CN111751527A - 新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测试剂盒及其制备方法和应用，试剂盒中的试纸条包括底板和在所述底板上顺次搭接粘贴的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述胶体金垫上涂覆有胶体金标记核衣壳蛋白、胶体金标记棘突蛋白和胶体金标记兔IgG抗体复合物；所述硝酸纤维素膜上设有IgG抗体检测线和IgM抗体检测线。本发明采用捕获法胶体金免疫层析技术，实现了对IgG抗体和/或IgM抗体的快速、灵敏、准确检测。

Description

新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物免疫检测分析技术领域，涉及新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
冠状病毒是一类具有外套膜(envelope)的单股正链RNA病毒，直径约60～220nm，广泛存在于人和其他哺乳动物之间。大多数冠状病毒感染为轻症感染，但仍有两种冠状病毒曾爆发肆虐，引起严重后果：重症急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。
2019年底出现的新型冠状病毒(2019-nCoV)引起社会各界的广泛关注，该病毒可经呼吸道飞沫、接触等传播，基本再生数R0约为2.2(90％高密度区间1.4-3.8)。
目前，《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南(第四版)》强调了呼吸道样本核酸检测和血清抗体检测用于新冠疑似患者筛查与诊断。其中，核酸检测具有灵敏度高等优势，但是不能实现对众多疑似患者的快速检测。基于PCR的核酸检测需要专用的分子生物学实验室和检测仪器，要求实验人员具有分子生物学背景，基层单位受到实验条件和实验人员的限制，难以开展基于核酸检测的新冠病毒检测。核酸检测耗时较长，平均需4～5个小时，效率较低，通常需要重复检测进行结果确认，样本采集不当容易造成假阴性或假阳性结果。目前该方法主要通过鼻咽拭子和口咽拭子进行样本采集，但是新冠病毒在上呼吸道(鼻、口部位)的停留时间短，主要聚集在下呼吸道，咽拭子采集方法容易造成假阴性结果，造成准确性低的问题。同时，该方法对样本运输和保存等也具有十分严格的要求，操作不当容易造成假阴性、假阳性结果。
血清抗体检测对实验室要求较低，方便快速，适合基层医院的大规模筛查。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测试剂盒及其制备方法和应用，所述试剂盒可以定性检测人全血、血清和血浆样本中的新型冠状病毒(2019-nCoV)IgG和IgM抗体，可用于新型冠状病毒肺炎的临床辅助诊断。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测试纸条，所述试纸条包括底板和在所述底板上顺次搭接粘贴的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
所述胶体金垫上涂覆有胶体金标记核衣壳蛋白、胶体金标记棘突蛋白和胶体金标记兔IgG抗体复合物；
所述硝酸纤维素膜上设有IgG抗体检测线和IgM抗体检测线。
本发明中，采用捕获法胶体金免疫层析技术，检测人血清和血浆样本中的2019-nCoV蛋白特异性IgG抗体和IgM抗体，当检测样本呈IgG抗体和/或IgM抗体阳性时，IgG抗体和/或IgM抗体与胶体金垫上的胶体金标记复合物结合，在层析作用下向前移动，经过检测线与检测线包被抗体结合形成免疫复合物而显现红色条带，实现了对IgG抗体和/或IgM抗体的快速、灵敏、准确检测。
优选地，所述胶体金垫的胶体金标记核衣壳蛋白、胶体金标记棘突蛋白和胶体金标记兔IgG抗体的摩尔比为(1～5):(1～5):1，例如可以是1:1:1、2:2:1、3:3:1、4:4:1或5:5:1，优选为4:4:1。
本发明中，将胶体金标记的新型冠状病毒(2019-nCoV)核衣壳蛋白复合物、棘突蛋白S1复合物和兔IgG抗体复合物以(1～5):(1～5):1、优选为4:4:1的比例混合，试纸条的检测灵敏度高、特异性好，质控线一致性好。
优选地，所述胶体金标记核衣壳蛋白、胶体金标记棘突蛋白和胶体金标记兔IgG抗体复合物在胶体金垫上的喷涂量为10～20μL/cm，例如可以是10μL/cm、11μL/cm、12μL/cm、13μL/cm、14μL/cm、15μL/cm、16μL/cm、17μL/cm、18μL/cm、19μL/cm或20μL/cm，优选为15μL/cm。
优选地，所述IgG抗体检测线上包被有抗人IgG抗体，优选为鼠抗人IgG抗体。
优选地，所述抗人IgG抗体的包被浓度为2～3mg/mL，灵敏度和特异性可以满足检测要求，浓度过低检测线颜色太浅。
优选地，所述IgM抗体检测线上包被有抗人IgM抗体，优选为鼠抗人IgM抗体。
优选地，所述抗人IgM抗体的包被浓度为2～3mg/mL，灵敏度和特异性可以满足检测要求，浓度过低检测线颜色太浅。
优选地，所述硝酸纤维素膜上还设置有质控线，作为判断层析过程是否正常的标准。
优选地，所述质控线上包被有与胶体金垫上的标记抗体发生抗原抗体反应的二抗，优选为所述质控线上包被有抗兔IgG抗体，进一步优选为所述质控线上包被有羊抗兔IgG抗体。
优选地，所述质控线上的抗兔IgG抗体的浓度为2～3mg/mL，阳性参考品、灵敏度和阴性参考品C线显色强度满足检测要求，浓度过低对于强阳性标本，质控线显色偏弱。
优选地，所述试纸条外包装有塑料外壳。
优选地，所述塑料外壳上设置有加样孔和观察窗。
优选地，所述加样孔位于所述样品垫的上方。
优选地，所述观察窗位于所述检测线和质控线的上方。
第二方面，本发明提供了一种新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的试纸条。
优选地，所述试剂盒还包括样本稀释液。
优选地，所述样本稀释液为含有酪蛋白和ProClin的PBS溶液，优选为含有酪蛋白和ProClin300的PBS溶液。
本发明中，采用PBS缓冲液作为样本稀释液，可以实现对IgG和IgM的显著区分，并为了消除假阳性，在PBS缓冲液中加入了酪蛋白，而ProClin300则提高了样本稀释液的稳定性。
优选地，所述酪蛋白在所述PBS溶液中的浓度为0.2％～2％，例如可以是0.2％、0.5％、1％或2％。
优选地，所述ProClin在所述PBS溶液中的浓度为0.02％～0.2％，例如可以是0.02％、0.05％、0.1％或0.2％。
第三方面，本发明提供了一种第一方面所述的试纸条的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)采用胶体金分别标记核衣壳蛋白、棘突蛋白和兔IgG抗体，将得到的胶体金标记核衣壳蛋白、胶体金标记棘突蛋白和胶体金标记兔IgG抗体混合后形成胶体金金标复合物，将胶体金金标复合物复溶和浓缩后，喷涂于胶体金垫上；
(2)在硝酸纤维素膜上分别包被IgG检测线、IgM检测线和质控线，烘干；
(3)将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底板上，得到所述试纸条。
优选地，所述胶体金的粒径为20～30nm。
优选地，采用胶体金标记核衣壳蛋白，所述核衣壳蛋白在胶体金溶液中的浓度为15～20μg/mL，标记时间不短于3h，胶体金和核衣壳蛋白结合稳定，小于10μg/mL或标记时间小于3h时，胶体金和核衣壳蛋白结合不稳定，有不同程度的变蓝。
优选地，采用胶体金标记核衣壳蛋白，封闭液为0.1％～2％BSA，封闭时间为16～20h，胶体金标记核衣壳蛋白的复溶性和试剂检测性能良好。
优选地，采用胶体金标记棘突蛋白，所述棘突蛋白在胶体金溶液中的浓度为15～20μg/mL，标记时间不短于3h，胶体金和棘突蛋白结合稳定，小于10μg/mL或标记时间小于3h时，胶体金和棘突蛋白结合不稳定，有不同程度的变蓝。
优选地，采用胶体金标记棘突蛋白，封闭液为0.1％～2％BSA，封闭时间为16～20h，胶体金标记棘突蛋白的复溶性和试剂检测性能良好。
优选地，采用胶体金标记兔IgG抗体，所述兔IgG抗体在胶体金溶液中的浓度为8～10μg/mL，制备的质控线清晰可见，当兔IgG抗体标记浓度小于8μg/mL，存在个别不清晰的现象。
优选地，所述复溶的溶液为含有蔗糖、海藻糖、BSA和Tween-20的Tris溶液，复溶后金标复合物颜色鲜红透亮，无沉淀，稳定性好，试剂性能最好，灵敏度和特异性均满足要求。
优选地，所述检测线的包被液为PBS溶液。
优选地，所述质控线的包被液为PBS溶液。
优选地，所述烘干的温度为30～37℃。
优选地，所述烘干的时间为1～4h。
第四方面，本发明提供了一种第二方面所述的试剂盒的使用方法，所述方法包括以下步骤：
采用样本稀释液稀释待测样本后，通过加样孔滴加于试纸条的样品垫上，反应10～15min，从观察窗观察检测线和质控线的结果。
第五方面，本发明提供了一种自动化检测装置，所述装置包括样本稀释单元、样本滴加单元和结果分析单元；
所述样本稀释单元采用样本稀释液稀释待测样本；
所述样本滴加单元将稀释的待测样本通过加样孔滴加于试纸条的样品垫上；
所述结果分析单元根据检测线和质控线的显色情况，分析检测结果。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的试纸条基于胶体金免疫层析原理，检测人血清和血浆样本中的2019-nCoV蛋白特异性IgG抗体和IgM抗体，试纸条的胶体金垫上涂覆有胶体金标记核衣壳蛋白、胶体金标记棘突蛋白和胶体金标记兔IgG抗体复合物，检测线上包被有抗人IgG抗体和抗人IgM抗体，通过抗原抗体反应、免疫层析原理实现对IgG抗体和/或IgM抗体的检测；
(2)本发明的试剂盒对新型冠状病毒IgG抗体和/或IgM抗体检测具有良好的特异性，灵敏度高，稳定性好；
(3)采用本发明的试纸条进行检测，过程操作简单、方便、快捷，不需要复杂的样本前处理步骤，也不需要严格的实验条件和仪器判读，对实验人员也无特别的实验资质或其他专业要求，试剂盒常温运输、常温保存，非常适合基层、社区医疗部门使用，应用前景广阔。
附图说明
图1为试纸条的结构示意图；
图2为试剂盒的生产工艺流程图；
图3为胶体金溶液用紫外分光光度计进行全波长扫描结果图；
图4为胶体金标记核衣壳蛋白用紫外分光光度计进行全波长扫描结果图；
图5为胶体金标记棘突蛋白用紫外分光光度计进行全波长扫描结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
试剂：
制备试剂盒采用的新型冠状病毒(2019-nCoV)核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein，N蛋白)和棘突蛋白S1购自杭州伊佰新生物技术有限公司；抗体包括鼠抗人IgG抗体、鼠抗人IgM抗体、兔IgG抗体、羊抗兔IgG抗体，其中鼠抗人IgG抗体购自深圳市菲鹏生物股份有限公司、鼠抗人IgM抗体购自杭州隆基生物科技有限公司、兔IgG抗体购自北京索莱宝科技有限公司、羊抗兔IgG抗体购自北京索莱宝科技有限公司。
实施例1试纸条的结构和检测原理
本发明的试纸条结构如图1所示，包括底板和在所述底板上顺次搭接粘贴的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，采用捕获法胶体金免疫层析技术，检测人血清和血浆样本中的2019-nCoV蛋白特异性IgG抗体和IgM抗体，检测原理为：
试纸条的胶体金垫上包被有核衣壳蛋白-胶体金、棘突蛋白-胶体金和兔IgG抗体-胶体金复合物，检测线上包被有鼠抗人IgG抗体(IgG线)和鼠抗人IgM抗体(IgM线)，质控线上包被有羊抗兔IgG抗体(C线)；
当检测样本呈IgG抗体阳性时，其中的2019-nCoV蛋白特异性IgG抗体与胶体金标记核衣壳蛋白和/或胶体金标记棘突蛋白结合形成复合物，在层析作用下复合物沿纸条向前移动，经过检测线(IgG线)时与预包被的鼠抗人IgG抗体反应，形成免疫复合物而显现红色条带，同时，胶体金标记兔IgG抗体则在质控线(C)处与羊抗兔IgG抗体结合显现红色条带；
当检测样本呈IgM抗体阳性时，其中的2019-nCoV蛋白特异性IgM抗体与胶体金标记核衣壳蛋白和/或胶体金标记棘突蛋白结合形成复合物，在层析作用下复合物沿纸条向前移动，经过检测线(IgM线)时与预包被的鼠抗人IgM抗体反应，形成免疫复合物而显现红色条带，同时，胶体金标记兔IgG抗体则在质控线(C)与羊抗兔IgG抗体结合显现红色条带；
当检测样本呈IgG抗体和IgM抗体双阳性时，其中的2019-nCoV蛋白特异性IgG抗体和IgM抗体与胶体金标记核衣壳蛋白和/或胶体金标记棘突蛋白结合形成复合物，在层析作用下复合物沿纸条向前移动，经过检测线(IgG线)和检测线(IgM线)时均形成免疫复合物而显现红色条带，同时，胶体金标记兔IgG抗体则在质控线(C)处与羊抗兔IgG抗体结合显现红色条带，作为判断层析过程是否正常的标准。
实施例2胶体金垫的制备
新型冠状病毒(2019-nCoV)IgG和IgM抗体检测试剂盒的生产工艺流程图如图2所示，主要包括胶体金垫包埋、硝酸纤维素膜包被和试剂盒的组装等，本实施例首先制备胶体金垫，主要步骤为采用胶体金颗粒标记兔IgG抗体、核衣壳蛋白或棘突蛋白S1并进行封闭处理，将胶体金标记复合物喷涂于结合垫上，干燥后得到胶体金垫。
(1)胶体金的制备
采用常规的氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金。将氯金酸溶液(1％)和柠檬酸三钠溶液(1％)按不同的体积比(5:6、5:7、5:8)混合煮沸，烧制不同粒径的胶体金；待上述胶体金冷却后，分别用0.2M碳酸钾溶液调节pH值，然后加入待标记抗原、抗体，再加入封闭液，反应后离心纯化，弃上清，沉淀用复溶液复溶，然后喷金，待干燥后，组装，切条，通过检测参考品来确定最佳的体积比。
结果发现，当V氯金酸(1％)/V柠檬酸三钠(1％)的体积比为5:7时，烧制的胶体金制备的试剂的灵敏度和特异性较好，故最佳体积比为5:7，将此体积比下烧制的胶体金溶液用紫外分光光度计(岛津UV-2450)进行全波长扫描，结果如图3所示，胶体金溶液在510～560nm波长处有单一吸收峰，可推测胶体金粒径约20～30nm；用精密pH试纸测定上述胶体金溶液，显示pH在5.0～5.5之间。
(2)胶体金标记兔IgG抗体的制备
将兔IgG抗体加入胶体金溶液中进行标记，终浓度至4、6、8、10μg/mL，分别反应3h；再加入封闭液(10％BSA)至终浓度1％，反应16h，标记离心后，然后3μL/cm喷金，待干燥后，组装，切条，通过检测参考品来确定最佳的兔IgG抗体标记浓度。
结果发现，当兔IgG抗体标记浓度小于6μg/mL，存在个别不清晰。当兔IgG抗体标记浓度为8、10μg/mL，质控线清晰可见，能够满足质控线要求。故最终选择8μg/mL作为IgG抗体标记量。
(3)胶体金标记核衣壳蛋白的制备
取25支洁净小试管，分别加入1mL胶体金溶液，分别用碳酸钾调节pH值至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，加入不同浓度的待标记核衣壳蛋白各50μL，至终浓度分别为3、5、10、15、20μg/mL，混匀后室温静置反应15min，然后向各管中加入100μL 10％NaCl溶液，观察颜色变化。
结果发现，当标记量小于10μg/mL时，金标抗体复合物不稳定，有不同程度变蓝；当标记量为15μg/mL时，只有当标记pH值为6.5时，金标抗体复合物结合稳定，未变蓝；当标记量为20μg/mL、pH值为6.0-7.0时，金标抗体复合物结合稳定，均未变蓝；故核衣壳蛋白标记量为15μg/mL，最佳标记pH值为6.5。
在胶体金标记核衣壳蛋白过程中分别加入终浓度为0.1％、0.5％、1％、2％的BSA、CAS、PEG 6000，用上述溶液稀释核衣壳蛋白，标记离心后，观察金标物的复溶性，然后喷金，待干燥后，组装，切条，通过检测参考品来确定最佳的封闭液。
结果发现，用CAS作封闭液，虽然金标物的复溶性比较好，但能显著降低试剂的灵敏度；用PEG6000作封闭液，金标物的复溶性良好，但容易造成试剂假阳性，而用终浓度为1％的BSA作封闭液，金标物的复溶性和试剂检测性能均良好。故选择终浓度为1％BSA作为胶体金标记的封闭液。
将新型冠状病毒(2019-nCoV)核衣壳蛋白加入胶体金溶液中进行标记，终浓度至15μg/mL，分别反应1h、2h、3h；再加入封闭液(1％BSA)反应8h、16h、20h，标记离心后，然后喷金，待干燥后，组装，切条，通过检测参考品来确定最佳的标记核衣壳蛋白反应时间和封闭液反应时间。
结果发现，如果标记抗体反应时间太短，结合不充分，灵敏度将受到影响，显色偏弱，反应时间以3h为宜；如果封闭液反应时间太短，封闭不充分，检测结果易出现假阳性，以16h为宜，此时各步反应均彻底。
将金标核衣壳蛋白复合物离心纯化后，复溶至原体积，用紫外分光光度计(岛津UV-2450)进行全波长扫描，结果如图4所示，金标核衣壳蛋白复合物在510～560nm波长处有单一吸收峰。
(4)胶体金标记棘突蛋白S1的制备
取25支洁净小试管，分别加入1mL胶体金溶液，分别用碳酸钾调节pH值至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，加入不同浓度的待标记棘突蛋白S1各50μL，至终浓度分别为3、5、10、15、20μg/mL，混匀后室温静置反应15min，然后向各管中加入100μL 10％NaCl溶液，观察颜色变化。
结果发现，当标记量小于10μg/mL时，金标抗体复合物不稳定，有不同程度变蓝；当标记量为15μg/mL时，只有当标记pH值为6.5时，金标抗体复合物结合稳定，未变蓝；当标记量为20μg/mL、pH值为6.0-7.0时，金标抗体复合物结合稳定，均未变蓝；故棘突蛋白S1标记量为15μg/mL，最佳标记pH值为6.5。
在胶体金标记棘突蛋白S1过程中分别加入终浓度为0.1％、0.5％、1％、2％的BSA、CAS、PEG 6000，用上述溶液稀释棘突蛋白S1，标记离心后，观察金标物的复溶性，然后喷金，待干燥后，组装，切条，通过检测参考品来确定最佳的封闭液。
结果发现，用CAS作封闭液，虽然金标物的复溶性比较好，但能显著降低试剂的灵敏度；用PEG6000作封闭液，金标物的复溶性良好，但容易造成试剂假阳性，而用终浓度为1％的BSA作封闭液，金标物的复溶性和试剂检测性能均良好。故选择终浓度为1％BSA作为胶体金标记的封闭液。
将新型冠状病毒(2019-nCoV)棘突蛋白S1加入胶体金溶液中进行标记，终浓度至15μg/mL，分别反应1h、2h、3h；再加入封闭液(1％BSA)反应8h、16h、20h，标记离心后，然后喷金，待干燥后，组装，切条，通过检测参考品来确定最佳的标记棘突蛋白S1反应时间和封闭液反应时间。
结果发现，如果标记抗体反应时间太短，结合不充分，灵敏度将受到影响，显色偏弱，反应时间以3h为宜；如果封闭液反应时间太短，封闭不充分，检测结果易出现假阳性，以16h为宜，此时各步反应均彻底。
将金标棘突蛋白S1复合物离心纯化后，复溶至原体积，用紫外分光光度计(岛津UV-2450)进行全波长扫描，结果如图5所示，金标棘突蛋白S1复合物在510～560nm波长处有单一吸收峰。
(5)胶体金垫的制备
胶体金金标复合物工作液由胶体金标记的新型冠状病毒(2019-nCoV)核衣壳蛋白、新型冠状病毒(2019-nCoV)棘突蛋白S1和胶体金标记的兔IgG抗体按照一定比例混合。
配制不同浓度不同pH值的Tris-HCl、PB、PBS缓冲体系，用于复溶金标复合物(三种复合物按照1:1:1混合)，静置2h，观察比较复溶效果，理想的复溶效果为：颜色鲜红透亮，无沉淀。
结果发现，只有用pH 8.5的0.02M Tris-HCl复溶时效果最理想，颜色鲜红透亮，无沉淀，其余溶液复溶沉淀后，均有不同程度蓝变，且有不同程度沉淀产生。因此，选择pH 8.5的0.02M Tris-HCl作为最佳的复溶液。
为了保证金标复合物的稳定性，在上述确定的最佳缓冲体系中分别加入0％、5％、10％、15％、20％蔗糖，调节pH值为8.5，分别用上述五种复溶液复溶离心所得金标复合物(三种复合物按照1:1:1混合)，混匀后，将其喷涂在玻璃纤维上烘干，制作胶体金垫，观察胶体金垫是否变蓝，从而确定最佳的蔗糖添加浓度。
结果发现，复溶液中加入5％蔗糖的胶体金垫蓝变程度相对较弱，复溶液中加入10％、15％、20％蔗糖的胶体金垫稳定性良好，均未蓝变，且颜色无显著差异。因此，复溶液暂选择含有10％蔗糖的0.02M Tris-HCl溶液，调pH值至8.5。
在含有10％蔗糖的0.02M Tris-HCl溶液中，分别添加不同浓度的组合的海藻糖、BSA、Tween-20，分别用上述复溶液复溶金标复合物(三种复合物按照1:1:1混合)，混匀后，将其喷涂在玻璃纤维上烘干，制作胶体金垫，制备试剂小样后，通过检测参考品来确定最佳的复溶液组成。
结果发现，当复溶液配方为pH 8.5的含有10％蔗糖、5％海藻糖、1％BSA、0.5％Tween-20的0.02M Tris溶液时，试剂性能最好，灵敏度和特异性均满足要求。
将胶体金标记的新型冠状病毒(2019-nCoV)核衣壳蛋白复合物、棘突蛋白S1复合物和胶体金标记的兔IgG抗体复合物10倍浓缩后，再将三种胶体金复合物按照不同比例混合(1:1:1、2:2:1、3:3:1、4:4:1、5:5:1)，以喷涂量15μL/cm进行喷金，制备试剂小样后，通过检测参考品及稳定性选择最佳混合比例。
结果如表1～表3所示，“++++”、“+++”代表强阳性，“++”代表中阳性，“+”代表弱阳性；“±”代表无法判定阴阳性；“-”代表阴性，浓缩后的胶体金标记的新型冠状病毒(2019-nCoV)核衣壳蛋白复合物、棘突蛋白S1复合物和兔IgG抗体复合物以4:4:1的比例混合，对IgG/IgM检测线灵敏度和特异性最好且质控线清晰一致性好。因此，优选4:4:1的混合比例。
表1不同混合比例对IgG检测线的影响
Figure BDA0002559715030000141
表2不同混合比例对IgM检测线的影响
Figure BDA0002559715030000142
Figure BDA0002559715030000151
表3不同混合比例对质控线的影响
Figure BDA0002559715030000152
综上可知，胶体金标记的新型冠状病毒(2019-nCoV)核衣壳蛋白复合物、棘突蛋白S1复合物和兔IgG抗体复合物浓缩比例选择100μL/1mL胶体金溶液，三种复合物的混合比例为4:4:1；最佳干燥方式为30～37℃烘干2±0.5h，在此条件下制备的胶体金垫稳定性良好，灵敏度和特异性满足要求。
实施例3硝酸纤维素膜的制备
(1)检测线包被
在pH 7.4的0.01M PBS溶液中分别添加不同浓度蔗糖(0％、1％、2％)和海藻糖(0％、1％、2％)作为检测线包被液，包被检测线，同时在质控线处包被羊抗兔IgG抗体，胶体金垫处包埋胶体金标记的新型冠状病毒(2019-nCoV)核衣壳蛋白、棘突蛋白S1和兔IgG抗体，制备试剂小样，通过检测参考品及其37℃10天的稳定性，来确定最佳的检测线包被液。
结果发现，加入蔗糖会影响试剂的稳定性，添加海藻糖后试剂稳定性无明显提高，故不加海藻糖和蔗糖也可保证试剂的稳定性，所以确定在包被稀释液中不添加任何封闭液，仅使用pH 7.4的0.01M PBS溶液作为检测线包被稀释液。
使用上述确定的最佳检测线包被液稀释鼠抗人IgG/IgM抗体，至抗体终浓度分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL，作为检测线工作液。同时使用2mg/mL羊抗兔IgG抗体作为质控线工作液。胶体金垫处包埋胶体金标记的新型冠状病毒(2019-nCoV)核衣壳蛋白、棘突蛋白S1和兔IgG抗体，制备试剂小样，通过检测参考品及其37℃10天的稳定性，确定最佳的抗体划线浓度。
结果发现，如果包被抗体浓度太低，检测线显色太浅，无法满足要求；当鼠抗人IgG/IgM包被浓度为2～3mg/mL时，灵敏度和特异性均满足要求。故选择2.0mg/mL作为最佳包被浓度。
(2)质控线包被
在pH 7.4的0.01M PBS溶液中分别添加不同浓度蔗糖(0％、1％、2％)和海藻糖(0％、1％、2％)作为质控线包被液，将羊抗兔IgG抗体稀释到1mg/mL，作为质控线工作液，同时在检测线处包被鼠抗人IgG/IgM抗体，胶体金垫处包埋胶体金标记的新型冠状病毒(2019-nCoV)核衣壳蛋白复合物、棘突蛋白S1复合物和兔IgG抗体复合物，制备试剂小样，通过检测参考品及37℃10天的稳定性，来确定最佳的质控线包被液。
结果发现，加入蔗糖会影响试剂的稳定性，添加海藻糖后试剂稳定性无明显提高，故不加海藻糖和蔗糖也可保证试剂的稳定性，所以确定在包被稀释液中不添加任何封闭液，仅使用pH 7.4的0.01M PBS溶液作为质控线包被稀释液。
在上述确定的最佳包被液中添加羊抗兔IgG抗体，使其终浓度分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL，包被质控线，同时在检测线处包被鼠抗人IgG/IgM抗体，胶体金垫处包埋胶体金标记的新型冠状病毒(2019-nCoV)核衣壳蛋白复合物、棘突蛋白S1复合物和兔IgG复合物(4:4:1混合)，制备试剂小样，通过检测参考品及其37℃10天的稳定性，来确定最佳的包被浓度。
结果发现，如果质控线包被浓度太低，对于强阳性标本，C线显色偏弱；包被浓度为2.0～3.0mg/mL时，阳性参考品、灵敏度和阴性参考品C线显色强度均满足要求。故最佳的质控线包被浓度为2.0mg/mL。
(3)硝酸纤维素膜的制备
将包被质控线和检测线的抗体分别按2.0mg/mL浓度进行划线，然后以30～37℃烘干1～4h，在此条件下制备的硝酸纤维素膜膜稳定性良好，灵敏度和特异性满足要求。
实施例4试剂盒的组装
将胶体金垫、硝酸纤维素膜、样品垫和吸水纸顺次搭接粘贴在底板上，在外包装塑料外壳，并封口制备试纸条；
对上述试纸条进行贴标签，标签内容包括名称、规格、批号等；将检验合格后的试纸条按要求分别装在规定要求的包装盒内，同时将样本稀释液和使用说明书一同装入，在外包装盒上的特定位置标注批号、生产日期及使用期限等。
实施例5反应体系的确定
(1)样本稀释液的制备
配制不同pH值的0.01M Tris-HCl、PB、PBS缓冲溶液。通过检测参考品确定最佳的样本稀释液缓冲体系。
结果发现，只有用pH7.4的0.01M PBS样本稀释液，IgG和IgM的检测样本区分度最佳。因此，选择pH7.4的0.01M PBS缓冲液作为最佳的样本稀释液。
为了消除假阳性，降低胶体金颗粒的非特异吸附，在上述缓冲体系中分别加入0％、0.2％、0.5％、1％、2％酪蛋白，通过检参考品确定最佳的样本稀释液组成。
结果发现，加入0.5％酪蛋白的0.01M PBS样本稀释液，IgG和IgM的检测样本区分度最佳。因此，选择添加0.5％酪蛋白的0.01M PBS缓冲液作为最佳的样本稀释液。
为了提高样本稀释液的稳定性，在上述确定的稀释液组分中分别加入不同浓度(0％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％)的ProClin300。通过检测参考品验证稀释液的性能(包括稳定性)，确定最佳的ProClin300的用量。
结果发现，加入0.05％ProClin300和0.5％酪蛋白的0.01M PBS样本稀释液，IgG和IgM的检测样本区分度最佳，放置10天稳定性差异也最小。因此，选择添加0.05％ProClin300和0.5％酪蛋白的0.01M PBS缓冲液作为最佳的样本稀释液。
(2)反应时间的确定
采用实施例2～4确定的生产工艺制备试剂小样，试剂宽度3.0+0.2mm，样本稀释液加样量为60μL。检测结果观察时间分别1～5min、5～10min、10～15min、15～20min、20～25min，通过检测参考品来确定最佳的反应时间。
结果发现，反应时间太短，层析不彻底，背景不清晰，结果判读不可靠；反应时间以10～15min为宜，此时背景清晰，检测线与质控线显色已经稳定，层析彻底，便于判读结果，故最佳的反应时间为10～15min。
实施例6
按照实施例2～4确定的生产工艺制备新型冠状病毒(2019-nCoV)IgG/IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)，用参考品进行性能全检，以验证生产工艺和反应体系。
参考品主要包括15个阴性参考品、10个阳性参考品、4个最低检测限参考品和3个精密度参考品，参考品由已灭活的新型冠状病毒感染肺炎病例组(确诊/临床诊断)患者血浆样本配制而成，样本由中国医学科学院病原生物学研究所提供。具体为：阴性参考品15份，编号为N1～N15，15份阴性参考品中含不同类型交叉样本；阳性参考品10份，编号为P1～P10；最低检测限参考品4份，编号为L1～L4，其中：L1为阴性样本，L2、L3为弱阳性样本，L4为中阳性样本；精密度参考品4份，编号为S1、S2、S3、S4，检测结果均为阳性。
检测结果如表4所示，“++++”、“+++”代表强阳性，“++”代表中阳性，“+”代表弱阳性；“±”代表无法判定阴阳性；“-”代表阴性，按照实施例2～5的生产工艺和反应体系制备的试剂检测企业内部参考品全部合格，符合预期结果。
表4试剂盒性能检验
Figure BDA0002559715030000191
Figure BDA0002559715030000201
综上所述，本发明通过对新型冠状病毒(2019-nCoV)IgG/IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)主要生产工艺及反应体系的研究，制备得到性能稳定、灵敏度高、特异性好的试剂盒，可以同时检测新型冠状病毒IgG抗体和IgM抗体，具有广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板和在所述底板上顺次搭接粘贴的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
所述胶体金垫上涂覆有胶体金标记核衣壳蛋白、胶体金标记棘突蛋白和胶体金标记兔IgG抗体复合物；
所述硝酸纤维素膜上设有IgG抗体检测线和IgM抗体检测线。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述胶体金垫的胶体金标记核衣壳蛋白、胶体金标记棘突蛋白和胶体金标记兔IgG抗体的摩尔比为(1～5):(1～5):1；
优选地，所述胶体金标记核衣壳蛋白、胶体金标记棘突蛋白和胶体金标记兔IgG抗体复合物在胶体金垫上的喷涂量为10～20μL/cm。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述IgG抗体检测线上包被有抗人IgG抗体；
优选地，所述抗人IgG抗体的包被浓度为2～3mg/mL；
优选地，所述IgM抗体检测线上包被有抗人IgM抗体；
优选地，所述抗人IgM抗体的包被浓度为2～3mg/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上还设置有质控线；
优选地，所述质控线上包被有与胶体金垫上的标记抗体发生抗原抗体反应的二抗；
优选地，所述质控线上包被有抗兔IgG抗体；
优选地，所述质控线上的抗兔IgG抗体的浓度为2～3mg/mL。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条外包装有塑料外壳；
优选地，所述塑料外壳上设置有加样孔和观察窗；
优选地，所述加样孔位于所述样品垫的上方；
优选地，所述观察窗位于所述检测线和质控线的上方。
6.一种新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-5任一项所述的试纸条；
优选地，所述试剂盒还包括样本稀释液；
优选地，所述样本稀释液为含有酪蛋白和ProClin的PBS溶液；
优选地，所述酪蛋白在所述PBS溶液中的浓度为0.2％～2％；
优选地，所述ProClin在所述PBS溶液中的浓度为0.02％～0.2％。
7.一种权利要求1-5任一项所述的试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)采用胶体金分别标记核衣壳蛋白、棘突蛋白和兔IgG抗体，将得到的胶体金标记核衣壳蛋白、胶体金标记棘突蛋白和胶体金标记兔IgG抗体混合后形成胶体金金标复合物，将胶体金金标复合物复溶和浓缩后，喷涂于胶体金垫上；
(2)在硝酸纤维素膜上分别包被IgG检测线、IgM检测线和质控线，烘干；
(3)将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底板上，得到所述试纸条。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述胶体金的粒径为20～30nm；
优选地，采用胶体金标记核衣壳蛋白，所述核衣壳蛋白在胶体金溶液中的浓度为15～20μg/mL，标记时间不短于3h；
优选地，采用胶体金标记核衣壳蛋白，封闭液为0.1％～2％BSA，封闭时间为16～20h；
优选地，采用胶体金标记棘突蛋白，所述棘突蛋白在胶体金溶液中的浓度为15～20μg/mL，标记时间不短于3h；
优选地，采用胶体金标记棘突蛋白，封闭液为0.1％～2％BSA，封闭时间为16～20h；
优选地，采用胶体金标记兔IgG抗体，所述兔IgG抗体在胶体金溶液中的浓度为8～10μg/mL；
优选地，所述复溶的溶液为含有蔗糖、海藻糖、BSA和Tween-20的Tris溶液；
优选地，所述检测线的包被液为PBS溶液；
优选地，所述质控线的包被液为PBS溶液；
优选地，所述烘干的温度为30～37℃；
优选地，所述烘干的时间为1～4h。
9.一种权利要求6所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
采用样本稀释液稀释待测样本后，通过加样孔滴加于试纸条的样品垫上，反应10～15min，从观察窗观察检测线和质控线的结果。
10.一种自动化检测装置，其特征在于，所述装置包括样本稀释单元、样本滴加单元和结果分析单元；
所述样本稀释单元采用样本稀释液稀释待测样本；
所述样本滴加单元将稀释的待测样本通过加样孔滴加于试纸条的样品垫上；
所述结果分析单元根据检测线和质控线的显色情况，分析检测结果。
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