CN113433232B - 一种测定人参属中药中人参皂苷含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种测定人参属中药中人参皂苷含量的方法，采用超高效液相色谱电雾式检测器法，同时测定人参属中药中15种人参皂苷的含量；所述15种人参皂苷包括：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、24(R)‑拟人参皂苷F11、人参皂苷Rf、人参皂苷Ra2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、人参皂苷Rd、竹节参皂苷IVa、20(R)‑人参皂苷Rg3。采用本申请的方法，通过合理选择色谱条件和检测条件，可以同时测定多种人参属中药中15种人参皂苷的含量，且所述方法具有简便、准确、灵敏度高、专属性强等优势，从而能够可信、全面、准确地用于人参属中药的质量控制。
Description
技术领域
本申请涉及中药成分测定技术领域，特别是涉及一种测定人参属中药中人参皂苷含量的方法。
背景技术
人参属中药多为补益类中药，其中人参、三七、西洋参属于名贵中药。人参属中药的主要活性成分是人参皂苷，该类成分具有防治心血管疾病、增强免疫力、安神、抗癌以及抗疲劳等功效。
然而，由于现有分析技术的局限，难以对人参属中药中的人参皂苷成分进行全面、准确的检测，且目前用于不同人参属中药的质量控制的各测定方法存在缺乏普适性、指标成分少、特异性不强等问题，因此需要建立一种全新的人参属中药中人参皂苷成分的含量测定方法，对人参属中药中人参皂苷成分的含量进行更加全面并且准确的测定，以能够更加可信、全面、准确地对人参属中药进行质量控制。
发明内容
本申请的目的在于提供一种测定人参属中药中人参皂苷含量的方法，能够同时测定人参属中药中15种人参皂苷的含量，可用于人参属中药的质量控制。
本申请提供了一种测定人参属中药中人参皂苷含量的方法，其中，所述人参皂苷包括：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、24(R)-拟人参皂苷F11、人参皂苷Rf、人参皂苷Ra2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、人参皂苷Rd、竹节参皂苷IVa、20(R)-人参皂苷Rg3；所述方法包括：
(1)建立15种人参皂苷的标准曲线；
以体积分数为60-80％的甲醇水溶液为溶剂，配制8-15个含有不同已知浓度的15种人参皂苷的混合对照品溶液；其中，三七皂苷R1浓度为0.08-220μg/mL，人参皂苷Rg1浓度为0.07-650μg/mL，人参皂苷Re浓度为0.1-950μg/mL，24(R)-拟人参皂苷F11浓度为0.07-600μg/mL，人参皂苷Rf浓度为0.06-40μg/mL，人参皂苷Ra2浓度为0.13-80μg/mL，人参皂苷Rb1浓度为0.15-670μg/mL，人参皂苷Rc浓度为0.3-650μg/mL，人参皂苷Ro浓度为0.3-1400μg/mL，人参皂苷Rb2浓度为0.32-400μg/mL，人参皂苷Rb3浓度为0.23-1050μg/mL，竹节参皂苷IV浓度为0.42-950μg/mL，人参皂苷Rd浓度为0.28-650μg/mL，竹节参皂苷IVa浓度为0.36-800μg/mL，20(R)-人参皂苷Rg3浓度为0.04-45μg/mL；
在相同的色谱条件和检测条件下，将体积V1的各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，通过电雾式检测器检测确定各色谱峰的人参皂苷成分，并获得各人参皂苷的色谱峰面积；
其中，所述色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数2-80％A相，20-98％B相，梯度洗脱；柱温：25-30℃；流速：0.2-0.4mL/分钟；进样体积V1：2-5μL；
以各人参皂苷的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，分别建立各人参皂苷的标准曲线；
(2)获得待测样品溶液的色谱峰面积；
将质量为M的待测样品，以体积分数为60-80％的甲醇水溶液进行超声提取，得到体积为V2的待测样品溶液，其中，M:V2为1:(80-120)g/mL；
在与步骤(1)中相同的色谱条件和检测条件下，取体积V1的待测样品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过电雾式检测器检测确定各色谱峰的人参皂苷成分，并获得各人参皂苷的色谱峰面积；
(3)确定待测样品中15种人参皂苷的含量；
根据已建立的各人参皂苷的标准曲线，由待测样品溶液中各人参皂苷的色谱峰面积，分别获得各人参皂苷的浓度C1，并按照公式C＝C1×V2/M，分别计算出待测样品中15种人参皂苷的含量C。
本申请提供的一种测定人参属中药中人参皂苷含量的方法，采用超高效液相色谱电雾式检测器法(UHPLC-CAD)，通过合理选择色谱条件和检测条件，可以同时测定人参属中药中15种人参皂苷的含量，且所述方法具有简便、准确、灵敏度高、专属性强等优势，从而能够可信、全面、准确地用于人参属中药的质量控制。本申请提供的一种测定人参属中药中人参皂苷含量的方法，适用于多种人参属中药进行人参皂苷的含量测定，实现一法多用，有效地解决了目前用于人参属中药质量控制的各测定方法缺乏普适性且指标成分少、特异性不强的问题，能够获得更全面、准确的人参属中药中人参皂苷成分的含量结果，为进一步研究人参属中药的鉴别提供了依据，也为进一步完善人参属中药的质量标准提供了新的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
图1为15种人参皂苷标准品的结构式；其中糖基：Glc为葡萄糖(C6H10O5)，Xyl为木糖(C5H8O4)，Rha为鼠李糖(C6H10O4)，Ara为阿拉伯糖(C5H8O4)，GlurA为葡萄糖醛酸(C6H8O6)。
图2为不同色谱柱检测混合人参皂苷溶液的色谱图。
图3为混合对照品溶液、混合待测样品溶液、空白溶液的色谱图；其中，A图为混合对照品溶液的色谱图，B图为混合待测样品溶液的色谱图，C图为空白溶液的色谱图。
附图标记为：1为三七皂苷R1，2为人参皂苷Rg1，3为人参皂苷Re，4为24(R)-拟人参皂苷F11，5为人参皂苷Rf，6为人参皂苷Ra2，7为人参皂苷Rb1，8为人参皂苷Rc，9为人参皂苷Ro，10为人参皂苷Rb2，11为人参皂苷Rb3，12为竹节参皂苷IV，13为人参皂苷Rd，14为竹节参皂苷IVa，15为20(R)-人参皂苷Rg3。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请提供了一种测定人参属中药中人参皂苷含量的方法，其中，所述人参皂苷包括：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、24(R)-拟人参皂苷F11、人参皂苷Rf、人参皂苷Ra2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、人参皂苷Rd、竹节参皂苷IVa、20(R)-人参皂苷Rg3；所述方法包括：
(1)建立15种人参皂苷的标准曲线；
以体积分数为60-80％的甲醇水溶液为溶剂，配制8-15个含有不同已知浓度的15种人参皂苷的混合对照品溶液；其中，三七皂苷R1浓度为0.08-220μg/mL，人参皂苷Rg1浓度为0.07-650μg/mL，人参皂苷Re浓度为0.1-950μg/mL，24(R)-拟人参皂苷F11浓度为0.07-600μg/mL，人参皂苷Rf浓度为0.06-40μg/mL，人参皂苷Ra2浓度为0.13-80μg/mL，人参皂苷Rb1浓度为0.15-670μg/mL，人参皂苷Rc浓度为0.3-650μg/mL，人参皂苷Ro浓度为0.3-1400μg/mL，人参皂苷Rb2浓度为0.32-400μg/mL，人参皂苷Rb3浓度为0.23-1050μg/mL，竹节参皂苷IV浓度为0.42-950μg/mL，人参皂苷Rd浓度为0.28-650μg/mL，竹节参皂苷IVa浓度为0.36-800μg/mL，20(R)-人参皂苷Rg3浓度为0.04-45μg/mL；
在相同的色谱条件和检测条件下，将体积V1的各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，通过电雾式检测器检测确定各色谱峰的人参皂苷成分，并获得各人参皂苷的色谱峰面积；
其中，所述色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数2-80％A相，20-98％B相，梯度洗脱；柱温：25-30℃；流速：0.2-0.4mL/分钟；进样体积V1：2-5μL；
以各人参皂苷的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，分别建立各人参皂苷的标准曲线；
(2)获得待测样品溶液的色谱峰面积；
将质量为M的待测样品，以体积分数为60-80％的甲醇水溶液进行超声提取，得到体积为V2的待测样品溶液，其中，M:V2为1:(80-120)g/mL；
在与步骤(1)中相同的色谱条件和检测条件下，取体积V1的待测样品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过电雾式检测器检测确定各色谱峰的人参皂苷成分，并获得各人参皂苷的色谱峰面积；
(3)确定待测样品中15种人参皂苷的含量；
根据已建立的各人参皂苷的标准曲线，由待测样品溶液中各人参皂苷的色谱峰面积，分别获得各人参皂苷的浓度C1，并按照公式C＝C1×V2/M，分别计算出待测样品中15种人参皂苷的含量C。
通过本申请的方法，采用本申请的色谱条件和检测条件对人参属中药进行分析，实现了同时测定不同人参属中药中15种人参皂苷的含量。
在本申请的一些实施方式中，所述混合对照品溶液中，三七皂苷R1浓度为2-173μg/mL，人参皂苷Rg1浓度为4-570μg/mL，人参皂苷Re浓度为6-840μg/mL，24(R)-拟人参皂苷F11浓度为2-555μg/mL，人参皂苷Rf浓度为0.4-30μg/mL，人参皂苷Ra2浓度为1-65μg/mL，人参皂苷Rb1浓度为2-625μg/mL，人参皂苷Rc浓度为4-605μg/mL，人参皂苷Ro浓度为1-1240μg/mL，人参皂苷Rb2浓度为1-330μg/mL，人参皂苷Rb3浓度为1.5-950μg/mL，竹节参皂苷IV浓度为3-850μg/mL，人参皂苷Rd浓度为2-580μg/mL，竹节参皂苷IVa浓度为5-730μg/mL，20(R)-人参皂苷Rg3浓度为0.6-39μg/mL。
本申请对混合对照品溶液的配制方式不做限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如可以先配制混合对照品储备液，其中各成分的浓度大于所述混合对照品溶液中各成分的浓度，然后通过稀释获得所述混合对照品溶液，在本申请的一些实施方式中，以体积分数为60-80％的甲醇水溶液为溶剂，配制含有15种人参皂苷的混合对照品储备液，其中，三七皂苷R1浓度为172-220μg/mL，人参皂苷Rg1浓度为570-650μg/mL，人参皂苷Re浓度为840-950μg/mL，24(R)-拟人参皂苷F11浓度为555-600μg/mL，人参皂苷Rf浓度为29-40μg/mL，人参皂苷Ra2浓度为65-80μg/mL，人参皂苷Rb1浓度为625-670μg/mL，人参皂苷Rc浓度为605-650μg/mL，人参皂苷Ro浓度为1240-1400μg/mL，人参皂苷Rb2浓度为330-400μg/mL，人参皂苷Rb3浓度为950-1050μg/mL，竹节参皂苷IV浓度为850-950μg/mL，人参皂苷Rd浓度为580-650μg/mL，竹节参皂苷IVa浓度为730-800μg/mL，20(R)-人参皂苷Rg3浓度为38-45μg/mL；
以体积分数为60-80％的甲醇水溶液稀释所述混合对照品储备液，获得所述8-15个含有不同已知浓度的15种人参皂苷的混合对照品溶液。
其中，用于配制所述混合对照品储备液的溶剂和用于稀释所述混合对照品储备液的溶剂可以相同，也可以不同，优选地，用于配制所述混合对照品储备液的溶剂和用于稀释所述混合对照品储备液的溶剂相同，更优选地，用于配制所述混合对照品储备液的溶剂和用于稀释所述混合对照品储备液的溶剂为70％甲醇。
在本申请的一些实施方式中，步骤(2)中，将质量为M的待测样品，以体积为V3体积分数为60-80％的甲醇水溶液进行超声提取1-3次，得到提取液，将所述提取液以体积分数为60-80％的甲醇水溶液进行稀释，得到体积为V2的待测样品溶液，其中M:V3为1:(25-35)g/mL。
在本申请的一些实施方式中，步骤(2)中，超声提取的时间为0.5-1.5h，提取功率为300-500W，提取温度为20-38℃。
通过采用本申请待测样品溶液的制备方法，实现获得包括15种人参皂苷的待测样品溶液，使得待测样品中人参皂苷成分的含量检测结果更加全面、准确、可信。
在本申请的一些实施方式中，所述色谱柱选自CORTECS UPLC Shield RP18、Kinetex EVO C18、BEH Shield RP18或Atlantis Premier BEH C18 AX中的任一种。
发明人在研究中发现，采用本申请的梯度洗脱，能够使所述15种人参皂苷获得更好的分离效果，优选地，在本申请的一些实施方式中，所述梯度洗脱具体为：0-7分钟，20％B；7-9分钟，20-24％B；9-32分钟，24-26％B；32-72分钟，26-26％B；72-80分钟，26-35％B；80-86分钟，35-50％B；86-92分钟，50-60％B；92-95分钟，60-98％B；95-98分钟，98％B。
为了提高本申请方法的灵敏度，以便于获得更准确的人参皂苷的检测结果，在本申请的一些实施方式中，所述检测条件包括：雾化温度：35-45℃；数据采集频率：2-10Hz；过滤常数：2-5s；幂函数：0.98-1.02；增益：98-102pA。优选地，所述检测条件包括：雾化温度：40℃；数据采集频率：5Hz；过滤常数：3.6s。
在本申请的一些实施方式中，所述人参属中药选自人参、西洋参、三七、红参、竹节参、珠子参、人参花、西洋参花、三七花、人参叶、西洋参叶和三七叶中的至少一种。
下面对本申请所需的仪器与试剂进行说明。
仪器：UltiMate 3000超高效液相系统：美国Thermo Fisher Scientific公司；Eppendorf高速离心机：德国Eppendorf公司；SB-4200DTS/P超声波提取仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；AX205十万分之一天平：瑞士Mettler Toledo公司；BP121S万分之一天平：瑞士Mettler Toledo公司；Vortex-2旋涡混匀仪：上海泸析实业有限公司。
试剂：乙腈(LC-MS级)：美国Thermo Fisher Scientific公司；甲酸(LC-MS级)：美国ACS公司；去离子水经Milli-Q系统(美国Millipore公司)纯化。
材料：15种人参皂苷标准品购自上海诗丹德生物技术有限公司或成都德斯特生物技术有限公司，化合物名称、分子式、精确分子量、亚型对应如表1所示，各标准品结构式如图1所示。12种人参属中药：人参(PG)、西洋参(PQ)、三七(PN)、红参(RG)、竹节参(ZJS)、珠子参(ZZS)、人参叶(PGL)、西洋参叶(PQL)、三七叶(PNL)、人参花(PGF)、西洋参花(PQF)、三七花(PNF)，购自吉林、黑龙江、云南等多地，具体批号和产地信息如表2所示。色谱柱信息如表3所示。
表1 15种人参皂苷标准品信息
表2 12种人参属中药的119批次信息
头：每500克三七的数
表3 色谱柱信息
以下实施例中所涉及的试剂与药材如无特殊说明均可来源于市售或按照本领域公知方法取得。
实施例1色谱柱确定
色谱条件：色谱柱分别选择如表3所示的12根色谱柱。
流动相：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样体积：3μL；梯度洗脱：根据表3中不同的色谱柱对于人参皂苷不同的保留能力，分别采用了两种梯度进行测定。
其中，采用表3中编号分别为1、3、5、7-9的色谱柱时，洗脱梯度：0-7min，20％B；7-9min，20-24％B；9-24min，24-27％B；24-50min，27-27％B；50-58min，27-28％B；58-62min，28-32％B；62-66min，32-35％B；66-71min，35-50％B；71-75min，50-65％B；75-78min，65-98％B；78-81min，98％B；
采用表3中编号分别为2、4、6、10-12的色谱柱时，洗脱梯度：0-7min，20％B；7-11min，20-28％B；11-23min，28-28％B；23-36min，28-29％B；36-41min，29-32％B；41-46min，32-35％B；46-50min，35-50％B；50-54min，50-65％B；54-57min，65-98％B；57-60min，98％B。
检测条件：雾化温度：40℃；数据采集频率：5Hz；过滤常数：3.6s；幂函数：1.00；增益：100pA。
混合人参皂苷溶液的制备：精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、24(R)-拟人参皂苷F11、人参皂苷Rf、人参皂苷F3、人参皂苷Ra2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ra1、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、人参皂苷Rd、竹节参皂苷IVa、20(R)-人参皂苷Rg3各1mg，分别用70％甲醇水溶液溶解，配制成浓度为1mg/mL的混合人参皂苷储备液。分别精密吸取50μL混合配制成浓度均为58.82μg/mL的混合人参皂苷溶液。
取混合人参皂苷溶液1mL于14000rpm离心10min，取上清液3μL按上述色谱条件和检测条件进样分析，得到混合人参皂苷溶液的色谱图。分别采用表3所示的不同十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，按上述色谱条件检测的混合人参皂苷溶液的色谱图如图2所示，混合人参皂苷溶液中的人参皂苷在12根色谱柱上得到不同程度的分离，其中，当采用表3中编号1-4的色谱柱检测的混合人参皂苷溶液中的人参皂苷时，表现出更好的保留行为，尤其是组分4：24(R)-拟人参皂苷F11和组分5：人参皂苷Rf能够得到更有效的分离。综合考虑色谱柱的分离效果和人参皂苷的保留行为，本申请采用的色谱柱选自CORTECS UPLC Shield RP18、BEH Shield RP18、Kinetex EVO C18或Atlantis Premier BEH C18 AX。优选的，色谱柱选自CORTECS UPLC Shield RP18或BEH Shield RP18。更优选的，色谱柱为CORTECS UPLCShield RP18。
实施例2柱温确定
色谱条件：柱温分别选择25℃、28℃、30℃、35℃、40℃。
色谱柱：CORTECS UPLC Shield RP18；流动相：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈；流速：0.3mL/min；进样体积：3μL；梯度洗脱：0-7min，20％B；7-9min，20-24％B；9-24min，24-27％B；24-50min，27-27％B；50-58min，27-28％B；58-62min，28-32％B；62-66min，32-35％B；66-71min，35-50％B；71-75min，50-65％B；75-78min，65-98％B；78-81min，98％B。
检测条件：雾化温度：40℃；数据采集频率：5Hz；过滤常数：3.6s；幂函数：1.00；增益：100pA。
待测人参样品溶液的制备：取表2中编号为PG-1的样品1g，研磨粉碎，精密称定100mg到15mL离心管中，分别加3mL 70％甲醇水溶液进行超声提取2次，每次超声1h，提取功率400W，提取温度25℃，4000rpm离心10min，合并两次上清液转移至10mL容量瓶中，用70％甲醇稀释定容至刻度线，摇匀，静置，即得PG-1样品的待测人参样品溶液。
取实施例1中的混合人参皂苷溶液和上述待测人参样品溶液各1mL，分别于14000rpm离心10min，各取上清液3μL按上述色谱条件和检测条件进样分析，得到混合人参皂苷溶液和PG-1样品的色谱图，发现当柱温从25℃升高到40℃时，人参皂苷Rc的分离度逐渐降低；而当柱温从25℃升高到35℃时，竹节参皂苷IV和人参皂苷Rd的分离度显著升高。综合考虑各成分的分离效果及混合人参皂苷溶液和PG-1样品中人参皂苷的保留行为，本申请采用的柱温为25-30℃。优选的，柱温为28℃，样品中各成分的分离度更好。
实施例3检测条件确定
色谱条件：色谱柱：CORTECS Shield RP18(2.1×100mm，1.7μm)；流动相：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈；柱温：28℃；流速：0.3mL/min；进样体积：3μL；梯度洗脱：0-7min，20％B；7-9min，20-24％B；9-32min，24-26％B；32-72min，26-26％B；72-80min，26-35％B；80-86min，35-50％B；86-92min，50-60％B；92-95min，60-98％B；95-98min，98％B。
检测条件：幂函数：1.00；增益：100pA；
雾化温度分别选择35℃、40℃、45℃、50℃；
数据采集频率分别选择2Hz、5Hz、10Hz、20Hz、25Hz；
过滤常数分别选择0.5s、1s、2s、3.6s、5s。
取实施例1中的混合人参皂苷溶液1mL于14000rpm离心10min，取上清液3μL按上述色谱条件和检测条件进样分析，得到混合人参皂苷溶液的色谱图。以15种人参皂苷成分的信噪比为指标，结果发现当雾化温度为35-45℃，数据采集频率为2-10Hz，过滤常数为2-5s时，15种人参皂苷的信噪比结果较高，反映出方法的灵敏度较好；优选的，雾化温度为40℃，数据采集频率为5Hz，过滤常数为3.6s，15种人参皂苷的信噪比为最高强度值。采用本申请的雾化温度、数据采集频率和过滤常数参数，能够得到更为平滑的基线，极大的提高了检测方法的灵敏度，使峰值检测和定量更容易。
实施例4标准曲线建立
发明人在研究中发现，由于CAD检测器的性质，浓度与响应不成正比，本申请通过二阶多项式回归方程分析评估线性，标准曲线由y＝ax2+bx+c表示，其中y指峰面积，x指浓度，a、b、c是常数。
色谱条件：色谱柱：CORTECS Shield RP18(2.1×100mm，1.7μm)；流动相：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈；柱温：28℃；流速：0.3mL/min；进样体积：3μL；梯度洗脱：0-7min，20％B；7-9min，20-24％B；9-32min，24-26％B；32-72min，26-26％B；72-80min，26-35％B；80-86min，35-50％B；86-92min，50-60％B；92-95min，60-98％B；95-98min，98％B。
检测条件：雾化温度：40℃；数据采集频率：5Hz；过滤常数：3.6s；幂函数：1.00；增益：100pA。
混合对照品储备液的制备：精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、24(R)-拟人参皂苷F11、人参皂苷Rf、人参皂苷Ra2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、人参皂苷Rd、竹节参皂苷IVa、20(R)-人参皂苷Rg3，用70％甲醇水溶液溶解，配制混合对照品储备液，于-20℃储存备用。其中，三七皂苷R1浓度为1380.00μg/mL，人参皂苷Rg1浓度为1140.00μg/mL，人参皂苷Re浓度为840.00μg/mL，24(R)-拟人参皂苷F11浓度为1110.00μg/mL，人参皂苷Rf浓度为940.00μg/mL，人参皂苷Ra2浓度为520.00μg/mL，人参皂苷Rb1浓度为1250.00μg/mL，人参皂苷Rc浓度为1210.00μg/mL，人参皂苷Ro浓度为1240.00μg/mL，人参皂苷Rb2浓度为1320.00μg/mL，人参皂苷Rb3浓度为950.00μg/mL，竹节参皂苷IV浓度为1700.00μg/mL，人参皂苷Rd浓度为1160.00μg/mL，竹节参皂苷IVa浓度为1460.00μg/mL，20(R)-人参皂苷Rg3浓度为610.00μg/mL。
建立标准曲线：精确量取上述混合对照品储备液，以70％甲醇水溶液为溶剂，依次稀释得到不同浓度的混合对照品溶液，于-20℃储存备用。各混合对照品溶液的浓度见表4，取各个浓度的混合对照品溶液，进样3μL，按上述色谱条件和检测条件进行分析，得到各对照品在不同浓度下的液相色谱图。以待测物峰面积(y)为纵坐标，待测物的浓度(x)为横坐标，构建各人参皂苷成分的标准曲线，得到各人参皂苷成分的回归方程及相关系数，并确定其线性范围，以S/N(信噪比)为10时各对照品的浓度作为定量限(LOQ)，以S/N为3时各对照品的浓度作为检测限(LOD)，结果见表5。各人参皂苷成分的线性回归方程，相关系数R2均在0.999以上，表明在考察的范围内线性关系良好。
表4 混合对照品溶液(浓度单位：μg/mL)
表5
实施例5专属性试验
精密吸取表4中浓度5的混合对照品溶液3μL，按实施例4的色谱条件和检测条件进样分析，得到混合对照品溶液的色谱图，如图3的A图所示。
混合待测样品溶液的制备：取红参RG-10、三七PN-3、珠子参ZZS-8、西洋参花PQF-1样品，分别粉碎后依次取500、200、200、100mg，合并，得到混合人参样品，精密称定100mg混合人参样品到15mL离心管中，分别加3mL 70％甲醇水溶液进行超声提取2次，每次超声1h，提取功率400W，提取温度25℃，4000rpm离心10min，合并两次上清液转移至10mL容量瓶中，用70％甲醇稀释定容至刻度线，摇匀，静置，即得混合待测样品溶液。
取混合待测样品溶液1mL于14000rpm离心10min，精密吸取上清液3μL按实施例4的色谱条件和检测条件进样分析，得到混合待测样品的色谱图，如图3的B图所示。
精密吸取空白溶液70％甲醇水溶液3μL，按实施例4的色谱条件和检测条件进样分析，得到空白溶液的色谱图，如图3的C图所示。
根据图3可知，混合待测样品溶液中15种人参皂苷的色谱峰和其它成分的色谱峰分离良好，实现了15种人参皂苷的基线分离，且空白溶液色谱峰未见干扰。
实施例6精密度试验
日内精密度：取表4中浓度5的混合对照品溶液，按实施例4的色谱条件和检测条件进样分析，同一天内连续进样6次，记录15种人参皂苷的峰面积，采用表5中各人参皂苷的标准曲线，按照外标法，计算15种人参皂苷的含量，计算其相对标准偏差(RSD)值，结果见表6，RSD为0.81％-1.94％。日间精密度：取表4中浓度5的混合对照品溶液，按实施例4的色谱条件和检测条件进行进样分析，连续进样3天，每天连续进样3次，记录15种人参皂苷的峰面积，采用表5中各人参皂苷的标准曲线，按照外标法，计算15种人参皂苷的含量，计算其RSD值，结果见表6，RSD为0.86％-2.35％。结果表明仪器精密度较好。
实施例7重复性试验
精密称取实施例5中的混合人参样品6份，每份100mg，按实施例5的方法制备混合待测样品溶液，分别进样，按实施例4的色谱条件和检测条件进样分析，记录15种人参皂苷的峰面积，采用表5中各人参皂苷的标准曲线，按照外标法，计算15种人参皂苷的含量，计算其RSD值，结果见表6，RSD为1.23％-4.03％。结果表明该方法重复性较好。
实施例8稳定性试验
取实施例5中的混合待测样品溶液，分别在混合待测样品溶液制备后第0、2、4、8、12、24、48h进样，按实施例4的色谱条件和检测条件进样分析，记录15种人参皂苷的峰面积，采用表5中各人参皂苷的标准曲线，按照外标法，计算15种人参皂苷的含量，计算其RSD值，结果见表6，RSD为1.49％-4.74％。结果表明混合待测样品溶液在制备后48h内稳定性较好。
实施例9加样回收率试验
采用表5中各人参皂苷的标准曲线，按照外标法，计算实施例5中混合待测样品溶液中各人参皂苷的浓度。配制15种人参皂苷的混合标准品母液，浓度为计算得到的混合待测样品溶液中各人参皂苷浓度的5倍值。根据计算得到的混合待测样品溶液中各人参皂苷浓度的一半值的50％、100％、150％，共3个水平进行加样回收率试验，依次标记为50％、100％、150％。精密称取实施例5中的混合人参样品9份，每份50mg，按以上3个水平分别加入混合标准品母液，每个水平3份，按实施例5的方法制备混合加标待测样品溶液，分别进样，按实施例4的色谱条件和检测条件进样分析，计算加样回收率，结果见表6，加样回收率为90.73％-107.60％。结果表明该方法准确可靠。
表6
实施例10人参属中药中人参皂苷成分含量测定
待测样品溶液的制备：取表2中PG-1样品1g，研磨粉碎，精密称定100mg到15mL离心管中，分别加3mL 70％甲醇水溶液进行超声提取2次，每次超声1h，提取功率400W，提取温度25℃，4000rpm离心10min，合并两次上清液转移至10mL容量瓶中，用70％甲醇稀释定容至刻度线，摇匀，静置，即得PG-1样品的待测样品溶液。同法制得表2中其余118批次的各待测样品溶液。分别进样，按实施例4的色谱条件和检测条件进样分析，然后采用表5中各人参皂苷的标准曲线，按照外标法，计算各批次的人参属中药样品中15种人参皂苷的含量，结果见表7。
本申请建立UHPLC-CAD分析方法，能够同时测定不同人参属中药中15种人参皂苷的含量，此方法简便、准确、灵敏度高、专属性强。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。
Claims (6)
1.一种测定人参属中药中人参皂苷含量的方法，其中，所述人参皂苷包括：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、24(R)-拟人参皂苷F11、人参皂苷Rf、人参皂苷Ra2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、人参皂苷Rd、竹节参皂苷IVa、20(R)-人参皂苷Rg3；所述方法包括：
(1)建立15种人参皂苷的标准曲线；
以体积分数为60-80％的甲醇水溶液为溶剂，配制8-15个含有不同已知浓度的15种人参皂苷的混合对照品溶液；其中，三七皂苷R1浓度为0.08-220μg/mL，人参皂苷Rg1浓度为0.07-650μg/mL，人参皂苷Re浓度为0.1-950μg/mL，24(R)-拟人参皂苷F11浓度为0.07-600μg/mL，人参皂苷Rf浓度为0.06-40μg/mL，人参皂苷Ra2浓度为0.13-80μg/mL，人参皂苷Rb1浓度为0.15-670μg/mL，人参皂苷Rc浓度为0.3-650μg/mL，人参皂苷Ro浓度为0.3-1400μg/mL，人参皂苷Rb2浓度为0.32-400μg/mL，人参皂苷Rb3浓度为0.23-1050μg/mL，竹节参皂苷IV浓度为0.42-950μg/mL，人参皂苷Rd浓度为0.28-650μg/mL，竹节参皂苷IVa浓度为0.36-800μg/mL，20(R)-人参皂苷Rg3浓度为0.04-45μg/mL；
在相同的色谱条件和检测条件下，将体积V1的各混合对照品溶液分别注入超高效液相色谱仪中，通过电雾式检测器检测确定各色谱峰的人参皂苷成分，并获得各人参皂苷的色谱峰面积；
其中，所述色谱条件包括：
色谱柱：CORTECS Shield RP18；
流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为乙腈；采用体积分数2-80％A相，20-98％B相，梯度洗脱：0-7min，20％B；7-9min，20-24％B；9-32min，24-26％B；32-72min，26-26％B；72-80min，26-35％B；80-86min，35-50％B；86-92min，50-60％B；92-95min，60-98％B；95-98min，98％B；柱温：25-30℃；流速：0.2-0.4mL/分钟；进样体积V1：2-5μL；
所述检测条件包括：雾化温度：35-45℃；数据采集频率：2-10Hz；过滤常数：2-5s；幂函数：0.98-1.02；增益：98-102pA；
以各人参皂苷的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，分别建立各人参皂苷的标准曲线；
(2)获得待测样品溶液的色谱峰面积；
将质量为M的待测样品，以体积分数为60-80％的甲醇水溶液进行超声提取，得到体积为V2的待测样品溶液，其中，M:V2为1:(80-120)g/mL；
在与步骤(1)中相同的色谱条件和检测条件下，取体积V1的待测样品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过电雾式检测器检测确定各色谱峰的人参皂苷成分，并获得各人参皂苷的色谱峰面积；
(3)确定待测样品中15种人参皂苷的含量；
根据已建立的各人参皂苷的标准曲线，由待测样品溶液中各人参皂苷的色谱峰面积，分别获得各人参皂苷的浓度C1，并按照公式C＝C1×V2/M，分别计算出待测样品中15种人参皂苷的含量C。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合对照品溶液中，三七皂苷R1浓度为2-173μg/mL，人参皂苷Rg1浓度为4-570μg/mL，人参皂苷Re浓度为6-840μg/mL，24(R)-拟人参皂苷F11浓度为2-555μg/mL，人参皂苷Rf浓度为0.4-30μg/mL，人参皂苷Ra2浓度为1-65μg/mL，人参皂苷Rb1浓度为2-625μg/mL，人参皂苷Rc浓度为4-605μg/mL，人参皂苷Ro浓度为1-1240μg/mL，人参皂苷Rb2浓度为1-330μg/mL，人参皂苷Rb3浓度为1.5-950μg/mL，竹节参皂苷IV浓度为3-850μg/mL，人参皂苷Rd浓度为2-580μg/mL，竹节参皂苷IVa浓度为5-730μg/mL，20(R)-人参皂苷Rg3浓度为0.6-39μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，以体积分数为60-80％的甲醇水溶液为溶剂，配制含有15种人参皂苷的混合对照品储备液，其中，三七皂苷R1浓度为172-220μg/mL，人参皂苷Rg1浓度为570-650μg/mL，人参皂苷Re浓度为840-950μg/mL，24(R)-拟人参皂苷F11浓度为555-600μg/mL，人参皂苷Rf浓度为29-40μg/mL，人参皂苷Ra2浓度为65-80μg/mL，人参皂苷Rb1浓度为625-670μg/mL，人参皂苷Rc浓度为605-650μg/mL，人参皂苷Ro浓度为1240-1400μg/mL，人参皂苷Rb2浓度为330-400μg/mL，人参皂苷Rb3浓度为950-1050μg/mL，竹节参皂苷IV浓度为850-950μg/mL，人参皂苷Rd浓度为580-650μg/mL，竹节参皂苷IVa浓度为730-800μg/mL，20(R)-人参皂苷Rg3浓度为38-45μg/mL；
以体积分数为60-80％的甲醇水溶液稀释所述混合对照品储备液，获得所述8-15个含有不同已知浓度的15种人参皂苷的混合对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，将质量为M的待测样品，以体积为V3体积分数为60-80％的甲醇水溶液进行超声提取1-3次，得到提取液，将所述提取液以体积分数为60-80％的甲醇水溶液进行稀释，得到体积为V2的待测样品溶液，其中M:V3为1:(25-35)g/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，超声提取的时间为0.5-1.5h，提取功率为300-500W，提取温度为20-38℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人参属中药选自人参、西洋参、三七、红参、竹节参、珠子参、人参花、西洋参花、三七花、人参叶、西洋参叶和三七叶中的至少一种。
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