CN118150745A - 一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，采用高效液相色谱法同时对莱博雷生原料药中苯磺酸酯类、醛类与硝基苯类基因毒性杂质进行定量分析，所述高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，色谱条件如下：流动相以磷酸二氢钾的水溶液为流动相A，以磷酸的乙腈溶液为流动相B；采用梯度洗脱的方式，流速为0.4ml/min～0.6ml/min；柱温：33℃～43℃；洗脱时间为40min。该方法专属性强、操作简单、灵敏度高、结果准确，适用于莱博雷生中基因毒性杂质的检测，该检测方法成本低廉，经济实用，可直接QC实验室进行莱博雷生原料药的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
莱博雷生（Lemborexant, E-2006），化学名称为（1S，2S)-2{[（（2，4-二甲基嘧啶-5-基）氧基}）甲基]-2-（3-氟苯基）-N-（5-氟吡啶-2-基）环丙烷-1-甲酰胺，结构式如下：
。
莱博雷生是由卫材公司研发的一种用于治疗失眠症的食欲素受体拮抗剂，可显著改善失眠患者的睡眠效率，同时在治疗阿尔兹海默症患者的不规则睡眠-觉醒节律障碍方面也显示巨大的潜力，具有广阔的临床应用前景。
莱博雷生生产过程中可能产生的苯磺酸酯类、醛类与硝基苯类杂质具有基因毒性警示结构，且评估结果均为阳性，表明其存在一定的基因毒性副作用，且较低水平存在于原料药中即可对服药患者造成较大的安全威胁，各生产企业或研究机构应对该类型杂质进行严格控制，相关具有基因毒性警示结构为VSD22001-M5-Z03、VSD22001-M6-Z01、VSD22001-M6-Z07、VSD22001-M6-Z10和VSD22001-M9-Z02，具体结构式如下：
VSD22001-M5-Z03；
VSD22001-M6-Z01；
VSD22001-M6-Z07；
VSD22001-M6-Z10；
VSD22001-M9-Z02。
目前尚无莱博雷生原料药中相关基因毒性杂质检测方法的报道，有必要提供一种测定方法以保证产品的质量及患者的用药安全。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，该测定方法成本低廉，经济实用，生产过程中可直接转移至QC实验室进行莱博雷生原料药的质量控制，为临床用药的安全性提供了保证和依据。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，采用高效液相色谱法同时对莱博雷生原料药中苯磺酸酯类、醛类与硝基苯类基因毒性杂质进行定量分析，包括如下步骤：
S1、对照品标准溶液的制备：
分别精密称取杂质VSD22001-M9-Z02对照品、杂质VSD22001-M6-Z10对照品、杂质VSD22001-M6-Z01对照品、杂质VSD22001-M6-Z07对照品、杂质VSD22001-M5-Z03对照品，用乙腈溶解并稀释制成每1mL中含上述对照品均为0.15mg的标准储备液，然后使用稀释剂将标准储备液逐步稀释成所需浓度的对照品标准溶液；
S2、样品溶液准备：
将待检测的莱博雷生原料药用所述稀释剂溶解后得到所述样品溶液；
S3、采用高效液相色谱法对莱博雷生原料药进行定量分析：
将相应浓度的对照品标准溶液注入高效液相色谱中进行测定；将所述样品溶液注入高效液相色谱中进行检测，所述高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，色谱条件如下：流动相以磷酸二氢钾的水溶液为流动相A，以磷酸的乙腈溶液为流动相B；采用梯度洗脱的方式；所述流动相的流速为0.4ml/min～0.6ml/min；洗脱时间为40min；柱温为36℃～40℃；色谱柱为C18或C8柱；进样量为4μL～6μL。
进一步的，步骤S1中，所述稀释剂为乙腈和水的混合液，所述乙腈和水的体积比为50：50。
进一步的，步骤S3中，所述流动相A中磷酸二氢钾的浓度为5mmol/L～15mmol/L；所述流动相B中磷酸的质量浓度为0.05%～0.15%。
优选的，步骤S3中，所述流动相A中磷酸二氢钾的浓度为10mmol/L；所述流动相B中磷酸的质量浓度为0.1%。
进一步的，步骤S3中，所述梯度洗脱按照如下线性梯度进行洗脱：
1）洗脱时间0min时，流动相A的体积分数为70%，流动相B的体积分数为30%；
2）洗脱时间5min时，流动相A的体积分数为70%，流动相B的体积分数为30%；
3）洗脱时间15min时，流动相A的体积分数为55%，流动相B的体积分数为45%；
4）洗脱时间20min时，流动相A的体积分数为55%，流动相B的体积分数为45%；
5）洗脱时间29min时，流动相A的体积分数为10%，流动相B的体积分数为90%；
6）洗脱时间34min时，流动相A的体积分数为10%，流动相B的体积分数为90%；
7）洗脱时间34.1min时，流动相A的体积分数为70%，流动相B的体积分数为30%；
8）洗脱时间40min时，流动相A的体积分数为70%，流动相B的体积分数为30%。
优选的，步骤S3中，所述色谱柱为3.0mm×150mm、3.5μm的C18色谱柱。
优选的，步骤S3中，所述流速为0.5ml/min。
优选的，步骤S3中，所述柱温为38℃。
本发明的有益效果是：
（1）本发明的测定方法可有效分离5种莱博雷生原料药中潜在的基因毒性杂质，空白溶剂与其他杂质均不干扰检测过程，方法专属性强。
（2）本发明样品溶液制备采用乙腈-水溶解后，直接进行基因毒性杂质的检测，无需任何复杂前处理过程，操作简便易行。
（3）相较于采用液质或气质联用手段进行基因毒性杂质存在检测及维护成本高昂，且因绝大多数QC实验室未配备质谱检测器，常规的检测方法直接转移至QC实验室中应用会存在困难，本发明采用常规高效液相色谱法，成本低廉，经济实用，可顺利转移至QC实验室进行莱博雷生原料药的质量控制。
附图说明
图1为实施例1中空白溶剂（乙腈-水）的色谱图；
图2为实施例1中杂质对照品溶液的色谱图；
图3为实施例1中供试品溶液的色谱图；
图4为实施例1中加标供试品溶液色谱图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式做详细说明。本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。所使用的术语只为描述具体实施方式，不为限制本发明。
一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，采用高效液相色谱法同时对莱博雷生原料药中苯磺酸酯类、醛类与硝基苯类基因毒性杂质进行定量分析，包括如下步骤：
S1、对照品标准溶液的制备：
分别精密称取杂质VSD22001-M9-Z02对照品、杂质VSD22001-M6-Z10对照品、杂质VSD22001-M6-Z01对照品、杂质VSD22001-M6-Z07对照品、杂质VSD22001-M5-Z03对照品，用乙腈溶解并稀释制成每1mL中含上述对照品均为0.15mg的对照品标准储备液，然后使用稀释剂将对照品标准储备液逐步稀释成所需浓度的对照品标准溶液；更具体的，用稀释剂将标准储备液稀释制成每1ml中约含各杂质均为600ng的对照品标准溶液。
S2、样品溶液准备：
将待检测的莱博雷生原料药用稀释剂溶解后得到所述样品溶液；更具体的，每1ml样品溶液中中约含4.0mg的莱博雷生原料药。
S3、采用高效液相色谱法对莱博雷生原料药进行定量分析：
将相应浓度的对照品标准溶液注入高效液相色谱中进行测定；将所述样品溶液注入高效液相色谱中进行检测，所述高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，色谱条件如下：流动相以磷酸二氢钾的水溶液为流动相A，以磷酸的乙腈溶液为流动相B；采用梯度洗脱的方式；所述流动相的流速为0.4ml/min～0.6ml/min；洗脱时间为40min；柱温为36℃～40℃；色谱柱为C18或C8柱；进样量为4μL～6μL。
具体的，步骤S1中，所述稀释剂为乙腈和水的混合液，所述乙腈和水的体积比为50：50。
具体的，步骤S3中，所述流动相A中磷酸二氢钾的浓度为5mmol/L～15mmol/L；所述流动相B中磷酸的质量浓度为0.05%～0.15%。
优选的，步骤S3中，所述流动相A中磷酸二氢钾的浓度为10mmol/L；所述流动相B中磷酸的质量浓度为0.1%。
具体的，步骤S3中，所述梯度洗脱按照如下线性梯度进行洗脱：
1）洗脱时间0min时，流动相A的体积分数为70%，流动相B的体积分数为30%；
2）洗脱时间5min时，流动相A的体积分数为70%，流动相B的体积分数为30%；
3）洗脱时间15min时，流动相A的体积分数为55%，流动相B的体积分数为45%；
4）洗脱时间20min时，流动相A的体积分数为55%，流动相B的体积分数为45%；
5）洗脱时间29min时，流动相A的体积分数为10%，流动相B的体积分数为90%；
6）洗脱时间34min时，流动相A的体积分数为10%，流动相B的体积分数为90%；
7）洗脱时间34.1min时，流动相A的体积分数为70%，流动相B的体积分数为30%；
8）洗脱时间40min时，流动相A的体积分数为70%，流动相B的体积分数为30%。
优选的，步骤S3中，所述色谱柱为3.0mm×150mm、3.5μm的C18色谱柱，检测波长为220nm。
优选的，步骤S3中，所述流速为0.5ml/min。
优选的，步骤S3中，所述柱温为38℃。
具体的测试程序为：
精密量取步骤S1中对照品标准储备液5μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积计算，5次进样的相对标准偏差不得超过2.0%；再精密量样品溶液5μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积按下式计算，计算公式为：
。
式中：
As：对照品标准溶液中杂质的平均峰面积；
At：样品溶液中杂质的峰面积；
Cs：对照品标准溶液中杂质的浓度；
Ct：样品溶液的浓度。
实施例1
对照品标准储备液的制备：
分别取杂质VSD22001-M9-Z02、杂质VSD22001-M6-Z10、杂质VSD22001-M6-Z01、杂质VSD22001-M6-Z07、杂质VSD22001-M5-Z03对照品各适量，精密称定，用乙腈分别溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.15mg杂质的对照品标准储备液。
液相色谱条件：
色谱柱为C18（3.0×150mm，3.5μm）；以10mmol/L磷酸二氢钾乙腈溶液为流动相A，以0.1%磷酸乙腈溶液为流动相B；检测波长为220nm；流速为0.5ml/min；柱温：38℃；进样量为5μL；采用梯度洗脱，洗脱时间为40min；检测器为紫外检测器。
方法学的验证：
1、专属性验证
在本试验条件中下，将对照品标准储备溶液稀释，制成每1ml中约含15μg的溶液，作为各杂质对照品标准溶液的定位溶液。
杂质对照品溶液：分别精密量取各杂质标准储备液1ml至同一10ml量瓶，用乙腈-水（50:50，v/v）稀释制成每1mL中约含6.0ug的混合杂质对照品溶液。
供试品溶液：称取样品99.98mg，置25ml量瓶，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
选择性溶液：称取本品99.96mg，置25ml量瓶，加杂质对照品溶液1ml，并用溶剂稀释至刻度加适量溶剂使溶解，摇匀。
专属性验证结果如下表1：
表1 专属性试验结果汇总表
空白溶液及其他杂质均不干扰上述杂质的检测，专属性良好。
2、检测限与定量限验证
在本试验条件中下，将标准储备溶液逐级稀释配制成不同浓度的各杂质对照品标准储备液，分别进样测定各杂质的信噪比（S/N），进而确定各杂质的检测限与定量限（检测限以S/N≥3计，定量限以S/N≥10计）。实验结果见表2与表3。
表2 检测限试验结果
表3 定量限试验结果（检测次数n=5）
3、对照品溶液稳定性验证
对照品溶液的制备：取标准储备溶液适量，用乙腈-水（50:50，v/v）稀释制成每1ml中约含各杂质均为600ng的对照品溶液，进行稳定性试验，分别测定放置4小时后的峰面积，测定结果见表4。
表4 稳定性考察结果汇总表
从表4可以看出：对照品溶液6℃放置4h时，对照品溶液中，各杂质各时间点的峰面积与0h峰面积之比均在0.8-1.2之间，表明其在6℃条件下4h内稳定。
4、线性关系验证
线性储备溶液：取标准储备溶液适量，用乙腈-水（50:50，v/v）稀释制成每1ml中约含各杂质均为15ng的混合溶液，作为线性储备溶液。
50%浓度水平线性溶液：精密量取线性储备溶液0.5ml至上述25ml量瓶，用乙腈-水（50:50，v/v）稀释至刻度，摇匀。
80%浓度水平线性溶液：精密量取线性储备溶液0.8ml至上述25ml量瓶，用乙腈-水（50:50，v/v）稀释至刻度，摇匀。
100%浓度水平线性溶液：精密量取线性储备溶液1.0ml至上述25ml量瓶，用乙腈-水（50:50，v/v）稀释至刻度，摇匀。
120%浓度水平线性溶液：精密量取线性储备溶液1.2ml至上述25ml量瓶，用乙腈-水（50:50，v/v）稀释至刻度，摇匀。
200%浓度水平线性溶液：精密量取线性储备溶液2.0ml至上述25ml量瓶，用乙腈-水（50:50，v/v）稀释至刻度，摇匀。
精密量取标准系列混合溶液各5μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，验证结果具体见表5。
表5 线性试验结果
从表5可以看出，各杂质在限度浓度50%～200%范围内线性关系良好。
5、准确度验证
供试品溶液：称取供试品40mg，置10ml量瓶，用乙腈-水（50:50，v/v）溶解并稀释至刻度，作为回收率本底溶液；
杂质对照品溶液：分别精密量取各杂质标准储备液1ml至同一25ml量瓶，用乙腈-水（50:50，v/v）稀释制成每1mL中约含6.0ug的混合杂质对照品溶液。
加标供试品溶液：取莱博雷生供试品约40mg，精密称定，置于10ml量瓶中，精密量取杂质对照品溶液1.0ml至上述10ml量瓶中，用乙腈-水（50:50，v/v）稀释至刻度，摇匀，配制成含杂质100%浓度水平的溶液，同法平行配制6份。
精密量取所述加标供试品溶液各5μL，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图，记录峰面积（其中供试品中杂质峰面积需扣除供试品溶液中杂质的本底峰面积），计算回收率，实验结果见下表6～表10，其中空白溶剂（乙腈-水）的色谱图如图1所示，杂质对照品溶液的色谱图如图2所示，供试品溶液的色谱图如图3所示，加标供试品溶液色谱图如图4所示。
回收率计算公式：
。
式中：W s ：杂质对照品质量（mg）；
C s ：杂质对照品含量（%）；
Au：供试品溶液中杂质的峰面积（扣除基质中杂质峰面积）；
Fs：杂质浓度与峰面积比。
表6 杂质VSD22001-M9-Z02回收率汇总表
表7 杂质VSD22001-M6-Z10回收率汇总表
表8 杂质VSD22001-M6-Z01回收率汇总表
表9 杂质VSD22001-M6-Z07回收率汇总表
表10 杂质VSD22001-M5-Z03回收率汇总表
实施例2
采用实施例1相同的方法进行加标供试品溶液的检测，液相色谱条件：色谱柱为C18（3.0×150mm，3.5μm）；以5mmol/L磷酸二氢钾乙腈溶液为流动相A，以0.1%磷酸乙腈溶液为流动相B；检测波长为220nm；流速为0.5ml/min；柱温：38℃；进样量为5μL；采用梯度洗脱，洗脱时间为40min；检测器为紫外检测器。
实施例3
采用实施例1相同的方法进行加标供试品溶液的检测，液相色谱条件：色谱柱为C18（3.0×150mm，3.5μm）；以15mmol/L磷酸二氢钾乙腈溶液为流动相A，以0.1%磷酸乙腈溶液为流动相B；检测波长为220nm；流速为0.5ml/min；柱温：38℃；进样量为5μL；采用梯度洗脱，洗脱时间为40min；检测器为紫外检测器。
实施例4
采用实施例1相同的方法进行加标供试品溶液的检测，液相色谱条件：色谱柱为C18（3.0×150mm，3.5μm）；以10mmol/L磷酸二氢钾乙腈溶液为流动相A，以0.1%磷酸乙腈溶液为流动相B；检测波长为220nm；流速为0.5ml/min；柱温：38℃；进样量为4μL；采用梯度洗脱，洗脱时间为40min；检测器为紫外检测器。
实施例5
采用实施例1相同的方法进行加标供试品溶液的检测，液相色谱条件：色谱柱为C18（3.0×150mm，3.5μm）；以10mmol/L磷酸二氢钾乙腈溶液为流动相A，以0.1%磷酸乙腈溶液为流动相B；检测波长为220nm；流速为0.5ml/min；柱温：38℃；进样量为6μL；采用梯度洗脱，洗脱时间为40min；检测器为紫外检测器。
实施例1-5不同色谱条件下检测结果如下表11。
表11 不同实施例色谱条件下检测结果汇总表
由表6-表11结果可得，各杂质回收率均在80%~120%范围内；且回收率RSD值均小于5%，表明该方法准确度较高。
综上，本方法专属性强、灵敏度高、线性关系拟合度高、准确度及耐用性均可满足检测要求，可用于同时测定莱博雷生原料药中五种基因毒性杂质含量。
另外，采用本实施例的检测方法与常规的液质联用设备检测相比，其偏差均不大于10%。进一步说明，本发明检测方法的可靠性，而且对设备要求更低，检测成本更加经济。
对比例1
采用实施例1相同的方法进行加标供试品溶液的检测，不同之处在于，洗脱过程中，流动相A和流动相B的体积始终是70%和30%。
结果发现：杂质各成分在相同运行时间内未能完全洗脱。
对比例2
采用实施例1相同的方法进行加标供试品溶液的检测，不同之处在于，洗脱过程中，流动相A和流动相B的体积始终是50%和50%。
结果发现：杂质各成分可全部洗脱，但杂质未能有效分离。
从对比例1和对比例2的实验情况可以看出，采用本发明的洗脱条件更利于实现莱博雷生原料药中多种潜在基因毒性杂质含量测定。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合穷举，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法同时对莱博雷生原料药中苯磺酸酯类、醛类与硝基苯类基因毒性杂质进行定量分析，包括如下步骤：
S1、对照品标准溶液的制备：
分别精密称取杂质VSD22001-M9-Z02对照品、杂质VSD22001-M6-Z10对照品、杂质VSD22001-M6-Z01对照品、杂质VSD22001-M6-Z07对照品、杂质VSD22001-M5-Z03对照品，用乙腈溶解并稀释制成每1mL中含上述对照品均为0.15mg的标准储备液，然后使用稀释剂将标准储备液逐步稀释成所需浓度的对照品标准溶液；
S2、样品溶液准备：
将待检测的莱博雷生原料药用所述稀释剂溶解后得到所述样品溶液；
S3、采用高效液相色谱法对莱博雷生原料药进行定量分析：
将相应浓度的对照品标准溶液注入高效液相色谱中进行测定；将所述样品溶液注入高效液相色谱中进行检测，所述高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，色谱条件如下：流动相以磷酸二氢钾的水溶液为流动相A，以磷酸的乙腈溶液为流动相B；采用梯度洗脱的方式；所述流动相的流速为0.4ml/min～0.6ml/min；洗脱时间为40min；柱温为36℃～40℃；色谱柱为C18或C8柱；进样量为4μL～6μL。
2.根据权利要求1所述一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，其特征在于，步骤S1中，所述稀释剂为乙腈和水的混合液，所述乙腈和水的体积比为50：50。
3.根据权利要求1所述一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，其特征在于，步骤S3中，所述流动相A中磷酸二氢钾的浓度为5mmol/L～15mmol/L；所述流动相B中磷酸的质量浓度为0.05%～0.15%。
4.根据权利要求3所述一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，其特征在于，步骤S3中，所述流动相A中磷酸二氢钾的浓度为10mmol/L；所述流动相B中磷酸的质量浓度为0.1%。
5.根据权利要求1-4任意一项所述一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，其特征在于，步骤S3中，所述梯度洗脱按照如下线性梯度进行洗脱：
1）洗脱时间0min时，流动相A的体积分数为70%，流动相B的体积分数为30%；
2）洗脱时间5min时，流动相A的体积分数为70%，流动相B的体积分数为30%；
3）洗脱时间15min时，流动相A的体积分数为55%，流动相B的体积分数为45%；
4）洗脱时间20min时，流动相A的体积分数为55%，流动相B的体积分数为45%；
5）洗脱时间29min时，流动相A的体积分数为10%，流动相B的体积分数为90%；
6）洗脱时间34min时，流动相A的体积分数为10%，流动相B的体积分数为90%；
7）洗脱时间34.1min时，流动相A的体积分数为70%，流动相B的体积分数为30%；
8）洗脱时间40min时，流动相A的体积分数为70%，流动相B的体积分数为30%。
6.根据权利要求1所述一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，其特征在于，步骤S3中，所述色谱柱为3.0mm×150mm、3.5μm的C18色谱柱。
7.根据权利要求1所述一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，其特征在于，步骤S3中，所述流速为0.5ml/min。
8.根据权利要求1所述一种同时测定莱博雷生原料药中多类基因毒性杂质的方法，其特征在于，步骤S3中，所述柱温为38℃。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118150745A true CN118150745A (zh) | 2024-06-07 |
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