CN117092251A - 一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法及其应用 - Google Patents
一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法及其应用，属于分析化学领域。其检测方法，包括：采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用亲水基键合硅胶填充剂的色谱柱，用流动相进行梯度洗脱，电喷雾(CAD)检测器检测。本发明通过对流动相比例流速、柱温等色谱条件的筛选优化，有效改善了牛磺酸、磺基丙氨酸的响应及分离度，并实现了这两个杂质准确的定量检测。该检测方法经过系统的方法学验证，具有专属性强、灵敏度高、精密度好、耐用性强等优点，可定性或可定量检测出半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸，从而提高相关产品的有效性及安全性。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法及其应用。
背景技术
半胱氨酸是一种常见的人体非必需氨基酸，对皮肤的形成与解毒有作用。半胱氨酸常添加于药物中，起到一定的治疗作用，但由于半胱氨酸较不稳定，尤其是溶于水后稳定性更差，降解产生杂质，进而影响患者的用药安全，故需要对半胱氨酸的有关物质进行研究。其中牛磺酸、磺基丙氨酸是其常见的半胱氨酸杂质，其结构式如下：
现有文献资料中，对牛磺酸的检测主要为衍生法，但是衍生法存在反应不稳定、操作繁琐等缺点，同时牛磺酸、磺基丙氨酸的紫外吸收均极弱，传统紫外检测器无法有效检出。故需要单独建立一种方法针对半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法及其应用，以解决目前缺少针对牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，实现可定性或可定量地检测出半胱氨酸原料中的牛磺酸、磺基丙氨酸，从而保证了相关产品的安全性。
本发明通过下述技术方案实现：
一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，包括：采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用亲水基键合硅胶填充剂的色谱柱，用流动相进行梯度洗脱，电喷雾(CAD)检测器检测，流动相流速为0.7ml/min～0.9ml/min，进样量为10μl～30μl，柱温为33℃～37℃；
所述流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为含有0.1wt％甲酸的甲酸铵溶液；流动相B为含有0.1wt％甲酸的乙腈。
作为一种可能的设计，所述流动相A中甲酸铵的浓度为13mmol/L～17mmol/L。
作为一种可能的设计，所述流动相A中甲酸铵的浓度为15mmol/L。
作为一种可能的设计，所述柱温为35℃～37℃。
作为一种可能的设计，所述进样量为10μl～20μl。
作为一种可能的设计，所述进样量为20μl。
作为一种可能的设计，所述梯度洗脱的条件为：
时间：0min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B；
时间：6min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B；
时间：30min，43～47％的流动相A，57～53％的流动相B；
时间：35min，43～47％的流动相A，57～53％的流动相B；
时间：35.1min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B；
时间：40min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B。
作为一种可能的设计，所述检测柱温为35℃。
作为一种可能的设计，所述流动相流速为0.8ml/min。
本发明还提供上述的半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法在检测半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明通过对流动相比例及流速、柱温、色谱梯度等色谱条件的筛选优化，有效改善了牛磺酸、磺基丙氨酸的响应及分离度，并实现了这两个杂质准确的定量检测。该检测方法经过系统的方法学验证，具有专属性强、灵敏度高、精密度好、耐用性强等优点，可定性或可定量检测出半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸，从而提高相关产品的有效性及安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：
图1为牛磺酸定位溶液的HPLC示意图；
图2为磺基丙氨酸定位溶液的HPLC示意图；
图3为杂质混合对照品溶液的HPLC示意图；
图4为系统适用性溶液的HPLC示意图；
图5为实施例2中硫磺酸的线性关系图；
图6为实施例2中L-磺基丙氨酸的线性关系图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的具体实施方式的技术方案为：
一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，包括：采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用亲水基键合硅胶填充剂的色谱柱，用流动相进行梯度洗脱，电喷雾(CAD)检测器检测。流动相流速为0.7ml/min～0.9ml/min，进一步地，流动相流速为0.8ml/min。进样量为10μl～30μl，进一步地，进样量为10μl～20μl，更进一步地，进样量为20μl。柱温为33℃～37℃，进一步地，柱温为35℃。
其中，所述流动相由流动相A和流动相B组成。流动相A：甲酸铵溶液(含0.1％甲酸)。所述流动相A为浓度为13mmol/L～17mmol/L甲酸铵溶液，进一步地，所述流动相A为浓度为15mmol/L甲酸铵溶液；其中，甲酸铵溶液中含有0.1％甲酸。
所述流动相B：乙腈。所述流动相B中含有0.1％甲酸。
所述梯度洗脱的条件为：
时间：0min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B；
时间：6min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B；
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时间：40min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B。
进一步地，本实施方式提供的一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，包括：采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用亲水基键合硅胶填充剂的色谱柱，用流动相进行梯度洗脱，电喷雾(CAD)检测器检测，流动相流速为0.8ml/min，进样量为进样量为20μl，柱温为35℃。
其中，流动相由流动相A和流动相B组成。流动相A：甲酸铵溶液(含0.1％甲酸)。所述流动相A为浓度为15mmol/L甲酸铵溶液；其中，含有0.1％甲酸。
流动相B：乙腈，所述流动相B中含有0.1％甲酸。
所述梯度洗脱的条件为：
时间：0min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B；
时间：6min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B；
时间：30min，43～47％的流动相A，57～53％的流动相B；
时间：35min，43～47％的流动相A，57～53％的流动相B；
时间：35.1min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B；
时间：40min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B。
本发明的具体实施方案如下：其中，
本品指半胱氨酸原料，津药药业股份有限公司提供。
实施例1：专属性实验
一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，包括：
混合对照品储备液：分别精密称取牛磺酸及L-磺基丙氨酸对照品9.382mg、9.875mg，分别置不同20ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质对照品储备液；分别精密量取2.0ml各杂质对照品储备液，置同一20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取1.0ml混合对照品储备液，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液：精密称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，加适量稀释剂溶解后加1.0ml混合对照品储备液，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
色谱条件：
色谱柱：ShodexHILICpak VN-50 4D，4.6mm×150mm，5μm；
流动相A：15mmol/L甲酸铵溶液(含0.1％甲酸)；
流动相B：乙腈(含0.1％甲酸)；
稀释剂：乙腈-水(60:40)；
柱温：35℃；
流速：0.8ml/min；
进样量：20μl；
梯度洗脱条件如下：
时间：0min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：6min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：30min，45％的流动相A，55％的流动相B；
时间：35min，45％的流动相A，55％的流动相B；
时间：35.1min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：40min，15％的流动相A，85％的流动相B。
检测方法：分别精确量取对照品溶液和系统适应性溶液，注入高效液相色谱仪中进行检测，结果见表1。
表1专属性考察结果
由表1可知，在对照品溶液与系统适应性溶液中，牛磺酸、磺基丙氨酸保留时间基本一致。图1和图2分别为牛磺酸定位溶液和磺基丙氨酸定位溶液的HPLC示意图，图3和图4分别为杂质混合对照品溶液和系统适用性溶液的HPLC示意图；由图4可知，系统适用性溶液中，牛磺酸与相邻峰分离度为2.0，磺基丙氨酸与相邻峰分离度为4.9，分离效果良好，说明本发明的色谱条件可以有效的分离牛磺酸、磺基丙氨酸。
实施例2：线性及灵敏度实验
一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，包括：
混合对照品储备液：分别精密称取牛磺酸及L-磺基丙氨酸对照品9.382mg、9.875mg，分别置不同20ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质对照品储备液；分别精密量取2.0ml各杂质对照品储备液，置同一20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。
取对照贮备液分别制成牛磺酸1.4017μg/ml、2.3361μg/ml、3.7378μg/ml、4.6722μg/ml、7.0084μg/ml、9.3445μg/ml，磺基丙氨酸1.4768μg/ml、2.4613μg/ml、3.9382μg/ml、4.9227μg/ml、7.3840μg/ml、9.8454μg/ml浓度的线性溶液。
色谱条件：
色谱柱：ShodexHILICpak VN-50 4D，4.6mm×150mm，5μm；
流动相A：15mmol/L甲酸铵溶液(含0.1％甲酸)；
流动相B：乙腈(含0.1％甲酸)；
稀释剂：乙腈-水(60:40)；
柱温：35℃；
流速：0.8ml/min；
进样量：20μl；
梯度洗脱条件如下：
时间：0min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：6min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：30min，45％的流动相A，55％的流动相B；
时间：35min，45％的流动相A，55％的流动相B；
时间：35.1min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：40min，15％的流动相A，85％的流动相B。
检测方法：分别精确量取5个不同浓度的线性溶液和定量限溶液，注入高效液相色谱仪中进行检测，结果见表2～3。
表2牛磺酸线性及灵敏度考察结果
表3磺基丙氨酸线性及灵敏度考察结果
由表2、3可知，线性方程相关系数r均大于0.995，线性关系良好。牛磺酸、磺基丙氨酸在定量限浓度时，信噪比均大于10。说明在本发明的色谱条件下牛磺酸、磺基丙氨酸灵敏度较高。
实施例3：精密度实验
一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，包括：
供试品溶液：精密称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
混合对照品储备液：分别精密称取牛磺酸及L-磺基丙氨酸对照品4.604mg、4.538mg，分别置不同10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质对照品储备液；分别精密量取2.0ml各杂质对照品储备液，置同一20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取2.0ml混合对照品储备液，置20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。
100％回收率溶液：精密称取供试品约30mg，置10ml量瓶中，加适量稀释剂溶解后加1.0ml混合对照品储备液，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
色谱条件：
色谱柱：ShodexHILICpak VN-50 4D，4.6mm×150mm，5μm；
流动相A：15mmol/L甲酸铵溶液(含0.1％甲酸)；
流动相B：乙腈(含0.1％甲酸)；
稀释剂：乙腈-水(60:40)；
柱温：35℃；
流速：0.8ml/min；
进样量：20μl；
梯度洗脱条件如下：
时间：0min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：6min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：30min，45％的流动相A，55％的流动相B；
时间：35min，45％的流动相A，55％的流动相B；
时间：35.1min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：40min，15％的流动相A，85％的流动相B。
检测方法：分别精确量取对照品溶液、供试品溶液和100％回收率溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，结果见表4。
表4精密度考察结果
| 样品编号 | 牛磺酸回收率 | 样品编号 | 磺基丙氨酸回收率 |
| 1-1# | 100％ | 2-1# | 99％ |
| 1-2# | 94％ | 2-2# | 92％ |
| 1-3# | 96％ | 2-3# | 87％ |
| 1-4# | 95％ | 2-4# | 91％ |
| 1-5# | 94％ | 2-5# | 89％ |
| 1-6# | 94％ | 2-6# | 85％ |
| 平均值 | 96％ | 平均值 | 91％ |
| RSD | 2％ | RSD | 5％ |
由表4可知，6份供试品加标溶液牛磺酸平均回收率为96％，RSD＝2％；磺基丙氨酸平均回收率为91％，RSD＝5％方法重复性良好。说明在本发明的色谱条件下牛磺酸、磺基丙氨酸的精密度良好。
实施例4：耐用性实验
一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，包括：
供试品溶液：精密称取供试品30.46mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品储备液：分别精密称取牛磺酸及L-磺基丙氨酸对照品4.536mg、4.667mg，分别置不同10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质对照品储备液；分别精密量取1.0ml各杂质对照品储备液，置同一10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取1.0ml混合对照品储备液，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。
供试品加标溶液：精密称取供试品30.63mg，置10ml量瓶中，加适量稀释剂溶解后加1.0ml混合对照品储备液，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
色谱条件：
色谱柱：ShodexHILICpak VN-50 4D，4.6mm×150mm，5μm；
流动相A：15mmol/L甲酸铵溶液(含0.1％甲酸)；
流动相B：乙腈(含0.1％甲酸)；
稀释剂：乙腈-水(60:40)；
柱温：35℃；
流速：0.8ml/min；
进样量：20μl；
梯度洗脱条件如下：
时间：0min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：6min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：30min，45％的流动相A，55％的流动相B；
时间：35min，45％的流动相A，55％的流动相B；
时间：35.1min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：40min，15％的流动相A，85％的流动相B。
通过改变柱温、流速和流动相比例来考察牛磺酸、磺基丙氨酸耐用性，柱温、流速和流动相比例设定条件如下表5：
表5耐用性条件参数
检测方法：根据表5耐用性条件参数进行设置，精准量取对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液在进行高效液相色谱仪中进行检测，结果见表6。
表6耐用性考察结果
由表6可知，微调色谱条件后，供试品加标溶液回收率均在85％～115％，牛磺酸RSD＝6％，磺基丙氨酸RSD＝4％。说明在本发明的色谱条件下牛磺酸、磺基丙氨酸方法耐用性良好。
对照例1
一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，包括：
供试品溶液：精密称取供试品30.46mg，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品储备液：分别精密称取牛磺酸及L-磺基丙氨酸对照品4.536mg、4.667mg，分别置不同10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质对照品储备液；分别精密量取1.0ml各杂质对照品储备液，置同一10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取1.0ml混合对照品储备液，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。
供试品加标溶液：精密称取供试品30.63mg，置10ml量瓶中，加适量稀释剂溶解后加1.0ml混合对照品储备液，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
色谱条件：
色谱柱：ShodexHILICpak VN-50 4D，4.6mm×150mm，5μm；
流动相A：15mmol/L甲酸铵溶液(含0.1％甲酸)；
流动相B：乙腈(含0.1％甲酸)；
稀释剂：乙腈-水(60:40)；
柱温：35℃；
流速：0.8ml/min；
进样量：20μl；
梯度洗脱条件如下：
时间：0min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：6min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：30min，45％的流动相A，55％的流动相B；
时间：35min，45％的流动相A，55％的流动相B；
时间：35.1min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：40min，15％的流动相A，85％的流动相B。
设定柱温、流速和流动相比例的色谱条件的对照例，设定条件如下表7：
表7对照例参数条件
| 条件 | 柱温℃ | 流速ml/min | 流动相比例 |
| 对照例1-1a | 33 | 0.8 | 85：15 |
| 对照例1-1b | 37 | 0.8 | 85：15 |
| 对照例1-2a | 35 | 0.7 | 85：15 |
| 对照例1-2b | 35 | 0.9 | 85：15 |
| 对照例1-3a | 35 | 0.8 | 83：17 |
| 对照例1-3b | 35 | 0.8 | 87：13 |
检测方法：根据表7对照例条件参数进行设置，精准量取对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液在进行高效液相色谱仪中进行检测，结果见表8。
表8耐用性考察结果
在柱温考察中，柱温33℃和37℃回收率正常。结合柱温耐用性筛选结果，故选择柱温范围为33～37℃。
在流速考察中，流速0.7ml/min和0.9ml/min回收率均无异常，正常条件0.8ml/min回收率良好。结合流速耐用性筛选结果，故选择流速范围为0.7ml/min～0.9ml/min。
在流动相比例考察中，流动相B和A比例83：17和87：13回收率均无异常，正常条件85：15回收率均良好。故流动相B和A的比例范围为83:17～87:13。
本发明通过对流动相比例及流速、柱温等色谱条件的筛选优化，有效改善了牛磺酸、磺基丙氨酸分离度，并实现了杂质准确的定量检测。该检测方法经过系统的方法学验证，具有专属性强、灵敏度高、精密度好、耐用性强等优点，可定性或可定量检测出半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸，从而提高相关产品的安全性。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，其特征在于，包括：采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用亲水基键合硅胶填充剂的色谱柱，用流动相进行梯度洗脱，电喷雾检测器检测，流动相流速为0.7ml/min～0.9ml/min，进样量为10μl～30μl，柱温为33℃～37℃；
所述流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为含有0.1wt％甲酸的甲酸铵溶液；流动相B为含有0.1wt％甲酸的乙腈。
2.根据权利要求1所述的半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，其特征在于，所述流动相A中甲酸铵的浓度为13mmol/L～17mmol/L。
3.根据权利要求2所述的半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，其特征在于，所述流动相A中甲酸铵的浓度为15mmol/L。
4.根据权利要求1所述的半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，其特征在于，所述柱温为35℃～37℃。
5.根据权利要求1所述的半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，其特征在于，所述进样量为10μl～20μl。
6.根据权利要求5所述的半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，其特征在于，所述进样量为20μl。
7.根据权利要求1所述的半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件为：
时间：0min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B；
时间：6min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B；
时间：30min，43～47％的流动相A，57～53％的流动相B；
时间：35min，43～47％的流动相A，57～53％的流动相B；
时间：35.1min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B；
时间：40min，13～17％的流动相A，87～83％的流动相B。
8.根据权利要求7所述的半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件为：
时间：0min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：6min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：30min，45％的流动相A，55％的流动相B；
时间：35min，45％的流动相A，55％的流动相B；
时间：35.1min，15％的流动相A，85％的流动相B；
时间：40min，15％的流动相A，85％的流动相B。
9.根据权利要求1所述的半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法，其特征在于，所述检测柱温为35℃；优选所述流动相流速为0.8ml/min。
10.权利要求1-9任一项所述的半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的检测方法在检测半胱氨酸原料中牛磺酸、磺基丙氨酸的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN117740983A (zh) * | 2023-12-15 | 2024-03-22 | 广东利泰制药股份有限公司 | 一种复方氨基酸注射液（6aa）中杂质的检测方法 |
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2023
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