CN106124682B - 一种刺五加注射液的成分检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种刺五加注射液的成分检验方法，更具体涉及对刺五加注射液中12种主要成份的含量测定方法，还包括刺五加注射液中4种糖类成分的含量测定方法。本发明采用HPLC和UPLC法进行检验，本发明提供的一种刺五加注射液的成分检验方法更加方便、高效、稳定、准确，适用性更强，为刺五加注射液的生产质量控制和临床应用安全提供了可靠保障。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种刺五加注射液的成分检验方法，更具体涉及对刺五加注射液中12种主要成份的含量测定方法。
背景技术
刺五加注射液为刺五加经提取加工而制成的灭菌水溶液，有平补肝肾，益精壮骨之功能，主治肝肾不足所致的短暂性脑缺血发作，脑动脉硬化，脑血栓形成，脑栓塞等。刺五加的化学成分主要包括苯丙酸类、香豆素类、木脂素类、含氮碱基类、糖、氨基酸等。
由于刺五加注射液中成分种类较多，其中主要化学成分包括苯丙素类、三萜类、黄酮类、含氮化合物、糖类等。目前还没有一种检测分析方法能够较为全面、快速、准确地检测刺五加注射液中的主要成分及含量。通常是对其中的各类成分进行单独检验。
例如，现有对刺五加注射液中总苷类物质的含量测定方法为：以紫丁香苷为对照品，依照分光光度法在265nm波长处测定吸收度，计算刺五加注射液中总苷的含量。而对总苷类中的具体成分，则是分别采用不同方法测定。例如，中国专利申请201210049755公开了紫丁香苷和刺五加苷E含量的检测方法，采用超高效液相色谱法，应用ACQUITY UPLC BEHC18色谱柱，柱温为40℃，流速为每分钟0.3mL，检测波长为220nm，理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于30000，刺五加苷E峰的分离度应达到1.5，梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相为5％的乙腈和95％的体积比为0.1％的磷酸溶液；3.2分钟时，流动相为9.2％的乙腈和90.8％的体积比为0.1％的磷酸溶液；10.0分钟时，流动相为22％的乙腈和78％的体积比为0.1％的磷酸溶液；12.0分钟时，流动相为100％的乙腈；15.0分钟时，流动相为5％的乙腈和95％的体积比为0.1％的磷酸溶液。
又例如，现有对刺五加注射液中总糖类物质的测定方法为以葡萄糖为对照品，依照分光光度法在490nm波长处测定吸收度，计算刺五加注射液中总糖的含量。
上述方法虽然能够快速获得刺五加注射液中的某类成分的含量，但是无法对该类物质所包含的具体成分进行定量分析，需要分别针对各个成分进行含量测定，分析测定过程相对较为繁复，耗时较长。
另一方面，中国专利申请200410044162公开了一种刺五加指纹图谱检测方法。该方法虽然高效液相色谱的方法实现了一次检测识别出刺五加中的14个成分峰。然而上述方法的分离度较低，多个成分峰之间存在明显重叠；准确性较低，基线不平稳，背景干扰严重；除紫丁香苷以外，没有识别出其他刺五加苷类物质、核苷类物质、黄酮类物质以及绿原酸等化合物，也没有提供标准参照；没有提供各个成分的浓度计算的线性回归方程，也就无法直观快速的进行各成分浓度的计算；重复性和准确性相对较低。
中药注射液由于其成分相对较为复杂，因此质量控制的难度也相对较大。就刺五加注射液而言，含有多种活性成分，如何能够一次将其中的主要活性成分检测出并进行定量，对其生产制造以及临床使用中的质量监控非常重要，然而现有技术并未很好地解决这一问题。
综上所述，提供一种刺五加注射液的成分检验方法，能够快速高效地对其中的主要活性成分进行检测定量，是其生产制造和临床应用中亟待解决的重要问题。
发明内容
本发明中涉及的超高效液相色谱简称为UPLC；高效液相色谱简称为HPLC。
如未特别说明，本发明中涉及的百分含量，例如“2％的甲醇溶液”指体积百分比，即“2％的甲醇溶液”指100mL溶液里含有2mL甲醇。
如未特别说明，本发明中涉及的某溶液，例如“甲醇溶液”指其水溶液，即“甲醇溶液”指以水为溶剂的甲醇溶液。
如未特别说明，本发明中涉及的水指超纯水。
本发明的目的是提供一种刺五加注射液的成分检验方法。
所述的刺五加注射液的成分检验方法包括能同时检测胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、刺五加苷B、隐绿原酸、异嗪皮啶和刺五加苷E，12个主要成分的UPLC含量测定方法。
所述的UPLC含量测定方法包括以下步骤：
(1)、供试品溶液的制备：量取待测刺五加注射液，加入甲醇溶液，摇匀后使用0.22μm的微孔滤膜过滤，收集滤液，即为供试品溶液；
(2)、UPLC检测：将步骤(1)得到的供试品溶液进行UPLC检测，应用Waters ACQUITYUPLC HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)色谱柱，柱温为25-40℃，采用体积浓度为0.1-0.6％的甲酸和40％的乙腈水溶液作为流动相A，体积浓度为0.1-0.6％的甲酸水溶液作为流动相B，进行梯度洗脱，流速为每分钟0.25-0.4mL，洗脱液经紫外检测器采集60分钟之内的数据。
所述的UPLC含量测定方法的步骤(1)中加入的甲醇溶液的浓度为5-15％；优选为5-10％；进一步优选为5-8％。
所述的UPLC含量测定方法的步骤(1)中加入的甲醇溶液的体积为刺五加注射液的2-5倍体积；优选为2-4倍体积；进一步优选为3-4倍体积。
所述的UPLC含量测定方法的步骤(2)中的柱温优选为25-35℃，进一步优选为30-35℃。
所述的UPLC含量测定方法的步骤(2)中的流动相A优选为体积浓度为0.2-0.4％的甲酸和40％的乙腈水溶液；进一步优选为0.3-0.4％的甲酸和40％的乙腈水溶液。
所述的UPLC含量测定方法的步骤(2)中的流动相B优选为体积浓度为0.2-0.4％的甲酸水溶液；进一步优选为0.3-0.4％的甲酸水溶液。
所述的UPLC含量测定方法的步骤(2)中的流速优选为每分钟0.3-0.4mL；进一步优选为每分钟0.35-0.4mL。
所述的UPLC含量测定方法的步骤(2)中的紫外检测的波长为：胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、刺五加苷B、刺五加苷E为270nm，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶为325nm。
所述的UPLC含量测定方法的步骤(2)中的梯度洗脱程序为：在开始时，也就是0分钟时，流动相B为100％；到8分钟时，流动相A为6％，流动相B为94％；到13分钟时，流动相A为13％，流动相B为87％；到19分钟时，流动相A为19％，流动相B为81％；到25分钟时，流动相A为25％，流动相B为75％；到40分钟时，流动相A为27％，流动相B为78％；到50分钟时，流动相A为36％，流动相B为64％；到60分钟时，流动相A为70％，流动相B为30％。
根据本发明所述的UPLC含量测定方法，利用上述12个成分的标准品，以浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，所述的12个主要成分的UPLC含量测定方法还包括用于计算上述12个成分的浓度的标准曲线回归方程，如下所示：
| 成分 | 标准曲线回归方程 |
| 胞苷 | Y＝16733.3X+8977.3 |
| 尿苷 | Y＝12495.4X+12446.0 |
| 腺苷 | Y＝13318.9X+7687.8 |
| 鸟苷 | Y＝11027.1X+5539.1 |
| 5-羟甲基糠醛 | Y＝30937.5X+11744.5 |
| 原儿茶酸 | Y＝13940.5X+16545.3 |
| 新绿原酸 | Y＝18262.6X+95195.1 |
| 绿原酸 | Y＝18472.6X+54605.3 |
| 刺五加苷B | Y＝12510.4X+198389.6 |
| 隐绿原酸 | Y＝16938.3X+63615.7 |
| 异嗪皮啶 | Y＝15791.8X+10735.4 |
| 刺五加苷E | Y＝900.2X+2199.1 |
所述的一种刺五加注射液的成分检验方法还包括刺五加注射液中4种糖类成分的含量测定方法。
所述的4种糖指果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖。
所述的刺五加注射液中4种糖含量测定方法是使用高效液相色谱法进行测定，包括以下步骤：
(1)、供试品溶液的制备：量取待测刺五加注射液，加入乙腈溶液，摇匀后使用0.22μm的微孔滤膜过滤，收集滤液，即为供试品溶液；
(2)、将步骤(1)得到的供试品溶液进行HPLC检测：应用Prevail Carbohydrate ES(4.6×250mm，5μm)色谱柱，柱温为30-40℃，采用乙腈作为流动相A，水作为流动相B，进行梯度洗脱，流速为每分钟0.6-1.2mL，洗脱液经蒸发光散射检测器采集55分钟之内的数据，检测器漂移管温度为90℃，N2雾化气流速为1L/min；梯度洗脱程序为：在开始时，也就是0分钟时，流动相A为85％流动相B为15％；到30分钟时，流动相A为75％，流动相B为25％；到40分钟时，流动相A为50％，流动相B为50％；到45分钟时，流动相A为50％，流动相B为50％；到46分钟时，流动相A为85％，流动相B为15％；到55分钟时，流动相A为85％，流动相B为15％。
所述的刺五加注射液中4种糖含量测定方法的步骤(1)中的加入的乙腈溶液的体积为刺五加注射液的5-12倍；优选为5-10倍；进一步优选为6-10倍。
所述的刺五加注射液中4种糖含量测定方法的步骤(1)中的加入的乙腈溶液的溶度为40-80％；优选为45-70％；进一步优选为50-65％。
所述的刺五加注射液中4种糖含量测定方法的步骤(2)中的柱温优选为30-36℃；进一步优选为30-34℃。
所述的刺五加注射液中4种糖含量测定方法的步骤(2)中的流速优选为每分钟0.6-1.0mL；进一步优选为每分钟0.6-0.8mL。
所述的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的含量测定方法还包括用于计算果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的浓度的标准曲线回归方程，如下所示，其中浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标：
| 成分 | 标准曲线回归方程 |
| 果糖 | Y＝1.51X+6.08 |
| 葡萄糖 | Y＝1.55X+4.68 |
| 蔗糖 | Y＝1.46X+6.41 |
| 麦芽糖 | Y＝1.44X+5.33 |
和现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)、本发明提供的一种刺五加注射液的成分检验方法能够在一管检测中实现对其中12个主要活性的成分的同时检测，而常规方法则是通过对大类成分总量进行定量，或针对其中的某种成分采用不同的方法逐个定量。因此本发明相较常规方法更加便捷省时，在面对大批量检验时，能够在较短时间内获得可靠的检验结果。
(2)、本发明提供的UPLC检验方法获得的图谱中成分峰之间分离度高，无重叠，极大程度地保障了检验结果的准确性。
(3)、本发明提供的UPLC检验方法获得的检测结果背景干扰小，基线平稳，能够避免杂质峰对检测结果的影响，使得检验结果更加精确。
(4)、本发明提供的一种刺五加注射液的成分检验方法还提供了对上述12个成分进行浓度计算的标准曲线回归方程，可根据检测的峰面积计算供试溶液中该成分的浓度，检测数据可直接换算成成分浓度，使得检测结果更加直观。方程的线性范围较广，实用性更强，并且相关系数均在0.999以上，准确性高。
(5)、本发明提供的一种刺五加注射液的成分检验方法中还包括了对其中4中糖类成分的检测方法，使得对刺五加注射液的检测更加全面，能够获知其中多种成分的含量。
(6)、本发明提供的一种刺五加注射液的成分检验方法灵敏度高、重复性好、特异性强。
综上所述，本发明提供的一种刺五加注射液的成分检验方法更加方便、高效、稳定、准确，适用性更强，为刺五加注射液的生产质量控制和临床应用安全提供了可靠保障。
附图说明
图1为刺五加注射液中12种主要成分的UPLC图谱。
图2为刺五加注射液中4种糖类成分的HPLC图谱。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
术语：超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography)在本发明中简称UPLC；高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography)在本发明中简称HPLC。
ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪，配脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器，购自Waters公司；Mill-Q超纯水器购自Millipore公司；Mettler XS105型电子天平购自Mettler公司；Minispin离心机，购自eppendorf公司。
乙腈、甲醇为色谱纯，购自Merck公司；甲酸为色谱纯购自ROC Scientific公司及Merck公司；其余试剂均为分析纯，购自西格玛奥德里奇公司；水为Milli-Q超纯水。
胞苷，批号：36641，HPLC纯度：99.0％；尿苷，批号31313，纯度：99.5％；腺苷，批号D1303032，纯度：99.5％；和鸟苷，批号32979，纯度：99.5％购自上海晶纯实业有限公司；5-羟甲基糠醛，批号：130607，HPLC纯度：99.64％；原儿茶酸，批号：130509，HPLC纯度：99.34％；新绿原酸，批号：130426，HPLC纯度：99.20％；绿原酸，批号130602，HPLC纯度：99.53％；刺五加苷B，批号：130504，HPLC纯度：99.25％；隐绿原酸，批号：130405，HPLC纯度：99.37％；异嗪皮啶，批号：130427，HPLC纯度：99.69％；和刺五加苷E，批号：130623，HPLC纯度：99.42％均购自上海融禾医药科技发展有限公司。
实施例1一种刺五加注射液的成分检验方法
供试样品：共28个不同批次的刺五加注射液，由哈尔滨珍宝制药有限公司生产，批号分别为BS20120801、AS20121101、BS20120803、AS20121102、AS20121103、AS20121104、A20120907、A20120908、A20120909、A20120910、C20120503、C20120507、C20120511、C20120515、C20120521、20120402、20120405、20120411、201306181、201306191、201306201、201308211、201310241、20131031S、20131101S、20131102S、20130513S2、20130513S1。
1、胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异嗪皮啶、刺五加苷B、刺五加苷E的含量测定方法：
照高效液相色谱法测定：
(1)、供试品溶液的制备：量取待测刺五加注射液，加入4倍体积的6％甲醇溶液，摇匀后使用0.22μm的微孔滤膜过滤，收集滤液，即为供试品溶液；
(2)、UPLC检测：将步骤(1)得到的供试品溶液进行UPLC检测，色谱条件为：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3，2.1×100mm，1.8μm；
柱温：32℃；
流速：每分钟0.3mL
检测波长：胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、刺五加苷B、刺五加苷E为270nm，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶为325nm；
流动相及梯度洗脱程序：采用体积浓度为0.3％的甲酸和40％的乙腈水溶液作为流动相A，体积浓度为0.3％的甲酸水溶液作为流动相B，在开始时，也就是0分钟时，流动相B为100％；到8分钟时，流动相A为6％，流动相B为94％；到13分钟时，流动相A为13％，流动相B为87％；到19分钟时，流动相A为19％，流动相B为81％；到25分钟时，流动相A为25％，流动相B为75％；到40分钟时，流动相A为27％，流动相B为78％；到50分钟时，流动相A为36％，流动相B为64％；到60分钟时，流动相A为70％，流动相B为30％。
数据采集时间为：60分钟。
标准曲线线性回归方程的制作：取胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异嗪皮啶、刺五加苷B、刺五加苷E对照品适量，精密称定，分别加10％甲醇溶液超声溶解定容，必要时适当加热助溶，制成浓度分别为胞苷80.00μg/mL、尿苷149.4μg/mL、腺苷91.92μg/mL、鸟苷84.16μg/mL、5-羟甲基糠醛60.48μg/mL、原儿茶酸224.6μg/mL、新绿原酸448.8μg/mL、绿原酸377.9μg/mL、刺五加苷B1 057μg/mL、隐绿原酸452.4μg/mL、异嗪皮啶147.4μg/mL和刺五加苷E 374.3μg/mL的混合对照品储备溶液。于4℃保存。精密量取混合对照品储备液适量，用6％甲醇溶液稀释制成1/1、4/5、2/5、1/5、1/10、1/20、1/40储备液浓度的混合对照品溶液。按本实施例1-(2)的方法进行UPLC检测，以浓度(X，μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到12种成分的线性回归方程和相关系数。
测定结果：
线性回归方程和相关系数结果如下，可见线性关系良好(R≥0.999)，可直接根据检测出的峰面积计算相应供试品中各个成分的浓度，且线性范围宽，方便高效、适用性强。
| 成分 | 标准曲线回归方程 | 线性范围(μg/mL) | 相关系数R |
| 胞苷 | Y＝16733.3X+8977.3 | 2.000-80.00 | 0.9997 |
| 尿苷 | Y＝12495.4X+12446.0 | 3.736-149.4 | 0.9997 |
| 腺苷 | Y＝13318.9X+7687.8 | 2.298-91.92 | 0.9996 |
| 鸟苷 | Y＝11027.1X+5539.1 | 2.104-84.16 | 0.9997 |
| 5-羟甲基糠醛 | Y＝30937.5X+11744.5 | 1.512-60.48 | 0.9997 |
| 原儿茶酸 | Y＝13940.5X+16545.3 | 5.615-224.6 | 0.9997 |
| 新绿原酸 | Y＝18262.6X+95195.1 | 11.22-448.8 | 0.9994 |
| 绿原酸 | Y＝18472.6X+54605.3 | 9.447-377.9 | 0.9996 |
| 刺五加苷B | Y＝12510.4X+198389.6 | 26.42-1057 | 0.9990 |
| 隐绿原酸 | Y＝16938.3X+63615.7 | 11.31-452.4 | 0.9995 |
| 异嗪皮啶 | Y＝15791.8X+10735.4 | 3.684-147.4 | 0.9997 |
| 刺五加苷E | Y＝900.2X+2199.1 | 9.357-374.3 | 0.9996 |
刺五加注射液中12种主要成分的UPLC图谱如图1所示，其中A为标准品图谱，B为供试刺五加注射液图谱，峰图上数字含义为：1为胞苷、2为尿苷、3为腺苷、4为鸟苷、5为5-羟甲基糠醛、6为原儿茶酸、7为新绿原酸、8为绿原酸、9为刺五加苷B、10为隐绿原酸、11为异嗪皮啶、12为刺五加苷E。
由图1可知本发明提供的检验方法获得峰图中的特征峰的保留时间和标准品一致，准确性高，且峰图中背景干扰小，几乎没有杂峰，基线平稳，特征峰明确，且分离度高，检验结果相较于现有技术更加准确。
根据上述标准曲线计算各批次刺五加注射液中12种主要成分的平均含量为：胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、刺五加苷B、隐绿原酸、异嗪皮啶和刺五加苷E的平均含量分别为43.44μg/mL、102.1μg/mL、42.75μg/mL、22.18μg/mL、19.16μg/mL、142.9μg/mL、421.5μg/mL、339.0μg/mL、749.9μg/mL、342.0μg/mL、22.88μg/mL和407.1μg/mL。
2、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的含量测定方法：
照高效液相色谱法测定：
(1)、供试品溶液的制备：量取待测刺五加注射液，加入10倍体积60％的乙腈溶液，摇匀后使用0.22μm的微孔滤膜过滤，收集滤液，即为供试品溶液；
(2)、将步骤(1)得到的供试品溶液进行HPLC检测：
色谱条件为：
色谱柱：Prevail Carbohydrate ES，4.6×250mm，5μm色谱柱；
柱温：30℃；
流速：每分钟0.8mL；
检测条件：蒸发光散射检测器采集55分钟之内的数据，检测器漂移管温度为90℃，N2雾化气流速为1L/min；
流动相及梯度洗脱程序：采用乙腈作为流动相A，水作为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：在开始时，也就是0分钟时，流动相A为85，％流动相B为15％；到30分钟时，流动相A为75％，流动相B为25％；到40分钟时，流动相A为50％，流动相B为50％；到45分钟时，流动相A为50％，流动相B为50％；到46分钟时，流动相A为85％，流动相B为15％；到55分钟时，流动相A为85％，流动相B为15％。
标准曲线线性回归方程的制作：分别精密称取果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖对照品适量于同一量瓶中，加60％乙腈溶液超声溶解定容，制成浓度分别为果糖2040μg/mL、葡萄糖1685μg/mL、蔗糖1460μg/mL、麦芽糖1690μg/mL的混合对照品储备液，于4℃保存。精密量取混合对照品储备液适量，用60％乙腈溶液稀释制成1/2、2/5、3/10、1/5、1/10、1/20储备液浓度的混合对照品溶液。按2.3项下色谱条件分别进样分析，以浓度的对数(X，μg/mL)为横坐标，峰面积对数(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到4种糖的线性回归方程和相关系数。
测定结果：
线性回归方程和相关系数结果如下，可见线性关系良好(R≥0.997)，可直接根据检测出的峰面积计算相应供试品中各个成分的浓度，且线性范围宽，方便高效、适用性强。
| 成分 | 标准曲线回归方程 | 线性范围(μg/mL) | 相关系数R |
| 果糖 | Y＝1.51X+6.08 | 102.0～1020 | 0.9979 |
| 葡萄糖 | Y＝1.55X+4.68 | 84.25～842.5 | 0.9999 |
| 蔗糖 | Y＝1.46X+6.41 | 73.00～730.0 | 0.9996 |
| 麦芽糖 | Y＝1.44X+5.33 | 84.51～845.1 | 0.9999 |
刺五加注射液中4种糖类成分的HPLC图谱如图2所示，其中A为标准品图谱，B为供试刺五加注射液图谱，峰图上数字含义为：1为果糖、2为葡萄糖、3为蔗糖、4为麦芽糖。
由图2可知本发明提供的检验方法获得峰图中的特征峰的保留时间和标准品一致，准确性高，且峰图中背景干扰小，几乎没有杂峰，基线平稳，特征峰明确，且分离度高，检验结果相较于现有技术更加准确。
根据上述标准曲线计算各批次刺五加注射液中4种糖类成分的平均含量为：果糖7.72mg/mL、葡萄糖6.65mg/mL、蔗糖4.01mg/mL、麦芽糖4.45mg/mL。
试验例1方法专属性试验
取刺五加注射液供试品溶液，本发明实施例1中的色谱条件进样分析，联用二极管阵列检测器(波长扫描范围：190～400nm)。分析各成分峰纯度，结果各成分峰纯度良好，证明本发明提供的检验方法具专属性。
试验例2仪器精密度试验
取刺五加注射液供试品溶液，按实施例1的检验方法重复检验6次，结果如下：12种主要成分的UPLC图谱中，各成分保留时间的RSD均小于1.0％，峰面积RSD均小于2.9％；4种糖类成分的HPLC图谱中，各成分峰面积RSD均小于1.9％，表明仪器精密度良好。
试验例3方法重复性试验
取同一批次刺五加注射液(批号：AS20121102)6份，分别按照实施例1中的检验方法进行检验计算胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、刺五加苷B、隐绿原酸、异嗪皮啶和刺五加苷E的含量和果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的含量，结果刺五加注射液中12种主要成分的含量RSD小于1.9％，4种糖类成分的RSD小于3.2％。表明本发明的方法具有良好重复性。
试验例4方法回收率试验
取9份已知各成分含量的刺五加注射液各1.25mL于5mL量瓶中，分别精密加入相当于制剂含量80％、100％、120％量的对照品溶液，按照实施例1的检验方法进行检验分析，计算含量和加样回收率，结果表明：测得胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、刺五加苷B、隐绿原酸、异嗪皮啶、刺五加苷E的平均加样回收率(n＝9)分别为(99.09±2.03)％、(101.3±2.03)％、(99.47±2.45)％、(98.83±2.78)％、(96.22±3.07)％、(99.62±3.30)％、(99.96±2.30)％、(99.79±2.26)％、(98.60±2.52)％、(99.95±2.30)％、(102.1±1.97)％、(97.04±2.89)％；测得果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的平均加样回收率分别为(98.40±3.32)％、(100.8±4.41)％、(101.2±3.34)％和(96.89±4.16)％，结果表明该方法准确度良好，符合方法学验证要求。
以上所述仅为本发明的部分对比例和部分较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种刺五加注射液的成分检验方法，其特征在于：所述的刺五加注射液的成分检验方法包括能同时检测胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、刺五加苷B、隐绿原酸、异嗪皮啶和刺五加苷E的UPLC含量测定方法；
所述的UPLC含量测定方法包括以下步骤：
(1)、供试品溶液的制备：量取待测刺五加注射液，加入甲醇溶液，摇匀后使用0.22μm的微孔滤膜过滤，收集滤液，即为供试品溶液；
(2)、UPLC检测：将步骤(1)得到的供试品溶液进行UPLC检测，应用WatersACQUITYUPLCHSST3色谱柱，柱温为25-40℃，采用体积浓度为0.1-0.6％的甲酸和40％的乙腈水溶液作为流动相A，体积浓度为0.1-0.6％的甲酸水溶液作为流动相B，进行梯度洗脱，流速为每分钟0.25-0.4mL，洗脱液经紫外检测器采集60分钟之内的数据；
所述的梯度洗脱的程序为：在开始时，也就是0分钟时，流动相B为100％；到8分钟时，流动相A为6％，流动相B为94％；到13分钟时，流动相A为13％，流动相B为87％；到19分钟时，流动相A为19％，流动相B为81％；到25分钟时，流动相A为25％，流动相B为75％；到40分钟时，流动相A为27％，流动相B为78％；到50分钟时，流动相A为36％，流动相B为64％；到60分钟时，流动相A为70％，流动相B为30％。
2.如权利要求1所述的检验方法，其特征在于：所述的UPLC含量测定方法的步骤(2)中的紫外检测的波长为：胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、刺五加苷B、刺五加苷E为270nm，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶为325nm。
3.如权利要求1-2任意一项所述的检验方法，其特征在于：所述的检验方法还包括刺五加注射液中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的含量测定方法。
4.如权利要求3所述的检验方法，其特征在于：所述的五加注射液中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的含量测定方法包括以下步骤：
(1)、供试品溶液的制备：量取待测刺五加注射液，加入乙腈溶液，摇匀后使用0.22μm的微孔滤膜过滤，收集滤液，即为供试品溶液；
(2)、将步骤(1)得到的供试品溶液进行HPLC检测：应用PrevailCarbohydrateES色谱柱，柱温为30-40℃，采用乙腈作为流动相A，水作为流动相B，进行梯度洗脱，流速为每分钟0.6-1.2mL，洗脱液经蒸发光散射检测器采集55分钟之内的数据，检测器漂移管温度为90℃，N2雾化气流速为1L/min。
5.如权利要求4所述的检验方法，其特征在于：所述的梯度洗脱的程序为：在开始时，也就是0分钟时，流动相A为85％，流动相B为15％；到30分钟时，流动相A为75％，流动相B为25％；到40分钟时，流动相A为50％，流动相B为50％；到45分钟时，流动相A为50％，流动相B为50％；到46分钟时，流动相A为85％，流动相B为15％；到55分钟时，流动相A为85％，流动相B为15％。
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