CN115452799B - 一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法及其应用，本发明涉及一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法及其应用。本发明的目的是为了解决现有药物成分分析方法复杂、耗时长的问题，本发明用柠檬酸钠溶液还原硝酸银生成银溶胶，加入卤化物孵育制备增强基底，将增强基底与待测样品混合，然后加入氯化钙溶液充分混合，再进行SERS检测。本发明在血清中检测小分子药物具有较好的灵敏度和信噪比，还成功监测了小鼠血清中阿霉素分子的代谢水平并检测到人血清中乐果的SERS信号，以及可以对血清中药物进行定量分析，本发明方法具有检测时间短、高灵敏性、高稳定性和重现性的特点。本发明应用于药物监测领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法及其应用。
背景技术
对样品中药物或其代谢产物进行监测分析，从而可以快速的检测样品中的药物含量并了解药物的代谢水平，目前药物监测主要技术为免疫法和色谱法。免疫法中放射免疫法，酶免疫法、荧光免疫法是较常用于血药浓度监测的方法，免疫法操作简单，速度快，但易受基质成分、药物代谢产物和内源性化合物等非目标待测物的干扰。而且不同药物靶点需要特定的结合分子，这严重限制了免疫法的通用性。色谱法中液相色谱串联质谱法(LC-MS)是目前临床实验室TDM检测的金标准，由于LC的高分离能力和MS的高特异性和灵敏度而被广泛使用。但该方法设备成本高、样品制备复杂，并且需要合格且训练有素的人员。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有药物监测方法复杂、耗时长的问题，提供了一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法及其应用。
本发明一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法，按以下步骤进行：一、将硝酸银溶于去离子水中，以1000-2500转/分钟的转速搅拌溶解，得到硝酸银溶液，然后向硝酸银溶液中加入柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后停止加热，搅拌冷却至室温，得到银溶胶，再将银溶胶在20℃、5000-10000转/分钟的条件下离心10-30min，然后去上清，得到离心产物，然后将离心产物与浓度为1mM的卤化物溶液在室温下孵育30-180min，得到增强基底；其中向硝酸银溶液中加入柠檬酸钠溶液的方式为直接倒入或滴加，若是滴加到硝酸银溶液中，则滴加速度为8-12滴/秒；柠檬酸钠溶液与硝酸银溶液的体积比为1：(20-40)；离心产物与卤化物溶液的体积比为1：(0.5-2)；
二、将增强基底与待测样品混合，然后加入浓度为10m M的氯化钙溶液，充分混合，再进行SERS检测，其中增强基底、待测样品与氯化钙溶液的体积比为20：(5-15)：(1-3)。
本发明一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法应用于分析血清中药物成分。
本发明一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法应用于监测血清中药物代谢水平。
本发明一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法应用于血清中药物的定量分析。
本发明基于表面增强拉曼光谱(SERS)技术，其增强基底无拉曼信号，得到的信号全部来自样品本身。该方法检测速度快(<5min)，成本低。本发明可以检测并区分血清中的不同小分子药物，还可以监测小鼠血清中阿霉素的血药浓度，并对其代谢水平进行评估。
利用传统的方法很难获得药物小分子清晰的SERS信号。本发明采用“两步清洗法”制备增强基底检测小分子药物。第一步“清洗”，利用卤化物清洗Ag@cit表面的柠檬酸根离子，不但消除了柠檬酸离子信号的干扰，而且形成了适合小分子药物进入的“热点”间隙，得到了清晰的小分子药物的SERS信号。第二步“清洗”，用钙离子再清洗Ag@cit表面，钙离子可以与残留柠檬酸根形成配合物进一步消除其影响。同时将氯化钙作为聚集剂可以引导银纳米颗粒(Ag@I)聚集，增强了SERS信号，该方法称为“两步清洗法”。该方法在血清中检测小分子药物具有较好的灵敏度和信噪比，成功的获得了具有较好信噪比的6种常见药物的SERS特征指纹图谱，包括阿霉素、阿糖胞苷、异烟肼、黄连素、柔红霉素和羧苄西林。此外，还成功地检测到了小鼠血清中阿霉素分子的SERS信号，以及可以对血清中药物进行定量分析。本申请建立的方法具有检测时间短、高灵敏性、高稳定性和重现性的特点，在药物检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中盐酸阿霉素、阿糖胞苷和盐酸黄连素的SERS谱图；
图2为实施例1中柔红霉素、羧卡西林和异烟肼的SERS谱图；
图3为实施例1中盐酸阿霉素、阿糖胞苷和盐酸黄连素混合物的SERS谱图；其中a为盐酸阿霉素、b为阿糖胞苷、c为盐酸黄连素、d为二氯甲烷；
图4为实施例1中柔红霉素、羧卡西林和异烟肼混合物的SERS谱图；d为二氯甲烷、e为柔红霉素、f为羧卡西林、g为异烟肼；
图5为实施例2中第1天到第5天小鼠血清中阿霉素的SERS光谱；其中1为5天、2为4天、3为3天、4为2天、5为1天；
图6为实施例2中I1436/I701特征峰比值随时间变化的折线图；
图7为实施例3中盐酸黄连素不同体系的SERS谱图；其中1为柠檬酸钠还原制备的银溶胶、2为碘离子孵育后的银溶胶、3为盐酸黄连素+碘离子孵育后的银溶胶；4为盐酸黄连素+引入钙离子聚集剂的银溶胶；
图8为实施例4中乐果固体及其甲醇溶液的SERS谱图；
图9为实施例5中盐酸黄连素在5种不同浓度下的SERS光谱；其中1为20μM、2为30μM、3为40μM、4为50μM、5为60μM；
图10为盐酸黄连素的特征峰强度比值(I728/I701)与相应浓度梯度的定量分析；
图11为混合药物的SERS光谱；其中1为盐酸黄连素浓度20μM、2为盐酸黄连素浓度30μM、3为盐酸黄连素浓度40μM、4为盐酸黄连素浓度50μM、5为盐酸黄连素浓度60μM；
图12为混合药物中盐酸黄连素的特征峰强度比值(I728/I701)与相应浓度梯度的定量分析。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法，按以下步骤进行：一、将硝酸银溶于去离子水中，以1000-2500转/分钟的转速搅拌溶解，得到硝酸银溶液，然后向硝酸银溶液中加入柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后停止加热，搅拌冷却至室温，得到银溶胶，再将银溶胶在20℃、5000-10000转/分钟的条件下离心10-30min，然后去上清，得到离心产物，然后将离心产物与浓度为1mM的卤化物溶液在室温下孵育30-180min，得到增强基底；其中向硝酸银溶液中加入柠檬酸钠溶液的方式为直接倒入或滴加，若是滴加到硝酸银溶液中，则滴加速度为8-12滴/秒；柠檬酸钠溶液与硝酸银溶液的体积比为1：(20-40)；离心产物与卤化物溶液的体积比为1：(0.5-2)；
二、将增强基底与待测样品混合，然后加入浓度为10m M的氯化钙溶液，充分混合，再进行SERS检测，其中增强基底、待测样品与氯化钙溶液的体积比为20：(5-15)：(1-3)。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中硝酸银溶液的浓度为0.15-0.20g/L，柠檬酸钠溶液的浓度为7-13g/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中卤化物为氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾、碘化钠或碘化钾。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中SERS检测的检测条件为：激光波长为633nm，扫描时间为10-60s，激光能量20mW。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法应用于分析血清中药物成分。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：所述方法用于血清中农药的检测。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五或六不同的是：所述方法用于检测并区分血清中混合药物的药物成分。其它与具体实施方式五或六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六或七不同的是：检测并区分血清中混合药物的药物成分的方法：混合药物经二氯甲烷归一化通过SERS检测后，利用峰位和共享峰值强度差异区分混合药物的成分。其它与具体实施方式六或七相同。
具体实施方式九：本实施方式一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法应用于监测血清中药物代谢水平。
具体实施方式十：本实施方式一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法应用于血清中药物的定量分析。
通过以下试验验证本发明的有益效果：
实施例1、
一种利用表面增强拉曼光谱技术的快速无标签监测药物的方法，按以下步骤进行：一、制备增强基底：a、称取0.07g硝酸银溶于400mL去离子水中，在三颈烧瓶中以1650转/分钟的转速搅拌8分钟，得到硝酸银溶液；称取0.12g的柠檬酸钠溶于12ml去离子水，然后倒入到硝酸银溶液中，在搅拌条件下加热至沸腾后停止加热，溶液由黄色变为绿色，冷却至室温，得到银溶胶，避光保存；b、将银溶胶离心，6500转/分钟，20min，20℃去上清，然后取10μL离心产物与10μL浓度为1mM的碘化钾溶液在室温下孵育2h，得到增强基底；
二、将20μL增强基底与10μL待测样品混合，然后加入1.6μL氯化钙溶液(10m M)充分混合，再进行SERS检测，检测条件为：激光波长为633nm，扫描时间为30s，激光能量20mW。
待测样品的配制：
分别称取10-4mol的六种药品(羧卡西林、盐酸阿霉素、阿糖胞苷、异烟肼、盐酸黄连素和柔红霉素)，加入10mL去离子水溶解，得到六种浓度为1×10-2M的药品溶液。牛血清稀释血清稀释10000倍，将上述配制的药品溶液与血清1：1混合，放到4℃冰箱中备用。
六种药品血清溶液SERS检测后，结果如图1和2，图中DCM为二氯甲烷。图1中可以清楚地观察到盐酸黄连素(特征峰：535，727，1273,1392,1423,1565，1634cm-1)，盐酸阿霉素(特征峰：456,1246,1346，1436cm-1)，阿糖胞苷(特征峰：794，1309，1436，1640cm-1)的特征峰，六种药品血清溶液经二氯甲烷归一化通过SERS检测后，可以明显观察到6种小分子药物特征峰的位置和强度有显著差异，利用峰位和共享峰值强度差异(1634cm-1分配给平面内变形的苯环(盐酸阿霉素<阿糖胞苷<盐酸黄连素)能够简单快速地区分三种药物，见图3。
同样在图2中利用到柔红霉素(特征峰：452,1250,1340,1440cm-1)，羧卡西林(特征峰：1000,1436,1594,1646cm-1)，异烟肼(特征峰：1010,1381,1436,1609cm-1)的特征峰峰位和共享峰值强度(1000cm-1分配给呼吸环状振动(羧卡西林<异烟肼)，1436cm-1分配给面内芳香环(柔红霉素<异烟肼<羧卡西林)以区分三种药物，见图4。
本实施例在血清中检测小分子药物具有较好的灵敏度和信噪比，成功的获得了具有较好信噪比的6种常见药物的SERS特征指纹图谱，可以检测并区分血清中的不同。
实施例2、
一种利用表面增强拉曼光谱技术的快速无标签监测药物的方法，按以下步骤进行：一、制备增强基底：a、称取0.07g硝酸银溶于400mL去离子水中，在三颈烧瓶中以1650转/分钟的转速搅拌8分钟，得到硝酸银溶液；称取0.12g的柠檬酸钠溶于12ml去离子水，以8-12滴/秒的速度逐滴加入到硝酸银溶液中，然后在搅拌条件下加热至沸腾后停止加热，溶液由黄色变为绿色，冷却至室温得到银溶胶，避光保存；b、将银溶胶离心，6500转/分钟，20min，20℃去上清，然后取10μL离心产物与10μL浓度为1mM的氯化钠溶液在室温下孵育2h，得到增强基底；
二、将20μL增强基底与10μL待测样品混合，然后加入1.6μL氯化钙溶液(10m M)充分混合，再进行SERS检测，检测条件为：激光波长为633nm，扫描时间为30s，激光能量20mW。
以上述增强基底进行SERS检测，监测小鼠血清中阿霉素的的代谢水平。
具体方法为：
直肠癌肝转移模型:对于直肠癌肝转移，将1×106个MC38细胞悬浮于100μL培养液中，经门静脉注入10周龄C57BL/6雌性小鼠脾脏。H&E染色检测肝组织病理改变。10天后尾静脉注射阿霉素(20mg/kg体重)。取动物外周血，静置后上清取血清。血清沉降浓缩后，用拉曼检测血药浓度。
血清的沉降浓缩方法：
1、取血清样品100μl，加入1.5ml EP管中，加入600μl甲醇溶液；
2、涡旋1min，4℃离心，12000rpm，20min；
3、取上清到4ml EP管中，水浴蒸干溶液；
4、15μl ddH2O复溶，剧烈震荡、吹打；
5、室温静置10min后，4℃离心，12000rpm，20min；
6、取上清进行拉曼检测。
第1天到第5天小鼠血清中阿霉素的SERS光谱如图5所示(所有光谱均通过二氯甲烷信号强度标准化，图中DCM为二氯甲烷)。从图5中可以明显地观察到血清中阿霉素的最强特征峰出现在1436cm-1处(1436cm-1归属为芳香环C-H振动。)从图6中的结果显示特征峰的比值I1436/I701随代谢时间呈规律性降低，其中CTR为生理盐水对照组。该方法可以清楚地观察到小鼠体内血清中阿霉素的SERS信号，其特征峰的比值I1436/I701随时间推移逐渐的减小，这与药物在小鼠体内的代谢结果相一致。该方法不仅可以鉴定体外血清中的不同药物，还可以检测小鼠体内血药浓度并评估其代谢水平，监测药物代谢的过程。
实施例3、
利用不同银溶胶对实施例1配制的盐酸黄连素药品溶液进行SERS检测
柠檬酸钠还原制备的银溶胶：a、称取0.07g硝酸银溶于400mL去离子水中，在三颈烧瓶中以1650转/分钟的转速搅拌8分钟，得到硝酸银溶液；称取0.12g的柠檬酸钠溶于12ml去离子水，以8-12滴/秒的速度逐滴加入到硝酸银溶液中，然后在搅拌条件下加热至沸腾后停止加热，溶液由黄色变为绿色，冷却至室温得到银溶胶，避光保存。
碘离子孵育后的银溶胶：将银溶胶离心，6500转/分钟，20min，20℃去上清，然后取10μL离心产物与10μL浓度为1mM的碘化钾溶液在室温下孵育2h。
引入钙离子聚集剂的银溶胶：将20μL碘离子孵育后的银溶胶与盐酸黄连素药品溶液混合，然后加入1.6μL氯化钙溶液(10mM)充分混合。
分别对不同银溶胶、盐酸黄连素药品溶液与不同银溶胶混合后进行SERS检测。
结果如图7所示，柠檬酸钠还原的银溶胶(Ag@cit)有拉曼信号(906cm-1；923cm-1；951cm-1)(图7中曲线1)，血清中的药物分子易受到柠檬酸根信号的干扰而无法识别。因此为了避免干扰，引入碘离子孵育取代Ag@cit表面的柠檬酸根，得到的银溶胶(Ag@I)几乎没有任何拉曼信号(图7中曲线2)。黄连素在银纳米颗粒(Ag@I)表面能产生清晰的SERS信号(图7中曲线3)。说明用碘离子孵育银纳米颗粒后，不但消除了柠檬酸根信号的干扰，而且形成了适合黄连素离子进入的“热点”间隙，得到了清晰的黄连素SERS信号。再引入氯化钙聚集剂，钙离子可以与银纳米颗粒表面上残留的柠檬酸根结合形成复合物，再一次消除了柠檬酸根的干扰。同时引导Ag@I银纳米颗粒聚集，增强了黄连素的SERS信号(图7中曲线4)。
实施例4、
一种利用表面增强拉曼光谱技术的快速无标签监测药物的方法，按以下步骤进行：一、制备增强基底：a、称取0.07g硝酸银溶于400mL去离子水中，在三颈烧瓶中以1650转/分钟的转速搅拌8分钟，得到硝酸银溶液；称取0.12g的柠檬酸钠溶于12ml去离子水，倒入到硝酸银溶液中，然后在搅拌条件下加热至沸腾后停止加热，溶液由黄色变为绿色，冷却至室温得到银溶胶，避光保存；b、将银溶胶离心，6500转/分钟，20min，20℃去上清，然后取10μL离心产物与10μL浓度为1mM的碘化钾溶液在室温下孵育2h，得到增强基底；
三、将20μL增强基底与10μL待测样品混合，然后加入1.6μL氯化钙溶液(10m M)充分混合，再进行SERS检测，检测条件为：激光波长为633nm，扫描时间为30s，激光能量20mW。
实验过程直接取血清-沉降浓缩，检测。
为了进一步验证该方法的临床效果，检测了临床患者(农药乐果中毒)血清的SERS光谱。在乐果固体(图8曲线1)和其甲醇溶液的拉曼光谱中(图8曲线2)，乐果在572,607,680,756和1643cm-1处出现特征峰(572,756cm-1:γ(P–S)/b(PO2S)；606cm-1:τ(HNCC)；680cm-1:γ(C–S)/b(CNC)/b(NCO)and 1643cm-1:γ(C＝O))。患者(图8曲线3)和健康人(图8曲线4)的血清在900-1800cm-1之间的SERS谱图变化不大，主要区别在于400-900cm-1之间。可以看出，在患者血清中明显出现乐果的特征峰680和756cm-1。说明该方法可以检测到临床患者血清中的农药乐果的存在。
实施例5
将盐酸黄连素溶于胎牛血清中，配制5种不同浓度(20、30、40、50和60μM)的盐酸黄连素作为待测样品，采用上述实施例1的方法进行SERS检测。图9显示了盐酸黄连素在5种不同浓度(20、30、40、50和60μM)下的SERS光谱(所有光谱均通过DCM信号强度标准化，图中DCM为二氯甲烷)。可以观察到随着浓度的降低，特征峰的强度逐渐减小。使用盐酸黄连素728cm-1处特征峰探索其信号强度随浓度的变化规律。图10显示盐酸黄连素的特征峰强度比值(I728/I701)与相应浓度梯度的定量分析。盐酸黄连素的拉曼峰强度比值I728/I701随浓度的降低而逐渐减小，在低浓度(20、30、40、50和60μM)区间进行线性拟合，得出y＝0.7089-0.038x，确定系数为R2＝0.994，具有良好的线性关系。实验结果表明，该方法可用于血清中低浓度药物的定量分析。
为了扩大该方法的应用范围，设计了阿糖胞苷与盐酸黄连素的混合药物模型进行定量分析。将盐酸黄连素和阿糖胞苷溶于胎牛血清中，配制阿糖胞苷浓度不变(10mM)、盐酸黄连素5种不同浓度(20、30、40、50和60μM)的混合药物作为待测样品，在图11中显示阿糖胞苷浓度不变(10mM)，而盐酸黄连素浓度依次升高(20、30、40、50、60μM)混合药物的SERS光谱，图中DCM为二氯甲烷。阿糖胞苷本身具有很强的SERS信号。因此，设计的模型中盐酸黄连素和阿糖胞苷的特征峰清晰可见(盐酸黄连素:728、1393、1419、1564和1634cm-1，阿糖胞苷:794、1435和1637cm-1)。虽然盐酸黄连素的浓度只有10μM的差异，但在血清中其他杂质的干扰下，仍能清晰地观察到728cm-1处的特征峰，且峰值强度均匀增加。选取盐酸黄连素拉曼峰强度比值I728/I701，在低浓度(20-60μM，浓度差为10μM)区间进行线性拟合，得出y＝1.0119-0.075x，确定系数R2＝0.993(图12)。实验结果显示该方法在血清中测定单个药物或混合药物均具有较高灵敏度和稳定性，可以实现快速准确的药物定量分析。
Claims (2)
1.一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、将硝酸银溶于去离子水中，以1000-2500转/分钟的转速搅拌溶解，得到浓度为0.15-0.20g/L的硝酸银溶液，然后向硝酸银溶液中加入浓度为7-13g/L的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后停止加热，搅拌冷却至室温，得到银溶胶，再将银溶胶在20℃、5000-10000转/分钟的条件下离心10-30min，然后去上清，得到离心产物，然后将离心产物与浓度为1 mM的卤化物溶液在室温下孵育30-180min，得到增强基底；其中向硝酸银溶液中加入柠檬酸钠溶液的方式为直接倒入或滴加，若是滴加到硝酸银溶液中，则滴加速度为8-12滴/秒；柠檬酸钠溶液与硝酸银溶液的体积比为1：（20-40）；离心产物与卤化物溶液的体积比为1：（0.5-2）；卤化物为氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾、碘化钠或碘化钾；
二、将增强基底与待测样品混合，然后加入浓度为10m M的氯化钙溶液，充分混合，再进行SERS检测，SERS检测条件为：激光波长为633nm，扫描时间为10-60s，激光能量20mW；所有光谱均通过二氯甲烷的信号强度进行归一化处理；其中增强基底、待测样品与氯化钙溶液的体积比为20：（5-15）：（1-3），所述待测样品为含有药物的血清；
所述利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法应用于分析血清中药物成分，其中药物为阿霉素、阿糖胞苷、异烟肼、黄连素、柔红霉素、羧苄西林中的一种或几种；
或用于分析血清中农药成分；
或用于监测血清中药物代谢水平；
或用于血清中药物的定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种利用表面增强拉曼光谱技术无标签监测药物的方法，其特征在于分析血清中混合药物的药物成分的方法：混合药物经二氯甲烷归一化通过SERS检测后，利用峰位和共享峰值强度差异区分混合药物的成分。
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