできる。

サンプルモニター試薬が固定化されている場合には、一般にその試薬は液体中で の使用に際して要求されるよりもさらに安定した試薬であることが必要である。

たとえば、固定化するためには、試薬は酵素ベースの系であるよりも１色素また は指示薬であることが好ましい、サンプルの成分と相互作用する色素および指示 試薬の例、ならびにｐＨ指示薬の例は上述の通りである。この系はサンプルの定 性的または定量的検出に使用できる。

多（の場合、多数のイムノア・１セイまたは特異的結合対アッセイを行っている 技術者が、見やすい明らかな色の変化により容易にサンプルの存在をチェ・ツク できるような濃度でサンプルモニター試薬または試薬系を使用するのが有利であ る。

別法または付加的な方法として、／ステムは検出可能なシグナルが適当な機器を 用いて測定できるシステム、たとえば変色を適当な波長を選択し襟準的マイクロ プレート分光光変法リーダーを用いて測定できるシステムとすることができる。

このような追加工程は容易に自動システムに組み込むことができる。検出１ま定 性的であってもよく、また所望により、たとえば存在するサンプルの容量を知り たい場合には定量的にすることもできる。

選択されるサンプルモニター試薬または試薬系は、サンプルの存在により産生さ れるシグナルが、以後のイムノアッセイまたは特異的結合対アッセイに干渉しな いものでなければならない、１つの方法は、アッセイ自体の被検物質特異的試薬 系が産生ずるシグナルとは種類の異なるシグナルを産生できるサンプルモニター （非被検物質特異的）試薬または試薬系を用いるものである。たとえば、アッセ イ自体のシグナルが色の変化である場合には、サンプル検出のためのシグナルは 化学発光または蛍光シグナルとすることができる。逆に、被検物質特異的試薬系 が化学発光または蛍光シグナルを利用する場合には、サンプルモニター試薬また は試薬系は色の変化を虫供するものとすることができる。

サンプル検出およびアッセイ自体に種類の異なるシグナルを使用することは。

均一相イムノアッセイおよび特異的結合対アッセイの場合、また被検物質の検出 に化学発光または蛍光シグナルを使用するイム／アッセイおよび特異的結合対ア ノセイノの場合にも好ましい、とくに単純ではあるが効果的なサンプル検出系は サンプルが存在すると肉眼で検出可能な色の変化を与えるサンプルモニター試薬 または試薬系の使用である。サンプルの存在はさらに池のモニター機器の必要も なく、肉眼的検査で簡単に決定できる。

干渉を避ける他の方法には、サンプル検出工程およびアッセイ自体に同じ種類の シグナルを用いるが、生成したシグナルの変化が互いに干渉しないような試薬お よび試薬系を２つの工程に選択する方法があり、たとえば両試薬が同じスペクト ル領域において光を吸収または透過をしないようにする。

色のシグナルの場合には、たとえば２つの試薬の光を吸収する波長が有意な程度 の重複を起こさないように選択されなければならない、たとえば、ベルオキ、・ ダーゼは、過酸化水素および発色原、多くの場合３．３°、５．５’−テトラメ チルベンチジノとともに酵素イムノアツセイにおいてきわめて一般的に用いられ る。この系は４５０ｎｍで測定できるシグナルを与える。ベルオキ／ダーゼ系の 波長とは異なった波長において、多くのサンプルモニター試薬および試薬系が特 徴的な色の変化を示す、たとえば、ブロモクレゾールパープルはアルブミンの存 在下で特徴的な色の変化を与え、吸収のピークは約６２０ｎｍであり、尿素検出 に用いられるウレアーゼ／グルタメートデヒドロゲナーゼは約３４０１ｍに色の 変化を与える。同様に、サンプルモニター試薬としての使用は前述したｐＨ指示 薬も特徴的な波長において色の変化を示し、たとえば、クロロフェノールレッド の黄色（酸性）から紫（中性）の変色は５７０ｎｍで読み取ることができる。適 当なサンプルモニター試薬または試薬系が、他の着色被検物質試薬系との使用の ために同様に選択できる。

捕獲イムノアッセイまたは特異的結合対アッセイの場合にはサンプルは一般に。

被検物質を捕獲するための固定化成分とインキュベートされ、ついで結合した被 検物質の検出の前に洗浄工程が行われる。したがって、サンプル検出工程は一般 に、被検物質検出工程の前に行われることになる。したがって、シグナル検出系 は、均一相アッセイの場合よりも広く選択すことができる１色の変化を含む検出 系がづンブル検出および被検物質検出のどちらにも使用できる。サンプルおよび 被検物質の雨検出シグナルが色の変化である場合には、サンプル検出のための色 の変化は一般的に被検物質の検出のための色の変化とは興なる波長で生じる。

凝集またはフロキュレーン璽ンアノセイ、たとえばラテックス凝集アッセイ。

ヘマグルチネーシ譚ンアッセイ、またはカーボンの微粒子を用いて７０キユレー ジテン効果を増強するフロキュレージ嘗ンアノセイの場合には、サンプル検出シ グナルは色の変化またはその他のシグナル、たとえば蛍光シグナルとすることが できる。

上述のように９本発明はイムノアッセイ容器中で行われる均一相イムノアッセイ もしくは特異的結合対アッセイ、または固相捕獲イムノア１セイもしくは特異的 結合対アッセイにおけるサンプルの存在の検出に使用できる１本発明は９手動ま たは自動サンプル分配のいずれかにより、複数のアッセイが同時に行われる場合 とくに有用である。／グナルは肉眼で判定できる色または他の変化および／また は分光光度計または他の計測装置で測定できる変化とすることができる。アッセ イが完全にまたは部分的に自動化／ステムで行われる場合２本発明はマイクロタ イタープレートの操作にもまたビーズフォーマットを用いるアッセイの実施にも 利用できるのでとくに有用である。均一相アッセイにおけるサンプルの検出は一 般に、イムノアッセイ容器へのサンプルの添加後、イムノアッセイまたは特異的 結合対アッセイに必要な各種試薬のすべてが添加される前に行われる。

捕獲アッセイの場合、サンプル検出工程はサンプル添加工程後の時点、たとえば 、インキエペーシ曹ン工程の開始時、その工程中またはその終了時に行われる。

付加的な検出工程、と（に色の変化を測定する工程は、とくに自動化されたシス テムの場合アブセイブロトコール中に容易に導入することができる。

本発明はまた。多数のサンプルが手動または自動で分配されるイムノアッセイ容 器中で行われる大規模な凝集またはフロキュレージ璽ンア１セイ、たとえば複数 個のラテックス凝集アフセイ、ヘマグルチネーシロンア１セイまたは７０キユレ ージ讐ンアフセイが行われる場合に、とくに有用である。

いずれのタイプのアッセイにおいても、技術者がサンプル添加工程後かつアッセ イ自体の前に、イムノアッセイ容器の検査を行える場合には、肉眼で判定できる 色の変化が得られるサンプルモニター試薬または試薬系を用いることが有利であ る。このようなサンプルモニター試薬は単純で、安価で、効果的である。

別法としてまたは付加的手段として、余分の分光光度的測定または他の測定工程 をイムノア１セイまたは特異的結合対アッセイのプロトコールに組み込むことが る。これは９手動または部分的もしくは完全自動化システムのいずれを用いる場 合にも容易である。これはまた、ほかに装置を必要としないことからも安価であ る。追加の測定および記録工程をアメセイブロトフールに使用する利点は、ア、 セイをサンプル検出工程での検査のために停止させることなく、始めから終わり まで実行できることである。サンプル検出工程の結果およびアッセイ自体の結果 はアッセイ終了時に比較することができる。サンプル検出段階での陰性の結果は サンプルの添加洩れによる偽陰性結果を指示する。そのサンプルについてはつい でアッセイを反復できる。

被検物質の測定に化学発光または蛍光分光法を用いるアッセイの場合には、さら に色の変化を与えるサンプルモニター試薬または試薬系の使用、およびアブセイ ブロトフールへのサンプル添加後の分光光度計測定工程の組み込が選択されるこ とになる。余分のの装置が要求されても２分光光度計、たとえばマイクロタイタ ープレートリーダーはイムノアッセイおよび特異的結合対アッセイを行っている 実験室では標準的な装備である。

いくつかの異なったす／プルモニター試薬や試薬系については前述した。試薬ま たは試薬系の選択が、たとえば利用可能な装置、アッセイフォーマット。被検物 質検出系の性質、または検討するサンプルの性質により制約される場合もある。

しかしながら、サンプルの成分と相互作用して色の変化を与える試薬または染料 を用いるサンプルモニター試薬および試薬系、ならびにサンプルの添加により色 の変化を与えるたとえば上述のようなｐＨ指示薬は、一般に化学発光、蛍光また は酵素系を用いる場合より安価であることを留意すべきである、それらは一般に 。

より耐久性でもある。それらはまた、と（にサンプルの存在の検出に肉眼的検査 を用いる場合には、迅速で使用が容易である。したがって、このようなサンプル モニター試薬または試薬系の選択には実用上の利点がある。

イムノアッセイは十分に確立され、臨床診断および予後判定ならびに供血のスク リーニングの両者に広く用いられている。イムノアッセイにおいて測定されるそ れら被検物質は抗原、抗体または〕＼ブテンである。

抗原またはハブテンは、疾患たとえばウィルス、細菌、原虫類、かび類および他 の寄生生物による感染症に関連する場合がある。検出する抗原またはノ＼ブテン は病原性生物自体に関連するかまたはそれに由来するものである。たとえば、Ｂ 梨肝炎ウィルスの一つの試験はＢ型肝炎表面抗原の検出が関与するものである。

病原性抗原についての多くの他の７１セイが知られていて、市販品を利用できる 。

また感染性の生物の産生物たとえばトキンンやトキソイドも興味がもたれる。疾 病に応答して生体が産生じ、または疾病の結果として異常量が産生される「サロ ゲートマーカー」と呼ばれる場合もある抗原は、イムノアッセイにより測定する ことができる。肝疾患に対するサロゲートマーカーである酵素アラニントランス アミナーゼ（Ａ　Ｌ　Ｔ）はその１例である。

それに対する抗体を励起できるホルモン、たとえばインスリン、エストロゲン。

プロゲステロンおよびペプチドホルモンもイムノアッセイによって測定できる。

実際、抗体を励起するすべての物質がイムノアッセイによって測定できる。イム ノアッセイによって測定できるノーブテンの例としては、治療薬剤および濫用薬 剤。

たとえばジゴキノン、サイロキシン、抗−てんかん薬１モルヒネおよび他のオピ エート類、アンフェタミン、バルビッール酸ならびにコカイン代謝物を挙げるこ とができる。

イムノアッセイはまた抗体の測定にも用いられる。抗体はそれ自体、たとえば自 己免疫抗体、骨髄腫抗体、および各種アレルギーに対する抗体の場合のように直 接臨床診断または予後判定に興味がもたれる場合がある。現在用いられているイ ムノアッセイで検出するにはサンプル中の抗原自体の量が少なすぎるため、実際 問題として関心抗原に対する抗体を検出することが必要な場合もある。現在では 病原性生物体たとえばＨＩＶおよびＣ型肝炎ウィルスのようなある種の血液伝播 性ウィルスに原因するある種の疾病がそれに該当する。したがって、抗体アッセ イは多種類の病原性生物たとえばウィルス、細菌、カビ、原虫類および他の寄生 生物体による感染症の間接的な検出に有用である。

本明細書において抗体および抗原との関連で記述されるイムノアッセイ技術は。

抗原および抗体以外の特異的結合対のメンバー、とくにレセプターおよびそれら のりガンどの検出および／または測定に同等に適用可能であり１本明細書におけ るイムノアッセイに関する記述も対応する特異的結合対アッセイに適用される。

リガンドの例には、ホルモンたとえばインスリンおよびグルカゴン、アミノ酸輸 送タンパク質、ウィルスフートタンパク質、神経伝達に関与する分子たとえばア ドレナリン作動性およびコリン作動性神経伝達物質、セロトニンおよびドーパミ ン、アドレナリン、ヒスタミンならびにサイトカインがある。リガンドまたはレ セプターに対する抗体を産生できる場合には、慣用のイムノアッセイによってリ ガンドまたはレセプターを測定することが好ましい場合もある。抗体の産生が困 難もしくは不可能な場合または他の理由からその方が望ましい場合には、リガン ドまたはレセプターはイムノアッセイに類似のアッセイたとえば均一相または固 相アッセイによって測定することができる。固相アッセイでは、リガンドまたは レセプターのいずれかが固相上に固定化される。リガンドのアゴニストおよびア ンタゴニストはこのような系により測定が可能で、「被検物質」の語にはそのよ うなアゴニストおよびアンタゴニストが包含される。

上に指摘したように１本発明のサンプルモニター系は偽陰性結果の１つの原因つ まりアッセイ容器中のサンプルの不存在の排除を可能にする点でと（に有用であ る、たとえば、被検物質のレベルが測定されるアッセイではサンプルモニター試 薬または試薬系の使用は検出の下限に近い検出結果の場合にサンプルの存在の確 証を提供する。被検物質の存在または不存在が測定されるアッセイでは、サンプ ルモニター試薬または試薬系の使用は陰性結果が真の陰性かまたはサンプルの添 加洩れによる偽陰性かの明瞭で即時の証明を提供する。

本発明のサンプルモニター試薬または試薬系の有用性を示す１つの例には病原体 汚染のない血液および血液製品の供給維持のための供血のスクリーニングがある 。血液スクリーニングは大規模に行われることが多く、そして血液の貯蔵寿命が 短いため短時間内に行わねばならない大量の試験に対処するために自動装置が開 発されている。各国の規制機関は試験が行われるべき病原体を特定している。

大部分の国において、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎（非−Ａ非−Ｂ肝炎）、Ｂ型肝炎および 梅毒に対するスクリーニングは必須となっている。一部の国ではさらにＨＴＬＶ に対する試験の要求もある。大部分の国においてＨＩ　Ｖ−１およびＨＩ　Ｖ− ２両者に対する試験が必須である。臓器移植を受けるもしくは受けた患者、また は免疫学的に脆弱化している患者への輸血に用いられる血液では、一般にＣＭＶ 　（サイトメガロウィルス）の存在に関しても試験される。

血液スクリーニングのために最も広く用いられている試験はイムノアッセイであ る。上に掲げた大部分の病原生物体に関しては、抗原の存在について血液を試験 する場合に、要求される感度を得ることは、抗体の存在について試験する場合よ りも困難である。一般にＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶおよびＣＭＶに対する試験は 抗体試験である４　Ｂ型肝炎に対しては２つの試験がある。すなわちＢ型肝炎表 面抗原（ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ）に対する抗原アッセイおよびＢ型肝炎コア抗原（Ｈ Ｂｃ）に対する抗体試験である。現在、ＨＢｓＡｇ試験が大部分の国で必須であ る。Ｂ梨肝炎コア抗体についての試験は一部の国で必須であるが、今後さらに多 くの国に導入されるものと思われる。梅毒に対しては抗体試験および抗原試験の 両者がある。梅毒試験は現在ではへマグルチネーノーＩン試験、およびフロキュ レーンラン効果を増強させるために微粒子カーボッを用い陽性または陰性結果の 測定を明瞭にしたフロキュレー／ヲンγノセイが用いられている。その他の病原 体は一般に酵素イムノアッセイを用いて試験されている。

血液スクリーニングアッセイで得られる結果は陽性、陰性または不確定に分類さ れる。陽性および不確定サンプルは異なったアッセイを用いてさらに検査される 。

スクリーニングアッセイにおける偽陰性結果が供給血液の汚染、受血者の感染に つながることは明らかである。供血のスクリーニングにおける偽陰性結果の排除 のための本発明のサンプルモニター試薬または試薬系の使用の重要性を過小評価 すべきではない。

血清または血漿サンプルの検出について上述したサンプルモニター試薬または試 薬系は血液スクリーニングに用いることができる。適当な試薬とくにサンプル希 釈液が血清または血清をほとんどまたは全く含まない場合には、アルブミンの存 在をたとえば上述の色指示薬を用い検出することによりサンプルの存在を検出す ることが有利である。他の有利なサンプルモニター試薬は、サンプルが緩衝化さ れていないかまたはわずかじかｔｉ衝化されていない場合の、ｐＨ変化に反応す る色指示薬から構成される。

肉眼によって検出できる色指示薬の使用が有利である０分光光度測定法は付加的 にまたは肉眼検査に代え使用できる。マイクロタイタープレートを用い、サンプ ル添加工程後にプレートを肉眼で検査する血液スクリーニングアッセイ用のサン プル希釈液中にブロモクレゾールパープルをサンプルモニター試薬として使用す るのは血液スクリーニング検査室において、きわめて効果的であることが証明さ れている。

以下の実施例は発明の詳細な説明するものである。

烈ユ アルブミンの検出による血漿サンプルの検出使用したアッセイはＨＩＶ抗体用の 市販酵素イム／アッセイ（ＥＩＡ）、すなわちＷｅｌｌｃｏｚｇｅ　ＶＫＳ４　 （’Ｗｅｌｌｃｏｚｙｍｅ−は商標である）である、このイムノア、セイキノト で提供される試薬は以下の通りである。すなわち。

ＨＴＶ−１およびＨＩ　Ｖ−２関連ペプチドエピトープでコーティングされた９ ６−ウェル付きマイクロタイタープレート：界面活性剤とｐＨ８，０のｐＨ緩衝 剤の溶液で、血清を含有しないサンプル希釈液：ｐＨが調節されたＨＩＶ−１お よびＨＩ　Ｖ−２ペプチドエピトーブの抗体接合体溶液：接合体に対する増幅系 成分を含有する基質溶液；および２Ｍ硫酸からなる停止溶液である。

サンプル希釈液はブロモクレゾールパープルを０．１２５ｍＭ濃度に添加して補 充された。

アッセイは、サンプル希釈液がサンプルのウェルへの添加前にすべてのウェルに 添加された以外、イムノアッセイキットに提供されている指示書に従って行われ た。略述すると、２５μ！のサンプル希釈液をマイクロタイタープレート中の各 ウェルに添加し、各ウェルに黄色を付与した。検討する個々の血清または血漿サ ンプル２５μｌをプレート中のウェルに添加した。サンプルはウェルＦ１２゜Ｇ １２およびＨ１２では故意に除外された。ウェル中の色はサンプルを添加すると 直ちに黄色から紫色に変化し、サンプルが除外されたウェルは肉眼で識別可能で あった。肉眼的検査に加えて、各ウェルの吸収をＭｕｌＨｓｋａｎ　ＭＣＣ／３ ４０Ｐの２．２０型プレートリーデイングスペクトロメーターを用いて６２０ｎ ｍで測定した。ウェルＡｌ−Ｈ６の結果は表ＩＡにウェルＡ７〜Ｈ１２の結果は 表ＩＢに示す。

表土Ａ Ａ　Ｏ，５０６０，５０４０，４９２０，５２５０，５２７０，５７５Ｂ　Ｏ， ４９００，５０８０，４９５０，５１２０，５３００，４９３ＣＯ，４８３０， ５１１０，４７１０，４８５０，４７９０，５３６Ｄ　Ｏ，４６５０，４９７０ ，４４５０，４６３０，５０４０，５２７Ｅ　Ｏ，４６８０，４９４０，４８６ ０，５２６０，５２１０，４４１Ｆ　Ｏ，５０３０，５０７０，４５１０，５１ ００，５２３０，５１９Ｇ　Ｏ，５０６０，４９００，４５４０，４９２０，４ ８９０，５１６ＨＯ，４９００，５１４０，４８９０，４７２０，４６００，４ ７６老±１ Ａ　Ｏ，５５７０，５７３０，５０７０，５６９０，５５８０，５８２Ｂ　Ｏ， ４６００，５１５０，５０７０，５１８０，５４７０，５４６ＣＯ，４６８０， ４８００，５４８０，５２１０，４７７０，４９９Ｄ　Ｏ，５１５０，５０９０ ，５９３０，４７７０，５３６０，５０９Ｅ　Ｏ，５３４０，４９１０，４９９ ０，５０２０，４７７０，５１５Ｆ　Ｏ，５２４０，５０００，４９９０，５６ ３０，４７２０，０５６Ｇ　Ｏ，５０８０，６１３０，５２６０，５１７０，５ ０５０，０５８ＨＯ，５１５０，５２３０，５８５０，５４８０，４７７０，０ ５８（Ｘ　＝　０．５０８±０．０３） 表ＩＡおよび表ＩＢに示した結果はサンプルが省がれたウェルＦ１２．Ｇ１２お よびＨ１２がサンプルを含有したウェルから著しく異なる光学的密度を有してい ることをを明瞭に示している。

このＨＴ■アフセイの全体的な結果は、希釈液にブロモクレゾールブルーが補充 されていてもいなくても同様であった。

東２のマイクロプレートは、添加された一部のサンプルがＨＩ　Ｖ−１抗体陽性 であることがわかっていること以外は上記と同様に調製した、ＨＩＶ陽性サンプ ルはウェルに二重に添加された。この各対のウェルの一方にはブロモクレゾール パープルを追加した希釈液が添加され、他方には同様の標準希釈剤であるが追加 の試薬を含まない希釈液が添加された。プレートは、サンプル添加後、上述した のと同様にして検査され、ついでＨＩＶアッセイはプレートおよびその内容物を ３７℃で３０分間インキュベートし、各ウェルに５０μｌの接合溶液を加え洗浄 し、ついで３７°Ｃで３０分間再インキュベートして完結させた。洗浄後、すべ てのウェルに増幅基質系を添加し、そして最終的にＭｕｌｔｉｓｋａｎプレート リーダーにより４９２ｎｍで光学濃度を測定した。

ウェルＡｌ−Ｈ６では使用された希釈液はブロモクレゾールパープルが補充され た希釈液てあり、ウェルＡ７〜ＨＩ２では補充されていない希釈液を用いた。

いくつかの弱いＨＴＶ陽性サンプルのアッセイを行った（このアッセイ系では弱 い陽性サンプルは強い陽性サンプルよりも検出が困難なことから９弱い陽性サン プルが選択された）、サンプル８４３はウェルＡ５およびＢ５．ＡｌｌおよびＢ １１；サンプル８４５はウェルＣ５およびＣ５，Ｃ１ｌおよびＤｌｌ；サンプル ９５１はウェルＥ５およびＦ５．ＥｌｌおよびＦｉｌ；サンプル８３４はウェル Ｇ５およびＨ５，ＧｌｌおよびＨｌｌに使用した。ＨＩＶ−１アフセイの対照は ウェルＡ６およびＢ６．Ａ１２およびＢ１２；ＨＩＶ−２の対照はウェルＣ６お よびＣ６，Ｃ１２およびＣ１２に用いた。他のすべてのウェルはＨＩ　ｖ陰性ｍ 清を含有させた。

Ｍｕｌｔｌｓｋａｎリーダー（１のフィルターは６２０；２のフィルターは６９ ０）で得られた結果は、マイクロプレートフォーマットで平均光学濃度として１ 表２Ａ（ウェルＡ１〜Ｈ６）および２Ｂ（ウェルＡ７〜Ｈ１２）、および表３に 示す。

轟主Ａ Ａ　Ｏ，０４９０，０４ｇ　０．０５２　０．５３５　０．５１９　１．０９２ Ｂ　Ｏ，０４３０，０５１０，０４９０，０４８０，４ｇ４　１．１３８ＣＯ， ０４９０，０３９０，０４３０，０４９０，２５３０，７９９Ｄ　Ｏ，０３８０ ，Ｑ４７　０．０４７　０．０５０　０．２６４　０．７７８Ｅ　Ｏ，０３７０ ，０３６０，０３９０，０４９０，１７７０，０６１Ｆ　Ｏ，０３７０，０３９ ０，０４２０，０５００，１７５０，０６１Ｇ　Ｏ，０３３０，０３６０，０３ ７０，０６６０，３８６０，０６０ＨＯ，０３５０，０３５０，０３８０，０５ ９０，３９００，０５６轟主旦 Ａ　Ｏ，０５００，０４８０，０４７０，０４８０，４９０１，０８９Ｂ　Ｏ， ０９５０，０５３０，０５２０，０４８０，４７２１，１５７ＣＯ，０４７０， ０４８０，０４５０，０４９０，２４６０，７７２Ｄ　０．０５Ｉ　Ｑ、０４８ 　０．０５０　０．０４８　０．２６６　０．８２９Ｅ　Ｏ，０４６０，０４８ ０，０４８０，０４９０，１７３０，０６０Ｆ　Ｏ，０５２０，０５００，０４ ９０，０５００，１６２０，０６２Ｇ　Ｏ，０５００，０４９０，０４９０，０ ５１０，３５６０，０６３ＨＯ，０４９０，０４９０，０４９０，０５００，３ ６６０，０６０人１ サンプル　ブロモクレゾールパープル添加　対照８４３　０．５０２　０．４８ １ ８４５　０．２５９　０．２５６ ９５Ｉ　Ｑ、１７６　０．１６８ ８３４　０．３８８　０．３６１ Ｈ１ｌｌ　１．１１５　１．１２３ ＨＩＶ−２０，７８９０，８００ 陰性対照　０．０６０　０．０６１ 上に掲げた表から、このＨＩＶアッセイの全体的結果は、希釈液にブロモクレゾ ールパープルが添加されていてもいなくても同じであることがわかる。

この例は、血清サンプルについて使用する市販のＨＩＶアッセイキットのサンプ ル希釈液中にサンプルモニター試薬としてブロモクレゾールパープルを用いて行 った。このサンプルモニター試薬は、サンプル希釈液のｐＨがその試薬に至適で はなくても、サンプルの存在下に独特で明瞭な肉眼で見える色の変化を与えた。

色の変化は分光光度法での測定により確認された。サンプルモニター試薬の存在 はその後のＨＩＶにχ１する抗体のイムノアッセイに影響しなかった。

本例は市販のイムノアッセイＷｅｌｌｃｏｚｙｍ６　Ｖに５４を使う代わりに１ 選択されたアｙセイに用いられるサンプル希釈液が血清または血漿を含有しない ことを条件に。

他の市販の酵素イムノアッセイ、たとえばＨＩＶに対する抗体の他のアッセイを 用いて実施することができる。ブロモクレゾールパープルまたは上述した他のア ルブミン指示薬の１つを使用できる。たとえばブロモクレゾールは中性よりすぐ 下のｐＨ値で、ンア／−ジ（４−二トロフェニル）−メタンは中性以上のｐＨ値 で。

ブロモクレゾールグリーンはｐＨ６付近で最もよく機能することから、サンプル 希釈液のｐＨを考慮にすることが好ましい。

烈ｌ アルブミンの屓　による血清サンプルの定量的＋ｌ＋定使用した抗体ア／セイ系 は非−へ非−Ｂ肝炎（ＨＣＶ）用アッセイ系であった。

試薬は以下の通りとした。

すなわち、標準的方法により非−Ａ非−Ｂ肝炎の抗原性ペプチドでコーティング したｔｆ１１ｉ的９６ウエルマイクロプレート；および血清を含有せず、塩溶液 中ｐＨ緩衝界面活性剤をベースとし、０．１２５ｎＭ濃度でブロモクレゾールパ ープルを補充したサンプル希釈液である。

アッセイは下記の通り行われた。すなわちプレートのすべてのウェルに１９０μ ｌのサンプル希釈液を添加し、５μｌだけサンプルを添加したウェルＡ１２゜Ｂ １２．ＣＩ２およびＣ１２，サンプルを添加しなかったウェルＥ１２．Ｆ１２゜ Ｇ１２およびｌ−［１２，２０μｌのサンプルを添加したウェルＡｌ　ｌ、Ｂｌ 　ｌ、Ｃ１１およびＤｌｌを除くすべてのウェルに１個々の血清または血漿ｌＯ μｌを添加した。

例１の場合と同様に、サンプルをサンプル希釈液に添加すると、肉眼で容易に検 知できる黄色から紫色への色の変化が直ちに生じた０例１に記載したと同様に。

ＭｕＨｉｓｋａｎプレートリーダーを用いて６２０ｎｍにおける吸収を測定した 。結果は表４Ａ（ウェルＡｌ−Ｈ６）および４Ｂ（ウェルＡ７〜Ｈ１２）に示す 。

人工Ａ Ａ　Ｏ，４７７０，４７３０，４７１０，４０５０，４６８０，４７２Ｂ　Ｏ， ４２００，４８００，４４００，４３６０，４９１０，４３ＩＣＯ，４４１０， ５０４０，４８７０，４１３０，４８８０，４３３Ｄ　Ｏ，４３２０，４５００ ，５０５０，４３４０，４７５０，４４７Ｅ　Ｏ，４４４０，４５１０，５０８ ０，４４３０，５３００，４２３Ｆ　Ｏ，４６７０，４４７０，４６７０，４２ ９０，４８７０，４８６Ｇ　Ｏ，４２１０，４７７０，４７１０，４３６０，４ ９１０，３８８ＨＯ，４９００，４３３０，４９００，４３６０，５２５０，４ ２２表４Ｂ Ａ　Ｏ，４４３０，４７６０，４７２０，４９２０，７３２０，２７５Ｂ　Ｏ， ４５９０，４４３０，４７２０，４３３０，７１６０，２５ＩＣＯ，４６１０， ３６６０，４７１０，４９２０，７０３０，２７６Ｄ　Ｏ，４６９０，４４３０ ，４３００，４７５０，６８４０，２５８Ｅ　Ｏ，４４５０，４４２０，４３８ ０，４３３０，４０９０，１００Ｆ　Ｏ，４２３０，４４５０，４４５０，４８ ２０，４２１０，１０６Ｇ　Ｏ，４２３０，４２８０，４１４０，４４６０，４ ８６０，１０５ＨＯ，４９２０，４３００，４９１０，４７２０，４２５０，１ ０８表４から明らかなように、この場合、マイクロプレートリーダーを用いて得 られた色の変化は定量可能なものであり、１０μｌのサンプルを添加した対照ウ ェル（平均０Ｄ＝０．４５５）、サンプルが添加されなかったウェル（平均ＯＤ χ０．１０５）、５μｍのサンプルを添加したウェル（平均０Ｄ＝０．２６５） および２０μｌのサンプルを添加したウェル（平均０Ｄ＝０．７０９）で得られ た吸収値の間には明らかな差が認められた。

正常な供血者からの血清または血漿中のアルブミンの量は約４．０ｇ／１００ｍ ＋で約＋１５％の範囲内と比較的一定で、サンプル容量における有意な誤差は容 易に検出できる。

アルブミン−ブロモクレゾールパープル複合体の吸収ピークは約６００　ｎｍに あるが、限られた光学的作動範囲のマイクロプレートリーダーを用い複合体の量 を定量するためには、よく知られている技術であるオフビークでのプレートの読 み取りが必要な場合も考えられる。

この実施例は、サンプル希釈液が血清または血漿を含まないことを条件に、他の 酵素イムノアッセイを用いて実施することもできる０例１に掲げたように、他の アルブミン指示薬を使用することも可能で、その選択は使用するサンプル希釈液 のｐＨによって影響される。

氾 及盪１見上！および　もしくは　、の　Ｈ果を　いる　および　、サンズ土五肩 ２ アノセインステムＨＩＶＩ／ＨＩＶ２を用いた。試薬は次の通りとした。

すなわちポリクローナル抗−ヒトＩ　ｇＧ　（ＤＡＫＯ）でコーティングした４ ｍ準９６−ウェルマイクロタイタープレート；　ＨＩ　Ｖ−１のＣＢＬ−１フイ ソレートがらのコアおよびエノベローブ抗原からなるＨ　Ｉ　Ｖ組換えタンパク 質［５ａｔｔｅｎｔａｕ。

Ｑ、Ｊ　ら（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１１２０３のＨＲＰ（西洋 ワサアビペルオ牛／ダーゼ）への接合体（”ＨＩＶ−１接合体−）；ｇｐ３６エ ンベローブタンパク質抗原からなるＨＩＶ−２ペプチドのＨＲＰへの接合体（” ＨＩ　Ｖ−２接合体”）；陽性サンプル・ＨＩＶ−１陰性血清中に希釈したＨ　 Ｉ　Ｖ−１陽性サンプルとＨＩ　Ｖ−２陰性血清に希釈したＨ　Ｉ　Ｖ−２陽性 サンプル；対照：供血がら得たＨ　Ｉ　Ｖ−１／ＨＩ　Ｖ−２陰性血清および血 漿：洗浄溶液（Ｔｖｅｅｎ含有グリシンホウ酸塩緩衝液）；接合体１ｉＮｉ液（ つ／血清アルブミンと界面活性剤とを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液）；ＴＭＢ　（ ３，３’５．５°−テトラメチルベンチジン）と過酸化水素を含む基質溶液であ る。

サンプル希釈液 サンプル希釈液Ａ　（ｐＨ効果希釈液）：サボ＝７２ｇ；ＥＤＴＡ１５００ｍＭ 溶液（ｐＨ８，０）　２ｍｌ　；Ｂｒｏｎｉｄｏｘ　Ｌ（防腐剤として）　０． ５ｍｌ　；Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ−１００（非イオン界面活性剤）１ｍｌ　；蒸留水 で１００ｍ１とする。ｐＨは４．７を示す。

サンプル希釈液Ａのアリコートにクロロフェノールレッド（０，１ｍｇ／ｍｌ最 終１１４度）またはフェノールレッド（０，３３ｍｇ／ｍ＋最終濃度）を添加し た。

サンプル希釈液Ｂ（アルブミン検出希釈液）：サンプル希釈液Ａに０．２Ｍクエ ン酸５．６ｍｌ　；０．２Ｍクエン酸三ナトリウム４．４ｍｌ　；２５％ナトリ ウムアジド０．０８ｍ１　；ブロモクレゾールパープル６．８ｍｇを加える。最 終ｐＨは６．０を示す。

方迭ユ アッセイは以下の４つのサンプル希釈液の効果を比較するために、１つのマイク ロタイタープレート上で同時に実施した。４つのサンプル希釈液はクロロフェノ ールレッド含有サンプル希釈液Ａ；サンプル希釈液Ｂ；フェノールレッド含有サ ンプル希釈液Ａ；染料を添加されていないサンプル希釈液Ａとした。

選択されたサンプル希釈液の５０μｌアリフートは後述のプロトコールに従って マイクロタイタープレート中の割り当てられたウェルに分配した。各ＩＨＩＶ− １およびＨ１ｖ−２陽性血清ならびにＨＩ　Ｖ−１７ＨＩ　Ｖ−２陰性血清また は血漿サンプルは以下に示すサンプルプロトフールに従ってウェルに添加された 。変色があれば記録し、プレートを、　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎプレートリーダーを 使用して、対照波長６９０ｎ、ｍ、ＯＤ５７０ｎｍにおいて直ちに読み取った。

これはサンプルの添加をモニターするために行われた。

ついでアッセイを以下のように完結させた、すなわちマイクロタイタープレート を加湿条件下３７℃で６０分間カバーしてインキュベートした。ついでウェルを 洗浄溶液で５回徹底的に洗浄した。各洗浄工程では吸引による各ウェルの内容物 の除去が行われ、ウェルを洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ含有グリシンポウ酸塩緩衝液） で満たし３０秒間浸漬した。最後の洗浄工程の後に、ウェルの内容物を除去し、 ウェルを裏返して、ペーパータオルまたはティソン二の上で軽く叩いて乾燥させ た。

つ／血清アルブミンおよび界面活性剤を含有するＨＥＰＥＳｉｌ衝剤中混合接合 剤中混合接合体液５０μｌをウェルに添加し、プレートを加湿条件下３７℃で３ ０分間インキュベートした。さらに上述の洗浄工程を行ったのち、　ＴＭＢ　（ ３，３。

５．５°−テトラメチルベンチジン）および過酸化水素を含有する基質溶液１０ ０ｕｌを各ウェルに添加し、プレートを加湿条件下３７℃で３０分間インキユベ ートシ、ついで５０μｌの２Ｍ硫酸を用いて反応を停止させた、ウェル内の吸収 は対照波長として６９０Ｂｍを用いて４５０Ｂｍにおいて記録された。

サンプル　釈液およびサンプルプロトフールクロロフェノールレ・／ド含有すン プル希釈液Ａは１〜３列、希釈液Ｂ（ブロモクレゾールパープル含有）は４〜６ 列、フェノールレッド含有サンプル希釈液Ａは列７〜９．サンプルモニター試薬 を含まないサンプル希釈液Ａは列１０−１２に用いられた。

サンプルは以下のようにマイクロタイタープレートのウェルに添加された。

Ａ１．８Ｉニブランク Ｃ１：ＨＩＶ−１陰性血清で１／１０１ｍ希釈したＨ　Ｉ　Ｖ−１陽性サンプ／ Ｌ、（）（ｌＶ−］　＋） Ｄ＋：ＨＩＶ−１陰性血清で１１５０に希釈したＨ　Ｉ　Ｖ−１＋Ｅ１：ＨＩＶ −１陰性血清ｒｌ／１００１ｍ希釈したＨ　Ｉ　Ｖ−１＋Ｆｌ：ＨＩＶ−１陰性 血清で１７２００１ｍ希釈したＨ　Ｉ　Ｖ−１＋Ｇｌ：ＨＩＶ−２陰性血清ｔ’ １７２１ｍ希釈したＨ　Ｉ　Ｖ−２陽性サンプル（ＨＩＶ−２→） Ｈ］：ＨＩＶ−２陰性血清ｒｌ／４１．−希釈したＨ　Ｉ　Ｖ−２＋Ａ２：ＨＩ Ｖ−２陰性血清’ｔ’ｌ／８に希釈したＨ　Ｉ　Ｖ−２＋Ｂ２：ＨＩＶ−２陰性 血清で１７１６に希釈したＨ　Ｉ　Ｖ−２＋Ｃ２−Ｈ２：１（ＩＶ−１７ＨＩＶ −２陰性血清対照Ａ３−）＋３　：ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２陰性血漿対照列１〜 ３のサンプルプロトコールは列４〜６．７〜９および１０〜１２で反復された。

時釆 ブランクのウェルを除いて、プレート中のサンプル希釈液にサンプルを添加する と、サンプルモニター希釈液を含む列１〜９では直ちに色の変化が観察された。

サンプルモニター試薬を含まない列１０−１２では変色は１察されなかった１列 １〜３では変色は赤から紫１列４〜６ではライムグリーンから紫、そして列７〜 ９ではオレンジから赤に色が変化した。すべての場合、変色は即時に起こり明瞭 に観察できた。最も鮮明な変色はクロロフェニルレッドを含むウェル（列ｌ〜３ ）における赤から紫への変色であった。５７０Ｂｍでプレートを読み取って得ら れた結果を表５Ａおよび５Ｂに示す。

Ａ　ブ５ン’Ｉ　Ｏ，９７５０，７４０ブランク　０．５７２　０．５０８Ｂ　 ブランク　１．０３０　０．８１４　ブランク　０．５５７　０．５７３Ｃ１， ０３６１，０５８０，６９９０，５６５０，４３００，４７８Ｄ　１．１０９　 １．０８７　０．７８８　０．５８０　０．５３８　０．５０８Ｅ　１．１６７ 　１．１９８　０．９９６　０．６１４　０．６２４　０．８］、３Ｆ　１．１ ４９　１．１１７　０．８ｇ１　０．６２４　０．５１５　０．５７１Ｇ　１． １４８　１．１７８　０．８９４　０．６９４　０．６２１　０．６２１Ｈ１， １６２１１５７１，１０７０，６６１０，６０８０，５８５轟旦１ Ａ　ブランク　０．６６９　０．４７８　ブランク　０．０８３　０．０３５Ｂ 　ブ５ンク　０．８２１　０．５４３　ブ５７り　０．０６８　０．００５ＣＯ ，７５００，４３００，４１５０，０７２０，００６０，０３８Ｄ　Ｏ，７９１ ０，８３２０，４５７０，０６８０，０２１０，０１８Ｅ　’０．８４４　０． ９０１　０．６２１　０．０７０　０．０８４−０．０５４Ｆ　Ｏ，９０２０， ６８９０，５１００，０７９０，０２１−０，０３８Ｇ　Ｏ，５２４０，９７６ ０，４４８０，＋５２　０．０４８　０．０３５ＨＯ，７１７１，００４０，５ ４２０，０９１０，０３２０，０３９この結果は、ｐＨ効果モニター試薬を含有 する希釈液（列ｌ〜３および７〜９）が血清または血漿サンプルが添加されると ＯＤに顕著な変化を生じることの肉眼による観察を確認するものである。ｐＨ効 果モニターを有するサンプル希釈剤は。

ＩＩＩＷＬまたは血漿サンプル内のアルブミンと相互作用するモニター試薬（ブ ロモクレゾールパープル）を含むサンプル希釈液（列４〜６）に直接相当する結 果を与える。

アッセイ完結時の結果を表６Ａおよび６Ｂに示す、これらの結果からサンプルモ ニター試薬がアッセイ自体の間に存在することはアッセイ自体すなわちＨＩ　Ｖ −１およびＨＩＶ−２のアッセイの結果には影響しないことが明らかである。

人互Ａ Ａ　ブランク　０．３１２　０．１２９　ブランク　０．２９５　０．１１２Ｂ 　ブランク　０．２２４　０．０９３　ブランク　０．２０７　０．０９１Ｃ１ ，６６９０，０７９０，１０２１，６１６０，０８１０，０８４Ｄ　Ｏ，７５０ ０，０９６０，０９４０，５９３０，０８２０，０８２）：　Ｑ　４８９　Ｑ、 ｌ１７　Ｑ、Ｑ９９　０．３７０　０．１０６　０．０８６Ｆ　Ｏ，２６７０， ０８５０，１０９０，２３００，０７３０，０８３Ｇ　Ｏ，７６６０，０８６０ ，０９００，７４５０，０７５０，０８３ＨＯ，４４１０，０８９０，０９３０ ，４４５０，０７９０，０８１入１１ Ａ　ブランク　０．２９５　０．１２０　ブランク　０．３２６　０．１２３Ｂ 　ブランク　０．２１３　０．０９１　ブ５７り　０．２１４　０．０９６Ｃ１ ，６８６０，０８３０，０９６１，６９３０，０７９０，０９４Ｄ　Ｏ，７５０ ０，０９７０，０９４０，７６５０，０９７０，０９４Ｅ　Ｏ，４４８０，１１ ｇ　０．０９１　０．４５６　０．１１５　０．０９３Ｆ　Ｏ，２７１０，０８ ６０，０８９０，２６７０，０８９０，０９６Ｇ　Ｏ，８２００，０９００，０ ９００，７９９０，０８８０，０９３ＨＯ，４５７０，０９２０，０９２０，４ ５３０，０８４０，１０１補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法制８４＆（０ ８）平成　６　年　１２　月　２　５１’ｌ、’

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サンプル中の被検物質についてイムノアッセイまたは特異的結合対アッセイ を行うイムノアッセイ容器中における体液サンプルまたはヒトもしくは非ヒト動 物生体に由来するサンプルの存在を確定する方法において，（ｉ）（ａ）イムノ アッセイ容器中で，サンプル，およびサンプルが存在する場合にのみシグナルを 産生できるサンプルモニター試薬または試薬系からなる液体を混合するか，また は （ｉ）（ｂ）サンプルが存在するとシグナルを産生できるサンプルモニター試薬 または試薬系が固体支持体上に固定化されてなるイムノアッセイ容器にサンプル を添加し，ついで （ｉｉ）シグナルを検出することからなり，サンプルが存在するとシグナルを産 生できるサンプルモニター試薬または試薬系はイムノアッセイ自体において被検 物質の検出に用いられる被検物質特異的試薬または試薬系とは異なる方法 ２．サンプルモニター試薬または試薬系によって産生するシグナルは色，化学発 光または蛍光の変化である「請求項１」に記載の方法３．サンプルモニター試薬 または試薬系はアルブミン，セルロプラスミン，トランスフェリン，血清もしく は血漿酵素，または他の血清−もしくは血漿−特異的タンパク質，または他の血 清もしくは血漿の高分子量成分の存在下にシグナルを産生できる「請求項１また は２」に記載の方法４．サンプルモニター試薬または試薬系はアルブミンの存在 下にシグナルの産生が可能で，アルブミンの検出用試薬はブロモクレゾールバー プル，プロモクレゾールグリーン，シアノージ（４−ニトロフェニル）−メタン またはクーマッシープリリアントプルーである「請求項３」に記載の方法５．サ ンプルモニター試薬または試薬系は血清，血漿または他の体液の低分子量成分の 存在下にシグナルを産生できる「請求項１または２」に記載の方法６．低分子量 成分はグルコース，カルシウム，マグネシウム，鉄，尿素または尿酸である「請 求項５」に記載の方法 ７．グルコースの検出のためのサンプルモニター試薬系はグルコースオキシダー ゼ／ペルオキシダーゼ系からなる「請求項６」に記載の方法８．尿素の検出のた めのサンプルモニター試薬系はウレアーゼ／グルタメートデヒドロゲナーゼから なり，尿酸の検出のためのサンプルモニター試薬系はウリカーゼ／ペルオキシダ ーゼ系からなる「請求項６」に記載の方法９．サンプルモニター試薬または試薬 系はからなる液体はサンプル希釈液である「請求項１〜８」のいずれかに記載の 方法１０．サンプルは緩衝能力がほとんどもしくは全くないサンプル希釈液と混 合し，サンプルモニター試薬または試薬系はサンプルおよび希釈液が添加された 場合のｐＨ変化の結果としてシグナル生じる成分からなる「請求項１〜８」のい ずれかに記載の方法 １１．サンプルモニター試薬または試薬系は酸性から中性方向またはアルカリ性 から中性方向へｐＨが変化した場合に色が変化するｐＨ指示薬からなる「請求項 １０」に記載の方法 １２．サンプルモニター試薬または試薬系はイムノアッセイ容器の内表面上およ び／またはイムノアッセイ容器中に用いるビーズの表面上に固定化される「請求 項１〜１１」のいずれかに記載の方法１３．イムノアッセイ容器はマイクロウエ ルであり，他の複数個のマイクロウエルとともにマイクロタイタープレートの形 で存在する「請求項１〜１２」のいずれかに記載の方法 １４．サンプルモニター試薬または試薬系によって発生するシグナルは色の変化 であり，色の変化は肉眼的検査および／または分光光学的測定によって検出が可 能である「請求項１〜１３」のいずれかに記載の方法１５．イムノアッセイもし くは特異的結合対アッセイは均一相アッセイである「請求項１〜１４」のいずれ かに記載の方法１６．イムノァッセイもしくは特異的結合対アッセイは捕獲アッ セイであり，イムノアッセイ容器の内部表面上および／またはイムノアッセイ容 器中に用いられるビーズの表面上には抗原，抗体または特異的結合対の一方のメ ンバーが固定化されている「請求項１〜１４」のいずれかに記載の方法１７．イ ムノアッセイはラテックス凝集アッセイ，ヘマグルチネーションアッセイまたは フロキュレーションアッセイである「請求項１〜１４」のいずれかに記載の方法 １８．被検物質は抗体もしくは抗原または特異的結合対の一方のメンバーであり ，アッセイは被検物質と相当する抗原もしくは抗体間または特異的結合対の２つ のメンバー間のイムノアッセイ容器中における特異的相互作用およびその相互作 用の検出からなるサンプル中の被検物質のイムノアッセイまたは特異的結合対ア ッセイにおいて，イムノアッセイ容器中におけるサンプルの存在または不存在を ，サンプルが存在するとシグナルを産生できるサンプルモニター試薬または議案 系によって検出し，サンプルモニター試薬または試薬系はアッセイにおける被検 物質自体の検出に用いられる被検物質特異的試薬または試薬系とは異なるイムノ アッセイまたは特異的結合対アッセイ１９．サンプルの検出は「請求項１〜１７ 」のいずれかに記載のようにして行われる「請求項１８」に記載のアッセイ２０ ．完全にまたは部分的に自動化されたシステムを用いて複数個のイムノアッセイ 容器中で同時に行われる「請求項１８または１９」に記載のアッセイ２１．体液 サンプルまたはヒトもしくは動物生体に由来するサンプルについて行われるイム ノアッセイまたは特異的結合対アッセイおいて，検討するサンプルのイムノアッ セイ容器中の存在を確定するためおよび／またはイムノアッセイもしくは特異的 結合対アッセイにおける偽陰性の結果を確認するための，検討するサンプルが存 在する場合にのみシグナルを産生できるサンプルモニター試薬または試薬系の使 用 ２２．アッセイにおいて検討するサンプルが存在する場合にはサンプル特異的シ グナルを産生できるサンプルモニター試薬または試薬系からなる，イムノアッセ イまたは特異的結合対アッセイに使用するためのサンプル希釈液２３．サンプル モニター試薬または試薬系は「請求項２〜８」，「請求項１０」または「請求項 １１」のいずれかに定義された「請求項２２」に記載のサンプル希釈液 ２４．イムノアッセイ容器またはイムノアッセイ容器中に使用するためのビーズ においてそのビーズ上またはその容器の内部表面上に検付するサンプルが存在す る場合にはサンプル特異的シグナルを産生できるサンプルモニター試薬または試 薬系が固定化されているイムノアッセイ容器またはイムノアッセイ容器中に使用 するためのビーズ ２５．試薬または試薬系は「請求項２〜８」，「請求項１０」または「請求項１ １」のいずれかに定義された「請求項２４」に記載のイムノアッセイ容器または ビーズ ２６．マイクロウエルのアッセンプリーの形態である「請求項２４または２５」 に記載の複数個のイムノァッセイ容器 ２７．検討するサンプルについてイムノアッセイまたは特異的結合対アッセイを 行うためのキットであり， （ａ）サンプルの存在下にシグナルを産生できるサンプルモニター試薬または試 薬系からなる液体および／または （ｂ）各容器またはビーズにはサンプルの存在下にシグナルを産生できるサンプ ルモニター試薬または試薬系が固定化されている複数個のイムノアッセイ容器ま たはイムノアッセイ容器中に用いられるビーズ，からなるキット ２８．液体は「請求項２２または２３」に記載の方法サンプル希釈液であり，お よび／またはイムノアッセイ容器およびビーズは「請求項２４〜２６」のいずれ かに記載のものである「請求項２７」に記載のキット２９．容器およびビーズか らなる成分の一方にはサンブルモ＝ター試薬または試薬系が固定化され，他方の 成分には関心被検物質の捕獲物質が固定化されている複数個のイムノアッセイ容 器またはイムノアッセイ容器中に用いられるビーズからなる「請求項２７」に記 載のキット３０．検討するサンプルは供血された血液である「請求項１〜１７」 のいずれかに記載の方法，または「請求項１８〜２０」のいずれかに記載のアッ セイ，または「請求項２５〜２８」のいずれかに記載のキット３１．サンプル中 の被検物質についてイムノアッセイまたは特異的結合対アッセイを行うイムノア ッセイ容器中における体液サンプルまたはヒトもしくは非ヒト動物生体に由来す るサンプルの存在を確認することからなるイムノアッセイにおける偽陰性結果を 確定する方法において，（ｉ）（ａ）イムノァッセイ容器中で、サンプルと，サ ンプルが存在する場合にはシグナルを産生できるサンプルモニター試薬または試 薬系からなる液体を混合するか、または， （ｉ）（ｂ）固体支持体上に、サンプルが存在する場合にはシグナルを産生でき るサンプルモニター試薬または試薬系が固定化されてなるイムノアッセイ容器に サンプルを添加し， （ｉｉ）サンプルモニター試薬または試薬来によって発生するシグナルを検出す ることからなり， サンプルが存在する場合にシグナルを産生できるサンプルモニター試薬または試 薬系はイムノアッセイまたは特異的結合対アッセイ自体における被検物質を検出 するために用いられる被検物質−特異的試薬または試薬系とは異なり．（ｉｉｉ ）関心被検物質のイムノアッセイまたは特異的結合対アッセイを行い、サンプル モニター試薬または試薬系によって発生するシグナル陰性の場合は偽陰性結果と する、イムノアッセイにおける偽陰性結果を確定する方法３２．サンプルの検出 は「請求項１〜１７」のいずれかの記載に従って実施する「請求項３１」に記載 の方法