CN113702350A - 基于表面增强拉曼光谱的新型冠状病毒检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明为基于表面增强拉曼光谱的新型冠状病毒检测方法及试剂盒，提供一种基于表面增强拉曼光谱的生物大分子检测方法及试剂盒，先制备碘离子修饰的银纳米颗粒溶胶为混合物1；将混合物1中加入乙腈得到混合物2；将混合物2中加入待测样品得到混合物3；将混合物3中加入能提供钙离子的物质得到混合物4；再将混合物4进行SERS检测。可应用于实际的临床检测，将促进SERS在病毒检测领域的应用，提升对于突发、新发病毒性传染病的处置能力。
Description
技术领域
本发明属于生物大分子检测技术领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱的生物大分子检测方法，还涉及一种试剂盒。
背景技术
生物大分子是指生物体细胞内存在的蛋白质、核酸、多糖等大分子，结构很复杂，但其基本的结构单元并不复杂。蛋白质分子是由氨基酸分子以一定的顺序排列成的长链。氨基酸分子是大部分生命物质的组成材料，不同的氨基酸分子有好几十种。生物体内的绝大多数酶就属于蛋白质，是生物体维持正常代谢功能所不可缺少的。拉曼光谱是研究生物大分子的有力手段，可以在接近自然状态、活性状态下来研究生物大分子的结构及其变化。病毒是由一个核酸长链和蛋白质外壳构成，在自然界中广泛存在，病毒性传染病是引起生物死亡的主要原因之一，例如SARS(3)、H1N1(4)、MERS(5)、埃博拉出血热以及新型冠状病毒肺炎，新型冠状病毒肺炎死亡率高，导致该病的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种含 29种编码蛋白的单链RNA病毒，虽然人们已经发现该病毒的4个重要的结构蛋白，但到目前为止仍然没有针对该病毒的有效治疗方案。
早发现、早识别对于病毒性传染病的防治具有重大价值。目前对于病毒的检测技术主要有分子检测和血清学检测。前者主要指的是聚合酶链反应(PCR)及其衍生技术，后者主要包括了荧光抗体测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法。但是这些技术大多数都存在操作复杂、成本高、灵敏度低等问题。新型冠状病毒目前最常用的检测方法是荧光定量PCR，该方法在标本中检测新冠病毒的灵敏度可达到500-1000拷贝数/ml，但当采样时机不正确，例如当病毒已经从上呼吸道清除时，该方法假阴性的情况就会出现。此外，运用该技术还需提前对标本进行处理及检测后数据分析，耗费时间较长，同时易受到污染从而出现假阳性的情况。而以ELISA为代表的血清学方法则存在交叉反应导致的假阳性现象，例如某些季节性冠状病毒会与新冠病毒发生交叉反应，甚至在某些情况下会造成病原体的误判。同时，对于新发传染病的未知病原体进行PCR检测及血清学检测，就必须使用基于该病毒的特异性探针分子，例如抗体或DNAOligomers，同时需要遵守“科赫法则”进行复杂的病毒分离及培养，该方法耗时长且生物安全等级要求严格，一般实验室难以开展。发展一种快速、简便、经济的病毒检测技术使得病毒感染的早期识别成为可能，这是早期临床干预和增加患者生存可能性的关键一点。
病毒检测领域的标准方法是PCR免疫荧光法，冠状病毒的检测方法与以往严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒 (MERS-CoV)的诊断试验相似，它有三个核衣壳基因靶点和一个阳性对照靶点，是针对病毒的核酸进行检测。核酸检测过程包括标本处理、核酸提取，进行PCR 检测等多个步骤，平均检测时间需要2～3个小时。因为它是直接对我们采集标本中的病毒核酸进行检测，所以结果精确，特异性强，敏感度相对较高，是当前主要的检测手段。这种检测方法的缺点是核酸检测耗时较长，完成一批次检测需要好几个小时，且需要实验室、仪器设备、试剂耗材和专业技术人员，所花费的人工成本和时间成本较高，无法成为普查筛选方法，任何一个城市也无法做到每人每天进行核酸检测以控制病毒的传播，而无症状患者的出现加大了病毒的传播的可能性。因为在无症状的潜伏期，甚至患病初期，由于病毒的遗传物质在体细胞被免疫系统针对攻击，有很大概率检测结果显示无病毒核酸的假阴性。
表面增强拉曼散射(SERS)是一种具有强大检测能力的无损、快速检测技术，无需对样品进行复杂的前处理，它就可以在极高的灵敏度下，甚至是单分子层面上对DNA和蛋白质等生物分子进行检测。同时由于作为生命最基本物质的水分，其本身没有荧光信号，不会对SERS信号造成干扰，因此SERS技术可以广泛应用于生命科学领域，包括用于检测几种呼吸道病毒，例如人腺病毒5型、流感病毒以及新冠病毒。然而，由于SERS技术的“热点”通常为金或银纳米结构之间不足10nm的空间，而生物大分子大于10nm，例如病毒的大小通常有100nm左右，这使得病毒等生物大分子无法适应SERS的“热点”，单纯的使用传统SERS技术无法可靠的检测和识别，针对上述，现有技术中进行了如下的改进：
Xingang Zhang等人开发了一种NHCMB新型基底，利用该基底可以对腺病毒进行准确的检测，同时具有良好的重现性。但是NHCMB基底的制备工艺较为复杂，制备成本较高；
Gayoung Eom等人制备了一种urchin金纳米颗粒，可以与耐奥司他韦流感病毒变异毒株的巯基结构特异性结合，可以在单分子层面上检测出该变异毒株。该方法虽然具有较高的灵敏度，但普适性较差，只能检测结构中带有巯基的病毒毒株；
Jae-young Lim等人利用SERS技术检测已感染流感病毒的细胞表面所表达的蛋白进而判定可能存在的流感变异毒株的感染情况。但其使用的方法无法获得病毒本身的指纹图谱，而是通过其感染细胞后所表达蛋白质间接检测，而该蛋白质的指纹图谱信号又容易受到细胞表面固有蛋白质的影响，造成准确性较差。
因此使SERS检测生物大分子兼具准确性、稳定性、灵敏性、普适性、可重复性、低成本、易操作且不受血清或唾液等背景荧光干扰是值得进一步探索的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于表面增强拉曼光谱的生物大分子检测方法，能够获取蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的SERS信号，在极低浓度下(100拷贝数/mL)获得指纹图谱，具备利用SERS特异性识别潜伏期患者体液内的新冠病毒信号的应用前景。具体如下：
一种基于表面增强拉曼光谱的生物大分子检测方法，包括如下步骤；
步骤一、制备碘离子修饰的银纳米颗粒溶胶为混合物1；
步骤二、将混合物1中加入乙腈得到混合物2；
步骤三、将混合物2中加入待测样品得到混合物3；
步骤四、将混合物3中加入能提供钙离子的物质得到混合物4；
步骤五、再将混合物4进行SERS检测，用于获取SERS信号和定量分析。
作为本发明更优的技术方案，步骤一中所述银纳米颗粒溶胶的制备过程为：将柠檬酸钠溶液(1％，4mL)加入到略微沸腾的硝酸银溶液(0.034g，200mL) 中得到银纳米颗粒溶胶。
作为本发明更优的技术方案，步骤一中所述碘离子修饰的银纳米颗粒溶胶的制备过程为：将5mL柠檬酸钠还原的银纳米颗粒溶胶离心(6500rpm，20min， 20℃)，除去上清液后，20μL离心银溶胶与20μL碘化钾溶液(1Mm)在室温下孵育大于60min。
作为本发明更优的技术方案：步骤二中混合物1中加入乙腈的体积比为 40:3-10:1。
作为本发明更优的技术方案：步骤三中混合物2和待测样品的比例为 43:20-11:5。
作为本发明更优的技术方案：步骤四中能提供钙离子的物质为包含Ca2+的无机盐。
作为本发明更优的技术方案：步骤四中能提供钙离子的物质为CaCl2·2H2O。
作为本发明更优的技术方案：所述钙离子和待测样品的加入比例为1:10-3:10。
作为本发明更优的技术方案：步骤三种所述待测样品为蛋白质、核酸、多糖等生物大分子。
作为本发明更优的技术方案：当所述待测样品为蛋白质、核酸、多糖等生物大分子时，步骤三还包括在混合物3中加入缓冲液。
作为本发明更优的技术方案：步骤三所述待测样品为包含有蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的体液。
作为本发明更优的技术方案：步骤三所述待测样品为含有蛋白质和核酸的病毒。
作为本发明更优的技术方案：步骤三所述体液为唾液或血清。
本发明还有一个目的是提供一种试剂盒，其可靠性和稳定性好，制备时间六个月后所获得的人腺病毒的指纹图谱中的增强信号仍然非常清晰。
本发明所述试剂盒包括支持体和试剂包组合；所述试剂包组合包括第一试剂包和第二试剂包，所述第一试剂包包含有混合物2，所述的混合物2为乙腈加入到碘离子修饰的银纳米颗粒溶胶得到；所述第二试剂包包含有能提供钙离子的物质。
作为本发明更优的技术方案，所述第一试剂包包括第三试剂包和第四试剂包，所述第三试剂包中含有混合物1，所述混合物1为含碘离子修饰的银纳米颗粒溶胶，所述第四试剂包中含有乙腈。
作为本发明更优的技术方案，所述试剂包还包括第五试剂包，所述第五试剂包含PBS缓冲液，pH值为7.2-7.4。
作为本发明更优的技术方案，所述支持体为玻璃毛细管或二氧化硅毛细管中的一种。
本发明还有一个目的是提供所述试剂盒的用途，其用于检测生物大分子或是含有待确定是否含有目标生物大分子的体液。
本发明还有一个目的是提供一种检测平台，所述检测平台包括所述试剂盒和拉曼光谱仪。
有益效果如下：
本发明提供了一种无标记病毒检测方法，在保证对病毒粒子本身进行直接检测的前提下，获得了高信噪比和良好重现性的病毒SERS信号，具有较高的灵敏度。本发明获得了针对病毒粒子本身进行检测的真实信号并检测了在唾液及血清背景下病毒的浓度变化线性关系；实现病毒检测下限可以达到100拷贝数/mL；所制备的增强基底具有良好的稳定性，可在六个月内保持良好的病毒分子增强拉曼信号。本发明以乙腈为内标，探索了病毒的滴度(浓度)变化的线性关系，并鉴定了在唾液及血清的背景下检测同样具有可靠性，不受背景荧光干扰。本发明将促进SERS在病毒检测领域的应用，提升对于突发、新发病毒性传染病的处置能力，并有助于分析病毒与宿主细胞之间的相互作用，可应用于实际的临床检测。
附图说明
图1为只加入新型冠状病毒的RNA序列的SERS谱图和实施例4的SERS 谱图对比；
图2为两种不同流感病毒的SERS谱图(D型流感病毒和C型流感病毒)；
图3为新型冠状病毒的RNA序列的SERS谱图；
图4为人腺病毒的下SERS谱图；
图5为加入钙离子后的透射电镜照片；
图6为4个月后人腺病毒的SERS谱图；
图7为人腺病毒的重现性分析图；
图8为新冠病毒的重现性分析图；
图9为人腺病毒浓度曲线；
图10为新冠病毒浓度曲线；
图11为人腺病毒检测下限；
图12为新冠病毒检测下限；
图13为血清中人腺病毒SERS谱图；
图14为唾液中人腺病毒SERS谱图；
图15为血清中新冠病毒SERS谱图；
图16为唾液中新冠病毒SERS谱图；
图17为血清中H1N1流感病毒SERS谱图；
图18为唾液中H1N1流感病毒SERS谱图；
图19是利用特征峰位置和共同峰强度的变化来区分实施例12至17中所涉及的三种病毒；
图20为唾液中人腺病毒浓度曲线及线性关系；
图21为加入钠离子未加入钙离子的SERS谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。所使用的甲醛灭活的新冠病毒购自新乡医学院检验学院免疫与靶向药物重点实验室，浓度为35μg/ml(107copies/ml)，置于4℃保存；人腺病毒3型由A549细胞培养扩增，回收细胞培养物并经阴离子交换层析法(BIOMIGA，V1160)进行纯化，利用REED-MUENCH法测定纯化后腺病毒的滴度，置于-80℃保存；H1N1 型流感病毒由VERO细胞培养繁殖，回收细胞培养物并经β-丙内酯灭活后置于4℃保存。所使用的SERS测试仪是由WITec Alpha 300R制造的(德国)。
实施例1
根据Lee的方法制备表面带有柠檬酸根离子的银溶胶，其中将柠檬酸钠溶液(1％，4mL)加入到略微沸腾的硝酸银溶液(0.034g，200mL)中还原银纳米颗粒。5mL柠檬酸钠还原的银溶胶离心(6500rpm，20min，20℃)，除去上清液后，20μL离心银溶胶与20μL碘化钾溶液(1Mm)在室温下孵育大于60min，得到碘离子修饰的银纳米颗粒溶胶；
实施例2
(1)20μL离心银溶胶与20μL碘化钾溶液(1Mm)的混合物中加入3μL的乙腈；
(2)再与20μL的D型流感病毒样品(100拷贝数/mL)和2μL的Ca2+(0.01M CaCl2·2H2O)混合；
(3)再将混合物充分混匀后放置在支持体上进行SERS检测，激光波长为 633nm，扫描时间为35s，激光能量28mW，每次测试累计一次。
实施例3
本实施例与实施例2的区别在于，病毒样品为C型流感病毒。
如图2所示，上述实施例2和3经过试验验证均获取了病毒构成物质的SERS 信号，而且均能够在极低(100拷贝数/mL)获得不同类型流感病毒的指纹图谱，
实施例4
本实施例与实施例2的区别在于，病毒样品为新冠病毒。
如图3所示，SARS-CoV-2的SERS光谱可以看到很多该序列的特征谱峰，可以获得非常稳定蛋白质和核酸的指纹图谱，观察到具有极高信噪比的 SARS-CoV-2信号。实施例4经过试验验证获取了新冠病毒构成物质(蛋白质分子和RNA分子)的SERS信号，而且能够在极低(100拷贝数/mL)获得新冠病毒的指纹图谱。
实施例5
本实施例与实施例4不同之处在于：未加入钙离子。
实施例6
本实施例与实施例4不同之处在于：未加入乙腈。
实施例6的SERS图中仅存在923cm-1峰，实施例5得到的SERS图与实施例4对比发现未能观察到SARS-CoV-2清晰的特征谱峰。
实施例7
本实施例与实施例4不同之处在于：将加入的钙离子替换为钠离子。
上述实施例7经过试验验证，如图21所示，未获取了新冠病毒构成物质(蛋白质分子和RNA分子)的SERS信号。
实施例8
本实施例与实施例4不同之处在于：Ca2+加入量为4μL。
实施例9
本实施例与实施例4不同之处在于：乙腈加入量为4μL。
实施例10
本实施例与实施例4不同之处在于：Ca2+加入量为6μL。
上述实施例10至12经过试验验证获取了新冠病毒构成物质(蛋白质分子和 RNA分子)的SERS信号。
由上述可知，本发明的对病毒的检测下限可以达到100拷贝数/mL。
实施例11
本实施例与实施例4的区别在于，病毒样品为人腺病毒。
本发明中钙离子作为聚集剂，可以与柠檬酸根形成稳定的络合物，如图5所示，银纳米颗粒表现出稳定而均匀的聚集，防止柠檬酸根进入“热点”形成虚假信号。以钙离子为聚集剂获得的人腺病毒的SERS图谱如图4所示，可以清楚的观察到谱图中标志蛋白质结构(1000cm-1)和核酸结构(722cm-1)的信号峰。
图7和8分别展示了不同时间间隔下获得的人腺病毒病毒和新冠病毒的20 组随机SERS光谱，所得的光谱均具有较高的重现性和灵敏性。
图9和10分别展示了人腺病毒和冠状病毒的浓度依赖性的SERS谱线，即使在最低浓度(100拷贝数/mL)下，在图11和12中也能清晰地观察到病毒分子的特征结构。
实施例12
本实施例与实施例11的区别在于，病毒样品为含有人腺病毒的血清。
实施例13
本实施例与实施例11的区别在于，病毒样品为含有人腺病毒的唾液。
实施例14
本实施例与实施例11的区别在于，病毒样品为含有新冠病毒的血清。
实施例15
本实施例与实施例11的区别在于，病毒样品为含有新冠病毒的唾液。
实施例16
本实施例与实施例11的区别在于，病毒样品为含有H1N1流感病毒的血清。
实施例17
本实施例与实施例11的区别在于，病毒样品为含有H1N1流感病毒的唾液。
图13至18分别显示了人腺病毒、新冠病毒、H1N1流感病毒在唾液中和血清中的SERS光谱，在该条件下的图谱与在PBS缓冲液中的图谱完全一致，说明本发明提供的方法在低检测限(LOD，100拷贝数/ml)下，可以实现病毒进行快速诊断和检测。
通过对这三种病毒的SERS谱图比较，可以清楚地观察到这三种病毒特征峰位置的差异：在761-881cm-1范围内可以观察到人腺病毒的特征峰；在763-884 cm-1和1036-1125cm-1范围内可以观察到新冠病毒的特征峰；在828-888cm-1范围内可以观察到H1N1流感病毒的特征峰。通过对每种病毒分子的1000组谱图的深度学习如图19所示，可以很容易地利用特征峰位置和共同峰强度的变化来区分实施例12至17中所涉及的三种病毒。
本发明对病毒滴度(浓度)的变化与拉曼峰强度变化之间的关系进行了分析实验，目的是为进一步证明该方法的稳定性和重现性，结果如图10所示，其分别显示了唾液中五组不同滴度下新冠病毒的SERS指纹图谱，随着滴度(浓度) 的增加可以观察到特征峰值强度逐渐增加。利用人新冠病毒中1125cm-1峰位置来探讨病毒浓度变化对峰强度的影响，由图10可知误差条阈值远小于区分不同浓度所需的阈值，证明了该方法的可靠性和稳定性，可用于唾液病毒分子定量识别。
所以本发明进行了人腺病毒在PBS缓冲液中和唾液中的量化分析实验，如图 9和20所示，可以看出同样获得了峰强度和浓度之间良好的线性关系。因此，本发明提供的检测方法可以定量存在于唾液中的病毒样本。
本发明提供的试剂盒用于检测生物大分子或是含有待确定是否含有目标生物大分子的体液，具体所述试剂盒包括支持体和试剂包组合；所述试剂包组合包括第一试剂包和第二试剂包，所述第一试剂包包含有混合物2，所述的混合物2 为乙腈加入到碘离子修饰的银纳米颗粒溶胶得到；所述第二试剂包包含有能提供钙离子的物质。
本发明提供的试剂盒还包括第四试剂包，所述第四试剂包含PBS缓冲液，pH 值为7.2-7.4，所述支持体为玻璃毛细管或二氧化硅毛细管中的一种。
将本发明所述的试剂盒制备六个月后，将人腺病毒与第二试剂包混合后，再加入到第一试剂包中得到的混合物，再置于硅毛细管中进行SERS检测，SERS 谱图如图6所示，可知在制备时间六个月的增强基底下所获得的人腺病毒的指纹图谱中的增强信号仍然非常清晰。所以本发明提供的增强基底具有良好的稳定性，可在至少六个月内保持良好的病毒分子增强拉曼信号，可制备成试剂盒应用于实际的临床检测。在每个银纳米颗粒的表面都有一层薄膜如图 5所示，推测是可能钙离子和乙腈共同阻止了该体系下病毒与银纳米颗粒表面的强相互作用，减弱了病毒表面与银纳米颗粒之间的静电相互作用提高了基底的增强效果，提高了SERS检测的灵敏度；而且还使所制备的增强基底具有良好的稳定性。
将本发明所述的试剂盒制备六个月后，本发明还对所述的试剂盒的使用方法进行对比：所述的第一试剂包中未加入乙腈，其他不变进行人腺病毒的检测，得到的SERS谱图增强信号非常不清晰。
将本发明所述的试剂盒制备六个月后，本发明还对所述的试剂盒的使用方法进行另一种情况的对比：未加入第二试剂包，其他不变进行人腺病毒的检测，得到的人腺病毒的指纹图谱中的增强信号不清晰。
将本发明所述的试剂盒制备六个月后，本发明还对所述的试剂盒的使用方法进行再一种情况的对比：第二试剂包中为钠离子，其他不变进行人腺病毒的检测，得到的人腺病毒的指纹图谱中的增强信号不清晰。
本发明促进了SERS在病毒检测领域的应用，提升对于突发、新发病毒性传染病的处置能力，并有助于分析病毒与宿主细胞之间的相互作用。
本发明提供和检测方法和试剂盒在临床实际应用中有重要的前景。
以上是本发明较佳的实例而已，并非是对本发明的技术范围作任何限制。故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明所保护的范围内。
Claims (10)
1.一种基于表面增强拉曼光谱的生物大分子检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、制备碘离子修饰的银纳米颗粒溶胶为混合物1；
步骤二、将混合物1中加入乙腈得到混合物2；
步骤三、将混合物2中加入待测样品得到混合物3；
步骤四、将混合物3中加入能提供钙离子的物质得到混合物4；
步骤五、将混合物4进行SERS检测。
2.如权利要求1所述一种基于表面增强拉曼光谱的生物大分子检测方法，其特征在于，步骤一中所述碘离子修饰的银纳米颗粒溶胶的制备过程为：将柠檬酸钠溶液(1％，4mL)加入到略微沸腾的硝酸银溶液(0.034g，200mL)中得到银纳米颗粒溶胶，再将5mL柠檬酸钠还原的银纳米颗粒溶胶离心(6500rpm，20min，20℃)，除去上清液后，20μL离心银溶胶与20μL碘化钾溶液(1Mm)在室温下孵育大于60min。
3.如权利要求1所述一种基于表面增强拉曼光谱的生物大分子检测方法，其特征在于，步骤二中混合物1中加入乙腈的体积比为40:3-10:1。
4.如权利要求1所述一种基于表面增强拉曼光谱的生物大分子检测方法，其特征在于，步骤三中混合物2和待测样品的比例为43:20-11:5。
5.如权利要求1所述一种基于表面增强拉曼光谱的生物大分子检测方法，其特征在于，所述钙离子和待测样品的加入比例为1:10-3:10。
6.如权利要求1所述一种基于表面增强拉曼光谱的生物大分子检测方法，其特征在于，步骤三种所述待测样品为蛋白质、核酸、多糖等生物大分子。
7.如权利要求1所述一种基于表面增强拉曼光谱的生物大分子检测方法，其特征在于，步骤三所述待测样品为包含有蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的体液。
8.一种试剂盒，其特征在于：包括支持体和试剂包组合；所述试剂包组合包括第一试剂包和第二试剂包，所述第一试剂包包含有混合物2，所述的混合物2为乙腈加入到碘离子修饰的银纳米颗粒溶胶中得到；所述第二试剂包包含有能提供钙离子的物质。
9.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于：其用于检测生物大分子或是含有待确定是否含有生物大分子的体液。
10.一种检测平台，其特征在于：包括如权利要求8所述试剂盒和拉曼光谱仪。
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