CN116242929A - 同时测定红花药物组合物中9种成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，属于药物检测技术领域，所述方法是取尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5‑羟甲基糠醛、紫丁香苷和对羟基红花黄色素A制备对照品溶液I；取对羟基肉桂酸和山萘酚3‑O‑芸香糖苷制备对照品溶液II；取红花药物组合物制备供试品溶液；分别取对照品溶液I、对照品溶液II和供试品溶液进行高效液相色谱检测，再利用外标法，分别计算得红花药物组合物中9种成分的含量。本发明利用高效液相色谱一次性检测红花药物组合物中9种化学成分的含量测定方法，实现对红花药物组合物中多个指标成分的控制。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测技术，尤其涉及一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法。
背景技术
红花注射液是由红花药材水提、精制而成的无菌水溶液，具有活血化瘀的功效，用于治疗闭塞心脑血管疾病、冠心病、脉管炎。
红花注射液质量标准为国家药品标准WS3-B-3825-98-2012，目前只测定羟基红花黄色素A一种化学成分的含量。查阅文献得知，目前对于红花注射液中有效成分的测定，仅有单独测定山柰酚或槲皮素化合物含量的方法，或同时测定尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷三种成分的方法，尚未有同时测定3种以上成分含量的方法。因此，为简便、快捷、多指标控制红花注射液的的质量，本发明了采用高效液相色谱仪、梯度洗脱，同时测定红花注射液中9种化合物的含量，并使其达到良好的分离效果和准确性。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，所述方法包括以下步骤：
取尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5-羟甲基糠醛、紫丁香苷和对羟基红花黄色素A共七种成分，制备对照品溶液I；
取对羟基肉桂酸和山萘酚3-O-芸香糖苷共两种成分，制备对照品溶液II；
取红花药物组合物制备供试品溶液；
分别取对照品溶液I、对照品溶液II和供试品溶液进行高效液相色谱检测，再利用外标法，分别计算得红花药物组合物中尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5-羟甲基糠醛、对羟基肉桂酸、山萘酚3-O-芸香糖苷、紫丁香苷和羟基红花黄色素的含量；
其中，检测尿嘧啶苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷和5-羟甲基糠醛的检测波长为252～256nm；
检测对羟基肉桂酸、山柰酚3-O-芸香糖苷和紫丁香苷的检测波长为262～270nm；
检测羟基红花黄色素A检测波长为408～412nm。
进一步的，所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的流动相A为乙腈、流动相B为0.1～0.2wt％的冰醋酸水溶液；
所述梯度洗脱条件为：
0～15min，2％→5％流动相A，98％→95％流动相B；
15～30min，5％→25％流动相A，95％→75％流动相B。
进一步的，所述高效液相色谱检测的柱温为25～40℃、流速为0.8～1.2mL/min、色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，优选phenomenex Gemini-C18，4.6×250mm 5μm；对照品溶液I、对照品溶液II和供试品溶液的进样体积均为10～30μL。
进一步的，对照品溶液I中含有尿嘧啶核苷10～80μg/mL、鸟嘌呤核苷10～60μg/mL、腺嘌呤核苷10～70μg/mL、对羟基苯甲酸苷10～70μg/mL、5-羟甲基糠醛10～70μg/mL、紫丁香苷1～70μg/mL、对羟基红花黄色素A1～65μg/mL；
对照品溶液II中含有对羟基肉桂酸8～50μg/mL和山萘酚3-O-芸香糖苷10～80μg/mL。
进一步的，对照品溶液I的溶剂为水；
对照品溶液II的溶剂为48～52vol％的乙腈水溶液；
供试品溶液是取红花药物组合物用水稀释2～10倍体积制得；
所述高效液相色谱检测过程中9种成分的理论板数均在10000以上。
一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，所述方法包括以下步骤：
取尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5-羟甲基糠醛、紫丁香苷和对羟基红花黄色素A共七种成分，制备不同浓度的对照品系列溶液I；
取对羟基肉桂酸和山萘酚3-O-芸香糖苷共两种成分，制备不同浓度的对照品系列溶液II；
分别取不同浓度的对照品系列溶液I和对照品系列溶液II进行高效液相色谱检测，并根据不同化学成分的浓度和相应化学成分对应浓度测定的峰面积，绘制不同化学成分对应的标准曲线；
取红花药物组合物制备供试品溶液；
对供试品溶液进行高效液相色谱检测，所得相应化学成分的峰面积代入相应的标准曲线，经计算，即得所述红花药物组合物中相应化学成分的含量；
其中，检测尿嘧啶苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷和5-羟甲基糠醛的检测波长为252～256nm；
检测对羟基肉桂酸、山柰酚3-O-芸香糖苷和紫丁香苷的检测波长为262～270nm；
检测羟基红花黄色素A检测波长为408～412nm。
进一步的，所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的流动相A为乙腈、流动相B为0.1～0.2wt％的冰醋酸水溶液；
所述梯度洗脱条件为：
0～15min，2％→5％流动相A，98％→95％流动相B；
15～30min，5％→25％流动相A，95％→75％流动相B。
进一步的，所述高效液相色谱检测的柱温为25～40℃、流速为0.8～1.2mL/min、色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，优选phenomenex Gemini-C18，4.6×250mm 5μm；对照品溶液I、对照品溶液II和供试品溶液的进样体积均为10～30μL；检测器为二极管阵列检测器。
进一步的，不同对照品系列溶液I中尿嘧啶核苷的浓度在10.01～60.05μg/mL之间、鸟嘌呤核苷的浓度在8.99～53.93μg/mL之间、腺嘌呤核苷的浓度在9.44～56.61μg/mL之间、对羟基苯甲酸苷的浓度在9.82～58.91μg/mL之间、5-羟甲基糠醛的浓度在9.60～57.62μg/mL之间、紫丁香苷的浓度在11.80～70.82μg/mL之间、对羟基红花黄色素A的浓度在1～65μg/mL之间；
不同对照品系列溶液II中对羟基肉桂酸的浓度在9.23～55.38μg/mL之间、山萘酚3-O-芸香糖苷的浓度在12.22～73.33μg/mL之间；
对照品系列溶液I的溶剂为水；
对照品系列溶液II的溶剂为48～52vol％的乙腈水溶液；
供试品溶液是取红花药物组合物用水稀释2～10倍体积制得；
所述高效液相色谱检测过程中9种成分的理论板数均在10000以上。
进一步的，所述不同化学成分对应的标准曲线如下：
尿嘧啶核苷对应的标准曲线为y＝46.13562x+1.73333，R2＝0.99992；
鸟嘌呤核苷对应的标准曲线为y＝42.86719x-0.26667，R2＝0.99995；
腺嘌呤核苷对应的标准曲线为y＝50.50161x+4.46667，R2＝0.99997；
对羟基苯甲酸苷对应的标准曲线为43.57603x-2.06667，R2＝0.99994；
5-羟甲基糠醛对应的标准曲线为y＝43.04129x-3.60000，R2＝0.99994；
对羟基肉桂酸对应的标准曲线为y＝105.70592x+19.66667，R2＝0.99993；
山萘酚3-O-芸香糖苷对应的标准曲线为y＝15.47304x-0.06667，R2＝0.99992；
紫丁香苷对应的标准曲线为y＝40.00366x+1.46667，R2＝0.99992；
羟基红花黄色素A对应的标准曲线为y＝40.31518x-18.93333，R2＝0.99946。
本发明的同时测定红花药物组合物中9种成分的方法的有益效果为：
本发明利用高效液相色谱一次性检测红花药物组合物中尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5-羟甲基糠醛、对羟基肉桂酸、山萘酚3-O-芸香糖苷、紫丁香苷、羟基红花黄色素A共9种化学成分的含量测定方法，实现对红花药物组合物中多个指标成分的控制；
本发明通过紫外扫描上述9种成分的紫外吸收，确定了不同成分所适宜的检测波长，其中，尿嘧啶苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷和5-羟甲基糠醛的检测波长为252～256nm；对羟基肉桂酸、山柰酚3-O-芸香糖苷、紫丁香苷的检测波长为262～270nm；羟基红花黄色素A检测波长为408～412nm。
本发明采用通过调整洗脱过程中的工艺参数，能够同时测定红花药物组合物中9种成分的含量，可实现良好的分离效果，且相互之间无干扰，测定结果准确，达到了多指标控制红花药物组合物质量的目的，且操作简单，快捷，易于掌握；
本发明的方法专属性强、准确度高、精密度高、且线性关系良好；
本发明仅通过一次测定，即完成了9种成分的含量测定，能够快速、简便的获知红花药物组合物的质量情况，解决了现有技术的检测方法仅能够测定3种以内成分的含量，无法全面控制红花药物组合物质量的问题，从而实现了通过测定9种化学成分的含量来控制红花药物组合物质量的目的。
附图说明
图1是本发明实施例1中对照品溶液I在254nm波长下的色谱图；
图2是本发明实施例1中对照品溶液II在266nm波长下的色谱图；
图3是本发明实施例1中对照品溶液I在410nm波长下的色谱图；
图4是本发明实施例1中对照品溶液I在266nm波长下的色谱图；
图5是本发明实施例1中供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图6是本发明实施例1中供试品溶液在266nm波长下的色谱图；
图7是本发明实施例1中供试品溶液在410nm波长下的色谱图；
图8是本发明实施例6中254nm波长下的的尿嘧啶核苷标准曲线图；
图9是本发明实施例6中254nm波长下的鸟嘌呤核苷标准曲线图；
图10是本发明实施例6中254nm波长下的腺嘌呤核苷标准曲线图；
图11是本发明实施例6中254nm波长下的对羟基苯甲酸苷标准曲线图；
图12是本发明实施例6中254nm波长下的5-羟甲基糠醛标准曲线图；
图13是本发明实施例6中266nm波长下的对羟基肉桂酸标准曲线图；
图14是本发明实施例6中266nm波长下的山萘酚3-O-芸香糖苷标准曲线图；
图15是本发明实施例6中266nm波长下的紫丁香苷标准曲线图；
图16是本发明实施例6中410nm波长下的羟基红花黄色素A标准曲线图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法
本实施例为一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，采用神威药业集团有限公司生产的红花注射液进行测定，具体包括以下步骤：
1)供试品溶液和对照品溶液的配制
11)供试品溶液配制
精密量取红花注射液(批号：HH001)，加入5倍体积水稀释(即N＝5)，摇匀，即得供试品溶液。
12)对照品溶液配制
分别称取尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5-羟甲基糠醛、紫丁香苷和对羟基红花黄色素A共七种成分，制备对照品溶液I，浓度为C对照品，其中，尿嘧啶核苷含量为40μg/mL、鸟嘌呤核苷含量为30μg/mL、腺嘌呤核苷含量为35μg/mL、对羟基苯甲酸苷含量为35μg/mL、5-羟甲基糠醛含量为30μg/mL、紫丁香苷含量为35μg/mL、对羟基红花黄色素A含量为30μg/mL(即C对照品-尿嘧啶核苷＝40μg/mL、C对照品-鸟嘌呤＝30μg/mL、C对照品-腺嘌呤核苷＝35μg/mL、C对照品-对羟基苯甲酸苷＝35μg/mL、C对照品-5-羟甲基糖醛＝30μg/mL、C对照品-紫丁香苷＝35μg/mL、C对照品-对羟基红花黄色素A＝30μg/mL)；
取对羟基肉桂酸和山萘酚3-O-芸香糖苷共两种成分，制备对照品溶液II，浓度为C对照品，其中，对羟基肉桂酸含量为25μg/mL和山萘酚3-O-芸香糖苷含量为40μg/mL(即C对照品-对羟基肉桂酸＝25μg/mL、C对照品-山萘酚3-O-芸香糖苷＝40μg/mL)。
2)高效液相色谱检测
21)取对照品溶液I和对照品溶液II进行高效液相色谱检测，得不同成分对应浓度下的峰面积A对照品，即A对照品-尿嘧啶核苷、A对照品-鸟嘌呤、A对照品-腺嘌呤核苷、A对照品-对羟基苯甲酸苷、A对照品-5-羟甲基糖醛、A对照品-紫丁香苷、A对照品-对羟基红花黄色素A、A对照品-对羟基肉桂酸、A对照品-山萘酚3-O-芸香糖苷。
其中，检测对照品溶液I和对照品溶液II的高效液相色谱条件为：
色谱柱：phenomenex Gemini-C18，4.6×250mm 5μm；
流动相：乙腈(A)-0.2wt％冰醋酸水溶液(B)；
洗脱程序：0～15min，2％→5％流动相A，98％→95％流动相B；
15～30min，5％→25％流动相A，95％→75％流动相B；
流速：0.8mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：254nm、266nm、410nm；
在一次进样的情况下，利用不同检测波长进行检测，具体为：254nm(检测尿嘧啶苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5-羟甲基糠醛)，266nm(检测对羟基肉桂酸、山柰酚3-O-芸香糖苷、紫丁香苷)，410nm(检测羟基红花黄色素A)；
进样量：对照品溶液I和对照品溶液II的进样量均为10μL，即I对照品＝10μL；
仪器：Agilent高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，四元梯度泵。
理论板数按各成分色谱峰计算应不低于10000。
其中，对照品溶液I在254nm波长下的色谱图见图1，图中a为尿嘧啶核苷、b为鸟嘌呤核苷、c为腺苷、d为对羟基苯甲酸苷、e为5-羟甲基糠醛；
对照品溶液II在266nm波长下的色谱图见图2，图中f为对羟基肉桂酸、g为山萘酚-3-O-芸香糖苷；
对照品溶液I在410nm波长下的色谱图见图3，图中h为羟基红花黄色素A；
对照品溶液I在266nm波长下的色谱图见图4，图中i为紫丁香苷。
22)取供试品溶液在上述色谱条件的条件下进行高效液相色谱检测，不同之处仅在于供试品溶液的进样量为30μL(即I供试品＝30μL)，得供试品溶液中所含相应化学成分的峰面积A供试品；即A供试品-尿嘧啶核苷、A供试品-鸟嘌呤、A供试品-腺嘌呤核苷、A供试品-对羟基苯甲酸苷、A供试品-5-羟甲基糖醛、A供试品-紫丁香苷、A供试品-对羟基红花黄色素A、A对照品-对羟基肉桂酸、A对照品-山萘酚3-O-芸香糖苷。
其中，供试品溶液在在254nm波长下的色谱图见图5，图中，a为尿嘧啶核苷、b为鸟嘌呤核苷、c为腺苷、d为对羟基苯甲酸苷、e为5-羟甲基糠醛；
供试品溶液在266nm波长下的色谱图见图7，图中f为对羟基肉桂酸、g为山萘酚-3-O-芸香糖苷、i为紫丁香苷；
供试品溶液在410nm波长下的色谱图见图8，图中h为羟基红花黄色素A。
再根据公式红花注射液中相应成分的含量C＝(A供试品×I对照品×C对照品×N)/(A对照品×I供试品)，计算红花注射液中相应成分的含量。
A供试品——供试品溶液中相应成分的峰面积；
A对照品——对照品溶液I或对照品溶液II中相应成分的峰面积；
I供试品——供试品溶液的进样量，μL；
I对照品——对照品溶液I或对照品溶液II的进样量，μL；
C对照品——对照品溶液的浓度，μg/mL；
N——制备供试品溶液时红花注射液的稀释倍数。
以尿嘧啶核苷为例：
红花注射液中尿嘧啶核苷的含量C尿嘧啶核苷＝(A供试品-尿嘧啶核苷×I对照品×C对照品-尿嘧啶核苷×N)/(A对照品-尿嘧啶核苷×I供试品)。
其它化学成分以此类推。
本实施例中，红花注射液中尿嘧啶核苷含量为206.2μg/mL、鸟嘌呤核苷含量为56.28μg/mL、腺嘌呤核苷含量为124.0μg/mL、对羟基苯甲酸苷含量为97.1μg/mL、5-羟甲基糠醛含量为26.8μg/mL、对羟基肉桂酸含量为80.0μg/mL和山萘酚3-O-芸香糖苷含量为104.9μg/mL、紫丁香苷含量为89.2μg/mL、对羟基红花黄色素A含量为429.8μg/mL。
实施例2～5同时测定红花药物组合物中9种成分的方法
实施例2～5分别为一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，它们的步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于工艺参数的不同，具体详见表1：
表1实施例2～5中各项工艺参数一览表
在一次进样的情况下，利用不同检测波长进行检测，具体为：252～256nm(检测尿嘧啶苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5-羟甲基糠醛)，264～268nm(检测对羟基肉桂酸、山柰酚3-O-芸香糖苷、紫丁香苷)，408～412nm(检测羟基红花黄色素A)；
实施例2～5其它部分的工艺参数及步骤，与实施例1相同。
实施例6一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法
b1)供试品溶液和对照品溶液的配制
b11)供试品溶液配制
按照实施例1中步骤11)的方法配制供试品溶液，其中步骤和用量与实施例1相同。
b12)不同浓度的对照品系列溶液配制
称取尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5-羟甲基糠醛对照品约5mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液I。
称取对羟基肉桂酸约4mg、山柰酚-3-0-芸香糖苷约6mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液II。
称取紫丁香苷约6mg、对羟基红花黄色素A约5mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加50％乙腈水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液III。
分别精密量取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL上述混合对照品储备液I，加至10mL容量瓶中，分别加水定容稀释制备成6个不同浓度梯度的对照品系列溶液I。
精密吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL上述混合对照品储备液II，加至10mL容量瓶中，分别加水定容稀释制备成6个不同浓度梯度的对照品系列溶液II。
精密吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL上述混合对照品储备液III，加至10mL容量瓶中，分别加50％乙腈水定容稀释制备成6个不同浓度梯度的对照品系列溶液III。
b2)高效液相色谱检测
b21)取不同浓度的对照品系列溶液I、不同浓度的对照品系列溶液II、不同浓度的对照品系列溶液III在实施例1的色谱条件下进行高效液相色谱检测，得相应化学成分对应浓度测定的峰面积，并根据不同化学成分的浓度和相应化学成分对应浓度测定的峰面积，绘制不同化学成分对应的标准曲线，并以不同化学成分的浓度作为横坐标(即x，单位为μg/mL)，以相应化学成分对应浓度测定的峰面积作为纵坐标(即y)。
以尿嘧啶核苷为例，即尿嘧啶核苷的浓度为10.00838μg/mL时，x＝10.00838μg/mL，此时该浓度对应的峰面积即为纵坐标y，以此类推其它化学成分。
利用不同浓度的对照品系列溶液I、不同浓度的对照品系列溶液II、不同浓度的对照品系列溶液III绘制的标准曲线如下：
尿嘧啶核苷对应的标准曲线为y＝46.13562x+1.73333，R2＝0.99992，见图8；
鸟嘌呤核苷对应的标准曲线为y＝42.86719x-0.26667，R2＝0.99995，见图9；
腺嘌呤核苷对应的标准曲线为y＝50.50161x+4.46667，R2＝0.99997，见图10；
对羟基苯甲酸苷对应的标准曲线为43.57603x-2.06667，R2＝0.99994，见图11；
5-羟甲基糠醛对应的标准曲线为y＝43.04129x-3.60000，R2＝0.99994，见图12；
对羟基肉桂酸对应的标准曲线为y＝105.70592x+19.66667，R2＝0.99993，见图13；
山萘酚3-O-芸香糖苷对应的标准曲线为y＝15.47304x-0.06667，R2＝0.99992，见图14；
紫丁香苷对应的标准曲线为y＝40.00366x+1.46667，R2＝0.99992，见图15；
羟基红花黄色素A对应的标准曲线为y＝40.31518x-18.93333，R2＝0.99946，见图16。
b22)取供试品溶液在实施例1的色谱条件的条件下进行高效液相色谱检测，分别得供试品溶液中所含9种成分各自对应的峰面积，将相应化学成分的峰面积代入相应的标准曲线，并将求得的C类比-相应成分的值代入下述公式，计算供试品溶液中9种成分各自的浓度。
公式为红花注射液中相应成分的含量C＝(C类比-相应成分×I对照品×N)/I供试品，计算红花注射液中相应成分的含量。
以尿嘧啶核苷为例，即将尿嘧啶核苷在实施例1的色谱条件条件下测定的峰面积(A对照品-尿嘧啶核苷)代入尿嘧啶核苷对应的标准曲线，计算得供试品溶液中尿嘧啶核苷的浓度(C类比-尿嘧啶核苷)；
红花注射液中尿嘧啶核苷的含量C＝(C类比-相应成分×I对照品×N)/I供试品，以此类推其它化学成分的计算方法。
本实施例中，红花注射液中尿嘧啶核苷含量为206.2μg/mL、鸟嘌呤核苷含量为56.28μg/mL、腺嘌呤核苷含量为124.0μg/mL、对羟基苯甲酸苷含量为97.1μg/mL、5-羟甲基糠醛含量为26.8μg/mL、对羟基肉桂酸含量为80.0μg/mL和山萘酚3-O-芸香糖苷含量为104.9μg/mL、紫丁香苷含量为89.2μg/mL、对羟基红花黄色素A含量为429.8μg/mL。
另外，在实际应用过程中，在已知标准曲线的情况下，可以直接配制供试品溶液进行高效液相色谱检测后，直接代入标准曲线进行计算。无需重复配制不同浓度的对照品系列溶液I、不同浓度的对照品系列溶液II和不同浓度的对照品系列溶液I进行测定，绘制标准曲线这个过程。
实施例7～10同时测定红花药物组合物中9种成分的方法
实施例7～10分别为一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，它们的步骤与实施例6基本相同，不同之处仅在于工艺参数的不同，具体详见表2：
表2实施例7～10中各项工艺参数一览表
在一次进样的情况下，利用不同检测波长进行检测，具体为：252～256nm(检测尿嘧啶苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5-羟甲基糠醛)，264～268nm(检测对羟基肉桂酸、山柰酚3-O-芸香糖苷、紫丁香苷)，408～412nm(检测羟基红花黄色素A)；
实施例7～10其它部分的工艺参数及步骤，与实施例6相同。
实验例1方法学考察
本实验例同时测定红花药物组合物中9种成分的方法进行考察，主要考察该含量测定方法的精密度、日内稳定性、重复性、加样回收率实验。
一、精密度
取尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸核苷、5-羟甲基糠醛、紫丁香苷、羟基红花黄色素A配制低、中、高三种不同浓度的混合对照品溶液I，三种不同浓度的混合对照品溶液I采用实施例1中的色谱条件及进样量分别测定6次，并对所得结果进行分析，具体结果见下表。
表3三种不同浓度的混合对照品溶液I的浓度一览表
表4精密度实验结果一览表一(峰面积)
表4中数据为低、中、高三种不同浓度的混合对照品溶液I进行6次平行测定时所得峰面积。由表4可以看出，尿嘧啶核苷RSD(％)≤0.70，鸟嘌呤核苷RSD(％)≤0.73，腺嘌呤核苷RSD(％)≤0.85，对羟基苯甲酸苷RSD(％)≤0.98，5-羟甲基糠醛RSD(％)≤1.45，紫丁香苷RSD(％)≤1.57，羟基红花黄色素A RSD(％)≤1.58，由此可以表明本方法精密度良好。
取对羟基肉桂酸、山萘酚-3-O-芸香糖苷、配制低、中、高三种不同浓度的混合对照品溶液II，三种不同浓度的混合对照品溶液II采用实施例1中的色谱条件及进样量分别测定6次，并对所得结果进行分析，具体结果见下表。
表5三种不同浓度的混合对照品溶液II的浓度一览表
表6精密度实验结果一览表二(峰面积)
表6中数据为低、中、高三种不同浓度的混合对照品溶液II进行6次平行测定时所得峰面积。由表6可以看出，对羟基肉桂酸RSD(％)≤1.15、山萘酚-3-O-芸香糖苷RSD(％)≤1.57，由此可以表明本方法精密度良好。
二、日内稳定性
取红花注射液(批号：HH001)按照实施例1中的方法配制供试品溶液W，将所得供试溶液W室温避光放置，并于0、1、2、6、12、18h时，精密量取10μL供试品溶液W，分别注入液相色谱仪中，采用实施例1中的色谱条件进行测定，并计算6次峰面积的相对标准偏差，具体结果见下表。
表7日内稳定性实验结果一览表(峰面积)
| 名称 | 0 | 1h | 2h | 6h | 12h | 18h | RSD％ |
| 尿嘧啶核苷 | 1911 | 1921 | 1906 | 1930 | 1872 | 1942 | 1.26 |
| 鸟嘌呤核苷 | 485 | 493 | 492 | 492 | 476 | 479 | 1.51 |
| 腺嘌呤核苷 | 1252 | 1261 | 1261 | 1239 | 1240 | 1264 | 0.89 |
| 对羟基苯甲酸苷 | 842 | 851 | 853 | 825 | 828 | 856 | 1.58 |
| 5-羟甲基糠醛 | 231 | 235 | 227 | 225 | 235 | 235 | 1.93 |
| 对羟基肉桂酸 | 1697 | 1702 | 1685 | 1673 | 1706 | 1704 | 0.76 |
| 山萘酚-3-O-芸香糖苷 | 322 | 325 | 316 | 317 | 328 | 326 | 1.53 |
| 紫丁香苷 | 718 | 731 | 701 | 710 | 728 | 726 | 1.62 |
| 羟基红花黄色素A | 3448 | 3472 | 3420 | 3427 | 3471 | 3467 | 0.67 |
由表7可以看出，供试品溶液W中尿嘧啶核苷RSD(％)≤1.26，鸟嘌呤核苷RSD(％)≤1.51，腺嘌呤核苷RSD(％)≤0.89，对羟基苯甲酸苷RSD(％)≤1.58，5-羟甲基糠醛RSD(％)≤1.93、对羟基肉桂酸RSD(％)≤0.76、山萘酚-3-O-芸香糖苷RSD(％)≤1.53、紫丁香苷RSD(％)≤1.62、羟基红花黄色素A RSD(％)≤0.67，表明本方法日内稳定性良好。
三、重复性考察
取同一批号红花注射液(批号：HH001，6份)，分别按照实施例1中的方法制备6份供试品溶液C，供试品溶液C采用实施例1中的色谱条件及进样量分别进行测定，并对所得结果进行分析，具体结果见下表。
表8重复性实验结果一览表(峰面积)
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD％ |
| 尿嘧啶核苷 | 1911 | 1934 | 1893 | 1927 | 1936 | 1941 | 0.95 |
| 鸟嘌呤核苷 | 485 | 490 | 481 | 490 | 491 | 491 | 0.84 |
| 腺嘌呤核苷 | 1252 | 1266 | 1226 | 1259 | 1266 | 1261 | 1.21 |
| 对羟基苯甲酸苷 | 842 | 853 | 822 | 849 | 849 | 849 | 1.34 |
| 5-羟甲基糠醛 | 231 | 233 | 229 | 234 | 229 | 228 | 1.05 |
| 对羟基肉桂酸 | 1697 | 1709 | 1683 | 1708 | 1682 | 1720 | 0.90 |
| 山萘酚-3-O-芸香糖苷 | 322 | 320 | 315 | 324 | 316 | 326 | 1.36 |
| 紫丁香苷 | 718 | 715 | 725 | 721 | 713 | 723 | 0.65 |
| 羟基红花黄色素A | 3448 | 3402 | 3487 | 3494 | 3420 | 3487 | 1.13 |
由表8可以看出，尿嘧啶核苷RSD(％)≤0.95，鸟嘌呤核苷RSD(％)≤0.84，腺嘌呤核苷RSD(％)≤1.21，对羟基苯甲酸苷RSD(％)≤1.34，5-羟甲基糠醛RSD(％)≤1.05、对羟基肉桂酸RSD(％)≤0.90，山萘酚-3-O-芸香糖苷RSD(％)≤1.36，紫丁香苷RSD(％)≤0.65、对羟基红花黄色素ARSD(％)≤1.13，结果表明本方法重复性良好。
四、加样回收率试验
取同一批号的红花注射液(批号：HH001)，精密量取1.3mL置于10ml容量瓶中，分别加入1.7ml、3.5ml、5.5ml实施例6制备的混合对照品储备液I混匀，定容至刻度值，得不同加样量的加样回收待测液I，每组加样量的加样回收待测液I平行制备3份，共9份，分别采用实施例1中的色谱条件测定各组不同加样量的加样回收待测液I，具体结果见下表。
表9加样回收实验结果一览表一
由表9可以看出，尿嘧啶核苷RSD(％)≤1.15，鸟嘌呤核苷RSD(％)≤0.95，腺嘌呤核苷RSD(％)≤1.12，对羟基苯甲酸苷RSD(％)≤1.45，5-羟甲基糠醛RSD(％)≤1.02，紫丁香苷RSD(％)＜1.13，羟基红花黄色素A的RSD(％)＜0.87％。可见本方法的回收率良好。
取同一批号的红花注射液(批号：HH001)，精密量取2mL置于10ml容量瓶中，分别加入1.7ml、3.5ml、5.5ml实施例6制备的混合对照品储备液I混匀，加水定容至刻度值，得不同加样量的加样回收待测液II，每组加样量的加样回收待测液II平行制备3份，共9份，分别采用实施例1中的色谱条件测定各组不同加样量的加样回收待测液II，具体结果见下表。
表10加样回收实验结果一览表一
| 名称 | 对羟基肉桂酸 | 山柰酚-3-O芸香糖苷 |
| 低浓度1 | 101.3 | 101.8 |
| 低浓度2 | 101.7 | 100.2 |
| 低浓度3 | 101.9 | 99.4 |
| 中浓度1 | 101.2 | 99.1 |
| 中浓度2 | 99.8 | 98.4 |
| 中浓度3 | 98.7 | 100.5 |
| 高浓度1 | 101.1 | 101.5 |
| 高浓度2 | 100.4 | 98.5 |
| 高浓度3 | 99.2 | 101.0 |
由表10可以看出，对羟基肉桂酸为RSD(％)≤1.11，山萘酚-3-O-芸香糖RSD(％)≤1.26，可见本方法的回收率良好。
实验例2不同批次供试品的测定
取不同批号的5批红花注射液分别按照实施例1中的方法制备供试品溶液B，供试品溶液B按照实施例1中的色谱条件及计算方法进行9种成分含量测定，每种供试品溶液B平行测定2次，计算平均值，所得结果见下表。
表11不同批次供试品中9种成分含量测定结果一览表
表11可以看出，不同批次的红花注射液中有效成分含量有所不同，可见目前的红花注射液的制备方法还有待提高，本发明为后续生产红花药物组合物的质量控制提供了良好的技术手段。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
取尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5-羟甲基糠醛、紫丁香苷和对羟基红花黄色素A共七种成分，制备对照品溶液I；
取对羟基肉桂酸和山萘酚3-O-芸香糖苷共两种成分，制备对照品溶液II；
取红花药物组合物制备供试品溶液；
分别取对照品溶液I、对照品溶液II和供试品溶液进行高效液相色谱检测，再利用外标法，分别计算得红花药物组合物中尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5-羟甲基糠醛、对羟基肉桂酸、山萘酚3-O-芸香糖苷、紫丁香苷和羟基红花黄色素的含量；
其中，检测尿嘧啶苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷和5-羟甲基糠醛的检测波长为252～256nm；
检测对羟基肉桂酸、山柰酚3-O-芸香糖苷和紫丁香苷的检测波长为262～270nm；
检测羟基红花黄色素A检测波长为408～412nm。
2.根据权利要求1所述的同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的流动相A为乙腈、流动相B为0.1～0.2wt％的冰醋酸水溶液；所述梯度洗脱条件为：
0～15min，2％→5％流动相A，98％→95％流动相B；
15～30min，5％→25％流动相A，95％→75％流动相B。
3.根据权利要求1或2所述的同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的柱温为25～40℃、流速为0.8～1.2mL/min、色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。
4.根据权利要求1或2所述的同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，其特征在于，对照品溶液I中含有尿嘧啶核苷10～80μg/mL、鸟嘌呤核苷10～60μg/mL、腺嘌呤核苷10～70μg/mL、对羟基苯甲酸苷10～70μg/mL、5-羟甲基糠醛10～70μg/mL、紫丁香苷1～70μg/mL、对羟基红花黄色素A1～65μg/mL；
对照品溶液II中含有对羟基肉桂酸8～50μg/mL和山萘酚3-O-芸香糖苷10～80μg/mL。
5.根据权利要求1或2所述的同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，其特征在于，对照品溶液I的溶剂为水；
对照品溶液II的溶剂为48～52vol％的乙腈水溶液；
供试品溶液是取红花药物组合物用水稀释2～10倍体积制得。
6.一种同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
取尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷、5-羟甲基糠醛、紫丁香苷和对羟基红花黄色素A共七种成分，制备不同浓度的对照品系列溶液I；
取对羟基肉桂酸和山萘酚3-O-芸香糖苷共两种成分，制备不同浓度的对照品系列溶液II；
分别取不同浓度的对照品系列溶液I和对照品系列溶液II进行高效液相色谱检测，并根据不同化学成分的浓度和相应化学成分对应浓度测定的峰面积，绘制不同化学成分对应的标准曲线；
取红花药物组合物制备供试品溶液；
对供试品溶液进行高效液相色谱检测，所得相应化学成分的峰面积代入相应的标准曲线，经计算，即得所述红花药物组合物中相应化学成分的含量；其中，检测尿嘧啶苷、鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、对羟基苯甲酸苷和5-羟甲基糠醛的检测波长为252～256nm；
检测对羟基肉桂酸、山柰酚3-O-芸香糖苷和紫丁香苷的检测波长为262～270nm；
检测羟基红花黄色素A检测波长为408～412nm。
7.根据权利要求6所述的同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的流动相A为乙腈、流动相B为0.1～0.2wt％的冰醋酸水溶液；所述梯度洗脱条件为：
0～15min，2％→5％流动相A，98％→95％流动相B；
15～30min，5％→25％流动相A，95％→75％流动相B。
8.根据权利要求6或7所述的同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的柱温为25～40℃、流速为0.8～1.2mL/min、色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。
9.根据权利要求6或7所述的同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，其特征在于，不同对照品系列溶液I中尿嘧啶核苷的浓度在10.01～60.05μg/mL之间、鸟嘌呤核苷的浓度在8.99～53.93μg/mL之间、腺嘌呤核苷的浓度在9.44～56.61μg/mL之间、对羟基苯甲酸苷的浓度在9.82～58.91μg/mL之间、5-羟甲基糠醛的浓度在9.60～57.62μg/mL之间、紫丁香苷的浓度在11.80～70.82μg/mL之间、对羟基红花黄色素A的浓度在1～65μg/mL之间；
不同对照品系列溶液II中对羟基肉桂酸的浓度在9.23～55.38μg/mL之间、山萘酚3-O-芸香糖苷的浓度在12.22～73.33μg/mL之间；
对照品系列溶液I的溶剂为水；
对照品系列溶液II的溶剂为48～52vol％的乙腈水溶液；
供试品溶液是取红花药物组合物用水稀释2～10倍体积制得；
所述高效液相色谱检测过程中9种成分的理论板数均在10000以上。
10.根据权利要求6或7所述的同时测定红花药物组合物中9种成分的方法，其特征在于，所述不同化学成分对应的标准曲线如下：
尿嘧啶核苷对应的标准曲线为y＝46.13562x+1.73333，R2＝0.99992；
鸟嘌呤核苷对应的标准曲线为y＝42.86719x-0.26667，R2＝0.99995；
腺嘌呤核苷对应的标准曲线为y＝50.50161x+4.46667，R2＝0.99997；
对羟基苯甲酸苷对应的标准曲线为43.57603x-2.06667，R2＝0.99994；
5-羟甲基糠醛对应的标准曲线为y＝43.04129x-3.60000，R2＝0.99994；
对羟基肉桂酸对应的标准曲线为y＝105.70592x+19.66667，R2＝0.99993；
山萘酚3-O-芸香糖苷对应的标准曲线为y＝15.47304x-0.06667，R2＝0.99992；紫丁香苷对应的标准曲线为y＝40.00366x+1.46667，R2＝0.99992；
羟基红花黄色素A对应的标准曲线为y＝40.31518x-18.93333，R2＝0.99946。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN117929592A (zh) * | 2024-03-25 | 2024-04-26 | 北京振东光明药物研究院有限公司 | 红花药材或制剂中成分含量和指纹图谱的检测方法和应用 |
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