CN111208298A - 一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及试剂盒技术领域，尤其涉及一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法，包括检测卡、金标抗体工作液、洗涤液和比色卡；所述金标抗体工作液由胶体金浓缩液与金标抗体稀释液按体积比1:5～30的比例混合而成；洗涤液包括Tris、氯化钠、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和防腐剂。利用该试剂盒可以快速、准确的检测2019‑nCOV，缩短了检测时间，操作简单方便。

Description

一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及试剂盒技术领域，尤其涉及一种2019新型冠状病毒抗体检测试 剂盒及其制备方法。
背景技术
2019新型冠状病毒，即“2019-nCoV”，2020年1月12日被世界卫生组织 命名。新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形， 常为多形性，直径60-140nm。S蛋白是病毒的主要蛋白之一，其编码基因用于 病毒分型。N蛋白包裹病毒基因组，可作为诊断抗原。基于目前的流行病学调查， 其临床表现：潜伏期一般为3～7天，最长不超过14天。人群普遍易感，以发 热、乏力、干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。重型病 例多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症 休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。值得注意的是重型、危重 型患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。部分患者仅表现为低热、轻微乏 力等，无肺炎表现，多在1周后恢复。多数患者预后良好，儿童病例症状相对 较轻，少数患者病情危重。死亡病例多见于老年人和有慢性基础疾病者。可能 的传播途径包括飞沫传播、粪口传播以及接触传播。
新型冠状病毒(2019-nCoV)感染后，机体可产生特异性抗体，如出现阳性 结果表明机体感染过新型冠状病毒(2019-nCoV)。目前实验室检测方法主要采 用病毒核酸检测，该方法检测时间长，对实验室不同反应条件空间要求相互独 立，且需专业人员通过设备进行操作，具有一定的局限性，不适合大规模检测 应用。因此针对上述问题，有必要开发一种检测2019新型冠状病毒抗体试剂盒 及其制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种简便、快 速、检测准确的2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒，包括检测卡、金标抗体工作液、 洗涤液和比色卡；所述检测卡包括上板块和下板块，所述上板块上设有反应窗 口，所述下板块的内部设有反应膜和吸水垫，与所述反应窗口相对应的所述反 应膜上设有包被羊抗鼠抗体的质控区、包被2019-nCoV的N蛋白抗原的第一检 测区和包被2019-nCoV的S蛋白抗原的第二检测区；所述金标抗体工作液由胶 体金浓缩液与金标抗体稀释液按体积比1:5～30的比例混合而成；所述洗涤液 包括Tris、氯化钠、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和防腐剂。
作为一种改进的技术方案，每100ml所述金标抗体稀释液由121.1～242.2mg 三羟甲基氨基甲烷、0.1～0.2mg的氯化钠、0.5～0.7mg的牛血清白蛋白、3～7 wt％的甘露醇、2～10wt％的蔗糖、2mL的甘油、0.01～0.1wt％的PEG20000、0.01～ 0.1wt％的PVP40和蒸馏水配置而成。
作为一种改进的技术方案，所述洗涤液配制时按照每100mL、10～20mM的 Tris溶液中含有氯化钠0.9～2.0g、牛血清白蛋白0.3～0.6g、1ml 10wt％的 PVP-40、PC3000.1～0.5mL进行配制，其中所述Tris溶液的pH为8.0-8.5。
作为一种改进的技术方案，所述上板块和所述下板块为卡固连接，其中所 述下板块的底面上设有卡槽，所述上板块的底面上设有与所述卡槽相适配的卡 柱。
作为一种改进的技术方案，所述反应窗口为一个上底直径为1—3cm的倒锥 形引流窗口，所述反应窗口的底部设有突出部。
作为一种改进的技术方案，所述下板块的两侧内壁上分别设有卡块。
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种简便、快 速、检测准确的2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以 下步骤：
(1)检测卡的组装
将吸水垫放置于下板块内部，再将反应膜放置在吸水垫上方，将上板块和 下板块卡固在一起；
(2)包被反应膜
1)包被抗原
用抗原包被液分别将2019-nCoV的N蛋白抗原和2019-nCoV的S蛋白抗原 稀释至终浓度为0.2mg/ml，再将配置的2019-nCoV的N蛋白抗原和2019-nCoV 的S蛋白抗原分别喷涂于反应膜上，形成第一检测区和第二检测区；
2)包被羊抗鼠抗体
将PBS缓冲液将羊抗鼠Ig G多抗稀释至2mg/ml，再将其喷涂于上述1)的 反应膜上，形成质控区；
3)烘干处理
上述操作结束后再将检测板在37℃条件下干燥2-4h，在湿度小于40％的环 境下平衡2h后，放置在铝箔袋内封口保存；
(3)金标抗体工作液的配置
1)胶体金的标记：取0.5～1wt％的氯金酸水溶液100mL，加热至沸腾，加 入0.4～0.8wt％柠檬酸三钠溶液0.8～1mL，混匀，继续煮沸5～15min，冷却至 室温，加入1mg/mL鼠抗人l g M单抗0.2～0.5mL，搅拌10～30min后再加入 0.3～0.7mg牛血清白蛋白，继续搅拌10～30min，离心，弃去上清液，下层沉 淀即胶体金标浓缩液；
2)金标抗体稀释液配置：将121.1～242.2mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1～ 0.2mg的氯化钠和0.5～0.7mg的牛血清白蛋白混合，加入双蒸水，溶解后依次 加入3～7wt％甘露醇、2～10wt％蔗糖、2mL甘油、0.01～0.1wt％PEG20000， 0.01～0.1wt％PVP40，定容至100mL，得到金标抗体稀释液；
3)将胶体金标浓缩液与金标抗体稀释液按体积比1:5～30的比例混合，得 到金标抗体工作液；
(4)洗涤液的配置
配制10～20mM Tris溶液100mL，用HCl调节pH至8.0～8.5，得到Tris-HCl 缓冲液，再依次加入NaCl 0.9～2.0g、BSA 0.3～0.6g、1mL 10wt％PVP-40和PC300 0.1～0.5mL，混匀，得到洗涤液；
(5)试剂盒的组装
将金标抗体工作液和洗涤液分别放入容量瓶内封装，将检测卡、金标抗体 工作液瓶、洗涤液瓶以及比色卡分别放入包装盒内部，封装即可。
作为一种改进的技术方案，抗原包被量为0.2mg/ml的2019新型冠状病毒 的N蛋白抗原和2019新型冠状病毒的S蛋白抗原各0.5μl，所述羊抗鼠抗体包 被量为2mg/ml的羊抗鼠抗体0.5μl。
作为一种改进的技术方案，所述抗原包被液由121.1～242.2mg三羟甲基氨 基甲烷、0.1～0.2mg氯化钠、5-15ml甘油、1～3wt％海藻糖、0.01～0.1wt％ 明胶、0.1～0.5％Pro-cl in300和双蒸水配置而成，所述抗原包被液的pH为8.0～ 8.5。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
(1)本发明采用金标渗滤法并包被高灵敏度2019-nCoV抗原检测新型冠状 病毒，采用硝酸纤维膜作为反应膜，因采用大表面积高蛋白质结合力的小孔径 膜的穿流式反应模式，可促使抗原和抗体在膜上反应时处于高浓度状态，保证 了检测灵敏度、特异性，缩短了反应时间，3min即可判读结果，缩短了病人等 待时间，做到了2019-nCoV的快速诊断。
(2)本发明采用了2019-nCoV的S蛋白和N蛋白作为包被抗原，提高检出 特异性，同时避免了漏检和误检。
(3)本发明优化了抗原包被液的配方，通过添加甘油增加其亲水性提高试 剂盒检测的敏感度；同时添加大分子物质明胶，增加了视觉判读的区分度，阳 性显色更加明显，阴性更加白净，便于结果判读；一定浓度的糖类物质的加入 增强了抗原结构稳定性。
(4)本发明改善了胶体金标记配方，通过添加牛血清白蛋白，将胶体金颗 粒表面上未结合位点进行封闭，从而减少了血清动力学的假阳性，提高了检测 的准确特异性；
(5)本发明改善了金标抗体稀释液配方，通过调整甘露醇与蔗糖以及大分 子聚合物PEG的体积质量比，减少了温度等外界环境变化对金标抗体工作液体 系稳定性的影响，同时，PVP的加入，大大降低了胶体金的聚合，延长了保存时 间。
(6)本发明中通过向洗涤液中添加聚乙烯吡咯烷酮，明显改善了因标本(高 脂血、溶血)中的难溶物或其与金标液非特异性结合后形成的难溶性复合物而 导致的膜面发红现象，提高检测灵敏度的同时降低了漏检水平。
(7)本发明的试剂盒操作简单、快速，无需专业人士，可应用于现社会状 态下对大批量可疑携带者人群的筛查，大大增强了实效性，便于不同类型人员 快速分流。对于在家自行隔离或就地隔离人员以及社区门诊等可迅速做出检测， 减少不必要骚动恐慌，且无需去医院检测避免了交叉感染。
(8)本发明试剂盒可直接用肉眼判读结果，根据比色卡对比显色差异，确 定为强阳、中阳、弱阳、阴性，便于结果判读。
由于上板块和下板块为卡固连接，其中下板块的底面上设有卡槽，上板块 的底面上设有与卡槽相适配的卡柱。这一设计，结构简单便于操作人员快速组 产品。
由于反应窗口为上底直径为1—3cm的倒锥形引流窗口，反应窗口的下方设 有突出部。反应窗口设计为倒锥形便于待检样本、洗涤液以及金标抗体工作液 流向反应膜。
由于下板块的两侧内壁上分别设有卡块。在安装检测卡时，将反应膜至于 下板块内部，通过两侧内壁上的卡块固定。卡块的设计便于固定反应膜。
附图说明
图1为本发明一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒的检测卡的俯视图；
图2为本发明中检测卡的纵向剖视图；
图3为检测卡中下板块的结构示意图；
其中，1-检测卡，10-上板块，100-反应窗口，101-卡柱，11-下板块，110- 卡槽,111-卡块，2-反应膜，3-吸水垫。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实 施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅 仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种快速检测2019新型冠状病毒抗体试剂盒，如图1和图2共同所示，包 括检测卡、金标抗体工作液、洗涤液和比色卡；检测卡1包括上板块10和下板 块11，上板块10上设有反应窗口100，下板块11的内部设有反应膜2和吸水 垫3，与反应窗口100相对应的反应膜2上设有包被羊抗鼠抗体的质控区20、 包被2019-nCoV的N蛋白抗原的第一检测区21和包被2019-nCoV的S蛋白抗原 的第二检测区22；金标抗体工作液由胶体金标浓缩液与金标抗体稀释液按体积 比1:5的比例混合而成；所述洗涤液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和防腐剂。
在实际应用中，将检测卡、金标抗体工作液瓶、洗涤液瓶从盒体内取出， 室温平衡20-30分钟；先将洗涤液(2滴)从反应窗口加入，反应膜润湿后加入 待检血清(50μL)，待液体充分吸入，然后再加入洗涤液(2滴)，待液体充分 吸入再加入金标抗体工作液(3滴)，待液体充分吸入再加入洗涤液(3滴)洗 去多余的金标抗体工作液和杂质，待液体充分吸入后3min内观察结果；如果待 检血清中含有2019-nCoV抗体时会分别与反应膜上第一检测区和第二检测区包 被的抗原结合，形成2019-nCoV抗原抗体复合物，再加入含有鼠抗人单抗的金 标抗体工作液，鼠抗人单抗与待检血清中的2019-nCoV抗原抗体复合物结合， 最后加入洗涤液，洗去多余的金标抗体工作液和其他杂质，如果第一检测区、 第二检测区显示红色，检测人员拿着比色卡进行比，即分为强阳性、中阳性、 弱阳性，证明感染该病毒；如果按照上述操作后，不显色即为阴性，证明没有 感染该病毒。
其中每100ml所述金标抗体稀释液由121.1mg三羟甲基氨基甲烷、0.1mg的 氯化钠、0.5mg的牛血清白蛋白、3wt％的甘露醇、2wt％的蔗糖、2mL的甘油、0.01wt％ 的PEG20000、0.01wt％的PVP40和蒸馏水配置而成。
每100mL、10mM的Tris溶液中含有氯化钠0.9g、牛血清白蛋白0.3g、1ml 10wt％的PVP-40、PC3000.1mL，其中所述Tris溶液的pH为8.0。
其中如图2所示，上板块10和下板块11为卡固连接，其中下板块11的底 面上设有卡槽110，上板块10的底面上设有与卡槽110相适配的卡柱101。安 装检测卡时，将吸水垫放置在下板块的底面上，再将反应膜放置在吸水垫的上 方，通过卡柱和卡槽将上板块和下板块卡固在一起。
其中如图2所示，反应窗口100为上底直径为1—3cm的倒锥形引流窗口， 反应窗口100的底部设有突出部。反应窗口设计为倒锥形便于待检样本、洗涤 液以及金标抗体工作液流向反应膜。
其中如图3所示，下板块11的两侧内壁上分别设有卡块111。在安装检测 卡时，将反应膜至于下板块内部，通过两侧内壁上的卡块固定。
其制备方法包括以下步骤：
(1)检测卡的组装
将吸水垫放置于下板块内部，再将步骤(1)的反应膜放置在吸水垫上方， 将上板块和下板块卡固在一起；
(2)包被反应膜
1)包被抗原
用抗原包被液分别将2019-nCoV的N蛋白抗原和2019-nCoV的S蛋白抗原 稀释至终浓度为0.2mg/ml，再将配置的2019-nCoV的N蛋白抗原和2019-nCoV 的S蛋白抗原分别喷涂于反应膜上，形成第一检测区和第二检测区；
2)包被羊抗鼠抗体
将PBS缓冲液将羊抗鼠Ig G多抗稀释至2mg/ml，再将其喷涂于上述1)的 反应膜上，形成质控区；
3)检测卡的干燥
上述操作后将检测板在37℃条件下干燥2-4h，在湿度小于40％的环境下平 衡2h后，放置在铝箔袋内封口保存；
(3)金标抗体工作液的配置
1)胶体金的标记：取0.5wt％的氯金酸水溶液100mL，加热至沸腾，加入 0.4wt％柠檬酸三钠溶液0.8mL，混匀，继续煮沸5min，冷却至室温，加入1mg/mL 鼠抗人lgM单抗0.2mL，搅拌10min后再加入0.3mg牛血清白蛋白，继续搅拌 10～30min，离心，弃去上清液，下层沉淀即金标浓缩液；
2)金标抗体稀释液配置：将121.1mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg的氯化 钠和0.5mg的牛血清白蛋白混合，加入双蒸水，溶解后依次加入3wt％甘露醇、 2wt％蔗糖、2mL甘油、0.01wt％PEG20000，0.02wt％PVP40，定容至100mL，得 到金标抗体稀释液；
3)将金标浓缩液与金标抗体稀释液按体积比1:5的比例混合，得到金标抗 体工作液；
(4)洗涤液的配置
配制10mM Tris溶液100mL，用HCl调节pH至8.0，得到Tris-HCl缓冲液， 再依次加入NaCl 0.9g、BSA 0.3g、1mL 10wt％PVP-40和PC3000.1mL，混匀， 得到洗涤液；
(5)试剂盒的组装
将金标抗体工作液和洗涤液分别放入容量瓶内封装，将检测卡、金标抗体 工作液瓶、洗涤液瓶以及比色卡分别放入包装盒内部，封装即可。
其中抗原包被量为0.2mg/ml的2019-nCoV的N蛋白抗原和2019-nCoV的S 蛋白抗原各0.5μl，羊抗鼠抗体包被量为2mg/ml的羊抗鼠抗体0.5μl。
其中抗原包被液由121.1mg三羟甲基氨基甲烷、0.1mg氯化钠、5ml甘油、 3wt％海藻糖、0.05wt％明胶、0.5％(体积浓度)Pro-cl in300和双蒸水配置而成， 经0.45um的硝酸纤维素膜过滤后，放在洗涤液瓶内，置于2～8℃下保存；其中 抗原包被液的pH为8.0。
实施例2
与实施例1不同的是其中每100ml所述金标抗体稀释液由184.2mg三羟甲 基氨基甲烷、0.15mg的氯化钠、0.6mg的牛血清白蛋白、5wt％的甘露醇、5wt％ 的蔗糖、2mL的甘油、0.05wt％的PEG20000、0.05wt％的PVP40和蒸馏水配置 而成。
每100mL、15mM的Tris溶液中含有氯化钠0.95g、牛血清白蛋白0.5g、1ml 10wt％的PVP-40、PC3000.3mL，其中所述Tris溶液的pH为8.3。
其制备方法不同操作在于：
(2)检测卡的组装
将吸水垫放置于下板块内部，再将步骤(1)的反应膜放置在吸水垫上方， 将上板块和下板块卡固在一起，检测板组装后在37℃条件下干燥2h，在湿度小 于40％的环境下平衡2h后，放置在铝箔袋内封口保存；
(3)金标抗体工作液的配置
1)胶体金的标记：取0.8wt％的氯金酸水溶液100mL，加热至沸腾，加入0.5wt％ 柠檬酸三钠溶液0.9mL，混匀，继续煮沸10min，冷却至室温，加入1mg/mL鼠 抗人单抗lgM单抗0.3mL，搅拌20min后再加入0.5mg牛血清白蛋白，继续搅拌 20min，离心，弃去上清液，下层沉淀即金标浓缩液；
2)金标抗体稀释液配置：将142.2mg的三羟甲基氨基甲烷、0.15mg的氯化 钠和0.6g的牛血清白蛋白混合，加入双蒸水，溶解后依次加入5wt％甘露醇、6wt％ 蔗糖、2mL甘油、0.05wt％PEG20000，0.05wt％PVP40，定容至100mL，得到金标 抗体稀释液；
3)将金标浓缩液与金标抗体稀释液按体积比1:15的比例混合，得到金标 抗体工作液；
(4)洗涤液的配置
配制15mM Tris溶液100mL，用HCl调节pH至8.3，得到Tris-HCl缓冲液， 再依次加入NaCl 0.95g、BSA 0.4g、1mL 10wt％PVP-40和PC3000.3mL，混匀， 得到洗涤液；
其中抗原包被液由180.2mg三羟甲基氨基甲烷、0.15mg氯化钠、10ml甘油、 2wt％海藻糖、0.05wt％明胶、0.3％Pro-cl in300和双蒸水配置而成，抗原包被液 的pH为8.3。
实施例3
与实施例1不同的是其中每100ml所述金标抗体稀释液由242.2mg三羟甲 基氨基甲烷、0.2mg的氯化钠、0.7mg的牛血清白蛋白、7wt％的甘露醇、10wt％ 的蔗糖、2mL的甘油、0.1wt％的PEG20000、0.1wt％的PVP40和蒸馏水配置而 成。
每100mL、20mM的Tris溶液中含有氯化钠2.0g、牛血清白蛋白0.6g、1ml 10wt％的PVP-40、PC3000.5mL，其中所述Tris溶液的pH为8.5。
其制备方法中不同操作在于：
(2)反应膜包被
3)检测卡干燥处理
上述操作结束后将检测板在37℃条件下干燥4h，在湿度小于40％的环境下 平衡2h后，放置在铝箔袋内封口保存；
(3)金标抗体工作液的配置
1)胶体金的标记：取1wt％的氯金酸水溶液100mL，加热至沸腾，加入0.8wt％ 柠檬酸三钠溶液1mL，混匀，继续煮沸15min，冷却至室温，加入1mg/mL鼠抗 人单抗lgm 0.5mL，搅拌30min后再加入0.7mg牛血清白蛋白，继续搅拌30min， 离心，弃去上清液，下层沉淀即金标浓缩液；
2)金标抗体稀释液配置：将242.2mg的三羟甲基氨基甲烷、0.2mg的氯化 钠和0.7mg的牛血清白蛋白混合，加入双蒸水，溶解后依次加入7wt％甘露醇、 10wt％蔗糖、2mL甘油、0.1wt％PEG20000，0.1wt％PVP40，定容至100mL，得到 金标抗体稀释液；
3)将金标浓缩液与金标抗体稀释液按体积比1:30的比例混合，得到金标 抗体工作液；
(4)洗涤液的配置
配制20mM Tris溶液100mL，用HCl调节pH至8.5，得到Tris-HCl缓冲液， 再依次加入NaCl 2.0g、BSA 0.6g、1mL 10wt％PVP-40和PC3000.5mL，混匀， 得到洗涤液；
其中抗原包被液由242.2mg三羟甲基氨基甲烷、0.2mg氯化钠、15ml甘油、 3wt％海藻糖、0.1wt％明胶、0.5％Pro-cl in300和双蒸水配置而成，抗原包被液 的pH为8.5。
为了更好的证明本发明的检测试剂盒具有较好的准确性，将本发明实施例 1-3中试剂盒对内部质控品(阴性质控品、弱阳性质控品、中阳性质控品、强阳 性质控品)进行检测，检测结果见表1、表2和表3。
表1
Figure BDA0002382322860000101
表2
Figure BDA0002382322860000111
表3
Figure BDA0002382322860000112
通过表1、表2和表3的检测结果可以发现，本发明实施例1、实施例2和 实施例3中的试剂盒具有较好的检测效果。
实施例4
试剂盒的稳定性考察
将本发明所述试剂盒(置37℃进行破坏性试验，每天考察试剂盒稳定性检 测标准如下：
检测板：平整洁净、装配严密，检测孔内膜片无划痕、破损和污点。
金标液：瓶盖瓶体无变形；瓶内液体红色透明，无浑浊、沉淀现象。
洗涤液：瓶盖瓶体无变形；瓶内液体无色透明，无浑浊、沉淀现象。
(2)阴性质控品符合率：用10份阴性质控品检测，检测结果全部呈阴性。
(3)阳性质控品符合率：用30份阳性(包括强、中、弱阳性)质控品检 测，检测结果全部呈阳性。
试剂盒稳定性考察结果见表4。
表4
Figure BDA0002382322860000121
Figure BDA0002382322860000131
备注：“+++”表示强阳性；“++”表示中阳性；“+”表示弱阳性；“-”表示阴性
经试验在37℃可稳定至少15天。根据稳定性实验原理，阿伦尼乌斯公式： d(Ink)/dT＝Ea/RT2 Ea。常温保存10个月，相当于37度破坏15天。可满足医 院诊所及卫生检疫部门的临床需求，也可用于大专院校和科研机构的疾病诊断 研究。
实施例5
选取237例血清样本(包含一定比例阳性和阴性)进行考核试剂与参比试 剂的对比试验，考核试剂为我公司生产的2019新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM 抗体检测试剂盒，参比试剂为市场上反馈结果较好的层析法试剂，进行同步检 测，分别记录结果。通过结果考察考核试剂与参比试剂的一致性；计算阳性符 合率、阴性符合率和总符合率。考核试剂与参比试剂检测结果统计见表5。
表5
Figure BDA0002382322860000132
考核试剂与参比试剂符合率分析
阳性符合率＝A/(A+C)×100％
阴性符合率＝D/(B+D)×100％
总符合率＝(A+D)/(A+C+B+D)×100％
差异性评价—卡方检验
检验假设：
H0：考核试剂和参比试剂不存在显著差异
H1：考核试剂和参比试剂存在显著差异
α＝0.05。
检验统计量为：
B+C≥40，
Figure BDA0002382322860000141
v＝1
B+C＜40，
Figure BDA0002382322860000142
v＝1
确定P值和分析：
配对资料v＝1；以α＝0.05为准，查卡方界值表，得知χ20.05(1)＝3.84。 若χ2>3.84，P<0.05，则拒绝H0，即认为考核试剂和参比试剂存在显著差异；若 χ2<3.84，P>0.05，则拒绝H1，即认为考核试剂和参比试剂不存在显著差异。考 核试剂与参比试剂结果统计及分析见表6。
表6
Figure BDA0002382322860000143
考核试剂与参比试剂符合率计算
考核试剂与参比试剂阳性符合率＝92/(92+14)×100％＝86.8％
考核试剂与参比试剂阴性符合率＝124/(7+124)×100％＝94.7％
考核试剂与参比试剂总符合率＝(92+124)/(92+7+14+124)×100％＝91.1％
差异性评价—卡方检验
检验假设
H0：考核试剂和参比试剂结果不存在显著差异
H1：考核试剂和参比试剂结果存在显著差异
α＝0.05。
检验统计量为：
因为B+C＝7+14＝21<40，
所以
Figure BDA0002382322860000151
得P>0.05，按α＝0.05水准，拒绝H1，即考核试剂和参比试剂结果不存在 显著差异，考核试剂和参比试剂结果具有较高的一致性。我公司生产的2019新 型冠状病毒(2019-nCov)IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)主要性能指标达到 市场上反馈结果较好的层析法试剂水平，符合临床辅助诊断要求。
为了更好的证明本发明的试剂盒具有较好的检测效果，以本发明实施例1 作为对照，给出了对比例1、对比例2和对比例3。
对比例1
与实施例1相比较其余操作相同，唯一的不同在于抗原包被液的配方不同：
对比例中的抗原包被液配制：将121.1mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg的氯 化钠置于容量瓶内，加入双蒸水，轻摇使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至 100mL，加入3wt％海藻糖，混匀后再用浓盐酸将其pH调节为8.0-8.5，最后加 入0.5％的Pro-cl in300，经0.45um的硝酸纤维素膜过滤后，放在瓶内，置于2～ 8℃下保存；
用企业内部质控品(阴性质控品、弱阳性质控品、中阳性质控品、强阳性 质控品)，采用实施例抗原包被液及对比例抗原包被液分别进行对比检测，检测 结果如下表7所示：
表7
Figure BDA0002382322860000161
注：“+++”表示强阳性；“++”表示中阳性；“+”表示弱阳性；“-”表示阴性
结果表明，添加特效物质的抗原包被液可有效提高灵敏度，增强显色程度， 最大程度满足样本准确性检验的要求。
对比例2
与实施例1相比较其于操作都相同，唯一不同的操作在于检测板没有在37℃ 条件下烘干，而是直接在湿度小于40％的环境下室温干燥2h。
用企业内部质控品(阴性质控品、弱阳性质控品、中阳性质控品、强阳性 质控品)，采用实施例检测板处理及对比例检测板处理分别进行对比检测，检 测结果如下表8所示：
表8
Figure BDA0002382322860000171
注：“+++”表示强阳性；“++”表示中阳性；“+”表示弱阳性；“-”表 示阴性
试验表明，检测板放在37℃烘箱烘膜2h-4h，然后在湿度小于40％的环境下 室温平衡2h，检测结果对于强中弱阳性质控品的显色性能、准确度等方面均优 越于在湿度小于40％的环境下室温平衡2h。考虑到企业生产过程中的时间因素， 检测板的处理选择放在37摄氏度烘箱烘膜2h，然后在湿度小于40％的环境下室 温平衡2h，然后用铝箔袋包装，并在袋内放置干燥剂，封口。
通过上述稳定性试验数据、对比例试验等检测数据可以证明，本发明的试 剂盒具有较好的稳定性，而且准确、快速的检测2019新型冠状病毒，操作简单， 使用方便。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：包括检测卡、金标抗体工作液、洗涤液和比色卡；所述检测卡包括上板块和下板块，所述上板块上设有反应窗口，所述下板块的内部设有反应膜和吸水垫，与所述反应窗口相对应的所述反应膜上设有包被羊抗鼠抗体的质控区、包被2019-nCOV的N蛋白抗原的第一检测区和包被2019-nCOV的S蛋白抗原的第二检测区；所述金标抗体工作液由胶体金标浓缩液与金标抗体稀释液混合而成；所述洗涤液包括Tris、氯化钠、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和防腐剂。
2.根据权利要求1所述的一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：每100ml所述金标抗体稀释液由121.1～242.2mg三羟甲基氨基甲烷、0.1～0.2mg的氯化钠、0.5～0.7mg的牛血清白蛋白、3～7wt％的甘露醇、2～10wt％的蔗糖、2mL的甘油、0.01～0.1wt％的PEG20000、0.01～0.1wt％的PVP40和蒸馏水配置而成。
3.根据权利要求1所述的一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液配制时按照每100mL、10～20mM的Tris溶液中含有氯化钠0.9～2.0g、牛血清白蛋白0.3～0.6g、1ml10wt％的PVP-40、PC3000.1～0.5mL进行配制，其中所述Tris溶液的pH为8.0-8.5。
4.根据权利要求1所述的一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述上板块和所述下板块为卡固连接，其中所述下板块的底面上设有卡槽，所述上板块的底面上设有与所述卡槽相适配的卡柱。
5.根据权利要求1所述的一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述反应窗口为一个上底直径为1—3cm的倒锥形引流窗口，所述反应窗口的底部设有突出部。
6.根据权利要求1所述的一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述下板块的两侧内壁上分别设有卡块。
7.一种如权利要求1所述的2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)包被反应膜
1)包被抗原
用抗原包被液分别将2019-nCoV的N蛋白抗原和2019-nCOV的S蛋白抗原稀释至终浓度为0.2mg/ml，再将配置的2019-nCoV的N蛋白抗原和2019-nCoV的S蛋白抗原分别喷涂于反应膜上，形成第一检测区和第二检测区；
2)包被羊抗鼠抗体
将PBS缓冲液将羊抗鼠IgG多抗稀释至2mg/ml，再将其喷涂于上述1)的反应膜上，形成质控区；
(2)检测卡的组装
将吸水垫放置于下板块内部，再将步骤(1)的反应膜放置在吸水垫上方，将上板块和下板块卡固在一起，检测板组装后在37℃条件下干燥2-4小时，在湿度小于40％的环境下平衡2小时后，放置在铝箔袋内封口保存；
(3)金标抗体工作液的配置
1)胶体金的标记：取0.5～1wt％的氯金酸水溶液100mL，加热至沸腾，加入0.4～0.8wt％柠檬酸三钠溶液0.8～1mL，混匀，继续煮沸5～15分钟，冷却至室温，加入1mg/mL鼠抗人IgM单抗0.2～0.5mL，搅拌10～30min后再加入0.3～0.7mg牛血清白蛋白，继续搅拌10～30min，离心，弃去上清液，下层沉淀即金标浓缩液；
2)金标抗体稀释液配置：将121.1～242.2mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1～0.2mg的氯化钠和0.5～0.7mg的牛血清白蛋白混合，加入双蒸水，溶解后依次加入3～7wt％甘露醇、2～10wt％蔗糖、2mL甘油、0.01～0.1wt％PEG20000，0.01～0.1wt％PVP40，定容至100mL，得到金标抗体稀释液；
3)将金标浓缩液与金标抗体稀释液按体积比1:5～30的比例混合，得到金标抗体工作液；
(4)洗涤液的配置
配制10～20mMTris溶液100mL，用HCl调节pH至8.0～8.5，得到Tris-HCl缓冲液，再依次加入NaCl0.9～2.0g、BSA0.3～0.6g、1mL10wt％PVP-40和PC3000.1～0.5mL，混匀，得到洗涤液；
(5)试剂盒的组装
将金标抗体工作液和洗涤液分别放入容量瓶内封装，将检测卡、金标抗体工作液瓶、洗涤液瓶以及比色卡分别放入包装盒内部，封装即可。
8.根据权利要求7所述的一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：抗原包被量为0.2mg/ml的2019-nCoV的N蛋白抗原和2019-nCoV的S蛋白抗原各0.5μl，所述羊抗鼠抗体包被量为2mg/ml的羊抗鼠抗体0.5μl。
9.根据权利要求7或8所述的一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述抗原包被液由121.1～242.2mg三羟甲基氨基甲烷、0.1～0.2mg氯化钠、5-15ml甘油、1～3wt％海藻糖、0.01～0.1wt％明胶、0.1～0.5％Pro-clin300和双蒸水配置而成，所述抗原包被液的pH为8.0～8.5。
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